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Bioengineering

La detección de biomarcadores exosomal por inducida por campo eléctrico de lanzamiento y Medición (Efirm)

doi: 10.3791/52439 Published: January 23, 2015

Abstract

Los exosomas son estructuras microvesicular que juegan un papel mediador en la comunicación intercelular. Es de interés para el estudio de la carga interna de exosomas para determinar si llevan biomarcadores discriminatorias de enfermedades. Para la realización de análisis exosomal, es necesario desarrollar un método para la extracción y el análisis de los exosomas de biofluidos objetivo sin dañar el contenido interno.

Liberación inducida por el campo eléctrico y medición (Efirm) es un método para extraer específicamente exosomas de biofluidos, descargando su carga, y prueba de su contenido interno de ARN / proteína. El uso de un anticuerpo micropartícula magnética específica anti-CD63 humano, los exosomas son primero precipitan a partir de biofluidos. Después de la extracción, las ondas de baja tensión eléctricos cíclicos cuadrados (CSW) se aplican a romper la membrana vesicular y causar desembarque de la carga. El contenido de la exosome se hibrida con cebadores de ADN o anticuerpos inmovilizados sobre una superficie de electrodo para quantification del contenido molecular.

El método Efirm es ventajoso para la extracción de los exosomas y descargando una carga para el análisis sin tampón de lisis. Este método es capaz de realizar la detección específica de ambas dianas de ARN y proteína de biomarcadores en el exosome. Efirm extrae exosomas específicamente en base a sus marcadores de superficie en comparación con las técnicas de tamaño basada en acciones.

Microscopía electrónica de transmisión (TEM) y el ensayo demuestran la funcionalidad del método para la captura y análisis exosome. El método se aplicó a Efirm exosomal análisis de 9 ratones inyectados con células de pulmón humano H640 cáncer (una línea celular transfectada para expresar el marcador exosome humano CD63-GFP) con el fin de poner a prueba su perfil exosome contra 11 ratones que recibieron los controles salinos. Se hallaron niveles elevados de biomarcadores exosomal (referencia GAPDH gen y la proteína marcador de superficie CD63 humano-GFP) para el H640 ratones inyectados en ambas muestras de suero y saliva. Además, saliva y muestras de suero se demostró tener linealidad (R = 0,79). Estos resultados son indicativos para la viabilidad de los biomarcadores de exosoma salivales para la detección de enfermedades distales.

Introduction

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Investigación exosome es un campo emergente de investigación que examina microvesículas lípidos que llevan ARN 1, DNA 2, y la proteína 3 de carga. Investigaciones anteriores de la biología exosome han conducido a la identificación de los exosomas en biofluidos tales como sangre 4, 5 orina, leche materna 6, 7 y la saliva. Los estudios han demostrado que los exosomas juegan un papel en diferentes vías celulares, meditando remotamente la comunicación entre diferentes sistemas del cuerpo 8. Debido al papel exosomas desempeñan en la comunicación intercelular, se plantea la hipótesis de que pueden empaquetar objetivos de biomoléculas (proteínas, ARN y ADN) correlacionados con estados de enfermedad. In vitro 3 y animal modelo de 9 estudios parecen corroborar esta hipótesis. En la investigación de contenido exosomal para el descubrimiento de biomarcadores, es necesario el desarrollo de una metodología para el aislamiento selectivo de exosome biofluidos, expulsi inducidaen la carga de los exosomas, y cuantificación de biomoléculas de exosoma. En la medida de este trabajo, los exosomas se definirán como una estructura que tiene un diámetro de aproximadamente 70-100 nm y poseyendo la superficie marcador CD63.

Los investigadores típicamente primera purifican exosomas por ultracentrifugación 10 y luego procesar el contenido exosomal través de la utilización de kits de tampón de lisis. El uso de métodos de tampón de lisis requiere tiempos de incubación que van desde minutos a horas. Este proceso puede potencialmente dañar carga exosome y conducir a probar la degradación. Por ejemplo, el ARN exosome salival lanzado a través de tampón de lisis en el entorno extracelular que rodea posee una vida media de menos de 1 min, por lo que la medición de RNA exosomal post-Tampón de Lisis una tarea particularmente difícil sin la adición de reactivos de estabilización 11. El efecto combinado de la adición de diversos reactivos para la lisis y la estabilización puede introducir agentes que complican e interferir con la Analysis de contenido exosomal. Un enfoque alternativo puede ser útil para la descarga rápidamente contenido exosomal y conservar de forma segura la carga para su caracterización.

En este trabajo, se propone el uso de un campo eléctrico no uniforme para la liberación de contenido exosomal. Eléctricos campos han sido conocidos por llevar la capacidad de polarizar y perturbar la bicapa lipídica que forma las membranas celulares. Nuestro trabajo experimental explora el uso de ondas cuadradas cíclicos no uniformes (CSW) para interrumpir la estructura microvesícula de exosomas y la liberación de la carga transportada. Este método utiliza tensiones en el rango de varios cientos de milivoltios, lo que significa que la mayoría de las biomoléculas no serán interrumpidos. Se demuestra que el uso de una onda cíclica cuadrados es capaz de accionar la liberación de exosome salival contenido de mRNA en el medio ambiente fluido circundante. Esta versión de contenido exosomal se integra perfectamente con un sistema de electrodos que puede ser utilizado para cuantificar los niveles de expresión de biomarcador 12,13. Este método propuesto permite una rápida sensible, y el tampón de lisis análisis, libres de contenidos exosome.

Figura 1
Figura 1. Visión general de Efirm de flujo de trabajo.. El método Efirm se divide a grandes rasgos en las tres fases principales que son necesarios para la purificación y el análisis de los exosomas.

Este método de liberación contenido exosomal y el análisis basado CSW se utiliza en conjunción con microperlas magnéticas-CD63 específico para el aislamiento exosome. Estas perlas CD63-de afinidad permiten el aislamiento selectivo de los exosomas de las muestras salivales (y otros fluidos biológicos). Después de la incubación y la extracción de los exosomas utilizando las perlas magnéticas, las cuentas se migran al sistema de sensor electroquímico para la CSW basado comunicado de contenido y parte de análisis del experimento. Figura 1 ofrece una visión general de la obrade flujo del método Efirm.

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Protocol

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1. magnética exosome extracción basado en perlas

  1. Pipetear una solución bien mezclada de 5 l de micropartículas magnéticas recubiertas con estreptavidina en 495 l de solución salina tamponada (PBS) tampón de fosfato en un tubo de microcentrífuga para resuspender las perlas. Lavar y resuspender las perlas con 500 l de PBS tres veces usando una rejilla magnética. El bastidor es un conjunto de imanes en el lado de una unidad de vivienda que puede sostener los tubos de muestra de microcentrífuga.
    1. Para cada lavado, primero deje que los tubos se sientan en el estante durante 1 minuto, y luego usar una punta de pipeta para retirar con cuidado el tampón sobrenadante sin perturbar las cuentas.
    2. Colocar los tubos en un estante regular sin imanes en el lado. Añadir 500 l de PBS en los tubos, y el uso de la pipeta para mezclar la solución y los granos juntos. A continuación, poner los tubos de nuevo en la gradilla magnética para separar de nuevo las perlas de la solución.
    3. Realizar esta eliminación de tampón a través de la magnetización y resuspensión en PBS unatotal de tres veces. Esto realiza un lavado inicial de las partículas magnéticas.
  2. Resuspender las perlas en 490 l de tampón de PBS, con el tubo colocado en la parte no magnetizada de la gradilla magnética. Pipetear 5 l de ratón biotinilado anticuerpo anti-CD63 humano en 1,0 mg / ml de concentración de stock en la mezcla de perlas. Use la pipeta para mezclar las perlas y el anticuerpo en solución.
  3. Coloque los tubos de microcentrífuga con el grano y la mezcla de anticuerpos con biotina en un rotador de muestras. Establezca los parámetros de los rotadores para el rotador de la muestra para la rotación recíproca a 90 ° de inclinación durante 5 segundos y vibrando a 5 ° durante 1 seg. Rotar los tubos de mezcla de muestra de perlas en estos parámetros para 30 min a TA.
  4. Eliminar el anticuerpo no unido después de la conjugación.
    1. Después de 30 min de rotación a TA, coloque los tubos de nuevo en la gradilla magnética durante 5 min.
    2. Realizar tres lavados de los granos mediante la eliminación de la fase líquida utilizando una micropipeta y se lava con 500 μ; L de PBS. Después de la triple lavado, volver a suspender las perlas en 490 l de caseína-PBS y colocar en la parte no magnetizado de la cremallera.
  5. Extracción exosome usando perlas recubiertas de anticuerpo.
    1. Marque cada tubo con específica identificación de la muestra. Pipetear una muestra de 10 l de suero o saliva en el tubo de microcentrífuga. Use la pipeta para mezclar la muestra y perlas magnéticas pipeteando varias veces.
    2. Colocar los tubos con la muestra y anti-humanos perlas de anticuerpo CD63 en los rotadores y rotar durante 2 horas a RT. Utilice los mismos parámetros de los rotadores, como se describe en el paso 1.2.
    3. Después de 2 hr de la muestra de rotación, realizar un lavado triple de magnetización a perlas separadas de la solución, la eliminación de fase líquida con micropipeta, y resuspensión de perlas en 500 l de tampón Tris-HCl. Las perlas resultantes están ligados a los exosomas y están listos para la liberación del campo eléctrico y la medición.

2. Electric Field inducida publicó unnd Medición de exosomal contenido

  1. Inicial PRECOATING de Electrodo con GADPH Primer
    1. Aplicar un plástico bien a un conjunto de electrodos para evitar la contaminación cruzada de los electrodos individuales. Para este experimento, utilizar un conjunto de electrodos 16-sensor con cada electrodo unidad en la matriz que consiste en un trabajo, contador, y electrodo de referencia de oro desnudo.
    2. Preparar una mezcla madre de 100 Nm sonda de ADN, 0,3 M KCl, y pirrol 10 mM pipeteando reactivos de valores en un tubo con agua destilada ultrapura. Mezclar bien por agitación.
      NOTA: Para este estudio, la sonda de ADN seleccionada corresponde a la referencia de genes GAPDH, que se sabe que existe dentro de los exosomas. La secuencia de la sonda utilizada es: 5'-Biotina-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 '. Utilice esta mezcla sobre todos los electrodos.
    3. Pipetear 60 l de la mezcla de sondas de ADN-monómero sobre la superficie de cada electrodo de oro. Examinar los electrodos para garantizar que hay una cobertura adecuada de la de trabajo, counter, y de referencia de la mezcla líquida.
    4. Electropolymerize mezcla de monómeros-sonda para crear una capa de polímero conductor en la superficie del electrodo mediante la aplicación de una onda cuadrada (CSW) el perfil de campo eléctrico cíclico a la superficie del electrodo. Este campo eléctrico consiste en aplicar 350 mV durante 9 s e inmediatamente cambiar a 950 mV durante 1 seg. Aplicar este perfil cíclico de onda cuadrada al electrodo durante 10 ciclos, para un total de 100 seg de campo eléctrico aplicado.
    5. Enjuague superficie del sensor 3 veces con agua destilada y se seca con gas nitrógeno para eliminar el líquido de la superficie del electrodo. Asegúrese de que el líquido se elimina correctamente del electrodo.
  2. Descarga exosome Cargo
    1. Cargar 5 l de 1 M de una sonda detector en 495 l de la mezcla de complejo de grano exosome y utilizar una pipeta para mezclar.
      NOTA: La sonda detector es una secuencia de cebador de ADN conjugado con una molécula de fluoresceína en el extremo 3 '. El prob detectorsecuencia e utilizado para este estudio corresponde al ARNm GAPDH se encuentra dentro de los exosomas. La secuencia de la sonda detector conjugado con fluoresceína es: 5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-fluoresceína-3 '.
    2. Pipeta 60 l de la sonda y compleja mezcla grano-exosome sobre una superficie de electrodos de oro con una selección de imanes debajo. Esta matriz imán consta de dieciséis 2,54 mm imanes de neodimio diámetro alineadas para corresponder a los electrodos de trabajo del sensor. La Figura 2A ilustra la colocación de los imanes y solución de grano exosome.
    3. Una vez que la muestra se carga en la superficie del electrodo, se aplican 20 ciclos del campo eléctrico CSW con 9 segundos a -300 mV y 1 seg a 200 mV (200 sec total). La carga exosomal que se libera se hibridará con los cebadores en la superficie del electrodo. Si los marcadores de superficie de la exosome son objeto de investigación, omitir esta parte del experimento. La Figura 2B ilustra este proceso.
    4. <li> Wash-off los analitos no unidos en la superficie del electrodo con un triple enjuague la superficie del electrodo con agua destilada. Secar el electrodo con gas nitrógeno.
  3. Reportero de anticuerpos y de lectura
    1. Añadir 60 l de 150 unidades / anticuerpo anti-fluoresceína ml conjugado con peroxidasa de rábano (HRP en 1: 1000 dilución) diluidas en caseína / PBS.
    2. Utilice una conjugación impulsado campo eléctrico a lo complejo HRP anti-fluoresceína para el bocadillo de la sonda. Aplicar -200 mV durante 1 segundo y 500 mV durante 1 segundo durante 5 ciclos a la superficie del electrodo. La Figura 2A muestra los complejos de sonda de captura y detector para tanto una proteína y sistema de ácido nucleico.
    3. Triple superficie del sensor de lavado usando agua destilada y se seca con gas nitrógeno.
    4. Después de la eliminación por lavado el exceso de anticuerpo no unido de anti-fluoresceína, añadir 60 l de 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). Cargar este sustrato a cada superficie del sensor usando una pipeta multicanal.
    5. Realizar la lectura amperométrica de la corriente mediante la medición de la corriente del electrodo en -200 mV durante 60 segundos usando un potenciostato electroquímico capaz de la medición simultánea de 16 canales. Figura 2C es un ejemplo de perfil actual durante la lectura.

Figura 2

Figura 2. Componentes del Método Efirm. (A) método de extracción de exosomas de biofluido usando micropartículas magnéticas CD63 anti-humano recubierto y luego la descarga de la carga exosome usando ondas cuadradas cíclicos aplicados al complejo de partícula exosome. (B) Esquema de biosensor electrodo utilizado para la detección de objetivos de ARN / ADN / proteína de la exosome liberado. (C) Ejemplo representativo de lectura amperométrica de la metodología Efirm, donde la magnitud de corriente más grande corresponde to niveles más altos de una biomolécula. Esta cifra es de Wei et al. 14 Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

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Validación de exosome captura de perlas usando TEM

El aislamiento de los exosomas de saliva usando perlas magnéticas CD63 anti-humano fue validado siguiendo el protocolo de extracción mediante el uso de microscopía electrónica de transmisión (TEM). TEM muestra perlas magnéticas con 70-100 nm gránulos inmediatamente adyacentes (ver Figura 3A, y 3B), en consonancia con el perfil conocido de exosomas. No se observaron gránulos 70-100 nm de las perlas magnéticas en la saliva que no tenían anticuerpos anti-CD63 humanas conjugadas con ellos previamente (ver Figura 3C y 3D).

Figura 3
Figura 3. Imágenes de TEM de micropartículas magnéticas. (A) Imagen de nanopartículas magnéticas CD63 anti-humano con pequeños gránulos de 70-100 nm adyacente. (B) enlaVer rged de nanopartícula magnética y gránulos observados. (C) Imagen de perlas magnéticas sin anticuerpo conjugado. (D) La vista ampliada de perlas magnéticas sin anticuerpo conjugado. Esta cifra es de Wei et al. 14 Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Estudio de Liberación de exosomal contenido Usando CSW Campo Eléctrico

Imágenes de TEM de perlas de CD63 anti-humanos muestran 70-100 nm gránulos adyacentes a perlas magnéticas (véase la Figura 3A). Después de la captura de los exosomas utilizando las perlas magnéticas, las muestras se procesaron con dos métodos diferentes en paralelo. El primer método utilizado fue Triton X-100 detergente para lisar exosomas y el segundo método era la onda cuadrada cíclico (CSW) de campo eléctrico método libre tampón de lisis discutido en este trabajo (detalles de Triton X-100 método are descrito por Wei e t al. 14). Estos complejos exosome-talón procesados ​​fueron analizadas por TEM y un gen de referencia ARNm se cuantificó usando el método electroquímico descrito en este trabajo. El gen de referencia utilizado en este estudio fue GAPDH, que está presente en la mayoría de los exosomas.

Imágenes de TEM muestran que tanto en las muestras tratadas Triton X-100 y el campo eléctrico CSW, hubo una ausencia notable de las estructuras de exosoma adheridas a las perlas magnéticas después de que tanto el CSW y Triton X-100 métodos de tratamiento (véase la Figura 4B-ii y Figura 4B-iv). La medición de los niveles de expresión de GAPDH en tanto las muestras tratadas Triton X-100 y el campo eléctrico CSW poseía un perfil similar: a saber, que después de los diferentes protocolos de lisis, hubo una disminución en los niveles de GAPDH medidos a medida que pasaba el tiempo, indicando una exposición de exosomal mRNA para el medio ambiente extravesicular de la saliva (ver Figura 4C).

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figura 4
Figura 4. Los resultados relativos a la cíclica de onda cuadrada exosome Cargo de lanzamiento. (A) Diagrama del método de liberación CSW eléctrica. (B) Las imágenes TEM de exosomas: (i) Antes de la liberación de la CSW, (ii) Después método CSW, (iii) Antes método tampón de lisis, (iv) Después método tampón de lisis. Antecedentes de imágenes de TEM es el soporte de encaje. (C) Cuantificación de exosoma niveles de ARNm de GAPDH cuando se aplica tampón de lisis y CSW campo eléctrico. Esta cifra es de Wei et al. 14 Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Examen de Desempeño de Efirm para la detección de proteínas de la superficie y el ARNm albergado

Evaluación de Efirm y compase llevó a cabo Rison a los métodos tradicionales. Efirm se comparó con la cuantificación de la proteína mediante Western blot (para CD63 humano-GFP, un marcador de superficie para exosomas) y qPCR para la cuantificación de ARN (usando GAPDH como un ARNm diana). Debido a que la CDP63-GFP humana estaba en la superficie de la exosome, CSW no se aplicó a descargar mercancías exosome. Los resultados de las pruebas de proteínas y ARN se muestran respectivamente en la Figura 5A y 5B.

También se realizaron pruebas de especificidad para Efirm mezclando los exosomas humanos con exosomas de las muestras de ratón. Estas pruebas de especificidad implicadas diferentes mezclas relación de ratón para muestras humanas. Los resultados de la experimentación demuestran que cuando el contenido exosomal ratón era cinco veces mayor que el contenido humano, proteínas exosomal humanos y ARNm podría todavía ser identificado y cuantificado (ver Figura 5C y 5D de proteínas y ARN, respectivamente).


Figura 5. Evaluación Efirm Rendimiento de mRNA y los niveles de proteína utilizando muestras diluidas de exosomas. (A) Comparación de Efirm y Western Blot en fracción GFP. (B) Comparación de Efirm y qPCR para GAPDH ARNm. Detectado niveles de señal GFP relativos de exosomas humanos diluidos en diferentes cantidades de exosome ratón (C). (D) relativa de la señal detectada para GAPDH ARNm para exosomas humanos diluidos en diferentes cantidades de exosome ratón. Esta cifra es de Wei et al. 14 Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Contenido exosomal cuantificado De Ratón Saliva

Con el fin de determinar la viabilidad de la detección de exocontenido Somal en muestras salivales, se utilizó un modelo de ratón desnudo. Este modelo de ratón desnudo recibió una inyección interpleural de 1 x 10 6 células de cáncer de pulmón humano H460 (una línea de células que se transfectan para expresar también el marcador exosome humano CD63-GFP) o solución salina. Había 11 ratones que recibieron un control negativo de 100 l de solución salina, y 9 ratones recibieron la inyección de células. Después de 20 días, las muestras de suero y saliva se obtuvieron de los dos grupos de ratones.

Uso del método Efirm permitido la cuantificación de los niveles relativos de la proteína CD63-GFP humana en el suero de ratones y la saliva. Una comparación de los niveles relativos entre los dos suero y saliva de los ratones demostró correlación lineal entre las dos biofluidos (r = 0,79). Además, se observó diferencia significativa en los niveles de CD63-GFP humanos para el H460 inyectó a los ratones contra los ratones inyectados con solución salina. Esto sugiere que los exosomas de células tumorales distales son traficadas into la vasculatura y la saliva. Los resultados que comparan el suero y la saliva se muestran en la Figura 6.

Figura 6
Figura 6. Efirm evaluación de los niveles relativos de CD63 humano-GFP en suero y saliva. Los estudios de comparación entre los niveles relativos de humano CDP63-GFP de los ratones inyectados con células de cáncer de pulmón humano. Existe linealidad entre muestras de suero y saliva para CD63-GFP humano. Los niveles de CD63-GFP humana son elevados en los ratones inyectados con células (en comparación con solución salina ratones inyectados). Esta cifra es de Wei et al. 14

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Discussion

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Como indican los resultados, las nanopartículas magnéticas CD63 anti-humano recubierto son capaces de capturar específicamente pequeñas partículas que tienen un tamaño que varía desde 70 hasta 100 nm. Esta partícula capturado es consistente con el perfil observado previamente de exosomas. Además, se muestra el uso de la CSW de baja tensión después de la captura de las partículas para eliminarlos de la superficie de la perla y causar perfiles de degradación de ADN similares a la de un método tradicional basado en tampón de lisis para la liberación de la carga. Estos datos indican que el flujo de trabajo de liberación de carga exosomal se puede simplificar mediante la aplicación de una onda cuadrada cíclica para la interrupción de la membrana lipídica exosome. Este método simplificado permite la liberación de carga rápida sin la necesidad de lisis de tampones que pueden afectar negativamente a la carga exosome, y como resultado el método Efirm parece ser un método preferible para los estudios de contenido exosomal en comparación con los métodos tradicionales de ultracentrifugación y el uso de lisistampones. La sensibilidad, especificidad, y la facilidad del método Efirm lo hace ideal para la extracción de los exosomas de un biofluido y rápida prueba de contenido interno para ambos ácidos nucleicos y proteínas diana.

La metodología Efirm se aplicó al estudio de un modelo de ratón desnudo que fue inyectado con células H460 de cáncer de pulmón humano. Las células cancerosas de pulmón humano H460 se transfectaron adicionalmente con CD63 humano-GFP de manera que los marcadores de superficie CD63 exosome tendría una propiedad fluorescente. Tras un período de 20 días, se recogieron suero de ratón y muestras de saliva, y la metodología Efirm se utilizó para analizar su contenido exosomal. Este estudio demostró correlaciones lineales entre las muestras de suero y saliva (R = 0,79). Las implicaciones de estos resultados son dos: En primer lugar, la capacidad de capturar exosomas de biofluidos sugiere que las células cancerosas distales son capaces de transmitir exosomas a otros segmentos del cuerpo, sobre todo en el estudio de la cavidad oral. Segundo, la linealidad observada entre las muestras de suero y saliva sugiere que la saliva puede ser un biofluido creíble para la captura de exosomas que se producen en un estado de enfermedad del cuerpo (es decir, cáncer) y el análisis de su contenido molecular.

El método descrito y los resultados posteriores muestran que el método es apropiado para la extracción de los exosomas de biofluidos en base a sus marcadores de superficie (en el ámbito de este trabajo, CD 63 es el marcador de superficie seleccionado). Para los proyectos futuros, es de mérito para examinar si la orientación marcadores de superficie exosomas adicionales (como CD 9) o la combinación del método Efirm con otras técnicas mejorará la extracción y verificación de contenido exosome.

Biología exosome es un área prometedora de estudio para la medicina traslacional, y los datos de la siguiente estudio sugiere que el análisis exosomal salival puede ser un lugar para la identificación de biomarcadores de enfermedades discriminatorias. Investigaciones futurasparece apropiado para determinar si biomarcadores de la enfermedad distales pueden ser utilizados para el diagnóstico no invasivas. Efirm como método podría ayudar a allanar el camino para un análisis más efectivo de dichos objetivos dentro de exosomas.

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Disclosures

David Wong es co-fundador de RNAmeTRIX Inc., una compañía de diagnóstico molecular. PeriRx LLC sublicenciada propiedad intelectual relacionados con el diagnóstico molecular de RNAmeTRIX. David Wong es un consultor para PeriRx.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Recursos para la Investigación y el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias de traslación, los Institutos Nacionales de Salud, a través de subvención UL1TR000124 (FW); Felix y Mildred Yip Endowed Cátedra y el Fondo de la Familia Barnes (a DTWW), el Instituto Nacional de Odontología y de Investigación Craneofacial de los Institutos Nacionales de Salud, bajo el premio número T90DE022734 (MT). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface  Genefluidics, USA  RS-1000-16
16x Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips Genefluidics, USA SC1000-16X-B
Biotinylated anti-human CD63 Antibody Ancell, USA 215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Invitrogen, USA 65601
Neodynium Magnetics (1/10" dia. x 1/32" thick) K&J Magnetics, USA DH101
Ultrapure Distilled Water Life Technologies, USA 10977-023
Mettler Toldeo 3 M KCl Solution Fisher Scientific, USA 1911512
Pyrrole Sigma-Aldrich, USA W338605-100g
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments Roche, Germany 11426346910
3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) Neogen, Usa 330175
Phosphate Buffered Saline Solution Life Technologies, USA 10010023
Casein/PBS Fisher Scientific, USA 37532

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References

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La detección de biomarcadores exosomal por inducida por campo eléctrico de lanzamiento y Medición (Efirm)
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Tu, M., Wei, F., Yang, J., Wong, D. Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM). J. Vis. Exp. (95), e52439, doi:10.3791/52439 (2015).More

Tu, M., Wei, F., Yang, J., Wong, D. Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM). J. Vis. Exp. (95), e52439, doi:10.3791/52439 (2015).

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