Abstract
エキソソームは、細胞間コミュニケーションにおける仲介の役割を果たして微小胞構造体である。彼らは病気差別バイオマーカーを運ぶかどうかを決定するエキソソームの内部の貨物を研究するために重要である。エキソソーム分析を行うためには、内部コンテンツに損傷を与えることなく、標的生体液からエキソソームを抽出し、分析するための方法を開発する必要がある。
電界誘起放出および測定（EFIRM）は、特に、生体液からのエキソソームを抽出し、その積荷を降ろして、その内部RNA /タンパク質含有量を試験するための方法である。抗ヒトCD63特異的抗体磁性微粒子を用いて、エキソソームは、まず生体液から沈殿させる。抽出後、低電圧電気サイクリック方形波（CSW）は、小胞膜を破壊し、貨物搬出を引き起こすために適用される。エキソソームの内容は、資格でのために電極表面上に固定化されたDNAプライマーまたは抗体とハイブリダイズさせる分子コンテンツのntification。
EFIRM方法は、エキソソームを抽出し、溶解緩衝液なしの分析のために貨物をアンロードするために有利である。この方法は、エキソソームの両方のRNA及びタンパク質バイオマーカー標的の特異的な検出を行うことができる。サイズベースの技術とは対照的にEFIRMは、具体的には、それらの表面マーカーに基づいて、エキソソームを抽出する。
透過型電子顕微鏡（TEM）およびアッセイは、エキソソームキャプチャおよび分析のための方法の機能性を実証する。 EFIRM法は、生理食塩水コントロールを受けた11匹のマウスに対して彼らエキソソームプロファイルをテストするために、ヒト肺癌H640細胞を注射した9匹のマウス（エキソソームマーカー、ヒトCD63-GFPを発現するようにトランスフェクト細胞株）の分析をエキソソームに適用した。エキソソームのバイオマーカーのレベルの上昇（参照遺伝子GAPDHおよびタンパク質表面マーカーのヒトCD63-GFP）は、H640の両方の血清および唾液サンプルをマウスに注射するために見出された。さらに、SalIでvaの血清試料を、直線性（R = 0.79）を有することが実証された。これらの結果は、遠位疾患の検出のための唾液エキソソームのバイオマーカーの生存のために示唆している。
Introduction
エキソソーム研究は、RNA 1、DNA 2、およびタンパク質3貨物を運ぶ脂質微小胞を調べ、調査の新興分野である。エキソソーム生物学の以前の研究は、血液4、尿5、母乳6、および唾液7などの生体液中のエキソソームの同定につながった。研究では、遠隔体8の異なるシステム間の通信を瞑想、エキソソームは、異なる細胞経路に役割を果たすことが実証されている。ロールのエキソソームは細胞間コミュニケーションにおいて役割を果たすので、それらは疾患状態と相関して生体分子標的（タンパク質、RNA、およびDNA）をパッケージ化することができると仮定される。 インビトロ 3および動物モデル9の研究は、この仮説を裏付けるように見える。バイオマーカー発見のためのエキソソームコンテンツを調査において、それは生体液から選択エキソソームを単離するための方法論を開発することが必要である、誘起expulsiエキソソームからの貨物、およびエキソソーム生体分子の定量化の上で。この作業の範囲では、エキソソームは、構造体は、約70~100ナノメートルの直径を有し、表面マーカーCD63を有するとして定義される。
研究者は、通常、最初の超遠心分離10によってエキソソームを精製した後、溶解バッファーキットの使用を通じてエキソソームコンテンツを処理する。溶解緩衝液法の使用は、数分から時間の範囲のインキュベーション時間を必要とする。このプロセスは、潜在的にエキソソーム貨物を害する劣化をサンプリングする可能性がある。例えば、周囲の細胞外環境への溶解緩衝液を介して放出唾液エキソソームRNAは、エキソソームRNA溶解後の測定が安定化試薬11を添加せずに、特に困難な作業バッファ作る、1分間の下での半減期を有している。溶解および安定化のための様々な試薬を加えるの配合効果が複雑にエージェントを導入し、ANALYを妨害する可能性がエキソソームコンテンツのSIS。別のアプローチは、迅速にエキソソームコンテンツをアンロードし、安全に特徴づけのために貨物を保持するのに役立つことができる。
本研究では、エキソソーム内容物の放出のために不均一な電界の使用を提案する。電気フィールドが分極し、細胞膜を構成する脂質二重層を破壊する能力を運ぶことが知られている。私たちの実験的な作品は、エキソソームの微小胞の構造を破壊し、運ば貨物を解放するために、不均一な周期的な方形波（CSW）の使用方法を探ります。この方法は、ほとんどの生体分子が中断されないことを意味し、数百ミリボルトの範囲で電圧を使用しています。我々は、環状方形波の使用は、周囲の流体環境に唾液エキソソームのmRNA内容物の放出を作動することができることを実証する。エキソソームコンテンツのこのリリースは、シームレスに、バイオマーカーの発現レベルを定量するために使用することができ、電極システムに統合されている12,13。この提案された方法は、エキソソームコンテンツの迅速、高感度、および溶解バッファー無料で分析することができます。
EFIRMワークフロー図1.概要。。EFIRM法が広くエキソソームを精製し、分析するために必要な三つの主要段階に分けられる。
このCSWベースエキソソームコンテンツ放出および分析方法は、エキソソームを単離するためのCD63特異的磁気ビーズと組み合わせて使用される。これらのCD63-親和性ビーズは、唾液サンプル（および他の生体液）からのエキソソームの選択的な単離を可能に。インキュベーションおよび磁化ビーズを使用してエキソソームの抽出に続いて、ビーズは、 図1を参照 。内容物の放出実験の分析部をベースCSWための電気化学センサーシステムに移行作業の概要を示しているEFIRM方法のフローチャート。
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Protocol
1.磁気ビーズベースのエキソソームの抽出
- ビーズを再懸濁し微小遠心管にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）バッファーの495μlの中にストレプトアビジン被覆磁性微粒子を5μlのよく混合溶液をピペットで。磁気ラックを使用して3回洗浄し、500μlのPBSでビーズを懸濁します。ラックは、サンプル微小遠心管を保持することができる収納部側の磁石のアレイである。
- 各洗浄のために、最初のチューブは1分間のラックの上に座るし、その後慎重にビーズを乱すことなく上澄み液を除去するためのピペットチップを使用してみましょう。
- 側の磁石せずに定期的なラックにチューブを置きます。チューブに500μlのPBSを追加し、一緒に解決し、ビーズを混合するために、ピペットを使用しています。その後、再び溶液からビーズを分離するための磁気ラック上に戻ってチューブを置く。
- PBS aの磁化と再懸濁を介してバッファのこの削除を実行します合計3回。これは、磁性粒子の最初の洗浄を行います。
- 磁気ラックの非磁化部分に配置されたチューブを、PBS緩衝液490μlの中にビーズを再懸濁する。ビーズの混合物中に1.0 mg / mlのストック濃度でビオチン化マウス抗ヒトCD63抗体のピペットで5μL。溶液中のビーズと抗体を混合するためにピペットを使用してください。
- サンプル回転子上のビーズとビオチン化抗体混合物を用いてマイクロチューブを置きます。 5秒間傾けると1秒間5℃で振動90°で相互の回転のためのサンプル回転子のための回転子のパラメータを設定します。 RTで30分間、これらのパラメータでサンプル·ビーズ混合管を回転させます。
- 共役した後、未結合抗体を除去する。
- RTで回転の30分に続いて、5分間のバック磁気ラック内のチューブを配置します。
- マイクロピペットを用いて、液相を除去することにより、ビーズの3回の洗浄を行い、500μで洗浄、PBSのリットル。トリプル洗浄後、490カゼイン-PBSのμLとラックの磁化されていない部分に所定の位置にビーズを再懸濁します。
- 抗体コートビーズを使用したエキソソーム抽出。
- ターゲットを絞ったサンプルIDを各チューブにラベルを付けます。マイクロ遠心チューブに血清または唾液10μlのサンプルをピペットで。数回ピペッティングしてサンプルとした磁気ビーズを混合するためにピペットを使用してください。
- ローテーター上のサンプルと抗ヒトCD63抗体ビーズを有する管を配置し、室温で2時間回転させる。ステップ1.2で説明したのと同じ回転子パラメータを使用してください。
- 回転サンプルの2時間に続いて、溶液からビーズを分離するために磁化するマイクロピペットで液相を除去し、トリス塩酸緩衝液500μlでビーズを再懸濁することにより、トリプル洗浄を行う。結果として得られるビーズは今エキソソームに結合させ、電界放出および測定のための準備ができているされている。
2.電界誘起リリースNDエキソソーム量の測定
- GADPHプライマーを有する電極の初期のプレコーティング
- プラスチックウェルに個別電極の交差汚染を防ぐために電極アレイを適用する。この実験では、裸の金製の作業、カウンタ、および基準電極からなるアレイ内のそれぞれの単位電極16センサ電極アレイを使用する。
- 超純蒸留水でチューブに株式試薬をピペッティングすることにより100 nMのDNAプローブ、0.3 MのKCl、および10mMのピロールの原料混合物を準備します。ボルテックスで完全に混合。
注：この研究のために選択されたDNAプローブは、エキソソーム内に存在することが知られているGAPDHを参照遺伝子に対応する。使用したプローブ配列は5'-ビオチンAGGTCCACCACTGACACGTTG-3 '。すべての電極上でこの混合物を使用してください。 - ピペットで各金電極の表面にモノマー-DNAプローブ混合物を60μl。作業、cは適切な範囲があることを保証するために電極を調べる液体混合物によるounter、及び基準電極。
- Electropolymerizeモノマープローブの混合物は、電極表面に周期的な方形波（CSW）電界プロファイルを適用することにより、電極表面上に導電性高分子層を作成する。この電界は9秒350 mVのを適用すると、すぐに1秒間950 mVのへの切り替えで構成されています。印加電界の100秒、合計10サイクルの電極は、この環状の方形波プロファイルを適用する。
- 電極の表面から液体を除去するために蒸留水および窒素ガスで乾燥して、センサ表面を3回すすぐ。液体が適切に電極から削除されていることを確認してください。
- エキソソーム貨物アンロード
- ビーズ - エキソソーム複雑な混合物の495μLにロード検出プローブの1μMの5μlのと混合するピペットを使用しています。
注記：検出プローブは、3 '末端にフルオレセイン分子に結合DNAプライマー配列である。検出器PROBこの研究のために使用される電子シーケンスはエキソソーム内にあるGAPDH mRNAに対応している。フルオレセイン結合検出プローブの配列は以下のとおりである：5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-フルオレセイン-3 '。 - ピペットの下に磁石アレイと金電極表面へのプローブとビーズ - エキソソーム複雑な混合物60μlの。この磁石アレイは、センサの作用電極に対応するように整列16 2.54ミリメートルの直径のネオジム磁石で構成されています。 図2（a）は、磁石とビーズエキソソームソリューションの配置を示している。
- サンプルは電極表面にロードされると、-300 Mvで9秒、200 MV（200秒の合計）で1秒でCSW電界の20サイクルを適用します。解放されるエキソソーム貨物は電極の表面にプライマーにハイブリダイズするであろう。エキソソームの表面マーカーは、調査の対象である場合、実験のこの部分をスキップする。 図2Bは、このプロセスを示している。 <李>ウォッシュオフ三重蒸留水で電極表面を洗浄することにより、電極表面に結合していない分析物。窒素ガスで電極を乾燥させる。
- ビーズ - エキソソーム複雑な混合物の495μLにロード検出プローブの1μMの5μlのと混合するピペットを使用しています。
- （：1,000希釈1にHRP）カゼイン/ PBSで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに結合し150単位/ mlの抗フルオレセイン抗体60μlのを追加します。
- プローブサンドイッチに複雑な抗フルオレセインHRPに電界駆動型共役を使用してください。電極表面に5サイクルのために1秒1秒、500 mVのために-200 mVのを適用します。 図2（a）は、タンパク質および核酸システムの両方のための捕捉および検出プローブ複合体を示しています。
- 蒸留水と窒素ガスとの乾燥を使用してトリプル洗浄センサー表面。
- 未結合の過剰抗フルオレセイン抗体の洗浄除去に続いて、3,3 '、5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）基質の60μlを添加する。マルチチャンネルピペットを使用して、各センサー表面上に、この基板をロードします。
- 16チャネルの同時測定が可能な電気化学ポテンショスタットを用いて60秒間-200 Mvで電極電流を測定することにより、現在の電流測定読み出しを実行します。 図2Cは、読み出し時の電流プロファイルの一例である。
EFIRM法の図2のコンポーネント。（A）抗ヒトCD63被覆した磁性微粒子を使用して、生体液からエキソソームを抽出した後、粒子-エキソソーム複雑に適用される周期的な方形波を用いたエキソソーム貨物をアンロードする方法。解放エキソソームからRNA / DNA /タンパク質標的を検出するために使用される電極バイオセンサーの（B）のスキーム。 （C）より大きい電流の大きさをtに対応EFIRM法、電流測定からの読み出しの代表例生体分子のより高いレベルoをこの図は、Wei らからである。14 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Representative Results
TEMを用いてビーズのエキソソームキャプチャの検証
抗ヒトCD63磁気ビーズを使用して、唾液からのエキソソームの単離は、透過型電子顕微鏡（TEM）画像を用いて抽出プロトコールに従って検証した。 TEMはすぐに、（ 図3A、および3B参照 ）は、隣接するエキソソームの既知のプロファイルと一致して70〜100 nmの顆粒とした磁気ビーズを示しています。いいえ70-100 nmの顆粒は、以前にそれらに結合させた抗ヒトCD63抗体を持っている（ 図3Cおよび3Dを参照）しませんでした唾液中の磁気ビーズのために認められなかった。
磁性微粒子の図3. TEM像。70-100 nmの隣接の小さな顆粒と抗ヒトCD63磁性ナノ粒子の（A）画像。 （B）Enla磁性ナノ粒子のビューをrged、顆粒を観察した。コンジュゲートしていない抗体と磁気ビーズの（C）画像。 （D）コンジュゲートしていない抗体と磁気ビーズの拡大図。この図は、Wei らからである。14 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
CSW電界を用いエキソソームコンテンツのリリースについての一考察
抗ヒトCD63ビーズのTEM画像は、磁気ビーズ（ 図3Aを参照）に隣接して70~100 nmの顆粒を示す。磁気ビーズを使用したエキソソームの取り込みに続いて、サンプルは、並列の2つの異なる方法で処理される。使用された最初の方法は、エキソソームを溶解するのTriton-X 100洗剤だった第二の方法は、この作品で議論サイクリック方形波（CSW）電界溶解バッファー無料の方法であった（トリトンX 100方法ARの詳細eはウェイ間tらによって記載14）。これらの処理されたエキソソーム - ビーズ複合体をTEMで分析し、mRNAの参照遺伝子は、この研究に記載の電気化学的方法を用いて定量した。この研究で使用される参照遺伝子は、ほとんどのエキソソーム中に存在するGAPDHあった。
TEM画像は、両方のTriton-X 100及びCSW電場処理した試料において、CSWおよびTriton X-100の治療法（両方とも参照図4B-二以降の磁気ビーズに付着したエキソソーム構造の注目欠如があったことを示し図4B-IV）。両方のTriton-X 100及びCSW電場処理したサンプルにおけるGAPDHの発現レベルの測定は、同様のプロフィールを有していた：異なる溶解プロトコルに従って、測定されたGAPDHのレベルの減少があった、すなわちある時間が進むにつれて、エキソソームの暴露を示す唾液の胞外環境へのmRNA（ 図4Cを参照）。
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巡回方形波エキソソーム貨物リリースに関連する図4の結果。電気CSWの解除方法の（A）図。 （B）エキソソームのTEM像：CSW解放前の（i）、（ii）CSW法の後に、（iii）の溶解緩衝液法の前に、（iv）の溶解緩衝液法の後。 TEM像の背景には、レイシーサポートです。 （C）溶解緩衝液と電界CSWが印加されたエキソソームGAPDH mRNAレベルの定量。この図は、Wei らからである。14 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表面タンパク質の検出とかくまっmRNAについてEFIRMのパフォーマンスの検証
EFIRMとコンパの評価伝統的な方法にrisonを行った。 EFIRMは（mRNA標的としてGAPDHを使用した）RNAの定量のため、および定量PCR（ヒトCD63-GFP、エキソソームについての表面マーカーについて）、ウェスタンブロットを用いたタンパク質の定量化と比較した。人間CDP63-GFPは、エキソソームの表面にあったため、CSWは、エキソソームの貨物をアンロードするために適用されませんでした。タンパク質およびRNAの試験の結果を、それぞれ図5Aおよび5Bに示されている。
特異性試験は、マウスサンプルからエキソソームヒトエキソソームを混合することによりEFIRM行った。これらの特異性試験は、ヒトのサンプルにマウスの異なる比の混合物を含んでいた。実験の結果（それぞれ、タンパク質およびRNAについては、図5Cおよび5Dを参照）、マウスエキソソームコンテンツがヒト含量の5倍であったとき、人間のエキソソームのタンパク質およびmRNAはまだ同定および定量することができたことを示している。
エキソソームの希釈サンプルを用いてmRNAおよびタンパク質レベルについて図5 EFIRMの性能評価 GFP部分上EFIRM及びウェスタンブロットの（A）の比較。 （B）GAPDH mRNAについてEFIRMと定量PCRの比較。 （C）マウスエキソソームの異なる量で希釈したヒトエキソソームの相対検出GFP信号レベル。 （D）マウスエキソソームの異なる量で希釈したヒトエクソソームのためにGAPDHのmRNAの相対検出された信号。この図は、Wei らからである。14 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
マウス唾液から定量エキソソームコンテンツ
エキソ検出の実行可能性を決定するために唾液サンプル中の細胞体の含有量は、ヌードマウスモデルを用いた。このヌードマウスモデルは、1×10 6個のヒト肺癌細胞H460または生理食塩水（またエキソソームマーカーヒトCD63-GFPを発現するようにトランスフェクトされた細胞株）のinterpleural注射を受けた。生理食塩水100μlをネガティブコントロールを受け、9マウスは、細胞の注射を受けた11匹のマウスが存在した。 20日後、血清および唾液サンプルを、2群のマウスから採取した。
EFIRM方法の使用は、マウス血清及び唾液中のヒトCD63-GFPタンパク質の相対レベルの定量化を可能にした。マウスの2血清および唾液との間の相対的なレベルの比較は、2つの生体液（R = 0.79）との間の線形相関を示した。加えて、有意な差がH460ヒトCD63-GFPレベルが観察された生理食塩水を注射したマウスからマウスを注射した。これは、遠位の腫瘍細胞からのエキソソームintを売買されていることを示唆している血管系および唾液O。血清および唾液との比較結果を図6に示す。
血清および唾液中のヒトCD63-GFPの相対レベルの図6 EFIRM評価。ヒト肺癌細胞を注射したマウスからのヒトCDP63-GFPの相対レベルの比較研究。直線性は、人間のCD63-GFPのための血清および唾液のサンプルの間に存在する。ヒトCD63-GFPのレベルは、細胞を注射したマウスで上昇している（生理食塩水を注射したマウスと比較して）。この図は、Wei らからである。14
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Discussion
結果が示すように、抗ヒトCD63被覆した磁性ナノ粒子は、具体的には70〜100ナノメートルの範囲のサイズを有する小さな粒子を捕捉することができる。この捕獲粒子は、エキソソームの以前に観察されたプロファイルと一致している。さらに、粒子の捕捉以下の低電圧CSWの使用は、ビーズ表面から削除し、貨物放出のための伝統的な溶解緩衝液ベースの方法と類似のDNAの分解プロフィールを引き起こすことが示されている。このデータは、エキソソーム貨物放出のワークフローがエキソソーム脂質膜の破壊のための環状の方形波の適用によって簡略化することができることを示している。この簡略化された方法に悪影響エキソソーム貨物に影響を与える可能性の緩衝液を溶解することを必要とせずに迅速な貨物の放出を可能にし、結果としてEFIRM方法は、超遠心分離、溶解の使用する従来の方法と比較してエキソソームコンテンツ研究のための好ましい方法であると思われるバッファ。感度、特異度、およびEFIRM方法の容易さは、生物流体からエキソソームを抽出し、急速に核酸およびタンパク質標的の両方の内部コンテンツをテストするために最適です。
EFIRM方法論は、H460ヒト肺癌細胞を注射したヌードマウスモデルの研究に適用した。エキソソーム表面マーカーCD63は蛍光特性を有するであろうように、H460ヒト肺癌細胞は、さらに、ヒトCD63-GFPでトランスフェクトした。 20日の期間の後、マウス血清および唾液サンプルを採取し、そしてEFIRM方法論は、そのエキソソーム含量を分析した。この研究は、血清および唾液サンプル（R = 0.79）との間の線形相関を示した。これらの結果の意味は2つある：まず、生体液からのエキソソームを捕捉する能力は、遠位の癌細胞は、この研究において、最も顕著には、身体の他のセグメントに口腔をエキソソームを送信することができることを示唆している。 Second、血清および唾液サンプルの間で観察された直線性は、唾液が体内（ すなわち 、癌）およびそれらの分子量の分析の病的状態で産生されるエキソソームを捕捉するための信頼できる生体液であることを示唆している。
方法について説明し、その後の結果は、本方法は、それらの表面マーカーに基づいて、生体液からエキソソームを抽出するために適切であることを示している（この作業の範囲内、CD 63は、選択された表面マーカーである）。将来のプロジェクトのためには、（CDなど9のような）追加の表面マーカーのエキソソームをターゲットに、または他の技術とEFIRM方法を組み合わせることエキソソームコンテンツの抽出とテストを改善するかどうかを調べることがメリットである。
エキソソーム生物学は、翻訳医学のための研究の有望な領域であり、以下の研究のデータは、唾液エキソソーム分析が病気差別的バイオマーカーを同定するための会場であることを示唆している。今後の調査遠位疾患のバイオマーカーは、非侵襲的な診断のために使用することができるかどうかを決定するのに適切であると思われる。方法としてEFIRMはエキソソーム内のこのような目標のより効果的な分析への道を開くに役立つことがあります。
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Disclosures
デビッド·ウォンはRNAmeTRIX社、分子診断会社の共同創設者である。 PeriRx LLCはRNAmeTRIXから分子診断に関連する知的財産のサブライセンス。デビッド·ウォンはPeriRxにコンサルタントです。
Acknowledgments
この作品は、（FW）のグラントUL1TR000124を通じて、トランスレーショナル科学、国立衛生研究所を進めるための研究資源のための国立センター、国立センターによってサポートされていました。フェリックス＆ミルドレッド·イップ寄附教授職と（DTWWへ）バーンズファミリー基金、（MT）の賞数T90DE022734下の国立衛生研究所の歯科·頭蓋顔面研究所研究所。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
| 16x Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
| Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
| Neodynium Magnetics (1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
| Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
| Mettler Toldeo 3 M KCl Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
| Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
| 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
| Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
| Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |
References
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