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Bioengineering

इलेक्ट्रिक फील्ड प्रेरित रिलीज और मापन (EFIRM) द्वारा Exosomal biomarker की जांच

Published: January 23, 2015 doi: 10.3791/52439
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1School of Dentistry, University of California, Los Angeles, 2School of Medicine, Clinical Nutrition, University of California, Los Angeles

Abstract

Exosomes कहनेवाला संचार में एक mediating भूमिका निभाते हैं कि microvesicular संरचनाओं हैं। यह वे रोग भेदभावपूर्ण बायोमार्कर ले जाने के लिए तय अगर exosomes की आंतरिक कार्गो अध्ययन करने के लिए ब्याज की है। Exosomal विश्लेषण प्रदर्शन के लिए, यह निकालने और आंतरिक सामग्री को नुकसान पहुँचाए बिना लक्ष्य biofluids से exosomes का विश्लेषण करने के लिए एक विधि विकसित करने के लिए आवश्यक है।

बिजली के क्षेत्र प्रेरित जारी है और माप (EFIRM) विशेष रूप से, biofluids से exosomes निकालने उनके माल उतारने, और उनके आंतरिक आरएनए / प्रोटीन सामग्री के परीक्षण के लिए एक विधि है। एक विरोधी मानव CD63 विशिष्ट एंटीबॉडी चुंबकीय microparticle का प्रयोग, exosomes पहले biofluids से उपजी हैं। निम्नलिखित निकासी, कम वोल्टेज बिजली के चक्रीय वर्ग तरंगों (CSW) vesicular झिल्ली को बाधित और माल उतराई पैदा करने के लिए लागू कर रहे हैं। exosome की सामग्री योग्यता के लिए एक इलेक्ट्रोड सतह पर स्थिर डीएनए प्राइमरों या एंटीबॉडी संकरित हैआणविक सामग्री के ntification।

EFIRM विधि lysis बफर के बिना विश्लेषण के लिए exosomes की निकासी और उतराई कार्गो के लिए लाभदायक है। इस विधि exosome में दोनों शाही सेना और प्रोटीन बायोमार्कर लक्ष्यों की विशिष्ट पहचान प्रदर्शन करने में सक्षम है। आकार-आधारित तकनीकों के लिए विरोध के रूप में EFIRM विशेष रूप से उनकी सतह मार्करों के आधार पर exosomes निकालता है।

संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) और परख exosome को पकड़ने और विश्लेषण के लिए विधि की कार्यक्षमता प्रदर्शित करता है। EFIRM विधि मानव फेफड़ों के कैंसर H640 कोशिकाओं के इंजेक्शन के साथ 9 चूहों का विश्लेषण खारा नियंत्रण प्राप्त करने के 11 चूहों के खिलाफ उनके exosome प्रोफ़ाइल का परीक्षण करने के क्रम में (exosome मार्कर मानव CD63-GFP व्यक्त करने के लिए ट्रांसफ़ेक्ट एक सेल लाइन) exosomal करने के लिए लागू किया गया था। Exosomal बायोमार्कर का ऊंचा स्तर (संदर्भ जीन GAPDH और प्रोटीन सतह मार्कर मानव CD63 GFP) H640 दोनों सीरम और लार के नमूनों में चूहों इंजेक्शन के लिए पाए गए। इसके अलावा, सालीवीए और सीरम नमूनों रैखिकता (आर = 0.79) के लिए प्रदर्शन किया गया। इन परिणामों से बाहर रोगों का पता लगाने के लिए लार exosome बायोमार्कर की व्यवहार्यता के लिए विचारोत्तेजक हैं।

Introduction

Exosome अनुसंधान शाही सेना 1, डीएनए 2, और प्रोटीन तीन माल ले कि लिपिड microvesicles परख होती है कि जांच का एक उभरता हुआ क्षेत्र है। Exosome जीव विज्ञान का पिछला जांच जैसे रक्त 4, मूत्र 5, मां के दूध 6, और लार के रूप में 7 biofluids में exosomes की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया है। अध्ययन दूर से शरीर 8 की विभिन्न प्रणालियों के बीच संचार ध्यान, exosomes अलग सेलुलर रास्ते में एक भूमिका निभा कि प्रदर्शन किया है। भूमिका का exosomes कहनेवाला संचार में खेलने की वजह से, यह है कि वे रोग राज्यों के साथ सहसंबद्ध बायोमोलिक्यूल लक्ष्य (प्रोटीन, आरएनए, और डीएनए) पैकेज हो सकता है कि धारणा है। इन विट्रो 3 और पशु मॉडल 9 अध्ययनों से इस परिकल्पना की पुष्टि करने के लिए दिखाई देते हैं। बायोमार्कर की खोज के लिए exosomal सामग्री की जांच में, यह biofluids से चयनात्मक exosome अलगाव के लिए एक पद्धति को विकसित करने के लिए आवश्यक है, प्रेरित expulsiexosomes से कार्गो, और exosome biomolecules के गुणात्मक रूप से पर। इस काम की हद में, exosomes एक संरचना लगभग 70-100 एनएम के एक व्यास होने और सतह मार्कर CD63 रखने के रूप में परिभाषित किया जाएगा।

शोधकर्ताओं आम तौर पर पहले ultracentrifugation 10 से exosomes शुद्ध और फिर lysis बफर किट के उपयोग के माध्यम से exosomal सामग्री की प्रक्रिया। Lysis बफर विधि के प्रयोग मिनट से घंटे से लेकर ऊष्मायन बार की आवश्यकता है। इस प्रक्रिया को संभावित exosome कार्गो नुकसान और गिरावट नमूना करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, आसपास के बाह्य वातावरण में lysis बफर के माध्यम से जारी की लार exosome शाही सेना exosomal आरएनए के बाद सेल का माप स्थिरीकरण अभिकर्मकों 11 के अलावा बिना एक विशेष रूप से कठिन कार्य बफर बनाने, एक मिनट के तहत की एक आधा जीवन पास। सेल और स्थिरीकरण के लिए विभिन्न अभिकर्मकों जोड़ने के जटिल प्रभाव उलझा कि एजेंट को शुरू करने और analy साथ हस्तक्षेप कर सकते हैंexosomal सामग्री की बहन। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण तेजी exosomal सामग्री उतारने और सुरक्षित रूप से लक्षण वर्णन के लिए कार्गो के संरक्षण के लिए उपयोगी हो सकता है।

इस काम में, हम exosomal सामग्री की रिहाई के लिए एक गैर वर्दी बिजली के क्षेत्र के उपयोग का प्रस्ताव है। इलेक्ट्रिक क्षेत्रों फूट डालना और कोशिका झिल्ली कि रूपों लिपिड bilayer को बाधित करने की क्षमता ले जाने के लिए जाने जाते हैं। हमारे प्रयोगात्मक कार्य exosomes की microvesicle संरचना में खलल न डालें और किए कार्गो रिहा करने के लिए गैर वर्दी चक्रीय वर्ग तरंगों (CSW) के उपयोग की पड़ताल। इस विधि सबसे जैवअणुओं बाधित नहीं किया जाएगा जिसका अर्थ है कि कई सौ millivolt रेंज में voltages के उपयोग करता है। हम एक चक्रीय-वर्ग की लहर के उपयोग के आसपास के fluidic वातावरण में लार exosome mRNA के सामग्री की रिहाई उकसाना करने में सक्षम है कि प्रदर्शित करता है। Exosomal सामग्री की इस रिलीज को मूल बायोमार्कर अभिव्यक्ति के स्तर यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक इलेक्ट्रोड प्रणाली के साथ एकीकृत है 12,13। इस प्रस्तावित विधि exosome सामग्री का तेजी से, संवेदनशील, और lysis बफर मुक्त विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।

चित्रा 1
EFIRM कार्यप्रवाह के 1. अवलोकन चित्रा।। EFIRM विधि मोटे तौर पर सफ़ाई और विश्लेषण exosomes के लिए जरूरी हैं कि तीन प्रमुख चरणों में बांटा गया है।

इस CSW आधारित exosomal सामग्री रिहाई और विश्लेषण विधि exosome अलगाव के लिए CD63-विशिष्ट चुंबकीय microbeads के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है। ये CD63-आत्मीयता मोती लार के नमूने (और अन्य biofluids) से exosomes के चुनिंदा अलगाव के लिए अनुमति देते हैं। ऊष्मायन और चुम्बकीय मोती का उपयोग exosomes की निकासी के बाद, मोती 1 चित्रा। सामग्री जारी है और प्रयोग के विश्लेषण के भाग के आधार CSW के लिए विद्युत सेंसर प्रणाली के लिए चले गए काम के एक सिंहावलोकन देता रहे हैंEFIRM विधि का प्रवाह।

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Protocol

1. चुंबकीय मनका-आधारित Exosome निकालना

  1. मोती resuspend करने के लिए एक microcentrifuge ट्यूब में फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) बफर के 495 μl में Streptavidin-कोटेड चुंबकीय microparticles के 5 μl की एक अच्छी तरह से मिश्रित समाधान पिपेट। एक चुंबकीय रैक का उपयोग करते हुए तीन बार धोएं और पीबीएस के 500 μl के साथ मोती resuspend। रैक नमूना microcentrifuge ट्यूब पकड़ कर सकते हैं कि एक आवास इकाई की तरफ मैग्नेट की एक सरणी है।
    1. प्रत्येक धोने के लिए, पहली ट्यूबों 1 मिनट के लिए रैक पर बैठते हैं, और फिर ध्यान से मोती परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला बफर दूर करने के लिए एक विंदुक टिप का उपयोग करते हैं।
    2. पक्ष में मैग्नेट के बिना एक नियमित रूप से रैक पर ट्यूबों रखें। ट्यूबों में पीबीएस के 500 μl जोड़ें, और एक साथ समाधान और मोती मिश्रण करने के लिए पिपेट का उपयोग करें। तो फिर समाधान से मोती अलग करने के लिए चुंबकीय रैक पर वापस ट्यूब डाल दिया।
    3. पीबीएस एक में आकर्षण संस्कार और मेजबान के माध्यम से बफर के इस हटाने प्रदर्शनतीन बार का कुल। यह चुंबकीय कणों की एक शुरुआती धोने करता है।
  2. चुंबकीय रैक के गैर-चुम्बकीय हिस्से पर रखा ट्यूब के साथ, पीबीएस बफर के 490 μl में मोती Resuspend। Pipet मोतियों की मिश्रण में 1.0 मिलीग्राम / एमएल शेयर एकाग्रता में biotinylated माउस मानव विरोधी CD63 एंटीबॉडी के 5 μl। समाधान में माला और एंटीबॉडी मिश्रण करने के लिए पिपेट का प्रयोग करें।
  3. एक नमूना रोटेटर पर मनका और biotinylated एंटीबॉडी मिश्रण के साथ microcentrifuge ट्यूब रखें। 90 ° 5 सेकंड के लिए झुकने और एक सेकंड के लिए 5 डिग्री पर हिल पर पारस्परिक रोटेशन के लिए नमूना रोटेटर के लिए रोटेटर मापदंडों सेट करें। आरटी पर 30 मिनट के लिए इन मापदंडों पर नमूना मनका मिश्रण ट्यूब घुमाएँ।
  4. संयुग्मन के बाद अनबाउंड एंटीबॉडी निकालें।
    1. आरटी पर रोटेशन के 30 मिनट के बाद, 5 मिनट के लिए वापस चुंबकीय रैक में ट्यूबों की जगह।
    2. एक micropipette का उपयोग तरल चरण को हटाने के द्वारा मोतियों की तीन washes के प्रदर्शन और 500 μ से धो लें; पीबीएस के एल। ट्रिपल धोने के बाद, रैक के unmagnetized हिस्से पर 490 कैसिइन-पीबीएस के μl और जगह में मोती resuspend।
  5. एंटीबॉडी लिपटे मोतियों का उपयोग कर Exosome निष्कर्षण।
    1. लक्षित नमूना आईडी के साथ प्रत्येक ट्यूब लेबल। Microcentrifuge ट्यूब में सीरम या लार की एक 10 μl नमूना पिपेट। कई बार pipetting द्वारा नमूना और चुंबकीय मोती मिश्रण करने के लिए पिपेट का प्रयोग करें।
    2. रोटेटर पर नमूना और मानव विरोधी CD63 एंटीबॉडी मोतियों के साथ ट्यूब प्लेस और आरटी पर 2 घंटे के लिए बारी बारी से। 1.2 चरण में वर्णित के रूप में एक ही रोटेटर मापदंडों का उपयोग करें।
    3. घूर्णन नमूना के 2 घंटे के बाद, समाधान से अलग मोती magnetizing micropipette के साथ तरल चरण को हटाने, और Tris-एचसीएल बफर के 500 μl में मोतियों resuspending द्वारा एक ट्रिपल धोने प्रदर्शन करते हैं। परिणामी मोती अब exosomes करने के लिए बाध्य है और बिजली के क्षेत्र रिहाई और माप के लिए तैयार हैं।

2. बिजली क्षेत्र प्रेरित जारीएन डी Exosomal सामग्री के मापन

  1. GADPH प्राइमर के साथ इलेक्ट्रोड की प्रारंभिक Precoating
    1. एक प्लास्टिक की अच्छी तरह से करने के लिए व्यक्तिगत इलेक्ट्रोड के पार संदूषण को रोकने के लिए एक इलेक्ट्रोड सरणी लागू करें। इस प्रयोग के लिए, नंगे सोने से बना एक काम कर, काउंटर, और संदर्भ इलेक्ट्रोड से मिलकर सरणी में प्रत्येक इकाई इलेक्ट्रोड के साथ एक 16-सेंसर इलेक्ट्रोड सरणी का उपयोग करें।
    2. Ultrapure आसुत जल के साथ एक ट्यूब में शेयर अभिकर्मकों pipetting द्वारा 100 एनएम डीएनए जांच, 0.3 एम KCl, और 10 मिमी pyrrole के एक शेयर के मिश्रण तैयार करें। Vortexing द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: इस अध्ययन के लिए, चयनित डीएनए जांच exosomes भीतर मौजूद करने के लिए जाना जाता है, जो GAPDH संदर्भ जीन, से मेल खाती है। प्रयोग किया जाता जांच अनुक्रम है: 'बायोटिन-AGGTCCACCACTGACACGTTG-तीन 5'। सभी इलेक्ट्रोड पर इस मिश्रण का प्रयोग करें।
    3. Pipet प्रत्येक सोने इलेक्ट्रोड की सतह पर मोनोमर-डीएनए जांच के मिश्रण के 60 μl। काम, सी की पर्याप्त कवरेज नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए इलेक्ट्रोड की जांचतरल मिश्रण द्वारा ounter, और संदर्भ इलेक्ट्रोड।
    4. Electropolymerize मोनोमर जांच मिश्रण इलेक्ट्रोड सतह के लिए एक चक्रीय वर्ग तरंग (CSW) बिजली के क्षेत्र प्रोफ़ाइल लगाने से इलेक्ट्रोड सतह पर एक आयोजन बहुलक परत बनाने के लिए। इस बिजली के क्षेत्र में 9 सेकंड के लिए 350 एम वी लागू करने और तुरंत एक सेकंड के लिए 950 एम वी के लिए स्विचन के होते हैं। आवेदन बिजली क्षेत्र के लिए 100 सेकंड की कुल के लिए, 10 चक्र के लिए इलेक्ट्रोड के लिए इस चक्रीय वर्ग तरंग प्रोफाइल को लागू करें।
    5. इलेक्ट्रोड की सतह से तरल दूर करने के लिए सेंसर सतह आसुत जल और नाइट्रोजन गैस के साथ सूखे के साथ तीन बार कुल्ला। कि तरल ठीक से इलेक्ट्रोड से निकाल दिया जाता है सुनिश्चित करें।
  2. Exosome माल उतारने
    1. लोड 5 मनका-exosome जटिल मिश्रण के 495 μl में एक डिटेक्टर जांच के 1 माइक्रोन के μl और मिश्रण करने के लिए एक विंदुक का उपयोग करें।
      नोट: डिटेक्टर जांच 3 'अंत में एक fluorescein अणु संयुग्मित एक डीएनए प्राइमर अनुक्रम है। डिटेक्टर समस्याइस अध्ययन के लिए उपयोग किए गए ई अनुक्रम exosomes के भीतर पाया GAPDH mRNA के लिए मेल खाती है। fluorescein संयुग्मित डिटेक्टर जांच के अनुक्रम है: 5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-Fluorescein-3 '।
    2. पिपेट के नीचे एक चुंबक सरणी के साथ एक सोने की इलेक्ट्रोड सतह पर जांच और मनका-exosome जटिल मिश्रण के 60 μl। यह चुंबक सरणी सेंसर का काम कर इलेक्ट्रोड के अनुरूप करने के लिए गठबंधन सोलह 2.54 मिमी व्यास neodymium मैग्नेट के होते हैं। 2A चित्रा मैग्नेट और मनका-exosome समाधान की नियुक्ति को दिखाता है।
    3. नमूना इलेक्ट्रोड सतह पर लोड है, एक बार -300 एम वी पर 9 सेकंड और 200 एम वी (200 सेकंड कुल) में एक सेकंड के साथ CSW बिजली क्षेत्र के 20 चक्र लागू होते हैं। जारी की है कि exosomal कार्गो इलेक्ट्रोड की सतह पर प्राइमरों के लिए संकरण जाएगा। Exosome की सतह मार्कर जांच का विषय हैं,। प्रयोग के इस भाग को छोड़ 2B इस प्रक्रिया को दिखाता है चित्रा।
      4. <ली> धो बंद ट्रिपल आसुत जल के साथ इलेक्ट्रोड सतह rinsing द्वारा इलेक्ट्रोड सतह पर अपार analytes। नाइट्रोजन गैस के साथ इलेक्ट्रोड सूखी।
  3. रिपोर्टर एंटीबॉडी और readout
    1. (: 1,000 कमजोर पड़ने 1 में एचआरपी) कैसिइन / पीबीएस में पतला हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित 150 यूनिट / मिलीलीटर विरोधी fluorescein एंटीबॉडी के 60 μl जोड़ें।
    2. जांच सैंडविच करने के लिए जटिल विरोधी fluorescein एचआरपी करने के लिए एक बिजली के क्षेत्र प्रेरित विकार का प्रयोग करें। 1 सेकंड और इलेक्ट्रोड सतह के लिए 5 चक्रों के लिए एक सेकंड के लिए 500 एम वी के लिए -200 एम वी लागू करें। 2A चित्रा एक प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड प्रणाली के लिए दोनों को पकड़ने और डिटेक्टर जांच परिसरों से पता चलता है।
    3. आसुत जल और नाइट्रोजन गैस के साथ सूखी का उपयोग कर ट्रिपल धोने सेंसर सतह।
    4. अनबाउंड अतिरिक्त विरोधी fluorescein एंटीबॉडी के धोने बंद के बाद, 3,3, '5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) सब्सट्रेट के 60 μl जोड़ें। एक मल्टीचैनल pipet का उपयोग प्रत्येक संवेदक सतह पर इस सब्सट्रेट लोड करें।
    5. । 16 चैनलों के एक साथ माप में सक्षम एक विद्युत potentiostat का उपयोग कर 60 सेकंड के लिए -200 एम वी पर इलेक्ट्रोड वर्तमान को मापने के द्वारा चालू की Amperometric readout के प्रदर्शन करना -2 सी readout के दौरान मौजूदा प्रोफाइल का एक उदाहरण है चित्रा।

चित्रा 2

EFIRM विधि चित्रा 2. अवयव। (ए) मानव विरोधी CD63 लेपित चुंबकीय microparticles का उपयोग कर जैविक तरल से exosomes निकालने और फिर कण-exosome जटिल करने के लिए लागू चक्रीय वर्ग तरंगों का उपयोग exosome माल उतारने की विधि। जारी की exosome से शाही सेना / डीएनए / प्रोटीन लक्ष्य का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया इलेक्ट्रोड biosensor (बी) योजना। बड़ा वर्तमान परिमाण टी मेल खाती है, जहां (सी) EFIRM कार्यप्रणाली से Amperometric readout के प्रतिनिधि उदाहरणएक बायोमोलिक्यूल के उच्च स्तर ओ। यह आंकड़ा वी एट अल से है। 14 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

मंदिर का प्रयोग मोतियों की Exosome कैद की मान्यता

मानव विरोधी CD63 चुंबकीय मोती का उपयोग कर लार से exosomes के अलगाव संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) छवियों का उपयोग करके निकासी प्रोटोकॉल के बाद मान्य किया गया था। मंदिर exosomes के ज्ञात प्रोफाइल के साथ संगत तुरंत आसन्न (चित्रा 3A देखते हैं, और 3 बी) 70-100 एनएम कणिकाओं, साथ चुंबकीय मोतियों से पता चलता है। कोई 70-100 एनएम कणिकाओं पहले उन्हें संयुग्मित मानव विरोधी CD63 एंटीबॉडी है (चित्रा -3 सी और 3 डी देखें) नहीं था कि लार में चुंबकीय मोतियों के लिए मनाया गया।

चित्रा 3
चित्रा चुंबकीय microparticle 3. मंदिर छवियों। 70-100 एनएम आसन्न के छोटे granules के साथ मानव विरोधी CD63 चुंबकीय नैनोकणों के (ए) छवि। (बी) Enlaचुंबकीय nanoparticle है और मनाया कणिकाओं के rged देखें। संयुग्मित कोई एंटीबॉडी के साथ चुंबकीय मोतियों की (सी) छवि। (डी) संयुग्मित कोई एंटीबॉडी के साथ चुंबकीय मोतियों की बढ़ाया देखें। यह आंकड़ा वी एट अल से है। 14 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

CSW इलेक्ट्रिक क्षेत्र का उपयोग कर Exosomal सामग्री की रिहाई के अध्ययन

मानव विरोधी CD63 मोतियों के मंदिर छवियों चुंबकीय मोती (चित्रा 3A देखें) से सटे 70-100 एनएम कणिकाओं दिखा। चुंबकीय मोती का उपयोग exosomes के कब्जे के बाद, नमूने समानांतर में दो अलग अलग तरीकों के साथ कार्रवाई कर रहे हैं। इस्तेमाल पहली विधि ट्राइटन एक्स exosomes lyse करने के लिए 100 डिटर्जेंट था और दूसरी विधि इस काम में चर्चा की चक्रीय वर्ग तरंग (CSW) बिजली के क्षेत्र lysis बफर मुक्त विधि थी ट्राइटन-x 100 विधि की गिरफ्तारी के (विवरणवी ई टी अल। 14 से वर्णित ई)। ये प्रसंस्कृत exosome मनका परिसरों मंदिर द्वारा विश्लेषण किया गया और एक mRNA के संदर्भ जीन इस काम में वर्णित विद्युत विधि का उपयोग मात्रा गया था। इस अध्ययन में इस्तेमाल संदर्भ जीन सबसे exosomes में मौजूद है जो GAPDH था।

मंदिर छवियों दोनों ट्राइटन एक्स 100 और CSW बिजली के क्षेत्र इलाज के नमूने में, CSW और ट्राइटन-x 100 उपचार विधियों (दोनों को देखने 4B चित्रा-द्वितीय और बाद चुंबकीय मोतियों का पालन exosome संरचनाओं के एक प्रख्यात अभाव था कि वहाँ दिखाने 4B चित्रा-IV)। दोनों ट्राइटन एक्स 100 और CSW बिजली के क्षेत्र इलाज के नमूने में GAPDH अभिव्यक्ति के स्तर की माप के लिए एक समान प्रोफाइल के पास: अलग lysing प्रोटोकॉल का पालन, मापा GAPDH स्तर में कमी नहीं थी अर्थात् उस समय के रूप में प्रगति, exosomal के एक जोखिम का संकेत लार की extravesicular पर्यावरण के लिए mRNA के (चित्रा 4C देखें)।

<रख-together.within पृष्ठ = "हमेशा">: के लिए पी वर्ग = "jove_content" चित्रा 4
चित्रा बिजली CSW रिहाई विधि के चक्रीय स्क्वायर वेव Exosome कार्गो रिलीज। (ए) आरेख से संबंधित 4. परिणाम। (बी) exosomes के मंदिर छवियों: CSW रिलीज से पहले (मैं), (द्वितीय) CSW विधि के बाद, (iii) के lysis बफर विधि से पहले, (चतुर्थ) lysis बफर विधि के बाद। मंदिर छवियों की पृष्ठभूमि लेसी समर्थन है। (सी) exosome GAPDH mRNA स्तर की मात्रा का ठहराव lysis बफर और बिजली के क्षेत्र CSW लागू किया जाता है जब। यह आंकड़ा वी एट अल से है। 14 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सतह प्रोटीन का पता लगाने और harbored mRNA के लिए EFIRM के प्रदर्शन की जांच

EFIRM और कंपनियों का मूल्यांकनपारंपरिक तरीकों को Rison आयोजित किया गया। EFIRM (एक mRNA लक्ष्य के रूप में GAPDH का उपयोग) आरएनए की मात्रा का ठहराव के लिए और qPCR (मानव CD63 GFP, exosomes के लिए एक सतह मार्कर के लिए) पश्चिमी धब्बा का उपयोग कर प्रोटीन की मात्रा का ठहराव की तुलना में था। मानव CDP63-GFP के exosome की सतह पर था, क्योंकि CSW exosome कार्गो अनलोड करने के लिए लागू नहीं किया गया था। प्रोटीन और आरएनए परीक्षणों के परिणामों क्रमशः चित्रा 5A और 5B में दिखाया जाता है।

विशिष्टता परीक्षण भी माउस के नमूनों से exosomes के साथ मानव exosomes मिश्रण से EFIRM के लिए आयोजित की गई। ये विशिष्टता परीक्षण मानव नमूनों के लिए माउस के विभिन्न अनुपात मिश्रण शामिल किया गया। प्रयोग के परिणाम माउस exosomal सामग्री पाँच मानव सामग्री की तुलना में अधिक बार, मानव exosomal प्रोटीन था और mRNA अभी भी पहचान की है और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है जब (क्रमशः, प्रोटीन और आरएनए के लिए चित्रा 5C और 5D देखें) कि प्रदर्शित करता है।


Exosomes का पतला नमूने का उपयोग mRNA और प्रोटीन के स्तर के लिए 5 चित्रा EFIRM निष्पादन मूल्यांकन। GFP के आधा भाग पर EFIRM और पश्चिमी धब्बा (ए) तुलना। GAPDH mRNA के लिए EFIRM और qPCR (बी) तुलना। (सी) माउस exosome के विभिन्न मात्रा में पतला मानव exosomes के लिए सापेक्ष पता चला GFP संकेत स्तरों। (डी) माउस exosome के विभिन्न मात्रा में पतला मानव exosomes के लिए GAPDH mRNA के लिए सापेक्ष पता लगाया संकेत। यह आंकड़ा वी एट अल से है। 14 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

माउस लार से मात्रा निर्धारित Exosomal सामग्री

पता लगाने EXO की व्यवहार्यता का निर्धारण करने के क्रम मेंलार के नमूनों में somal सामग्री, एक नग्न माउस मॉडल का इस्तेमाल किया गया था। इस नग्न माउस मॉडल 1 एक्स 10 6 मानव फेफड़ों के कैंसर सेल H460 या खारा (भी exosome मार्कर मानव CD63-GFP व्यक्त करने के लिए ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, जो एक सेल लाइन) के एक interpleural इंजेक्शन प्राप्त किया। खारा के 100 μl की एक नकारात्मक नियंत्रण प्राप्त किया, और 9 चूहों सेल इंजेक्शन प्राप्त किया है कि 11 चूहों थे। 20 दिनों के बाद, सीरम और लार के नमूने चूहों के दो समूहों से एकत्र किए गए थे।

चूहों सीरम और लार में मानव CD63-GFP प्रोटीन के रिश्तेदार स्तरों के EFIRM विधि की अनुमति मात्रा का ठहराव का उपयोग। चूहों के दो सीरम और लार के बीच सापेक्ष स्तरों की तुलना से दो biofluids (आर = 0.79) के बीच रैखिक संबंध का प्रदर्शन किया। H460 खारा इंजेक्शन चूहों के खिलाफ चूहों इंजेक्शन के लिए इसके अतिरिक्त, महत्वपूर्ण अंतर मानव CD63-GFP के स्तर में मनाया गया। यह बाहर का ट्यूमर कोशिकाओं से exosomes पूर्णांक तस्करी कर रहे हैं कि पता चलता हैvasculature और लार ओ। सीरम और लार की तुलना परिणाम चित्रा 6 में दिखाया जाता है।

चित्रा 6
सीरम और लार में मानव CD63-GFP के सापेक्ष स्तरों के 6 चित्रा EFIRM मूल्यांकन। मानव फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं को इंजेक्शन के साथ चूहों से मानव CDP63-GFP के सापेक्ष स्तरों के बीच तुलना अध्ययन करता है। Linearity मानव CD63-GFP के लिए सीरम और लार के नमूनों के बीच मौजूद है। मानव CD63-GFP के स्तर कोशिकाओं को इंजेक्शन के साथ चूहों में बुलंद कर रहे हैं (खारा इंजेक्शन चूहों की तुलना में)। यह आंकड़ा वी एट अल से है। 14

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Discussion

परिणामों से संकेत मिलता है के रूप में, मानव विरोधी CD63 लेपित चुंबकीय नैनोकणों विशेष रूप से 70-100 एनएम से लेकर एक आकार है कि छोटे कणों पर कब्जा करने में सक्षम हैं। इस पर कब्जा कर लिया कण exosomes के पहले मनाया प्रोफाइल के साथ संगत है। इसके अलावा, कणों के कब्जे के बाद कम वोल्टेज CSW के उपयोग मनका सतह से उन्हें हटाने और माल रिहाई के लिए एक पारंपरिक lysis बफर आधारित पद्धति के समान डीएनए गिरावट प्रोफाइल को पैदा करने के लिए दिखाया गया है। इस डेटा exosomal कार्गो रिहाई के कार्यप्रवाह exosome लिपिड झिल्ली के विघटन के लिए एक चक्रीय वर्ग की लहर के आवेदन के माध्यम से सरल किया जा सकता है कि इंगित करता है। इस सरल विधि प्रतिकूल exosome कार्गो को प्रभावित कर सकता है कि बफ़र्स lysing बिना जरूरत के लिए तेजी से कार्गो रिहाई के लिए अनुमति देता है, और एक परिणाम के रूप में EFIRM विधि ultracentrifugation और सेल के उपयोग के पारंपरिक तरीकों की तुलना में exosomal सामग्री के अध्ययन के लिए एक बेहतर तरीका प्रतीत होता हैबफ़र्स। EFIRM विधि की संवेदनशीलता, विशिष्टता, और आसानी न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन लक्ष्य के लिए दोनों आंतरिक सामग्री की जांच तेजी से एक जैविक तरल से exosomes निकालने और के लिए आदर्श बनाता है।

EFIRM कार्यप्रणाली H460 मानव फेफड़ों के कैंसर सेल इंजेक्शन के साथ किया गया था कि एक नग्न माउस मॉडल का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया था। Exosome सतह मार्कर CD63 एक फ्लोरोसेंट संपत्ति होता है कि इतनी H460 मानव फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं को अतिरिक्त मानव CD63-GFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। 20 दिन की अवधि के बाद, माउस सीरम और लार के नमूने एकत्र किए गए थे, और EFIRM कार्यप्रणाली उनके exosomal सामग्री का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस अध्ययन सीरम और लार के नमूने (आर = 0.79) के बीच रेखीय सहसंबंध का प्रदर्शन किया। इन परिणामों के निहितार्थ दुगना कर रहे हैं: पहला, biofluids से exosomes कब्जा करने की क्षमता बाहर का कैंसर की कोशिकाओं को इस अध्ययन में सबसे विशेष रूप से, शरीर के अन्य क्षेत्रों के लिए मौखिक गुहा exosomes संचारित करने में सक्षम हैं कि पता चलता है। एसecond, सीरम और लार के नमूनों के बीच मनाया linearity के लार शरीर (यानी, कैंसर) और उनके आणविक सामग्री के विश्लेषण का एक रोगग्रस्त राज्य में उत्पादित कर रहे हैं कि exosomes के कब्जा करने के लिए एक विश्वसनीय जैविक तरल हो सकता है कि पता चलता है।

विधि का वर्णन किया और बाद में परिणाम विधि उनकी सतह मार्करों के आधार पर biofluids से exosomes निकालने के लिए उपयुक्त है कि शो (इस काम के दायरे में, सीडी 63 चयनित सतह मार्कर है)। भविष्य की परियोजनाओं के लिए, यह (जैसे सीडी 9) के रूप में अतिरिक्त सतह मार्करों exosomes को लक्षित या अन्य तकनीकों के साथ EFIRM विधि के संयोजन exosome सामग्री की निकासी और परीक्षण में सुधार होगा कि क्या जांच करने के लिए योग्यता का है।

Exosome जीव विज्ञान translational चिकित्सा के लिए अध्ययन का एक होनहार क्षेत्र है, और निम्न अध्ययन के डेटा लार exosomal विश्लेषण रोग भेदभावपूर्ण बायोमार्कर की पहचान करने के लिए एक स्थल हो सकता है कि पता चलता है। भविष्य जांचबाहर का रोग बायोमार्कर गैर इनवेसिव निदान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता निर्धारण में उपयुक्त लगता है। एक विधि के रूप EFIRM exosomes के भीतर इस तरह के लक्ष्यों की अधिक प्रभावी विश्लेषण के लिए मार्ग प्रशस्त करने में मदद कर सकते हैं।

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Disclosures

डेविड वोंग RNAmeTRIX इंक, एक आणविक निदान कंपनी के सह-संस्थापक है। PeriRx एलएलसी RNAmeTRIX से आणविक निदान से संबंधित बौद्धिक संपत्ति sublicensed। डेविड वोंग PeriRx करने के लिए एक सलाहकार है।

Acknowledgments

इस काम के अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केन्द्र और (परिवार कल्याण) के लिए अनुदान UL1TR000124 के माध्यम से translational विज्ञान, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, आगे बढ़ाने के लिए राष्ट्रीय केन्द्र द्वारा समर्थित किया गया था; फेलिक्स और मिल्ड्रेड भौंकना संपन्न प्रोफेसरशिप और (DTWW करने के लिए) बार्न्स परिवार फंड (एमटी) अवार्ड संख्या T90DE022734 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के चिकित्सकीय और Craniofacial अनुसंधान के राष्ट्रीय संस्थान। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface  Genefluidics, USA  RS-1000-16
16x Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips Genefluidics, USA SC1000-16X-B
Biotinylated anti-human CD63 Antibody Ancell, USA 215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Invitrogen, USA 65601
Neodynium Magnetics (1/10" dia. x 1/32" thick) K&J Magnetics, USA DH101
Ultrapure Distilled Water Life Technologies, USA 10977-023
Mettler Toldeo 3 M KCl Solution Fisher Scientific, USA 1911512
Pyrrole Sigma-Aldrich, USA W338605-100g
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments Roche, Germany 11426346910
3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) Neogen, Usa 330175
Phosphate Buffered Saline Solution Life Technologies, USA 10010023
Casein/PBS Fisher Scientific, USA 37532

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References

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बायोइन्जिनियरिंग अंक 95 Exosome विद्युत सेंसर ट्यूमर बायोमार्कर फेफड़ों का कैंसर लार निदान
इलेक्ट्रिक फील्ड प्रेरित रिलीज और मापन (EFIRM) द्वारा Exosomal biomarker की जांच
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Tu, M., Wei, F., Yang, J., Wong, D. Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM). J. Vis. Exp. (95), e52439, doi:10.3791/52439 (2015).

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