Abstract
엑소 좀은 세포 간 의사 소통의 매개 역할을 microvesicular 구조입니다. 그것은 그들이 질병 차별적 인 바이오 마커를 가지고 있는지 확인 엑소 좀의 내부화물을 연구하는 관심입니다. exosomal 분석을 수행하기위한, 그것을 추출하여 내부 콘텐츠를 손상시키지 않고 타겟 biofluids에서 엑소 좀을 분석하기위한 방법을 개발하는 것이 필요하다.
전계 방출 유도 및 측정 (EFIRM)는 구체적 biofluids에서 엑소 좀을 추출 그들의화물을 하역하고, 내부 RNA / 단백질 함량을 테스트하기위한 방법이다. 항 인간 CD63에 특이적인 항체를 사용하여 자성 미립자, 엑소 좀은 제 biofluids으로부터 침전된다. 다음 추출, 저전압 전기 순환 구형파 (CSW)는 기공을 막 중단 및화물 하역의 원인에 적용됩니다. 엑소 좀의 함유량 ...로서 대한 전극 표면에 고정화 DNA 프라이머 또는 혼성화 항체분자 내용의 ntification.
EFIRM 방법은 용해 완충액없이 분석 엑소 좀의 추출 및 언화물 유리하다. 이 방법은 엑소 모두 RNA와 단백질의 특이 표적 바이오 마커 검출을 수행 할 수있다. 크기 기반의 기술과 반대로 EFIRM 특히 그 표면 마커에 기초하여 엑소 좀을 추출한다.
투과 전자 현미경 (TEM) 분석은 엑소 및 캡쳐 및 분석을위한 방법의 기능을 설명한다. EFIRM 방법은 인간 폐암 H640 세포를 주입 구 마우스의 분석 식염수 컨트롤을 수신 (11) 쥐에 대해 자신의 엑소 프로파일을 테스트하기 위해 (엑소 마커 인간 CD63-GFP를 발현하는 형질 감염된 세포주) exosomal 도포 하였다. exosomal 바이오 마커의 상승 된 레벨 (참고 GAPDH 유전자 및 단백질 표면 마커 인간 CD63-GFP)는 H640 모두 혈청 및 타액 샘플 주입을 위해 쥐를 발견 하였다. 또한, SalI로버지니아 및 혈청 샘플은 선형성 (R = 0.79)가 입증되었다. 이러한 결과는 말초 질환의 검출을위한 타액 엑소 바이오 마커의 실행 가능성에 대한 암시이다.
Introduction
엑소 조사 RNA 1, 2 DNA 및 단백질 3화물을 운반 지질 마이크로 소포를 검사 조사의 새로운 분야입니다. 엑소 생물학의 이전 조사는 혈액 4, 소변 5, 모유 6, 침 7로 biofluids에서 엑소 좀의 식별을 주도했다. 연구는 원격으로 본체 (8)의 서로 다른 시스템 간의 통신을 명상, 엑소 좀 다른 세포질 통로에 역할을한다는 것을 증명하고있다. 역할의 엑소 좀은 세포 간 통신에서 재생하기 때문에, 그들이 질병 상태와 상관 생체 분자 표적 (단백질, RNA 및 DNA)를 패키지 가설이 성립된다. 시험관 3 및 동물 모델 (9) 연구는이 가설을 확증하기 위해 나타납니다. 바이오 마커 발견에 대한 콘텐츠를 조사 exosomal, 그것은 선택적 엑소 biofluids로부터 격리를위한 방법론을 개발하는 것이 필요하다, 유도 expulsi엑소 좀에서화물 및 엑소 생체 분자의 정량에. 이 일의 범위에서, 엑소 좀은 구조가 약 70 ~ 100 nm의 직경을 갖는 표면 마커 CD63을 갖는 것으로 정의한다.
연구진은 일반적으로 첫 번째 초 원심 분리 (10)에 의해 엑소 좀을 정화하고 용해 버퍼 키트의 사용을 통해 exosomal 내용을 처리합니다. 용해 버퍼 방법의 사용은 분에서 시간에 이르기까지 배양 시간이 필요합니다. 이 과정은 잠재적으로 엑소화물을 손상 및 열화를 샘플링 될 수 있습니다. 예를 들어, 주변의 세포 외 환경으로 용해 완충액을 통해 방출 타액 엑소의 RNA는 exosomal의 RNA 후 - 용균 측정 안정화 시약 (11)의 첨가없이 특히 어려운 태스크를 버퍼링하게 1 분 아래의 반감기를 갖는다. 용해 및 안정화를위한 다양한 시약을 추가하는 복리 효과는 복잡 에이전트를 소개하고 analy을 방해 할 수 있습니다exosomal 내용의 동생. 또 다른 방법은 빠르게 exosomal 내용을 하역하고 안전하게 특성에 대한화물을 보존 도움이 될 수 있습니다.
본 연구에서는 exosomal 콘텐츠 릴리스 불균일 전기장의 사용을 제안한다. 전기 필드는 편광 및 세포막을 형성하는 지질 이중층을 방해하는 기능을 수행하는 것으로 알려져있다. 우리의 실험 작업은 엑소 좀의 마이크로 소포 구조를 방해하고 수행화물을 해제하기위한 비 균일 순환 구형파 (CSW)의 사용을 탐구한다. 이 방법은 대부분의 생체 분자가 중단되지 않을 것임을 의미하는 수백 밀리 볼트 범위의 전압을 사용합니다. 우리는 환상 구형파의 사용량이 주변 환경으로의 유체 타액 엑소 mRNA의 함량의 방출을 작동 할 수 있다는 것을 입증한다. exosomal 함량이 릴리스 원활 바이오 마커의 발현 정도를 정량화하는데 사용될 수있다 전극 시스템과 통합되어 12,13.이 제안 된 방법은 엑소 콘텐츠의 빠른, 민감한, 그리고 용해 버퍼 무료로 분석 할 수 있습니다.
EFIRM 워크 플로우 1. 개요를 그림.. EFIRM 방법은 크게 정화 및 분석 엑소 좀에 필요한 세 가지 주요 단계로 구분된다.
이 CSW exosomal 기반 컨텐츠 방출 및 분석 방법은 엑소 격리를위한 자기 고유의 CD63 마이크로 비드와 함께 사용된다. 이러한 CD63-친화 비즈 타액 샘플 (및 기타 biofluids)에서 엑소 좀의 선택적 분리를 위해 할 수 있습니다. 인큐베이션과 자화 비드 엑소 좀을 이용하여 추출 후, 비드는도 1. 컨텐츠 방출 실험과 분석을 기초 부 CSW위한 전기 화학적 센서 시스템으로 마이그레이션 작업의 개요를 제공 아르EFIRM 방법의 흐름.
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Protocol
1. 자기 비드 기반 엑소 추출
- 비드를 재현 탁하는 마이크로 원심 분리 튜브에 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 완충액 495 ㎕를 스트렙 타비 딘으로 코팅 된 자성 미립자의 5 μL의 혼합 된 용액을 피펫. 자기 랙을 사용하여 세 번 세척하고 PBS 500 μL와 구슬을 재현 탁. 랙 샘플 튜브를 마이크로 원심 수납 할 하우징 유닛의 측면에 자석의 배열이다.
- 각각의 세척을 위해, 먼저 튜브 1 분 동안 선반에 앉아서 조심스럽게 구슬을 방해하지 않고 뜨는 버퍼를 제거하기 위해 피펫 팁을 사용하자.
- 측면에 자석이없는 일반 랙에 튜브를 놓습니다. 튜브에 PBS의 500 μl를 추가하고 함께 해결책과 구슬을 혼합하는 피펫을 사용합니다. 다시 용액으로부터 비드를 분리하는 자기 선반에 다시 넣어 튜브.
- PBS의 자화 및 재 부유를 통해 버퍼의이 제거를 수행합니다3 회 총. 이 자성 입자의 초기 세척을 수행한다.
- 자기 랙의 비자 성 부분 상에 배치 된 튜브, PBS 완충액 490 μL로 비드를 재현 탁. 피펫 구슬의 혼합물에 1.0 ㎎ / ㎖ 농도의 스톡 오티 닐화 마우스 항 인간 CD63 항체 5 μL. 용액에 구슬과 항체를 혼합하는 피펫을 사용합니다.
- 샘플 회에 구슬과 비오틴 항체 혼합물의 microcentrifuge 튜브를 놓습니다. 90 ° 5 초 동안 기울를 1 초 동안 5 °에서 진동에 왕복 회전에 대한 샘플 회전의 회전 매개 변수를 설정합니다. 실온에서 30 분 동안 이러한 매개 변수에 샘플 비드 혼합 튜브를 회전합니다.
- 결합 후 결합되지 않은 항체를 제거합니다.
- RT에서 회전 30 분 후, 5 분 동안 다시 자기 랙에 튜브를 배치합니다.
- 마이크로 피펫을 이용하여 액체 상을 제거하여 구슬 세 세척을 수행하고, 500 μ 씻어; PBS의 리터. 트리플 세척 한 후, 랙의 자화되지 않은 부분에 490 카제인 PBS의 μL과 장소에 구슬을 재현 탁.
- 항체 코팅 구슬을 사용 엑소 추출.
- 타겟 샘플 ID와 각 튜브 레이블. 마이크로 원심 튜브에 혈청 또는 타액의 10 μL 샘플을 피펫. 여러 번 피펫 팅하여 샘플 및 자기 구슬을 혼합하는 피펫을 사용합니다.
- 회 전자에 샘플 및 안티 인간 CD63 항체 구슬 튜브를 삽입하고 실온에서 2 시간 동안 회전합니다. 단계 1.2에 기재된 바와 같이 동일한 회 파라미터를 사용한다.
- 회전 샘플의 2 시간 후, 솔루션에서 별도의 구슬 자화 마이크로 피펫과 액상을 제거하고, 트리스 - 염산 완충액 500 μL에 구슬을 재 부유하여 트리플 세척을 수행합니다. 결과 구슬은 이제 엑소 좀 바인딩 및 전기장 방출 및 측정을위한 준비가되어 있습니다.
2. 전기장 유도 출시차 Exosomal 내용의 측정
- GADPH 프라이머와 전극의 초기 프리 코팅
- 플라스틱 잘은 개별 전극의 교차 오염을 방지하기 위해 전극 배열을 적용합니다. 이 실험을 위해, 베어 금으로 제조 작업, 카운터 및 기준 전극으로 구성된 어레이의 각 전극 부 16 센서 전극 어레이를 사용한다.
- 초순수 증류수로 튜브에 재고 시약을 피펫 팅 100 nm의 DNA 프로브, 0.3 M KCl을, 10 mM의 피롤의 재고 혼합물을 준비합니다. 와동에 의해 철저하게 섞는다.
참고 : 본 연구를 위해, 선택된 DNA 프로브 엑소 좀 내에 존재하는 것으로 알려져 참조 GAPDH 유전자에 대응한다. 사용되는 프로브 서열은 다음과 '- 비오틴 AGGTCCACCACTGACACGTTG 5'-3. 모든 전극에이 혼합물을 사용합니다. - 피펫 각 금 전극의 표면 상에 모노머-DNA 프로브 혼합물을 60 μL. 작업, (C)의 적절한 범위가되도록하여 전극을 검사액체 혼합물에 의해 ounter, 전극과 기준 전극.
- 프로브 Electropolymerize 단량체 혼합물을 전극 표면에 환상 구형파 (CSW) 전계 프로파일을 적용하여 전극 표면에 전도성 고분자 층을 생성한다. 이 전기장은 9 초 동안 350 MV를 적용하고 바로 1 초 동안 950 MV로 전환 구성되어 있습니다. 인가 전기장의 100 초, 총 10 사이클 용 전극이 환상 구형파 프로파일을 적용한다.
- 전극의 표면으로부터 액체를 제거하는 센서 표면을 증류수와 질소 가스와 건조로 3 회 헹군다. 그 액체가 제대로 전극에서 제거되어 있는지 확인합니다.
- 엑소화물 하역
- 로드 5 비드 - 엑소 좀 복잡한 혼합물의 495 μL에 검출기 프로브의 1 μM의 μL와 혼합 피펫을 사용합니다.
주 : 검출기 프로브가 3 '말단에 형광 분자에 접합 된 DNA 프라이머 서열이다. 검출기 확률값본 연구를 위해 사용 된 전자 서열 엑소 좀 내에있는 GAPDH mRNA에 대응한다. 형광 검출기 공액 프로브의 서열은 : 5'- 플루오 레세 GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-3 '. - 피펫 아래 자석 배열과 금 전극 표면 상에 프로브와 엑소 - 비드 복합체의 60 μL. 이 자석 어레이가 센서의 작용 극에 대응하도록 정렬 된 여섯 2.54 mm 직경 네오디뮴 자석으로 이루어져있다.도 2a는 자석 비드 - 엑소 용액의 배치를 도시한다.
- 샘플이 전극 표면에로드되면, -300 MV에서 9 초 및 200 MV (200 초 총)에서 1 초에 CSW 전기장의 20주기를 적용합니다. 해제 exosomal화물은 전극의 표면에 프라이머 혼성화한다. 엑소 좀의 표면 마커는 조사의 대상이되는 경우. 실험의이 부분을 건너 2b는이 과정을 도시한다. <리> 워시 오프 트리플 증류수로 전극 표면을 세정함으로써, 전극 표면에 결합되지 않은 분석 물질. 질소 가스와 함께 전극을 건조.
- 로드 5 비드 - 엑소 좀 복잡한 혼합물의 495 μL에 검출기 프로브의 1 μM의 μL와 혼합 피펫을 사용합니다.
- (1,000 희석 1 HRP) 카제인 / PBS에 희석 고추 냉이 과산화 효소에 결합 150 단위 / ml의 방지 형광 항체의 60 μl를 추가합니다.
- 프로브 샌드위치 복잡한 안티 플루 HRP에 전기장 구동 결합을 사용합니다. 1 초와 전극 표면에 5 사이클을 1 초 동안 500 MV에 대해 -200 MV를 적용합니다. 그림 2a는 단백질과 핵산 시스템 모두에 대해 캡처 및 검출기 프로브 단지를 보여줍니다.
- 증류수 및 질소 가스를 이용하여 건식 세척 트리플 센서면.
- 언 바운드 초과 방지 형광 항체의 워시 오프에 이어, 3,3 ', 5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB) 기판의 60 μl를 추가합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 센서 표면에이 기판을 넣습니다.
- . 16 개의 채널을 동시에 측정 할 수있는 전기 화학적 텐쇼을 60 초 동안 사용하여 -200 Mv로, 전극 전류를 측정함으로써, 현재의 판독 전류 측정을 수행 2C는 판독시 전류 프로파일의 일례도이다.
EFIRM 방법 그림 2. 구성 요소. (A) 항 - 인간 CD63 코팅 자성 미립자를 사용하여 체액에서 엑소 좀을 추출하고 입자 엑소 좀 복잡한에 적용 순환 광장 파도를 사용 엑소화물을 하역하는 방법. 릴리스 엑소에서 RNA / DNA / 단백질 표적을 검출하기 위해 사용되는 바이오 센서의 전극 (B) 방식. 큰 전류 크기가 t에 해당 (C) EFIRM 방법론에서 전류 측정 판독의 대표적인 예생체 분자의 높은 수준 O. 이 그림은 웨이 등 알에서입니다. (14)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
TEM을 사용하여 구슬의 엑소 캡처의 검증
항 인간 CD63 자성 비드를 이용하여 타액에서 엑소 좀의 분리는 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지를 이용하여 추출 프로토콜 다음 검증 하였다. TEM은 엑소 좀의 알려진 프로파일과 일치 바로 인접 (도 3a를 참조하고, 3B) 70 ~ 100 나노 입자와 자성 비드를 보여줍니다. 아니 70 ~ 100 nm의 과립은 이전에 그들에게 결합 항 - 인간 CD63 항체가 (그림 3C 및 3D 참조)하지 않은 타액의 자기 구슬 관찰되지 않았다.
그림 자기 미세 3. TEM 이미지. 70 ~ 100 nm의 인접의 작은 알갱이 함께 안티 - 인간 CD63 자성 나노 입자의 (A) 이미지. (B) Enla자성 나노 입자 관찰 과립의 rged보기. 결합없이 항체와 자성 비드 (C) 이미지. (D) 결합없이 항체와 자석 구슬의보기를 확대했습니다. 이 그림은 웨이 등 알에서입니다. (14)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
CSW 전기장을 사용하여 Exosomal 내용의 출시에 관한 연구
항 - 인간 CD63 비드의 TEM 이미지는 자성 비드 (도 3a 참조)에 인접 70-100 nm의 입자를 나타낸다. 자성 비드를 이용하여 엑소 좀의 캡쳐 후, 시료는 병렬로 두 가지 다른 방법으로 처리된다. 사용 첫 번째 방법은 트리톤-X에게 엑소 좀을 용해하는 100 세제를이고 두 번째 방법은이 작품에서 논의 된 순환 구형파 (CSW) 전기장 용해 버퍼 무료 방법이었다 트리톤-X 100 방법 아칸소의 (세부 사항웨이 전자 t 알. (14)에 의해 설명 된 E). 이러한 처리 엑소 - 비드 복합체 TEM에 의해 분석하고, mRNA의 참조 유전자는이 연구에서 기술 된 전기 화학적 방법을 이용하여 정량 하였다. 본 연구에 사용 된 참조 유전자는 대부분의 엑소 좀으로 존재 GAPDH이었다.
TEM 이미지는 모두 트리톤 X 100, CSW 전계 처리 샘플에, CSW와 트리톤 X 100 처리법 (모두 참조도 4b-II 후의 자성 비드에 부착 엑소 구조 저명한 부재 있다는 것을 보여 그림 4B-IV). 두 트리톤 X 100, CSW 전계 처리 샘플에서 GAPDH 발현 수준의 측정은 유사한 프로파일을 보유 : 다른 용균 프로토콜에 따라 측정 GAPDH 수준의 감소가 있었다 즉 그 시간 진행됨 exosomal의 노출을 나타내는 타액의 extravesicular 환경의 mRNA (그림 4C 참조).
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그림 전기 CSW 해제 방법의 반복 사각 파 엑소화물 릴리스. (A) 다이어그램에 관한 4. 결과. (B)의 엑소 좀의 TEM 이미지 : CSW 방출 전에 (ⅰ), (ⅱ) 후 CSW 방법, (ⅲ) 용해 버퍼 법 전에, (ⅳ) 용해 버퍼 법 후. TEM 이미지의 배경 레이 지원입니다. (C) 엑소 GAPDH mRNA 수준의 정량화 용해 완충액과 CSW 전계가인가된다. 이 그림은 웨이 등 알에서입니다. (14)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표면 단백질의 검출 및 숨겨의 mRNA에 대한 EFIRM의 성능 검사
EFIRM 및 안돼요 평가전통적인 방법에 rison가 실시되었다. EFIRM는 (mRNA를 대상으로 GAPDH를 사용하여) RNA의 정량 및 qPCR에 (인간 CD63-GFP, 엑소 좀을위한 표면 마커) 웨스턴 블롯을 이용하여 단백질의 정량 비교했다. 인간의 CDP63-GFP는 엑소의 표면에 있었기 때문에, CSW는 엑소화물을 하역 적용되지 않았습니다. 단백질과 RNA 시험 결과를 각각도 5a 및도 5b에 나타낸다.
특이성 시험은 또한 마우스 샘플에서 엑소 좀과 인간 엑소 좀을 혼합하여 EFIRM 동안 수행 하였다. 이러한 특이성 테스트는 인간의 샘플 마우스의 서로 다른 비율의 혼합물을 포함했다. 실험의 결과는 마우스 exosomal 내용이 다섯 사람의 콘텐츠를보다 배 이상, 인간 exosomal 단백질이고 mRNA를 아직 확인 및 정량화 할 수있을 때 (각각, 단백질과 RNA 그림 5C 및 5D 참조) 것을 보여줍니다.
엑소 좀의 희석 된 샘플을 이용하여 mRNA와 단백질 수준 그림 5. EFIRM의 성능 평가. GFP 부분에 EFIRM과 웨스턴 블롯의 (A) 비교. GAPDH mRNA를위한 EFIRM 및 qPCR에의 (B) 비교. (C)의 마우스 엑소 상이한 양의 희석 된 인간 엑소 좀 검출하는 상대 GFP 신호 레벨. (D) 마우스 엑소 좀 다른 양의 희석 인간의 엑소 좀을위한 GAPDH의 mRNA에 대한 상대 감지 신호. 이 그림은 웨이 등 알에서입니다. (14)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마우스 타액에서 정량화 된 Exosomal 내용
엑소의 검출 가능성을 결정하기 위해타액 샘플 somal 함량은 누드 마우스 모델을 사용 하였다. 이러한 누드 마우스 모델은 1 × 106 인간 폐암 세포 H460 또는 식염수 (또한 엑소 마커 인간 CD63-GFP를 발현하는 형질 전환 된 세포주)의 interpleural 주사 하였다. 식염수 100 ㎕의 음성 대조군을 받아 9 생쥐 세포를 주입받은 쥐 (11)이 있었다. 이십일 후, 타액 및 혈청 샘플을 마우스의 두 그룹에서 수집 하였다.
생쥐 혈청 타액 인간 CD63-GFP 단백질의 상대적인 수준 EFIRM 허용 정량화 방법의 사용. 마우스의 혈청 개의 침 사이의 상대 수준의 비교는 두 biofluids (R = 0.79) 간의 선형 상관 관계를 보여 주었다. H460는 식염수 주입 된 마우스에 대해 마우스를 주사에 대해 부가 적으로, 의미있는 차이는 인간 CD63-GFP 레벨에서 관찰되었다. 이 원위부 종양 세포에서 엑소 좀은 INT를 인신 매매 제안혈관과 타액 오. 혈청과 타액을 비교 결과는 그림 6에 표시됩니다.
타액 및 혈청 인간 CD63-GFP의 상대적인 수준도 6 EFIRM 평가. 인간 간암 세포를 주입 마우스에서 인간 CDP63-GFP의 상대 수준의 비교 연구. 직선은 인간 CD63-GFP에 대한 혈청과 타액 샘플 사이에 존재합니다. 인간 CD63-GFP의 수준이 세포를 주입 쥐에서 증가되어 (식염수 주입 쥐에 비해). 이 그림은 웨이 등 알에서입니다. (14)
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Discussion
결과가 나타내는 바와 같이, 항 인간 CD63 코팅 된 자성 나노 입자는 특히 70 ~ 100 nm의 범위의 크기를 갖는 작은 입자를 포착 할 수있다. 이 캡처 된 입자는 엑소 좀 이전에 관찰 된 프로파일과 일치한다. 또한, 입자의 캡처 다음 저전압 CSW의 사용은 비드 표면에서 제거화물 릴리스 전통적인 용해 완충액 기반 방법과 동일한 DNA 분해 프로파일을 일으키는 것으로 도시되어있다. 이 데이터는 exosomal화물 릴리스의 워크 플로가 엑소의 지질막의 중단에 대한주기적인 구형파의 응용 프로그램을 통해 간단하게 할 수 있음을 나타냅니다. 상기 간단한 방법은 악영향 엑소화물에 영향을 미칠 수있는 버퍼를 용해시키기위한 필요없이 급속화물 방출을 허용하고, 그 결과 EFIRM 방법은 초 원심 분리 및 분해의 사용 전통적인 방법에 비해 exosomal 콘텐츠 연구 바람직한 방법이 될 것으로 보인다버퍼. EFIRM 방법의 민감도, 특이도, 쉽게는 핵산과 단백질 목표도 내부 콘텐츠를 테스트 신속하게 체액에서 엑소 좀을 추출에 이상적이다.
EFIRM 방법론 H460 인간 간암 세포를 주사 한 누드 마우스 모델 연구에 적용 하였다. 엑소 표면 마커 CD63 형광 특성을 가질 정도로 H460 인간 폐암 세포를 추가로 인간 CD63-GFP로 형질 감염시켰다. 이십일의 기간 후의 마우스 혈청 타액을 수거하고, EFIRM 방법론 exosomal 그들의 콘텐츠를 분석하기 위해 사용되었다. 이 연구는 혈청과 타액 샘플 (R = 0.79) 사이의 선형 상관 관계를 보여 주었다. 이러한 결과의 의미는 두 가지이다 : 첫째, biofluids에서 엑소 좀을 캡처하는 능력은 원위 암 세포는이 연구에서 특히, 신체의 다른 부분으로 구강 엑소 좀을 송신 할 수 있음을 시사한다. 에스econd, 혈청과 타액 샘플을 관찰 사이의 선형성은 침이 몸 (즉, 암)과 분자 내용의 분석의 병에 걸린 상태에서 생산되는 엑소 좀의 캡처를위한 신뢰할 수있는 체액이 될 수 있음을 시사한다.
방법 설명 및 후속하는 결과에있어서 그들의 표면 마커에 기초 biofluids에서 엑소 좀을 추출하기에 적합한 것을 보여준다 (이 작업의 범위에서, CD (63)는 선택된 표면 마커이다). 향후 프로젝트의 경우, (예로서 CD 9) 추가적인 표면 마커의 엑소 좀을 타겟팅하거나 다른 기술로 EFIRM 방법을 조합하면 엑소 컨텐츠 추출 및 테스트를 개선할지 여부를 검사하는 장점이다.
엑소 생물학 병진 의학 연구의 유망 지역이며, 다음과 같은 연구의 데이터는 타액 exosomal 분석은 질병 차별적 인 바이오 마커를 식별 할 수있는 장소가 될 수 있음을 시사한다. 향후 조사원위 질병 표지자가 비 침습적 진단에 사용할 수 있는지 여부를 결정하는데 적절한 것으로 보인다. 방법으로 EFIRM는 엑소 좀 내에서 이러한 목표를보다 효과적으로 분석 방법을 포장하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
데이비드 웡 RNAmeTRIX 주식, 분자 진단 회사의 공동 설립자이다. PeriRx LLC는 RNAmeTRIX에서 분자 진단에 관한 지적 재산권을 재사용 권. 데이비드 웡 PeriRx 컨설턴트입니다.
Acknowledgments
이 작품은 연구 자원을위한 국가 센터 (FW에) 부여 UL1TR000124을 통해 번역 상 과학, 건강의 국립 연구소를, 전진을위한 국가 센터에 의해 지원되었다; 펠릭스 & 밀드레드 깨갱 기증 교수 및 (DTWW에) 반스 가족 기금 (MT에) 상 수 T90DE022734에서 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 치과 및 두개 안면 연구소의 국립 연구소. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
| 16x Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
| Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
| Neodynium Magnetics (1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
| Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
| Mettler Toldeo 3 M KCl Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
| Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
| 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
| Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
| Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |
References
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