通过电场诱导释放和测量（EFIRM）检测外体生物标志物

Abstract

外来体是起到间通讯中介的作用，小泡结构。这是研究的外来体的内部货物以确定它们是否携带疾病的生物标志物的歧视性的兴趣。用于执行外来体分析，有必要开发用于提取和分析来自靶生物流体的外来体，而不会损坏内部内容的方法。

电场诱导释放，并测量（EFIRM）是用于具体提取外来体从生物流体，卸载他们的货物，并测试其内部的RNA /蛋白质含量的方法。使用抗人类CD63特定抗体的磁性微粒，外来体被首先从生物流体中沉淀。以下提取，低压电环状方波（CSW）被施加到破坏泡囊膜而引起的货物装卸。外来体的含量杂交固定在电极表面，用于QUA的DNA引物或抗体的ntification分子内容。

该EFIRM方法是有利的提取外来体和卸载货物中的分析，而无需裂解缓冲液。该方法是能够执行RNA和蛋白质生物标志物的目标的特异性检测，在外来体中。 EFIRM提取具体地说明在其表面上的标记的外来体，而不是基于大小的技术。

透射电子显微镜（TEM）和测定表明该方法对于外来体捕获和分析的功能。该EFIRM方法用于外来体注射人肺癌细胞H640 9小鼠的分析，以测试它们的外来体信息对11只小鼠接受盐水对照（转染以表达外来体标记人类CD63-GFP的细胞系）。外体生物标志物水平升高（参照基因GAPDH和蛋白质表面标志CD63人-GFP）被发现的H640小鼠注射血清和唾液样本。此外，贝VA和血清样品证明具有线性关系（r = 0.79）。这些结果暗示对唾液外来体的生物标志物用于检测远端疾病的可行性。

Introduction

切体研究是调查的一个新兴领域，它检查携带RNA ^{1，DNA 2}和³的蛋白脂类货物微泡。以前的调查外来体生物学已经导致鉴定外来体的生物流体诸如血液^4，尿^5，母乳⁶和唾液^7。研究表明，外来体发挥不同细胞途径的作用，远程沉思的体⁸的不同系统之间的通信。的作用，因为外来体在细胞间通讯玩，假定它们可以打包与疾病状态相关的生物分子靶（蛋白质，RNA和DNA）。 体外 ³和动物模型⁹的研究显示为证实这一假设。在调查的生物标志物发现外来体的内容，有必要制定从生物液体选择性切体隔离的方法，诱导expulsi货物从外来体，和切体生物分子​​的定量。在这项工作中的程度，外来体将被定义为具有直径为约70-100纳米，具有表面标记CD63的结构。

研究人员通常先净化外来体由超速^10，然后经过加工裂解液袋使用外体内容。裂解缓冲液的方法的使用需要的孵育时间范围从数分钟到数小时。这个过程可能会潜在危害的外来体货，导致样品降解。例如，通过裂解缓冲液释放到周围的细胞外环境唾液外来体RNA具有的半衰期小于1分钟，使得外来体RNA后裂解的测定缓冲一个特别困难的任务不添加稳定化试剂^11。添加各种试剂溶解和稳定的配合作用可以引入该复杂化剂和干扰ANALYSIS的外来体内容。另一种做法可以是用于快速卸外来体内容并安全地保存货物为表征很有帮助。

在这项工作中，我们提出了一个非均匀电场的用法的外来体内容的释放。电场已被公知的携带极化和破坏形成细胞膜脂双层的能力。我们的实验工作探索不均匀环状方波（CSW）的用法用于破坏外来体的微泡结构和​​释放运载的货物。这种方法在几百毫伏范围内使用电压，这意味着大多数生物分子不会中断。我们表明，环状方波的使用能够致动的唾液mRNA的外来体内容释放进入周围环境中的流体。此释放的外来体内容无缝地与可用于量化生物标志物表达水平的电极系统集成^12,13，该提出的方法允许快速，灵敏，和裂解缓冲液不含外来体含量分析。

图EFIRM工作流1.概述^。该EFIRM方法大致分为三个主要阶段所必需的纯化和分析外来体。

这个CSW基于外来体内容释放和分析方法被用在与CD63的特异性磁微珠为外来体隔离结合使用。这些CD63亲和力磁珠允许从唾液样品（和其他生物流体）的外来体的选择性分离。在温育和提取使用磁化珠的外来体，珠粒被迁移到的CSW基于内容发布和实验分析部的电化学传感器系统。 图1给出了工作的概述流动EFIRM方法。

Protocol

1.基于磁珠的外来体提取

1. 吸管5微升链霉亲和涂层的磁性体微粒的充分混合的溶液加入495微升磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液中离心管，以重悬珠子。用磁力架洗，重悬珠用500μlPBS中的3倍。机架是磁体上的壳体单元，可容纳的样品的离心管的侧阵列。
   1. 对于每一个洗，先让管子坐在架1分钟，然后用枪头小心地取出上清缓存，而不会干扰珠。
   2. 放置在常规机架管子而不磁铁在侧。添加500微升PBS入管，并使用移液管以混合溶液和珠在一起。然后把管背面磁性机架上再次从溶液中分离磁珠。
   3. 通过磁化和再悬浮在PBS中执行此清除缓冲区总共三次。此进行磁性粒子的初始洗涤。
2. 重悬珠子到490微升的PBS缓冲液中，与管放置在磁性支架的非磁化部。吸管5微升生物素化的小鼠抗人CD63抗体以1.0mg / ml储备浓度成珠的混合物。使用吸移管以混合珠和抗体在溶液中。
3. 将离心管与珠和生物素标记抗体的混合物样品上肩。设置的旋转器参数为往复旋转样品旋转器，在90°倾斜5秒，并在5℃振动1秒。旋转样品珠混合物在管的这些参数在室温30分钟。
4. 结合后，除去未结合的抗体。
   1. 以下旋转在室温30分钟后，将管背磁架中5分钟。
   2. 通过使用微量吸管除去液相执行珠粒洗涤三次并清洗用500μ;升PBS的。三重洗涤后，悬浮于机架的非磁化部分在490微升酪蛋白的PBS和地点的珠子。
5. 外来体提取使用抗体包被的珠子。
   1. 标记每个管有针对性的样品ID。吸取血清或唾液的10微升样品放入离心管中。使用吸管吹打几次以混合样品和磁性珠粒。
   2. 放置与旋转器样品和抗人CD63抗体的珠子的管子和旋转2小时，在室温。如在步骤1.2中所述使用相同的旋转器的参数。
   3. 以下的2个小时的样品旋转的，由磁化分离珠从溶液中去除液体相用微量吸管，并在500微升的Tris-HCl缓冲液重悬珠子进行三重洗涤。所得珠粒现在结合到外来体，并准备对电场释放和测量。

2.电场感应发布了次外体含量的测定

1. 电极的初始与预涂底漆GADPH
   1. 适用于塑料以及一个电极阵列，以防止交叉污染的个别电极。对于这个实验，使用16传感器电极阵列与每个单元的电极由一个工作，计数器，和参考制成的裸金电极的阵列中。
   2. 吹打库存试剂与超纯蒸馏水的管制备股票混合物100nM的DNA探针，0.3M KCl和10mM的吡咯。涡旋调匀。
      注：在本研究中，所选择的DNA探针对应于GAPDH基因的参考，这是公知的外来体中存在。所使用的探针序列是：5'-生物素 - AGGTCCACCACTGACACGTTG-3'。上所有的电极使用此混合物。
   3. 吸管上各金电极的表面60微升单体-DNA探针混合物。检查电极，以确保有工作角的足够的覆盖范围ounter，和参考电极由液体混合物。
   4. Electropolymerize单体探针混合物通过施加环状方波（CSW）电场分布到电极表面，以创建在电极表面上的导电聚合物层。该电场由申请350 mV的9秒，并立即切换到950毫伏1秒。应用此环状方波剖面向电极对10个循环，共100秒施加的电场的。
   5. 冲洗传感器表面3次，用蒸馏水和干氮气以从电极表面除去液体。确保液体从电极适当除去。
2. 切体卸货
   1. 负载5微升1μM的一个探测器探测到495微升珠外来体复合物的混合物，并使用移液管混合。
      注：检测探针是偶联于荧光素分子在3'末端的DNA引物序列。该探测器概率用于此留学e序列对应于外来体中找到的GAPDH的mRNA。荧光素缀合的检测探针的序列是：5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC荧光素-3'。
   2. 吸管上与下一个磁体阵列金电极表面60微升探针​​和珠子的外来体复合物的混合物。这种磁体阵列由排列以对应于所述传感器的工作电极162.54毫米直径的钕磁铁。 图2A示出的放置在磁铁和珠外来体溶液。
   3. 一旦样品在电极表面上加载，应用20个周期的CSW电场与9秒，在-300毫伏和1秒，200毫伏（200秒计）。被释放的外来体的货物将杂交到引物的电极的表面上。如果外来体的表面标记是调查对象，跳过实验的这一部分。 图2B示出了这个过程。
   <LI>洗掉由三重漂洗电极表面用蒸馏水在电极表面上的未结合的分析物。干燥氮气的电极。
3. 记者抗体和读出
   1. 加入60微升150单位/ ml的抗荧光素抗体缀合到辣根过氧化物酶（在1 HRP：1,000稀释度）稀释于酪蛋白/ PBS中。
   2. 使用电场驱动的缀合复合物的抗荧光素HRP到探针三明治。申请-200毫伏为1秒和500毫伏，1秒，5个循环到电极表面上。 图2A示出了用于两个蛋白质和核酸的系统的捕获和检测探针复合物。
   3. 使用蒸馏水和干氮气三重洗涤传感器表面。
   4. 继洗掉未结合的多余的抗荧光素抗体的，加入60微升的3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物。装载在该基板上，以使用多通道移液管的每个传感器的表面上。
   5. 通过测量电极的电流在-200毫伏为60秒，使用能够16路同时测量的电化学电位执行当前的安培读数。 图2C是在读出期间电流分布的一个例子。

图2.组件EFIRM方法。（A）中提取使用抗人类CD63包被的磁性微粒生物流体外来体，然后使用施加到颗粒外来体复合物的循环方波卸货物外来体的方法。电极的生物传感器的（B）的计划用于从释放外来体检测的RNA / DNA /蛋白质的目标。 （C）的距离EFIRM方法论，安培读出的代表性的例子，其中较大的电流幅度将对应吨Ø更高水平的生物分子。这个数字是从威等¹⁴ 请点击此处查看该图的放大版本。

Representative Results

珠用TEM的外来体捕获验证

以下通过使用透射电子显微镜（TEM）图像提取协议使用抗人类CD63磁性珠从唾液外来体的分离进行了验证。 TEM显示磁珠与70-100纳米颗粒直接相邻（ 见图3A和3B），与外来体的已知轮廓相一致。观察为磁珠唾液那些没有缀合到它们的抗人CD63抗体先前（ 见图3C和3D）无70-100纳米颗粒。

图磁性微粒3. TEM图像。（A）与70-100纳米相邻的小颗粒的抗人CD63磁性纳米粒子的图像。 （B）ENLA磁性纳米粒子，观察颗粒rged观点。 （C）用无抗体缀合的磁珠的图像。 （D）的磁珠与无抗体缀合放大图。这个数字是从威等¹⁴ 请点击此处查看该图的放大版本。

研究外来体内容发布使用CSW电场

抗人CD63珠粒TEM图像显示邻近于磁珠（ 见图3A）70-100纳米颗粒。以下使用磁性珠的外来体的捕获，样品被处理以并联的两个不同的方法。所用的第一种方法是的Triton-X 100的洗涤剂裂解外来体和第二种方法是环状的方波（CSW）的电场裂解缓冲液游离法在这项工作中所讨论的的Triton-X 100的方法的芳（详情魏（E T） 人 ¹⁴描述E）。这些处理的外来体珠复合物用TEM分析，并使用在这项工作中所描述的电化学方法的mRNA的对照基因进行定量。在这项研究中所使用的参考基因GAPDH，这是目前在大多数外来体。

TEM图像显示双方的Triton-X 100和CSW电场处理的样品中，有一位著名的缺席附 ​​着在磁珠后两者CSW和Triton-X 100的处理方法（ 见图4B-II和外来体结构的图4B-ⅳ）。两者的Triton-X 100和CSW电场处理的样品中的GAPDH表达水平的测量具有相似的轮廓：即下面的不同的裂解协议，有在测定GAPDH水平的降低随着时间的进展，这表明外来体的曝光的mRNA的唾液的extravesicular环境（参见图4C）。

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图4.与循环方波外来体货物释放。（A）电CSW的释放方法的图中的效果。 （B）的外来体的TEM图像：（ⅰ）CSW释放之前，（ⅱ）CSW方法后，（三）在裂解缓冲液的方法，（ⅳ）后的裂解缓冲液的方法。 TEM照片的背景是莱西的支持。 （C）的外来体的GAPDH mRNA水平的定量时裂解缓冲液和电场CSW被应用。这个数字是从威等¹⁴ 请点击此处查看该图的放大版本。

检查EFIRM性能检测表面蛋白和mRNA的包庇

评价EFIRM和COMPA的里森以传统的方法进行。 EFIRM物相比，使用免疫印迹蛋白质的定量（对于人类CD63-GFP，表面标志物的外来体）和定量PCR进行RNA的定量（使用GAPDH作为mRNA靶）。因为人CDP63-GFP是外来体的表面上，CSW没有被施加到卸载外来体的货物。蛋白质和RNA测试的结果在图5A和5B分别示出。

特异性试验也通过将人的外来体与来自小鼠的样品进行的外来体为EFIRM。这些特异性试验涉及的鼠标不同的比例混合，以人体标本。该实验的结果表明，当小鼠外来体含量高于人的含量大于5倍，人外来体的蛋白质和mRNA仍然可以被识别和量化（参见图5C和5D为蛋白质和RNA，分别）。

使用外来体稀样图5. EFIRM绩效评估的mRNA和蛋白水平。EFIRM和免疫印迹的GFP部分的（A）比较。 EFIRM和qPCR的（B）进行比较GAPDH的mRNA。 （C）的用于稀释在不同量的小鼠的外来体的人的外来体相关检测的GFP信号电平。 （D）的相对检测的信号为GAPDH的mRNA稀释在不同量的小鼠的外来体的人的外来体。这个数字是从威等¹⁴ 请点击此处查看该图的放大版本。

外体量化的内容从小鼠唾液

为了确定检测外的可行性唾液样品中的常染色体含量，使用裸鼠模型。这个裸鼠模型接收到胸膜间注射1×10 ⁶人肺癌细胞H460或盐水（将其转染到还表达外来体标记人类CD63-GFP的细胞系）的。有报道说，接收的100微升盐水的阴性对照，9只小鼠接收的细胞注射11只小鼠。以下20天，血清和唾液样品从两组小鼠收集。

用法人类CD63-GFP蛋白在小鼠血清和唾液中的相对水平的EFIRM方法允许定量。两个血清的小鼠和唾液之间的相对水平的比较显示出两个生物流体（R = 0.79）之间的线性关系。此外，显著差异，观察在人CD63-GFP水平为H460注射的小鼠对盐水注射小鼠。这表明，从远端肿瘤细胞的外来体被贩卖INT澳血管和唾液。比较血清和唾液中的结果示于图6中 。

图6. EFIRM人类CD63-GFP在血清和唾液相对水平的评估。人类CDP63-GFP的从注射了人肺癌细胞的小鼠的相对水平的比较研究。血清和唾液样本对人类CD63-GFP之间存在线性关系。人类CD63-GFP的水平升高在注射细胞的小鼠（与盐水注射的小鼠）。该图是从卫等人 ¹⁴

Discussion

其结果表明，抗 - 人CD63包被的磁性纳米颗粒能够特异性捕获具有的尺寸范围为70-100纳米的小颗粒。这个捕获粒子是与外来体的先前观察到的轮廓相一致。此外，低电压的CSW以下，颗粒的捕获的使用被示为从胎圈表面除去它们，并导致DNA降解型材类似于传统的裂解缓冲液基础的方法对货物的释放。此数据表明，外来体货物释放的工作流可以通过一个环状的方波的外来体的脂质膜的破坏的应用被简化。这种简化的方法允许快速货物释放，而不需要用于裂解缓冲剂可能外来体货物造成不利影响，并且其结果是EFIRM方法似乎是一种优选的方法为外来体含量的研究相比，超离心和溶解的使用传统方法缓冲区。敏感性，特异性和易用性的EFIRM方法使得它非常适用于生物流体提取外来体和快速检测为核酸和蛋白质的目标内部内容。

该EFIRM方法被施加到裸鼠模型的那个用H460人肺癌细胞中喷射出的研究。该H460人肺癌细胞，另外转染人CD63-GFP使外来体表面标记物CD63的将具有荧光性质。经过一段时间的20天，小鼠的血清和唾液样本收集，并且EFIRM方法被用来分析它们的外来体的内容。这项研究表明血清和唾液样本（R = 0.79）之间的线性相关性。这些结果的影响是双重的：首先，从生物流体捕获外来体的能力表明远侧癌细胞能够在这项研究中发送外来到身体的其他段，最显着的口腔。 S的Econd，血清和唾液样品之间观察到的线性度表明，唾液可以是一个可信的生物流体为那些在体内产生（ 即 ，癌症），以及它们的分子的内容分析的疾病状态的外来体的捕获。

所描述的方法和随后的结果表明，该方法适合于从基于其表面标记生物流体提取外来体（在该工作范围，光盘63是所选择的表面标记物）。对于未来的项目，这是值得的，以研究是否针对额外的表面标志外来体（如CD 9）或EFIRM方法与其他技术相结合将提高外来体内容的提取和检测。

外来体生物学是研究转化医学的一个有希望的领域，而下面的研究数据表明，唾液外体的分析可以是一个场所，确定疾病的歧视性的生物标志物。未来的调查似乎是适当确定远侧疾病的生物标志物是否可用于非侵入性诊断。 EFIRM作为一种方法可以帮助铺平道路，以这样的目标，在外来体更有效的分析。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface	Genefluidics, USA	RS-1000-16
16x Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips	Genefluidics, USA	SC1000-16X-B
Biotinylated anti-human CD63 Antibody	Ancell, USA	215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, USA	65601
Neodynium Magnetics (1/10" dia. x 1/32" thick)	K&J Magnetics, USA	DH101
Ultrapure Distilled Water	Life Technologies, USA	10977-023
Mettler Toldeo 3 M KCl Solution	Fisher Scientific, USA	1911512
Pyrrole	Sigma-Aldrich, USA	W338605-100g
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments	Roche, Germany	11426346910
3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity)	Neogen, Usa	330175
Phosphate Buffered Saline Solution	Life Technologies, USA	10010023
Casein/PBS	Fisher Scientific, USA	37532