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Bioengineering

Detecção de Exosomal Biomarker por induzida pelo campo elétrico de lançamento e Mensuração (Efirm)

doi: 10.3791/52439 Published: January 23, 2015

Abstract

Exossomos são estruturas microvesicular que desempenham um papel de mediação na comunicação intercelular. É de interesse para o estudo da carga interna de exossomos para determinar se eles são portadores da doença biomarcadores discriminatórias. Para a realização de análise exosomal, é necessário desenvolver um método para a extracção e análise de exossomas a partir de fluidos biológicos alvo sem danificar o conteúdo interno.

Libertação eléctrica induzida por campo e medição (Efirm) é um método para a extracção especificamente exossomas a partir de fluidos biológicos, descarregar as suas cargas, e testando o seu conteúdo de ARN / proteína interna. O uso de um anticorpo CD63 específico de micropartículas magnética anti-humana, exossomos são primeiro precipitado a partir de fluidos biológicos. Após a extracção, de baixa tensão ondas quadradas eléctricas cíclicos (CSW) são aplicados para romper a membrana vesicular e causar o descarregamento da carga. O conteúdo do exossoma é hibridado com iniciadores de ADN ou de anticorpos imobilizados numa superfície de eléctrodo para quantification de teor molecular.

O método Efirm é vantajoso para a extracção de exossomas carga e descarga para análise sem tampão de lise. Este método é capaz de efectuar a detecção específica de ambos os alvos de ARN e proteína de biomarcadores na exossoma. Efirm extrai exossomas especificamente com base nos seus marcadores de superfície, em oposição a técnicas baseadas em tamanho.

A microscopia electrónica de transmissão (TEM) e ensaio de demonstrar a funcionalidade do método de captura e análise de exossoma. O método foi aplicado para Efirm exosomal análise de 9 ratinhos injectados com células de pulmão humano H640 do cancro (uma linha de células transfectadas para expressar o marcador CD63 humano exossoma-GFP), a fim de testar o seu perfil contra exossoma 11 ratinhos que receberam controlos de solução salina. Níveis elevados de biomarcadores exosomal (GAPDH gene de referência e proteína de superfície do marcador CD63 humano-GFP) foi encontrado com o H640 injetaram em ratos em ambas as amostras de soro e saliva. Além disso, saliva e amostras de soro foram demonstradas ter linearidade (R = 0,79). Estes resultados são sugestivos para a viabilidade de biomarcadores de exossoma salivares para a detecção de doenças distais.

Introduction

Pesquisa exosome é um campo emergente de investigação que examina microvesículas lipídicas que carregam um RNA, DNA 2, 3 e proteína de carga. Inquéritos anteriores da biologia exosome levaram a identificação de exossomos em fluidos biológicos como sangue 4, 5 urina, leite materno 6, 7 e saliva. Estudos têm demonstrado que os exossomas desempenhar um papel em diferentes vias celulares, meditar remotamente a comunicação entre diferentes sistemas do corpo 8. Devido ao papel exossomas desempenhar na comunicação intercelular, é a hipótese de que eles podem empacotar alvos biomoleculares (proteína, RNA e DNA) correlacionados com estados de doença. 3 in vitro e animal modelo 9 estudos parecem confirmar esta hipótese. Ao investigar o conteúdo exosomal para descoberta de biomarcadores, é necessário o desenvolvimento de uma metodologia para o isolamento exosome seletiva de fluidos biológicos, expulsi induzidona carga a partir de exossomas, e quantificação de biomoléculas de exossoma. No âmbito do presente trabalho, os exossomas irá ser definido como uma estrutura com um diâmetro de cerca de 70-100 nm e que possui marcador de superfície CD63.

Os investigadores tipicamente primeiro purificar os exossomas por ultracentrifugação a 10 e, em seguida, processar o conteúdo exosomal através do uso de kits de tampão de lise. O uso de métodos de tampão de lise requer tempos de incubação variam de minutos a horas. Este processo pode potencialmente prejudicar carga exosome e levar para provar degradação. Por exemplo, o ARN exossoma salivar libertado através de tampão de lise para o ambiente extracelular circundante possui uma semi-vida de menos de 1 min, tornando a medição de ARN exosomal pós-tampão de lise uma tarefa particularmente difícil sem a adição de reagentes de estabilização 11. O efeito combinado da adição de vários reagentes para lise e estabilização podem introduzir agentes que complicam e interferir com a Analysis de conteúdo exosomal. Uma abordagem alternativa pode ser útil para uma rápida descarga conteúdo exosomal e preservar a segurança da carga para caracterização.

Neste trabalho, propomos o uso de um campo elétrico não uniforme para a liberação de conteúdo exosomal. Elétrico-campos foram conhecidos para levar a capacidade de polarizar e perturbar a bicamada lipídica que forma as membranas celulares. Nosso trabalho experimental explora o uso de não-uniformes cíclicos ondas quadradas (CSW) para interromper a estrutura microvesículas de exossomos e liberando a carga transportada. Este método utiliza tensões na faixa de várias centenas de milivolts, o que significa que a maioria das biomoléculas não será interrompido. Nós demonstramos que o uso de uma onda quadrada-cíclico é capaz de accionar o conteúdo lançamento de ARNm salivar exossoma no ambiente circundante fluídica. Esta versão do conteúdo exosomal está perfeitamente integrado com um sistema de eletrodos que podem ser usados ​​para quantificar os níveis de expressão de biomarcadores 12,13. Este método proposto permite, e tampão de lise análise livre rápido, sensível do conteúdo exosome.

Figura 1
Figura 1. Visão Geral do Efirm Workflow.. O método Efirm é dividida em três fases principais que são necessários para a purificação e análise de exossomos.

Este método de libertação conteúdo exosomal e análise baseada CSW é usado em conjunto com microesferas magnéticas específicos de CD63 para isolamento exossoma. Estes grânulos de CD63 por afinidade para permitir o isolamento selectivo de exossomas a partir de amostras salivares (e outros fluidos biológicos). Após a incubação e extração de exossomos usando as esferas magnetizadas, as contas são migrados para o sistema de sensor eletroquímico para a CSW baseado liberação de conteúdo e análise de parte do experimento. A Figura 1 apresenta uma visão geral do trabalhofluir do método Efirm.

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Protocol

1. magnética baseado no grânulo exossomo Extracção

  1. Pipetar uma solução bem agitada de 5 mL de micropartículas magnéticas revestidas de estreptavidina em 495 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS), tampão num tubo de microcentrífuga para ressuspender as esferas. Lavar e ressuspender as esferas com 500 ul de PBS três vezes usando uma cremalheira magnética. A cremalheira é uma matriz de magnetos na parte lateral de uma unidade de alojamento, que pode prender os tubos de amostra de microcentrífuga.
    1. Para cada lavagem, primeiro deixe-os tubos de sentar-se no rack para 1 min, e em seguida, usar uma ponteira para remover cuidadosamente o buffer sobrenadante sem perturbar as contas.
    2. Colocar os tubos em uma cremalheira regular sem ímãs na parte lateral. Adicionar 500 ul de PBS nos tubos, e usar a pipeta para misturar a solução e grânulos juntos. Em seguida, coloque os tubos de volta na prateleira magnética para separar novamente as contas a partir da solução.
    3. Realize esta remoção de tampão via magnetização e ressuspensão em PBS umtotal de três vezes. Isso realiza uma lavagem inicial das partículas magnéticas.
  2. Ressuspender as pérolas em 490 ul de tampão PBS, com o tubo colocado na porção não magnetizada da cremalheira magnética. Pipet 5 l de rato biotinilado anticorpo anti-CD63 humano a 1,0 mg / ml de concentração de ações para a mistura de grânulos. Utilizar a pipeta para misturar os grânulos e anticorpo em solução.
  3. Inserir os tubos de microcentrífuga com rebordo e mistura de anticorpo biotinilado num rotor amostra. Defina os parâmetros rotador para o rotator amostra para rotação recíproca a 90 ° de inclinação por 5 segundos e vibrando em 5 ° por 1 segundo. Rodar os tubos de amostra da mistura de pérolas a-esses parâmetros para 30 min à temperatura ambiente.
  4. Remover o anticorpo não ligado após conjugação.
    1. Após 30 minutos de rotação, à TA, coloque os tubos em volta da cremalheira magnético durante 5 min.
    2. Executar três lavagens de grânulos através da remoção da fase líquida utilizando uma micropipeta e lava-se com 500 μ; L de PBS. Após a lavagem triplo, ressuspender as contas em 490 mL de caseína-PBS e coloque sobre a porção desmagnetizado do rack.
  5. Extracção exossoma utilizando esferas revestidas com anticorpo.
    1. Escreva em cada tubo com ID amostra alvejado. Pipetar uma amostra de 10 uL de soro ou saliva no tubo de microcentrífuga. Utilizar a pipeta para misturar a amostra e as esferas magnéticas, pipetando várias vezes.
    2. Colocar os tubos de amostra com e anti-humanos esferas de anticorpo CD63 no rotador e rodar durante 2 horas à temperatura ambiente. Usar os mesmos parâmetros rotador como descrito no passo 1.2.
    3. Após 2 h de amostragem rotativa, fazer uma lavagem tripla através da magnetização de grânulos separados a partir da solução, a remoção de fase líquida com micropipeta, e ressuspensão de grânulos em 500 ul de tampão Tris-HCl. Os grânulos resultantes são agora ligado aos exossomos e estão prontos para o lançamento de campo elétrico e de medição.

2. Elétrica campo induzido Lançado umnd Medição de conteúdo Exosomal

  1. A pré-cobertura inicial de Eletrodo com GADPH Primer
    1. Aplicar um poço de plástico para um conjunto de eléctrodos para impedir a contaminação cruzada dos eléctrodos individuais. Para esta experiência, use um eletrodo de matriz de 16-sensor com cada eletrodo unidade na matriz constituída por um, contador, e eletrodo de referência de trabalho feito de ouro nua.
    2. Prepare uma mistura de ações de 100 sonda nM DNA, 0,3 M KCl, e pirrol 10 mM por pipetagem reagentes de ações em um tubo com puríssima água destilada. Misture bem em vórtice.
      NOTA: Para este estudo, a sonda de DNA seleccionada corresponde ao gene GAPDH de referência, que é conhecida por existir dentro de exossomas. A sequência da sonda utilizada é: 5'-biotina-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 '. Use esta mistura em todos os eletrodos.
    3. Pipetar 60 ul da mistura de sondas de ADN-monómero sobre a superfície de cada eléctrodo de ouro. Examine os eletrodos para garantir que haja uma cobertura adequada do trabalho, counter, os eléctrodos de referência e por a mistura líquida.
    4. Electropolymerize mistura de monómero-sonda para criar uma camada de polímero condutor sobre a superfície do eléctrodo por aplicação de uma onda quadrada (CSW) cíclico perfil do campo eléctrico para a superfície do eléctrodo. Este campo elétrico consiste na aplicação de 350 mV para 9 seg e imediatamente mudar para 950 mV por 1 segundo. Aplicar este perfil cíclico onda quadrada ao eléctrodo durante 10 ciclos, para um total de 100 segundos de campo eléctrico aplicado.
    5. Lavar superfície do sensor 3 vezes com água destilada e seca com azoto gasoso para remover o líquido da superfície do eléctrodo. Certifique-se que o líquido é adequadamente removida do eletrodo.
  2. Exosome Carga Descarga
    1. Carga 5 uL de 1 uM de uma sonda de detecção em 495 uL da mistura de complexo de talão-exossoma e usar uma pipeta para misturar.
      NOTA: A sonda de detecção é uma sequência de iniciador de ADN conjugado com uma molécula de fluoresceína na extremidade 3 '. A prov detectore sequência utilizada para este estudo corresponde ao ARNm de GAPDH encontrado dentro de exossomas. A sequência da sonda detectora conjugada com fluoresceína é: 5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-Fluoresceína-3 '.
    2. Pipeta 60 ul da sonda e mistura complexa talão-exosome em uma superfície do eletrodo de ouro com uma matriz ímã embaixo. Esta matriz ímã é constituído por dezesseis 2,54 milímetros de diâmetro de neodímio ímãs alinhados para corresponder aos eletrodos de trabalho do sensor. Figura 2A ilustra a colocação dos ímãs e solução talão-exosome.
    3. Uma vez amostra é carregado na superfície do eletrodo, aplicar 20 ciclos de campo elétrico CSW com 9 segundos a -300 mV e 1 seg a 200 mV (200 sec total). A carga exosomal que é libertado irá hibridar com os iniciadores na superfície do eléctrodo. Se os marcadores de superfície do exosome são objeto de investigação, pule esta parte do experimento. Figura 2B ilustra esse processo.
    4. <li> Wash-off os analitos não ligados na superfície do eletrodo por triplo enxaguar a superfície do eletrodo com água destilada. Seque o eletrodo com gás nitrogênio.
  3. Anticorpo repórter e Leitura
    1. Adicionar 60 ul de 150 unidade / anticorpo anti-fluoresceína conjugado ml de peroxidase de rábano (HRP em 1: 1000 de diluição) diluídos em caseína / PBS.
    2. Use um campo elétrico dirigido conjugação a HRP anti-fluoresceína complexo para o sanduíche de sonda. Aplicar -200 mV durante 1 segundo e 500 mV durante 1 seg durante 5 ciclos até à superfície do eléctrodo. A Figura 2A mostra os detectores de captura e complexos de sonda, tanto para um sistema de ácido nucleico e proteína.
    3. Superfície do sensor tríplice lavagem com água destilada e seque com gás nitrogênio.
    4. Após a lavagem-off de desacoplado excesso de anticorpo anti-fluoresceína, adicionar 60 ul de 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). Coloque esta substrato sobre a superfície de cada sensor com uma pipeta multicanal.
    5. Realizar leitura amperométrica da corrente através da medição da corrente do eléctrodo em -200 mV durante 60 segundos usando um potenciostato electroquímico capaz de medição simultânea de 16 canais. A Figura 2C é um exemplo de perfil de corrente durante a leitura.

Figura 2

Figura 2. Componentes de Efirm. Método (A) Método de extracção de exossomas usando biofluid CD63 anti-humano de micropartículas revestidas magnéticos e, em seguida, a descarga de carga exossoma utilizando ondas quadradas cíclicos aplicados ao complexo partícula-exossoma. (B) Esquema de eletrodo biosensor utilizado para detecção de alvos de RNA / DNA / proteína do exosome liberado. (C) Exemplo representativo de leitura amperometric da metodologia Efirm, onde maior magnitude atual corresponde to níveis mais altos de uma biomolécula. Este valor é a partir de Wei et al. 14 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Representative Results

Validação de exossomo Captação de contas usando TEM

Isolamento de exossomos de saliva usando CD63 esferas magnéticas anti-humanos foi validado seguindo o protocolo de extração, utilizando imagens de microscopia eletrônica de transmissão (MET). TEM mostra esferas magnéticas com grânulos 70-100 nm imediatamente adjacentes (ver Figura 3A, 3B e), de acordo com o perfil conhecido de exossomos. Não foram observados grânulos de 70-100 nm para as esferas magnéticas na saliva que não possuem anticorpos anti-CD63 humano conjugados com eles anteriormente (ver Figura 3C e 3D).

Figura 3
Figura 3. Imagens TEM de micropartículas magnético. (A) Imagem do CD63 nanopartículas magnéticas anti-humanos com pequenos grânulos de 70-100 nm adjacente. (B) enlavista rged de nanopartículas magnéticas e grânulos observados. (C) Imagem de esferas magnéticas sem anticorpo conjugado. (D) de visualização ampliada das esferas magnéticas sem anticorpo conjugado. Este valor é a partir de Wei et al. 14 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estudo da Libertação de Exosomal Conteúdo Usando CSW Campo Elétrico

As imagens de TEM de grânulos anti-CD63 humanas mostram 70-100 nm grânulos adjacentes a pérolas magnéticas (ver Figura 3A). Após a captura dos exossomas usando as esferas magnéticas, as amostras são processadas com dois métodos diferentes em paralelo. O primeiro método utilizado foi Triton-X 100 detergente para lisar exosomes eo segundo método foi a onda quadrada cíclico (CSW) do campo elétrico lise método livre discutido neste trabalho (detalhes de Triton-X 100 método are descrito por Wei e 14 t ai.). Estes complexos exossoma-grânulo processadas foram analisadas por MET e um gene de referência do mRNA foi quantificado usando o método electroquímico descrito neste trabalho. O gene de referência utilizado neste estudo foi de GAPDH, que está presente na maioria dos exossomas.

Imagens TEM mostram que em ambas as Triton X-100 e do campo eléctrico CSW amostras tratadas, houve uma notável ausência das estruturas de exossoma aderidas às esferas magnéticas, depois tanto a CSW e Triton X-100 métodos de tratamento (ver Figura 4B-ii e Figura 4B-iv). A medição dos níveis de expressão de GAPDH em ambos os Triton-X 100 e campo elétrico CSW amostras tratadas possuía um perfil semelhante: a saber, que a seguir os diferentes protocolos de lise, houve uma diminuição nos níveis de GAPDH medidas como o tempo passou, indicando uma exposição de exosomal ARNm para o ambiente extravesicular de saliva (ver Figura 4C).

<p class = "jove_content" fo: manter-together.within-page = "always"> Figura 4
Figura 4. Resultados relativos a cíclica Square Wave exossomo Carga Release. (A) Diagrama do método de liberação CSW elétrica. (B) as imagens de TEM de exossomas: (i) Antes da colocação CSW, (ii) Depois método CSW, (iii) método Antes de tampão de lise, (iv) Após método de tampão de lise. O fundo de imagens de TEM é o apoio Lacey. (C) A quantificação dos níveis de ARNm de GAPDH de exossoma quando é aplicada tampão de lise e a CSW campo eléctrico. Este valor é a partir de Wei et al. 14 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Examinando Desempenho de Efirm para a detecção de proteínas de superfície e ARNm abrigava

Avaliação de Efirm e compaRison aos métodos tradicionais foi conduzido. Efirm foi comparada com a quantificação de proteína utilizando Western blot (para CD63 humano-GFP, um marcador de superfície para exossomas) e qPCR para a quantificação de ARN (utilizando GAPDH como um alvo de ARNm). Porque o CDP63-GFP humano estava na superfície do exossoma, CSW não foi aplicada para descarregar a carga exossoma. Os resultados dos ensaios de proteína e ARN são, respectivamente, mostrados na Figura 5A e 5B.

Testes de especificidade também foram conduzidos para Efirm misturando os exossomos humanos com exossomos a partir de amostras de mouse. Estes testes de especificidade envolvidos diferentes misturas de relação de mouse para amostras humanas. Os resultados da experimentação demonstram que quando o conteúdo do rato exosomal foi cinco vezes maior do que o conteúdo humano, proteínas exosomal humanos e ARNm poderia ainda ser identificados e quantificados (ver Figura 5C e 5D para a proteína e ARN, respectivamente).


Figura 5. Efirm Avaliação de Desempenho para mRNA e os níveis de proteína utilizando amostras diluídas de exossomos. (A) Comparação de Efirm e western blot em GFP porção. (B) Comparação de Efirm e qPCR para ARNm de GAPDH. Níveis de sinal relativas detectadas GFP para exossomos humano diluído em diferentes quantidades de rato exosome (C). (D) sinal detectado relativo de GAPDH mRNA para exossomos humano diluído em diferentes quantidades de rato exosome. Este valor é a partir de Wei et al. 14 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Conteúdo Exosomal quantificadas a partir Rato Saliva

A fim de determinar a viabilidade de detectar exoconteúdo Somal nas amostras de saliva, foi utilizado um modelo nu mouse. Este modelo do ratinho nu receberam uma injecção interpleural de 1 x 10 6 de células de cancro de pulmão H460 humano (uma linha celular que foi transfectada para expressar o marcador também exossoma humano CD63-GFP) ou solução salina. Havia 11 ratinhos que receberam o controlo negativo de 100 ul de solução salina, e 9 ratos receberam a injecção das células. Após 20 dias, as amostras de soro e saliva foram colhidas dos dois grupos de ratos.

Uso do método de Efirm permitiu a quantificação dos níveis relativos de proteína CD63-GFP humana no soro de ratinhos e saliva. Uma comparação dos níveis relativos entre os dois soro e saliva de murganhos demonstraram correlação linear entre os dois fluidos biológicos (R = 0,79). Além disso, foram observadas diferenças significativas nos níveis de CD63-GFP humanos para o H460 injectados ratinhos contra os ratos injectados com soro fisiológico. Isto sugere que exossomos de células tumorais distais são traficadas into a vasculatura e saliva. Os resultados comparando soro e saliva são mostrados na Figura 6.

Figura 6
Figura avaliação 6. Efirm de níveis relativos de humano CD63-GFP no soro e saliva. Os estudos de comparação entre os níveis relativos de humano CDP63-GFP de camundongos injetados com células de câncer de pulmão humano. Existe linearidade entre as amostras de soro e saliva de humanos CD63-GFP. Os níveis de CD63 humano-GFP estão elevados em ratinhos injectados com células (em comparação com ratinhos injectados salina). Este valor é a partir de Wei et al 14.

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Discussion

Como os resultados indicam, CD63 anti-humano revestido nanopartículas magnéticas são capazes de capturar especificamente pequenas partículas que têm um tamanho que varia 70-100 nm. Esta partícula capturado é consistente com o perfil observado anteriormente de exossomas. Além disso, o uso da CSW baixa voltagem após a captura das partículas é mostrado para removê-los da superfície do grânulo e provocar perfis de degradação de ADN semelhante ao de um método tradicional de tampão de lise com base para a libertação da carga. Estes dados indicam que o fluxo de trabalho de libertação carga exosomal pode ser simplificada, através da aplicação de uma onda quadrada cíclico para a ruptura da membrana lipídica exossoma. Este método simplificado permite a libertação rápida da carga sem a necessidade de lise de tampões que podem afectar adversamente a carga exossomas, e como um resultado do método Efirm parece ser um método preferido para estudos de conteúdo exosomal em comparação com os métodos tradicionais de ultracentrifugação e uso de lisetampões. A sensibilidade, especificidade e facilidade do método Efirm torna-o ideal para a extração de exossomos de um biofluid e rapidamente testar conteúdo interno para ambos os ácidos nucléicos e proteínas alvo.

A metodologia Efirm foi aplicada ao estudo de um modelo do ratinho nu que foram injectados com células do cancro de pulmão H460 humano. As células de câncer de pulmão humano H460 foram adicionalmente transfectadas com CD63 humano-GFP para que marcadores de superfície CD63 exosome teria uma propriedade fluorescente. Após um período de 20 dias, soro de ratinho e amostras de saliva foram coletadas, ea metodologia Efirm foi utilizado para analisar seu conteúdo exosomal. Este estudo demonstrou a correlação linear entre as amostras de soro e saliva (r = 0,79). As implicações destes resultados são dois: Em primeiro lugar, a capacidade de capturar exossomos de fluidos biológicos sugere que as células cancerosas distais são capazes de transmitir exosomes a outros segmentos do corpo, principalmente no estudo da cavidade oral. Segunda, a linearidade observada entre as amostras de soro e de saliva, saliva sugere que pode ser um biofluid credível para a captura de exossomas que são produzidos em um estado de doença do corpo (ou seja, cancro) e análise do seu conteúdo molecular.

O método descrito e os resultados subsequentes mostraram que o método é adequado para a extracção de exossomas a partir de fluidos biológicos com base nos seus marcadores de superfície (no âmbito do presente trabalho, CD 63 é o marcador de superfície seleccionado). Para projetos futuros, é de mérito para examinar se a segmentação marcadores de superfície exosomes adicionais (como CD 9) ou combinar o método com outras técnicas Efirm vai melhorar a extração e análise de conteúdo exosome.

Biologia exosome é uma área promissora de estudo para a medicina translacional, e dados seguinte do estudo sugere que a análise exosomal salivar pode ser um local de encontro para a identificação de biomarcadores de doenças discriminatórias. Futuro investigaçãoparece apropriado para determinar se os biomarcadores da doença distais pode ser usado para diagnóstico não invasivos. Efirm como um método pode ajudar a pavimentar o caminho para uma análise mais efetiva de tais alvos dentro exossomos.

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Disclosures

David Wong é co-fundador da RNAmeTRIX Inc., uma empresa de diagnóstico molecular. PeriRx LLC sublicensed propriedades intelectuais pertencentes ao diagnóstico molecular de RNAmeTRIX. David Wong é um consultor para PeriRx.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos e do Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translacional, Institutos Nacionais de Saúde, através de Grant UL1TR000124 (a FW); o Felix & Mildred Yip Endowed Professorship eo Fundo Família Barnes (para DTWW), do Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número T90DE022734 (de MT). O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface  Genefluidics, USA  RS-1000-16
16x Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips Genefluidics, USA SC1000-16X-B
Biotinylated anti-human CD63 Antibody Ancell, USA 215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Invitrogen, USA 65601
Neodynium Magnetics (1/10" dia. x 1/32" thick) K&J Magnetics, USA DH101
Ultrapure Distilled Water Life Technologies, USA 10977-023
Mettler Toldeo 3 M KCl Solution Fisher Scientific, USA 1911512
Pyrrole Sigma-Aldrich, USA W338605-100g
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments Roche, Germany 11426346910
3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) Neogen, Usa 330175
Phosphate Buffered Saline Solution Life Technologies, USA 10010023
Casein/PBS Fisher Scientific, USA 37532

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Detecção de Exosomal Biomarker por induzida pelo campo elétrico de lançamento e Mensuração (Efirm)
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Tu, M., Wei, F., Yang, J., Wong, D. Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM). J. Vis. Exp. (95), e52439, doi:10.3791/52439 (2015).More

Tu, M., Wei, F., Yang, J., Wong, D. Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM). J. Vis. Exp. (95), e52439, doi:10.3791/52439 (2015).

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