Abstract
Exosomer er microvesicular strukturer, der spiller en rolle som mægler intercellulære kommunikation. Det er af interesse at studere den interne last af exosomer at afgøre, om de bærer sygdoms diskriminerende biomarkører. Til udførelse exosomal analyse er det nødvendigt at udvikle en metode til ekstraktion og analyse af exosomer fra target Biofluids uden at beskadige den interne indhold.
Elektrisk felt-induceret frigivelse og måling (EFIRM) er en metode til specifikt at udtrække exosomer fra Biofluids, losse deres last, og teste deres interne indhold RNA / protein. Anvendelse af et anti-humant CD63-specifikt antistof magnetisk mikropartikel er exosomer først udfældet fra Biofluids. Efter ekstraktion lav spænding elektriske cykliske firkantede bølger (CSW) anvendes til at forstyrre den vesikulær membran og forårsage losning gods. Indholdet af exosomet hybridiseres til DNA-primere eller antistoffer immobiliseret på en elektrode overflade til quantification molekylær indhold.
Den EFIRM fremgangsmåde er fordelagtig til ekstraktion af exosomer og losning lasten til analyse uden lysisbuffer. Denne metode er i stand til at udføre specifik påvisning af både RNA og protein biomarkør mål på exosomet. EFIRM ekstrakter exosomer specifikt baseret på deres overflademarkører i modsætning til størrelse teknikker.
Transmissionselektronmikroskopi (TEM) og assay påvise funktionaliteten af fremgangsmåden til exosom opsamling og analyse. Den EFIRM metode blev anvendt til exosomal analyse af 9 mus injiceret med human lung cancer H640 celler (en cellelinie transficeret til at udtrykke exosomet markør human CD63-GFP) for at teste deres exosome profil mod 11 mus, der modtog saltvand kontrol. Forhøjede niveauer af exosomal biomarkører (henvisning gen GAPDH og protein overflademarkør human CD63-GFP) blev fundet for H640 injicerede mus i både serum og spytprøver. Endvidere SallVA og serumprøver blev påvist at have linearitet (R = 0,79). Disse resultater er tankevækkende for levedygtighed spyt exosom biomarkører til detektering af distale sygdomme.
Introduction
Exosome forskning er en nye inden for undersøgelse, der undersøger lipid mikrovesikler der bærer RNA 1, DNA 2, og protein 3 last. Tidligere undersøgelser af exosom biologi har ført til identifikation af exosomer i Biofluids såsom blod 4, urin 5, modermælk 6, og spyt 7. Undersøgelser har vist, at exosomer spiller en rolle i forskellige cellulære veje, fjernt meditere kommunikation mellem forskellige systemer i kroppen 8. På grund af den rolle exosomer spille i intercellulære kommunikation er det en hypotese, at de kan pakke biomolekylære mål (protein, RNA og DNA) korreleret med sygdomstilstande. In vitro 3 og dyremodel 9 undersøgelser synes at bekræfte denne hypotese. Ved at undersøge exosomal indhold til biomarkør opdagelse, er det nødvendigt at udvikle en metode til selektiv exosom isolation fra Biofluids, induceret expulsipå af gods fra exosomer, og kvantificering af exosom biomolekyler. I omfanget af dette arbejde, vil exosomer defineres som en struktur, der har en diameter på ca. 70-100 nm og besidder overflade markør CD63.
Forskere typisk først rense exosomer ved ultracentrifugering 10 og så behandle exosomal indhold gennem brugen lysisbuffer kits. Anvendelse lysisbuffer metoder kræver inkubationstider i området fra minutter til timer. Denne proces kan potentielt skade exosom fragt og føre til prøve nedbrydning. For eksempel spyt exosome RNA frigivet via lysis buffer i det omgivende ekstracellulære miljø har en halveringstid på under 1 minut, hvilket gør måling af exosomal RNA post-lysepuffer en særlig vanskelig opgave uden tilsætning af stabiliserende reagenser 11. Den sammensatte virkning af tilsætning af forskellige reagenser til lysis og stabilisering kan indføre midler, der komplicerer og interfererer med anasis af exosomal indhold. En alternativ fremgangsmåde kan være nyttige for hurtigt losning exosomal indhold og sikkert bevare lasten til karakterisering.
I dette arbejde, foreslår vi brugen af en ikke-ensartet elektrisk felt for frigivelse af exosomal indhold. Elektriske felter er kendt for at bære evnen til at polarisere og forstyrre lipiddobbeltlag, der danner cellemembraner. Vores eksperimentelle arbejde udforsker brugen af uensartede cykliske firkantede bølger (CSW) for at forstyrre mikrovesikel struktur exosomer og frigivelse gennemført fragt. Denne metode anvender spændinger i flere hundrede millivolt interval, hvilket betyder, at de fleste biomolekyler ikke vil blive afbrudt. Vi viser, at brugen af en cyklisk-firkantbølge er i stand til at aktivere frigivelsen af spyt exosome mRNA indhold i det omgivende fluide miljø. Denne udgave af exosomal indhold er integreret med en elektrode, der kan bruges til at kvantificere biomarkør ekspressionsniveauer 12,13.. Den foreslåede metode giver mulighed for hurtig, følsom, og lysis buffer gratis analyse af exosome indhold.
Figur 1. Oversigt over EFIRM Workflow.. The EFIRM metode groft inddeles i tre hovedfaser, der er nødvendige til rensning og analyse exosomer.
Denne CSW baseret exosomal indhold frigivelse og analysemetode bruges sammen med CD63-specifikke magnetiske mikroperler til exosome isolation. Disse CD63-affinitetsperler mulighed for selektiv isolering af exosomer fra spyt prøver (og andre kropsvæsker). Efter inkubering og ekstraktion af exosomer under anvendelse af de magnetiserede perler, er perlerne migreret til den elektrokemiske sensor system for CSW baseret indhold frigivelse og analyse del af forsøget. Figur 1 giver en oversigt over det arbejde,flow af EFIRM metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. magnetisk perle-baserede exosome Extraction
- Pipette en godt blandet opløsning af 5 pi streptavidin-coatede magnetiske mikropartikler i 495 pi phosphatpufret saltvand (PBS) buffer i et mikrocentrifugerør at resuspendere perlerne. Vask og resuspender perlerne med 500 pi PBS tre gange under anvendelse af en magnetisk rack. Stativet er en vifte af magneter på siden af en boligenhed, der kan holde prøven mikrocentrifugerør.
- For hver vask, først lade rørene sidde på rack til 1 min, og derefter bruge en pipettespids til forsigtigt at fjerne supernatanten buffer uden at forstyrre perlerne.
- Placer rørene på regelmæssig rack uden magneter i siden. Der tilsættes 500 pi PBS i rørene, og bruge pipetten at blande opløsningen og perler sammen. Derefter sættes rørene tilbage på den magnetiske rack til igen at adskille perlerne fra opløsningen.
- Udfør denne fjernelse af buffer via magnetisering og resuspendering i PBS Ai alt tre gange. Dette udfører en indledende vask af de magnetiske partikler.
- Resuspender perlerne i 490 pi PBS-buffer, med røret anbragt på den ikke-magnetiseret del af den magnetiske rack. Pipetter 5 pi biotinyleret muse-anti-humant CD63-antistof ved 1,0 mg / ml stamopløsning koncentration i blandingen af perler. Brug pipetten at blande perler og antistof i opløsning.
- Placer mikrocentrifugerør med perle og biotinylerede antistof blanding på en prøve rotator. Indstil rotator parametre for prøven rotator for gensidig rotation ved 90 ° hældning i 5 sek og vibrerende ved 5 ° i 1 sek. Drej prøvespecifikke perleblandingen rør ved disse parametre i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern ubundet antistof efter konjugering.
- Efter 30 min rotation ved stuetemperatur placere rørene tilbage i det magnetiske stativ til 5 min.
- Udfør tre vaske af perler ved at fjerne den flydende fase ved hjælp af en mikropipette og vaskes med 500 μL PBS. Efter den tredobbelte vask resuspenderes perlerne i 490 pi af kasein-PBS og sted på umagnetiseret del af reolen.
- Exosome ekstraktion under anvendelse af antistof-overtrukne perler.
- Mærk hvert rør med målrettet prøve-ID. Pipette en 10 pi prøve af serum eller spyt i mikrocentrifugerør. Brug pipetten at blande prøven og magnetiske perler ved pipettering flere gange.
- Placer rørene med prøven og anti-humane CD63 antistof perler på rotator og rotere i 2 timer ved stuetemperatur. Brug de samme rotator parametre som beskrevet i trin 1.2.
- Efter 2 timer prøve roterende, udføre en tredobbelt vask ved magnetisering til separate perler fra opløsning, fjernelse af væskefase med mikropipette og resuspendere perlerne i 500 pi Tris-HCI-buffer. De resulterende perler er nu bundet til exosomer og er klar til det elektriske felt frigivelse og måling.
2. Electric Field induceret Udgivelsesdato ennd Måling af Exosomal indhold
- Initial Precoating elektrode med GADPH Primer
- Påfør en plastik godt til en elektrode-array for at forhindre krydskontaminering af de enkelte elektroder. Til dette forsøg anvender en 16-sensor elektrodesæt med hver enhed elektrode i arrayet består af en arbejdsgruppe, tæller, og reference elektrode fremstillet af nøgne guld.
- Forbered en bestand blanding af 100 nM DNA-probe, 0,3 M KCI og 10 mM pyrrol ved pipettering stock reagenser i et rør med ultrarent vand. Bland grundigt ved vortex.
BEMÆRK: Til denne undersøgelse DNA probe valgt svarer til GAPDH henvisning genet, der vides at eksistere i exosomer. Probesekvensen anvendes, er: 5'-Biotin-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 '. Brug denne blanding på alle elektroderne. - Pipetter 60 pi af monomer-DNA-probe blandingen på overfladen af hver guldelektrode. Undersøg elektroderne for at sikre, at der er tilstrækkelig dækning af arbejderklassen, counter, og referenceelektroder af den flydende blanding.
- Electropolymerize monomer-probe blandingen at skabe en ledende polymer lag på elektrodeoverfladen ved anvendelse en cyklisk firkantbølge (CSW) elektrisk felt profil elektrodeoverfladen. Dette elektriske felt består af anvendelsen +350 mV for 9 sek og straks skifte til 950 mV i 1 sek. Anvend denne cykliske firkantbølge profil til elektroden 10 cyklusser i alt 100 sek elektrisk felt.
- Skyl sensoroverfladen 3 gange med destilleret vand og tør med nitrogengas for at fjerne væske fra overfladen af elektroden. Sørg for, at væsken er fjernet ordentligt fra elektroden.
- Exosome Cargo Aflæsning
- Load 5 pi af 1 uM af en detektorprobe i 495 pi af perle-exosomet kompleks blanding og bruge en pipette for at blande.
BEMÆRK: detektorprobe er en DNA-primer sekvens konjugeret til et fluorescein molekylet ved 3'-enden. Detektoren probe sekvensen anvendt til denne undersøgelse svarer til GAPDH mRNA inden exosomer. Sekvensen af fluoresceinkonjugeret detektorprobe er: 5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-fluorescein-3 '. - Pipette 60 pi af proben og perle-exosome kompleks blanding på en guldelektrode overflade med et magnetsystem nedenunder. Dette magnetsystem består af seksten 2,54 mm diameter neodymmagneter linie svarer til de arbejdende elektroder i sensoren. Figur 2A illustrerer placering af magneter og perle-exosome opløsning.
- Når prøven er indlæst på elektrodeoverfladen, anvendes 20 cyklusser af CSW elektrisk felt med 9 sekunder ved -300 mV og 1 sek ved +200 mV (200 sek alt). Den exosomal last, frigives vil hybridisere til primerne på overfladen af elektroden. Hvis overflademarkører af exosomet er genstand for undersøgelsen, springe denne del af forsøget. 2B illustrerer denne proces. <li> afvaskning af ubundne analytter på elektrodeoverfladen ved tredobbelt skylning elektrodeoverfladen med destilleret vand. Tør elektrode med nitrogengas.
- Load 5 pi af 1 uM af en detektorprobe i 495 pi af perle-exosomet kompleks blanding og bruge en pipette for at blande.
- Tilsættes 60 pi 150 enheder / ml anti-fluorescein-antistof konjugeret til peberrodsperoxidase (HRP i 1: 1.000 fortynding) fortyndet i Casein / PBS.
- Brug en elektrisk-felt drevet konjugering til komplekse anti-fluorescein HRP til sonden sandwich. Påfør -200 mV i 1 sek og +500 mV i 1 sek for 5 cyklusser til elektrodeoverfladen. Figur 2A viser opsamling og detektorprobe komplekser for både protein og nukleinsyre system.
- Triple vask sensoroverfladen anvendelse af destilleret vand og tør med nitrogengas.
- Efter afvaskning af ubundet overskud anti-fluorescein-antistof, tilsættes 60 pi 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) -substrat. Læg dette substrat til hver sensor overflade ved anvendelse af en multikanal pipette.
- Udfør amperometriske udlæsning af den nuværende ved at måle elektrode strøm ved -200 mV i 60 sek ved hjælp af en elektrokemisk potentiostat stand til samtidig måling af 16 kanaler. Figur 2C er et eksempel på den aktuelle profil under udlæsning.
Figur 2. Komponenter af EFIRM metode. (A) en metode til ekstraktion af exosomer fra biovæske anvendelse af anti-humant CD63 coatede magnetiske mikropartikler og derefter aflæsning exosom fragt ved hjælp cykliske firkantede bølger anvendes til partikel-exosome komplekset. (B) Ordning af elektrode biosensor til påvisning af RNA / DNA / protein-mål fra den frigivne exosome. (C) Et repræsentativt eksempel på amperometrisk udlæsning fra EFIRM metode, hvor større aktuelle størrelsesorden svarer to højere niveauer af et biomolekyle. Dette tal er fra Wei et al. 14 Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validering af exosome Capture af perler Brug TEM
Isolering af exosomer fra spyt under anvendelse af anti-humane CD63 magnetiske perler blev valideret efter ekstraktion protokol ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM) billeder. TEM viser magnetiske perler med 70-100 nm granulat umiddelbart tilstødende (se figur 3A og 3B), i overensstemmelse med den kendte profil exosomer. Ingen 70-100 nm granuler blev observeret for de magnetiske perler i spyt, som ikke har anti-humane CD63-antistoffer konjugeret til dem tidligere (se figur 3C og 3D).
Figur 3. TEM billeder af magnetisk mikropartikel. (A) Billede af anti-humane CD63 magnetiske nanopartikler med små korn af 70-100 nm tilstødende. (B) Enlarged visning af magnetisk nanopartikel og observerede granulat. (C) Billede af magnetiske perler uden antistof konjugeret. (D) Forstørret visning af magnetiske perler med ingen antistof konjugeret. Dette tal er fra Wei et al. 14 Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Undersøgelse af Frigivelse af Exosomal indhold ved hjælp CSW Electric Field
TEM billeder af anti-humane CD63-perler viser 70-100 nm granulat støder op til magnetiske perler (se figur 3A). Efter indfangning af exosomer under anvendelse af magnetiske perler, prøverne behandles med to forskellige metoder i parallel. Den første metode var Triton-X 100 detergent at lysere exosomer og den anden metode var den cykliske firkantet bølge (CSW) elektrisk-felt lysispuffer fri metode diskuteres i dette arbejde (detaljer om Triton-X 100 metoden are beskrevet af Wei e t al. 14). Disse forarbejdede exosom-perle-komplekser blev analyseret ved TEM og en mRNA henvisning genet blev kvantificeret ved anvendelse af den elektrokemiske metode er beskrevet i dette arbejde. Henvisningen genet anvendt i denne undersøgelse var GAPDH, som er til stede i de fleste exosomer.
TEM billeder viser, at i både Triton-X 100 og CSW elektrisk felt behandlede prøver, var der en kendt mangel på exosom strukturer klæbet til de magnetiske perler, efter at både CSW og Triton-X 100 behandlingsmetoder (se figur 4B-II og figur 4B-IV). Målingen af GAPDH ekspressionsniveauer i både Triton-X 100 og CSW elektrisk felt behandlede prøver besad en lignende profil: nemlig at følge de forskellige lyserende protokoller, der var et fald i målte GAPDH niveauer som tiden skred frem, hvilket indikerer en eksponering på exosomal mRNA til extravesicular miljø spyt (se figur 4C).
<p class = "jove_content" FO: keep-together.within-side = "altid">
Figur 4. Resultater vedrørende cyklisk Square Wave exosome Cargo Release. (A) Diagram for elektrisk CSW release metode. (B) TEM billeder af exosomer: (I) Før CSW frigivelse, (ii) Efter CSW fremgangsmåde (iii) før lysisbuffer metode, (iv) Efter lysisbuffer metode. Baggrund for TEM billeder er lacey støtte. (C) Kvantificering af exosom GAPDH mRNA-niveauer, når lysepuffer og elektrisk felt CSW anvendes. Dette tal er fra Wei et al. 14 Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Undersøgelse ydeevne EFIRM til påvisning af overfladeproteiner og nærede mRNA
Evaluering af EFIRM og virksomRison til traditionelle metoder blev gennemført. EFIRM blev sammenlignet med kvantificering af protein under anvendelse af western blot (for human CD63-GFP, en overflade markør for exosomer) og qPCR til kvantificering af RNA (under anvendelse af GAPDH som et mRNA target). Fordi det menneskelige CDP63-GFP var på overfladen af exosomet blev CSW ikke anvendes til at losse exosome last. Resultaterne af protein- og RNA-test er vist i henholdsvis figur 5A og 5B.
Specificitet test blev også udført for EFIRM ved blanding af humane exosomer med exosomer fra muse prøver. Disse specificitet forsøg vedrørte forskellige forhold mellem blandinger af musen til humane prøver. Resultater af eksperimenter viser, at når mus exosomal indholdet var fem gange større end human indhold humane exosomal proteiner og mRNA kunne stadig identificeres og kvantificeres (se figur 5C og 5D for protein og RNA, henholdsvis).
Figur 5. EFIRM Performance Evaluation for mRNA og protein niveauer ved hjælp af fortyndede prøver af exosomer. (A) Sammenligning af EFIRM og western blot på GFP-delen. (B) Sammenligning af EFIRM og qPCR for GAPDH mRNA. (C) Relative påviste GFP signalniveauer for menneskelige exosomer fortyndet i forskellige mængder af mus exosome. (D) Relativ detekteret signal for GAPDH mRNA for menneskelige exosomer fortyndet i forskellige mængder af mus exosome. Dette tal er fra Wei et al. 14 Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Exosomal indhold Kvantificeret Fra Mouse Spyt
For at bestemme levedygtigheden af påvisning exosomal indhold i spyt prøver blev en nøgen musemodel anvendes. Denne nøgen musemodel modtaget en interpleural injektion af 1 x 10 6 human lungecancer celle H460 (en cellelinie, som blev transficeret også udtrykke exosomet markør human CD63-GFP) eller saltvand. Der var 11 mus, som modtog en negativ kontrol af 100 pi saltvand og 9 mus modtog cellen injektion. Efter 20 dage blev serum- og spytprøver opsamlet fra de to grupper af mus.
Anvendelse af EFIRM metode tillades kvantificering af de relative niveauer af humant CD63-GFP-protein i mus serum og spyt. En sammenligning af de relative niveauer mellem to serum og spyt af musene påvist lineær korrelation mellem de to kropsvæsker (R = 0,79). Desuden blev signifikant forskel observeret i de humane CD63-GFP-niveauer for H460 injicerede mus mod saltvand injicerede mus. Dette antyder, at exosomer fra distale tumorceller handles into vaskulaturen og spyt. Resultaterne, der sammenligner serum og spyt er vist i figur 6.
Figur 6. EFIRM evaluering af de relative niveauer af humant CD63-GFP i serum og spyt. Sammenligning undersøgelser mellem de relative niveauer af human CDP63-GFP fra mus injiceret med humane lungecancerceller. Linearitet eksisterer mellem serum og spytprøver til human CD63-GFP. Niveauer af humant CD63-GFP er forhøjet i mus injiceret med celler (sammenlignet med saltvand injicerede mus). Dette tal er fra Wei et al. 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som resultaterne indikerer, anti-human CD63 coatede magnetiske nanopartikler er i stand til specifikt at fange små partikler, der har en størrelse i intervallet fra 70 til 100 nm. Dette fanget partikel er i overensstemmelse med den tidligere observerede profil exosomer. Desuden er brugen af lav spænding CSW efter indfangning af partiklerne vist at fjerne dem fra perleoverfladen og forårsage DNA-nedbrydning profiler svarende til en traditionel metode lysepuffer til fragt frigivelse. Disse data tyder på, at arbejdsgangen i exosomal fragt frigivelse kan forenkles gennem anvendelse af en cyklisk firkantet bølge for forstyrrelse af exosome lipidmembranen. Denne forenklede fremgangsmåde tillader hurtig ladning frigivelse uden behov for lysering buffere, som kan påvirke exosome lasten, og som et resultat EFIRM metode synes at være en foretrukken fremgangsmåde til exosomal indhold undersøgelser sammenlignet med de traditionelle metoder til ultracentrifugering og brug af lysisbuffere. Følsomhed, specificitet, og brugervenlighed af EFIRM metode gør det ideelt til at udvinde exosomer fra en biovæske og hurtigt teste interne indhold for både nukleinsyrer og protein-targets.
Den EFIRM metode blev anvendt til studiet af en nøgen mus-model, der var injiceret med H460 human lungecancer celle. H460 humane lungecancerceller blev yderligere transficeret med humant CD63-GFP, således at exosome overflademarkører CD63 ville have en fluorescerende egenskab. Efter en periode på 20 dage blev museserum og spytprøver opsamlet, og EFIRM metode blev anvendt til at analysere deres indhold exosomal. Denne undersøgelse viste lineære korrelationer mellem de serum- og spytprøver (R = 0,79). Konsekvenserne af disse resultater er dobbelt: For det første evnen til at fange exosomer fra Biofluids tyder på, at distale kræftceller er i stand til at overføre exosomer til andre dele af kroppen, især i denne undersøgelse mundhulen. Second, linearitet observeret mellem serum og spytprøver tyder på, at spyt kan være en troværdig biovæske til fangst af exosomer, der produceres i en syg tilstand af kroppen (dvs. kræft) og analyse af deres molekylære indhold.
Metoden beskrevet og de efterfølgende resultater viser, at metoden er egnet til at udvinde exosomer fra Biofluids baseret på deres overflademarkører (i omfanget af dette arbejde, CD 63 er overfladen valgte markør). For fremtidige projekter, er det af fortjeneste at undersøge, om målretning yderligere overflademarkører exosomer (såsom CD 9) eller kombinere EFIRM metoden med andre teknikker vil forbedre udvinding og afprøvning af exosome indhold.
Exosome biologi er et lovende område af undersøgelsen for translationel medicin, og følgende undersøgelsens data tyder på, at spyt exosomal analyse kan være et mødested for at identificere sygdoms diskriminerende biomarkører. Fremtidig undersøgelsesynes hensigtsmæssigt for, om distale sygdomstilstande biomarkører kan bruges til ikke-invasiv diagnostik. EFIRM som metode kan være med til at bane vejen for en mere effektiv analyse af sådanne mål inden exosomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
David Wong er medstifter af RNAmeTRIX Inc., en molekylær diagnostisk selskab. PeriRx LLC underlicens intellektuelle egenskaber vedrørende molekylær diagnostik fra RNAmeTRIX. David Wong er en konsulent til PeriRx.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Center for Research Resources og National Center for Fremme Translationelle Sciences, National Institutes of Health, gennem Grant UL1TR000124 (til FW); Felix & Mildred Yip Begavet professorat og Barnes Family Fund (til DTWW), National Institute of Dental & Craniofacial Research af National Institutes of Health under Award Number T90DE022734 (MT). Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
| 16x Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
| Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
| Neodynium Magnetics (1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
| Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
| Mettler Toldeo 3 M KCl Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
| Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
| 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
| Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
| Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |
References
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer. Clinical Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
- Lau, C. S., Wong, D. T. W. Breast Cancer Exosome-like Microvesicles and Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-Derived Exosome-like Microvesicles In. Vitro. PLoS ONE. 7 (3), e33037 (2012).
- Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatolog. 56 (5), 1946-1957 (2012).
- Dear, J. W., Street, J. M., Bailey, M. A. Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling. Proteomics. 13 (10-11), 1572-1580 (2013).
- Lässer, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9 (1), 9 (2011).
- Palanisamy, V., et al. Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes. PLoS ONE. 5 (1), e8577 (2010).
- Camussi, G., et al. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lau, C., et al. Role of pancreatic cancer-derived exosomes in salivary biomarker development. The Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26888-26897 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids. Current Protocols in Cell Biology. 3 (22), (2001).
- Park, N. J., Li, Y., Yu, T., Brinkman, B. M. N., Wong, D. T. Characterization of RNA in Saliva. Clinical Chemistry. 52 (6), 988-994 (2006).
- Wei, F., et al. Bio/Abiotic Interface Constructed from Nanoscale DNA Dendrimer and Conducting Polymer for Ultrasensitive Biomolecular Diagnosis. Small. 5 (15), 1784-1790 (2009).
- Wei, F., et al. Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection. Clinical Cancer Research. 15 (13), 4446-4452 (2009).
- Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM). Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).
