Abstract
Exosomes er microvesicular strukturer som spiller en meklerrolle i interkommunikasjon. Det er av interesse å studere i laste av exosomes å finne ut om de bærer sykdoms diskriminerende biomarkører. For å utføre exosomal analyse, er det nødvendig å utvikle en metode for ekstrahering og analyse av exosomes fra target biofluids uten å skade det indre innhold.
Elektrisk felt-indusert frigjøring og måling (EFIRM) er en metode for spesielt trekke ut exosomes fra biofluids, lossing sin last, og teste deres interne RNA / protein innhold. Ved hjelp av et anti-humant CD63-spesifikt antistoff magnetiske mikropartikkel, er exosomes først utfelt fra biofluids. Etter ekstraksjon, lavspente elektriske sykliske firkantbølger (CSW) er brukt for å forstyrre vesicular membran og føre last lossing. Innholdet i exosome blir hybridisert til DNA-primere eller antistoffer immobilisert på en elektrodeoverflate for quantification av molekylær innhold.
Den EFIRM metoden er fordelaktig for utvinning av exosomes og lossing last for analyse uten lysisbuffer. Denne metoden er i stand til å utføre spesifikk påvisning av både RNA- og protein biomarkør mål i exosome. EFIRM ekstrakter exosomes spesielt basert på deres overflatemarkører i motsetning til størrelse baserte teknikker.
Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og analysen viser funksjonaliteten av fremgangsmåten for exosome fangst og analyse. Den EFIRM metode ble anvendt for å exosomal analyse av ni mus injisert med human lungekreft H640-celler (en cellelinje transfektert for å uttrykke exosome markør human CD63-GFP) for å teste deres exosome profil mot 11 mus som mottok saltløsningskontrollene. Forhøyede nivåer av exosomal biomarkører (referanse genet GAPDH og protein overflaten markør human CD63-GFP) ble funnet for den H640 injisert mus i både serum og spyttprøver. Videre saliva, og serumprøver ble vist å ha linearitet (R = 0,79). Disse resultatene er tankevekkende for levedyktigheten av spytt exosome biomarkører for påvisning av distale sykdommer.
Introduction
Exosome forskning er et voksende felt av etterforskningen som undersøker lipid mikrovesikler som bærer RNA 1, DNA to, og protein tre last. Tidligere undersøkelser av exosome biologi har ført til identifisering av exosomes i biofluids som blod 4, urin 5, morsmelk 6, og spytt 7. Studier har vist at exosomes spille en rolle i forskjellige cellulære veier, eksternt meditere kommunikasjon mellom forskjellige systemer i kroppen 8. På grunn av den rollen exosomes spille i inter kommunikasjon, er det en hypotese om at de kan pakke biomolekyl mål (protein, RNA, og DNA) korrelerte med sykdomstilstander. In vitro tre og dyremodell ni studier synes å bekrefte denne hypotesen. I å undersøke exosomal innhold for biomarkører, er det nødvendig å utvikle en metode for selektiv exosome isolasjon fra biofluids, indusert expulsipå av last fra exosomes, og kvantifisering av exosome biomolekyler. I den utstrekning av dette arbeidet, vil exosomes bli definert som en struktur med en diameter på omtrent 70 til 100 nm og besitter overflatemarkører CD63.
Forskere typisk først rense exosomes av ultrasentrifugering 10 og deretter behandle exosomal innhold gjennom bruk av lysis buffer kits. Bruk av lyseringsbuffer metoder krever inkubasjonstider som strekker seg fra minutter til timer. Denne prosessen kan potensielt skade exosome last og føre til prøve degradering. For eksempel, spytt exosome RNA frigitt via lysisbuffer i det omgivende ekstracellulære miljøet besitter en halveringstid på under ett minutt, noe som gjør måling av exosomal RNA post-lysisbuffer en særlig vanskelig oppgave uten tilsetning av stabiliserings reagenser 11. Forverret effekten av å legge ulike reagenser for lysering og stabilisering kan innføre midler som vanskelig og forstyrre analysis av exosomal innhold. En alternativ tilnærming kan være nyttig for hurtig lossing exosomal innhold og trygt å bevare lasten for karakterisering.
I dette arbeidet, foreslår bruken av et ikke-uniformt elektrisk felt for frigjøring av exosomal innhold. Elektrisk-felt er kjent for å bære evne til å polarisere og forstyrre det ytre lipid bilaget som danner cellemembraner. Vår eksperimentelt arbeid utforsker bruk av uensartede sykliske firkantbølger (CSW) for å forstyrre mikrovesikkelen strukturen i exosomes og slippe gjennomført last. Denne metoden bruker spenninger i flere hundre millivolt rekkevidde, noe som betyr at de fleste biomolekyler ikke vil bli forstyrret. Vi viser at bruken av en cyklisk-firkantbølge er i stand til å aktivere frigjøring av spytt exosome mRNA-innholdet i det omgivende fluidmiljø. Denne utgaven av exosomal innhold er sømløst integrert med en elektrode system som kan brukes til å kvantifisere biomarkør uttrykk nivåer 12,13. Denne foreslåtte metoden gjør det mulig for rask, følsom, og lysisbuffer gratis analyse av exosome innhold.
Figur 1. Oversikt over EFIRM arbeidsflyt.. The EFIRM metode grovt deles inn i tre hovedfaser som er nødvendige for å rense og analysere exosomes.
Dette CSW basert exosomal innhold utgivelsen og analysemetode er brukt i forbindelse med CD63-spesifikke magnetiske mikroperler for exosome isolasjon. Disse CD63-affinitet perler gir mulighet for selektiv isolering av exosomes fra spyttprøver (og andre biofluids). Etter inkubering og utvinning av exosomes ved hjelp av de magnetiserte kuler, blir kulene overført til den elektrokjemiske sensorsystemet for CSW basert innhold frigjøring og analysedelen av forsøket. Figur 1 gir en oversikt over arbeidetflyt av EFIRM metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Magnetisk Bead-baserte Exosome Extraction
- Pipetter en godt blandet løsning av 5 ul streptavidin-belagte magnetiske mikropartikler i 495 ul av fosfatbufret saltvann (PBS) buffer i et mikrosentrifugerør for å resuspendere kulene. Vask og resuspender perlene med 500 mL PBS tre ganger ved hjelp av en magnetisk rack. Stativet er en rekke magneter på siden av en boenhet som kan holde prøve mikrosentrifugerør.
- For hver vask, først la rørene sitte på pinebenken i 1 minutt, og deretter bruke en pipette til å forsiktig fjerne supernatanten buffer uten å forstyrre perlene.
- Plasser rørene på en vanlig stativ uten magneter på siden. Legg 500 ul av PBS inn i rørene, og bruke pipette for å blande løsningen og perlene sammen. Deretter setter rørene tilbake på magnetstativ for igjen å skille kulene fra oppløsningen.
- Utfør denne fjerning av buffer via magnetisering og resuspensjon i PBS entotalt tre ganger. Dette utfører en første vask av de magnetiske partiklene.
- Resuspendere kulene inn i 490 pl av PBS-buffer, med røret plassert på den ikke-magnetiske del av magnetstativ. Pipetter 5 ul biotinylert mus anti-human CD63-antistoff ved 1.0 mg / ml stamkonsentrasjon i blandingen av perler. Bruk pipetten for å blande kulene og antistoff i oppløsning.
- Plasser mikrosentrifugerør med perle og biotinylerte antistoff blandingen på en prøve rotator. Still rotator parametere for prøven rotator for gjensidig rotasjon på 90 ° tilting for 5 sek og vibrerer på 5 ° i 1 sek. Rotere prøve-perle-blandingen rørene på disse parametrene i 30 minutter ved RT.
- Fjerne ubundet antistoff etter konjugering.
- Etter 30 min rotasjons ved RT, plasserer rørene tilbake i magnetisk stativ i 5 min.
- Utføre tre vaskinger av perler ved å fjerne den flytende fase ved anvendelse av en mikropipette og vask med 500 μ; L PBS. Etter trippel vask, resuspender perler i 490 mL av kasein-PBS og sted på unmagnetized delen av stativet.
- Exosome utvinning ved hjelp antistoffbelagte kuler.
- Merk hver tube med målrettet prøve ID. Pipette en 10 mL prøve av serum eller spytt inn i mikrosentrifugerør. Bruk pipette for å blande prøven og magnetiske kuler ved å pipettere flere ganger.
- Plasser rørene med prøve- og anti-human CD63 antistoff perler på rotator og roter for 2 timer ved RT. Bruk samme rotator parametre som beskrevet i trinn 1.2.
- Etter to timers prøve roterer, utfører en trippel vaske ved magnetiseringen for å skille kulene fra oppløsning, fjerne væskefase med mikropipette, og resuspendering av perler i 500 ul Tris-HCl-buffer. De resulterende kuler er nå bundet til exosomes og er klar for den elektriske frigjøringsfeltet og måling.
2. Elektrisk Feltet Induced Utgitt ennd Måling av Exosomal innhold
- Initial forbelegging av elektrode med GADPH Primer
- Anvende en plast ned til et elektrodesystem for å forhindre kryss-forurensning av de enkelte elektroder. For dette eksperimentet, bruke en 16-sensor elektrodesystem med hver enhet elektrode i rekken består av en arbeidsgruppe, teller, og referanseelektrode laget av nakne gull.
- Tilbered en stamblanding av 100 nM DNA-probe, 0,3 M KCl og 10 mM pyrrol ved pipettering arkiv reagenser inn i et rør med ultrarent destillert vann. Bland grundig ved virvling.
NB: For denne studien, DNA-probe valgt svarer til GAPDH referanse-genet, noe som er kjent for å eksistere innenfor exosomes. Sonden sekvensen som benyttes er: 5'-biotin-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 '. Bruke denne blandingen på alle elektrodene. - Pipetter 60 ul av monomer-DNA-probe blandingen på overflaten av hver gullelektrode. Undersøke elektrodene for å sikre at det ikke er tilstrekkelig dekning på arbeidsstedet, counter, og referanseelektroder av den flytende blanding.
- Electropolymerize monomer-probe blandingen for å skape en ledende polymersjikt på elektrodeoverflaten ved å anvende en syklisk firkantbølge (CSW) elektrisk feltprofilen til elektrodeoverflaten. Dette elektriske feltet består av å bruke 350 mV for 9 sek og umiddelbart bytte til 950 mV for 1 sek. Påfør denne sykliske firkantbølgeprofil til elektroden for 10 sykluser, for totalt 100 sekunder av påtrykte elektriske felt.
- Skyll sensorflaten 3 ganger med destillert vann og tørkes med nitrogengass for å fjerne væske fra overflaten av elektroden. Sørg for at væske er fjernet fra elektroden.
- Exosome Cargo Lossing
- Belastning 5 ul av 1 pM av et detektorsonden i 495 ul av vulsten-exosome kompleks blanding og bruke en pipette for å blande.
MERK: Detektoren proben er et DNA-primer-sekvens konjugert til et fluorescein-molekyl ved 3'-enden. Detektoren probe-sekvens anvendt for denne studien tilsvarer GAPDH mRNA innenfor exosomes. Sekvensen av fluorescein-konjugert detektorsonden er: 5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-Fluorescein-3 '. - Pipetter 60 ul av probe og vulst-exosome kompleks blanding på en gullelektrode overflate med en magnetgruppen under. Denne magnetgruppen består av seksten 2,54 mm diameter neodymmagnetene innrettet for å svare til de arbeidende elektroder av sensoren. Figur 2A illustrerer plasseringen av magnetene og vulst-exosome løsning.
- Når prøven er lastet på elektrodeoverflaten, gjelder 20 sykluser av CSW elektrisk felt med 9 sek på -300 mV og 1 sekund ved 200 mV (200 sek totalt). Den exosomal last som er sluppet vil hybridisere til primerne på overflaten av elektroden. Dersom overflatemarkører av exosome er gjenstand for etterforskning, hoppe over denne delen av forsøket. Figur 2B illustrerer denne prosessen. <li> Wash-off de ubundne analytter på elektrodeoverflaten etter trippel skylling elektrodeoverflaten med destillert vann. Tørk elektroden med nitrogengass.
- Belastning 5 ul av 1 pM av et detektorsonden i 495 ul av vulsten-exosome kompleks blanding og bruke en pipette for å blande.
- Legg 60 ul av 150 enheter / ml anti-fluorescein-antistoff konjugert til pepperrotperoksidase (HRP i 1: 1000 fortynning) fortynnet i Kasein / PBS.
- Bruke en elektrisk-felt drevet konjugering til komplekse anti-fluorescein-HRP til sonden sandwich. Påfør -200 mV for 1 sek og 500 mV for 1 sek for 5 sykluser til elektrodeoverflaten. Figur 2A viser fangst og detektor probe komplekser for både protein og nukleinsyre system.
- Triple vask sensor overflaten med destillert vann og tørk med nitrogengass.
- Etter vask-off av ubundet overflødig anti-fluorescein antistoff, tilsett 60 mL av 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) substrat. Laste dette underlaget på hver sensor overflaten ved hjelp av en flerkanals pipette.
- Utføre amperometrisk avlesning av gjeldende ved måling av elektrodestrømmen ved -200 mV i 60 sek ved å bruke en elektrokjemisk potensiostat i stand til samtidig måling av 16 kanaler. Figur 2C er et eksempel på gjeldende profil under avlesning.
Figur 2. Komponenter i EFIRM Method. (A) Metode for å utvinne exosomes fra Biovæske hjelp av anti-human CD63 belagt magnetiske mikropartikler og deretter lossing exosome last ved hjelp av sykliske firkantbølger brukes på partikkel-exosome kompleks. (B) Reaksjonsskjema for elektrode biosensor brukes for å påvise RNA / DNA / protein-mål fra det frigjort exosome. (C) Representant eksempel på amperometrisk avlesning fra EFIRM metodikk, hvor større strømstyrke tilsvarer to høyere nivåer av et molekyl. Dette tallet er fra Wei et al. 14 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validering av Exosome Capture av Perler Bruke TEM
Isolering av exosomes fra spytt ved hjelp av anti-humane CD63 magnetiske kuler ble validert etter ekstraksjon protokoll ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM) bilder. TEM viser magnetiske kuler med 70-100 nm granulater umiddelbart hosliggende (se figur 3A og 3B), i samsvar med den kjente profil exosomes. Ingen 70-100 nm korn ble observert for de magnetiske kuler i spytt som ikke har anti-human CD63 antistoff konjugert til dem tidligere (se figur 3C og 3D).
Figur 3. TEM bilder av magnetiske mikropartikkel. (A) Bilde av anti-human CD63 magnetiske nanopartikler med små partikler av 70-100 nm tilstøtende. (B) Enlarged visning av magnetiske nanopartikkel og observerte granulat. (C) Bilde av magnetiske kuler uten antistoff konjugert. (D) Forstørret visning av magnetiske kuler uten antistoff konjugert. Dette tallet er fra Wei et al. 14 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Studie av Offentliggjøring av Exosomal innhold ved hjelp av CSW elektrisk felt
TEM bilder av anti-human CD63 perler viser 70-100 nm granulater tilstøtende til magnetiske kuler (se figur 3A). Etter fangst av exosomes ved hjelp av magnetiske kuler blir prøver behandlet med to ulike metoder parallelt. Den første metoden som ble brukt var Triton-X 100 vaskemiddel å lysere exosomes og den andre metoden var den sykliske firkantbølge (CSW) elektrisk-feltet lysisbuffer gratis metode omtalt i dette arbeidet (detaljer fra Triton-X 100 metode are beskrevet av Wei e t al. 14). Disse behandlede exosome-kulekompleksene ble analysert ved TEM, og en mRNA-referanse-genet ble kvantifisert ved anvendelse av den elektrokjemiske metode som er beskrevet i dette arbeidet. Referanse genet anvendt i denne studien var GAPDH, som er tilstede i de fleste exosomes.
TEM-bilder viser at i begge de Triton-X-100 og CSW elektriske felt behandlede prøver, var det en kjent fravær av exosome strukturer festet til de magnetiske kuler etter at både CSW og Triton X-100 behandlingsmetoder (se figur 4B-ii og Figur 4B-iv). Måling av GAPDH uttrykk nivåer i både Triton-X-100 og CSW elektriske felt behandlede prøver besitter en tilsvarende profil, nemlig som følger de forskjellige lyseringsprotokoller, var det en reduksjon i målte GAPDH nivåer etter hvert som tiden gikk, noe som indikerer en eksponering på exosomal mRNA til extravesicular miljø av spytt (se figur 4C).
<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-side = "always">
Figur 4. Resultater knyttet til Cyclic Square Wave Exosome Cargo Release. (A) Diagram av elektrisk CSW utgivelsen metoden. (B) TEM-bilder av exosomes: (i) Før CSW frigjøring, (ii) Etter CSW metoden, (iii) Før lysisbuffer metoden, (iv) Etter lysis buffer metode. Bakgrunn av TEM bilder er Lacey støtte. (C) Kvantifisering av exosome GAPDH mRNA nivåer når lysisbuffer og elektrisk felt CSW er brukt. Dette tallet er fra Wei et al. 14 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Undersøke Utførelse av EFIRM for deteksjon av overflateproteiner og næret mRNA
Evaluering av EFIRM og selrison til tradisjonelle metoder ble gjennomført. EFIRM ble sammenlignet med kvantifisering av protein ved hjelp av western blot (for human CD63-GFP, en overflatemarkør for exosomes) og qPCR for kvantifisering av RNA (ved hjelp av GAPDH mRNA som en target). Fordi den menneskelige CDP63-GFP var på overflaten av exosome, ble CSW ikke søkt å losse exosome last. Resultatene av protein og RNA-testene er henholdsvis vist i figur 5A og 5B.
Spesifisitet tester ble også gjennomført for EFIRM ved å blande de menneskelige exosomes med exosomes fra mus prøver. Disse spesifisitet tester involvert ulike ratio blandinger av mus til humane prøver. Resultater av forsøk viser at når mus exosomal innholdet var fem ganger større enn human-innhold, humane exosomal proteiner og mRNA kan fortsatt bli identifisert og kvantifisert (se figur 5C og 5D for protein og RNA, henholdsvis).
Figur 5. EFIRM Performance Evaluation for mRNA og proteinnivåer ved hjelp av fortynnede prøver av exosomes. (A) Sammenligning av EFIRM og western blot på GFP-delen. (B) sammenligning av EFIRM og qPCR for GAPDH mRNA. (C) Relative oppdaget GFP signalnivåer for menneske exosomes utvannet i ulike mengder muse exosome. (D) Relativ oppdaget signal for GAPDH mRNA for menneske exosomes utvannet i ulike mengder muse exosome. Dette tallet er fra Wei et al. 14 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Exosomal innhold kvantifiserte Fra Mouse Spytt
For å bestemme gjennomførbarheten av å detektere eksoSomal innholdet i spyttprøver, ble en naken mus-modellen benyttes. Denne naken mus modellen fikk en interpleural injeksjon av 1 x 10 6 human lungekreft celle H460 (en cellelinje som er transfektert til å uttrykke det også exosome markør human CD63-GFP) eller saltvann. Det var 11 mus som mottok en negativ kontroll av 100 ul saltvann og 9 mus mottok celleinjeksjon. Etter 20 dager ble serum og spyttprøver oppsamlet fra de to gruppene av mus.
Bruk av EFIRM metoden tillot kvantifisering av de relative nivåer av human CD63-GFP-proteinet i museserum og spytt. En sammenligning av de relative nivåer mellom de to serum og spytt av musene demonstrerte lineær korrelasjon mellom de to biofluids (R = 0,79). I tillegg ble det observert signifikant forskjell i den humane CD63-GFP nivåer for H460 injiserte mus mot saltvann injisert mus. Dette tyder på at exosomes fra distale kreftceller er trafikkert into blodkar og spytt. Resultatene sammenligner serum og spytt er vist i figur 6.
Figur 6. EFIRM evaluering av relative nivåer av human CD63-GFP i serum og spytt. Sammenligningsstudier mellom de relative nivåer av human CDP63-GFP fra mus injisert med humane lungekreftceller. Linearitet mellom serum og spyttprøver for mennesker CD63-GFP. Nivåer av human CD63-GFP er forhøyet i mus injisert med celler (sammenlignet med saltvann injisert mus). Dette tallet er fra Wei et al. 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som resultatene viser, anti-human CD63 belagte magnetiske nanopartikler er i stand til spesifikt å fange opp små partikler som har en størrelse i området 70-100 nm. Dette fanges partikkel er i overensstemmelse med den tidligere observerte profil exosomes. Videre er bruken av lavspent CSW etter fangst av partiklene vist seg å fjerne dem fra kuleoverflaten og forårsake DNA-degraderingsprofil lik den i et tradisjonelt lysisbuffer basert metode for frigjøring av last. Disse dataene indikerer at arbeidsflyten av exosomal utgivelsen last kan forenkles gjennom bruk av en syklisk firkant bølge for forstyrrelse av exosome lipid membran. Denne forenklede fremgangsmåte tillater hurtig frigivelse last uten behov for lysering av buffere som kan påvirke exosome last, og som et resultat av EFIRM metoden ser ut til å være en foretrukket metode for exosomal innholds studier, sammenlignet med de tradisjonelle metoder for ultrasentrifuge og bruk av lysisbuffere. Følsomhet, spesifisitet, og brukervennlighet av EFIRM metoden gjør det ideelt for å trekke ut exosomes fra en Biovæske og raskt å teste intern innhold for både nukleinsyrer og protein mål.
Den EFIRM metodologi ble anvendt til undersøkelse av en naken mus modell som ble injisert med H460 human lungekreft celle. De H460-humane lungekreftceller ble også transfektert med human CD63-GFP, slik at exosome overflatemarkører CD63 ville ha en fluoriserende egenskap. Etter en periode på 20 dager, ble museserum og spyttprøver oppsamlet, og EFIRM metodologi ble anvendt for å analysere deres exosomal innhold. Denne studien viste lineære sammenhenger mellom serum og spyttprøver (R = 0,79). Implikasjonene av disse resultatene er todelt: For det første, evnen til å fange exosomes fra biofluids antyder at distale kreftceller er i stand til å overføre exosomes til andre deler av kroppen, spesielt i denne studien munnhulen. Second, linearitet observert mellom serum og spyttprøver tyder på at spytt kan være en troverdig Biovæske for fangst av exosomes som er produsert i en sykelig tilstand av kroppen (dvs. kreft) og analyse av deres molekylær innhold.
Metoden som er beskrevet, og de etterfølgende resultater viser at fremgangsmåten er egnet for å ekstrahere exosomes fra biofluids basert på deres overflatemarkører (i omfanget av dette arbeidet, er CD 63 overflaten markør valgt). For fremtidige prosjekter, er det of merit å undersøke om målretting ytterligere overflatemarkører exosomes (for eksempel CD 9) eller kombinere EFIRM metoden med andre teknikker vil forbedre utvinning og testing av exosome innhold.
Exosome biologi er et lovende område av studiet for translasjonell medisin, og følgende studiens data tyder på at spytt exosomal analyse kan være en arena for å identifisere sykdoms diskriminerende biomarkører. Tidig etterforskningsynes hensiktsmessig å avgjøre om distale sykdoms biomarkører kan brukes til ikke-invasiv diagnostikk. EFIRM som metode kan bidra bane vei til mer effektiv analyse av slike mål innenfor exosomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
David Wong er co-grunnlegger av RNAmeTRIX Inc., en molekylær diagnostikk. PeriRx LLC lisensieres videre intellektuelle egenskaper knyttet til molekylær diagnostikk fra RNAmeTRIX. David Wong er en konsulent til PeriRx.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Nasjonalt Senter for Forskningsressurser og Nasjonalt Senter for Advancing Translasjonsforskerne Sciences, National Institutes of Health, gjennom Grant UL1TR000124 (til FW); Felix & Mildred Yip gaveprofessorat og Barnes Family Fund (til DTWW), National Institute of Dental og kraniofaciale Forskning av National Institutes of Health i henhold Award Number T90DE022734 (til MT). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
| 16x Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
| Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
| Neodynium Magnetics (1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
| Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
| Mettler Toldeo 3 M KCl Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
| Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
| 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
| Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
| Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |
References
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer. Clinical Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
- Lau, C. S., Wong, D. T. W. Breast Cancer Exosome-like Microvesicles and Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-Derived Exosome-like Microvesicles In. Vitro. PLoS ONE. 7 (3), e33037 (2012).
- Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatolog. 56 (5), 1946-1957 (2012).
- Dear, J. W., Street, J. M., Bailey, M. A. Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling. Proteomics. 13 (10-11), 1572-1580 (2013).
- Lässer, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9 (1), 9 (2011).
- Palanisamy, V., et al. Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes. PLoS ONE. 5 (1), e8577 (2010).
- Camussi, G., et al. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lau, C., et al. Role of pancreatic cancer-derived exosomes in salivary biomarker development. The Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26888-26897 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids. Current Protocols in Cell Biology. 3 (22), (2001).
- Park, N. J., Li, Y., Yu, T., Brinkman, B. M. N., Wong, D. T. Characterization of RNA in Saliva. Clinical Chemistry. 52 (6), 988-994 (2006).
- Wei, F., et al. Bio/Abiotic Interface Constructed from Nanoscale DNA Dendrimer and Conducting Polymer for Ultrasensitive Biomolecular Diagnosis. Small. 5 (15), 1784-1790 (2009).
- Wei, F., et al. Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection. Clinical Cancer Research. 15 (13), 4446-4452 (2009).
- Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM). Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).
