Abstract
Exosomes är microvesicular strukturer som spelar en medlande roll i kommunikationen mellan. Det är av intresse att studera den interna last av exosomes att avgöra om de bär sjukdoms diskriminerande biomarkörer. För att utföra exosomal analys är det nödvändigt att utveckla en metod för att utvinna och analysera exosomes från målgrupp Biofluids utan att skada den interna innehåll.
Elektriskt fält-inducerad frisättning och mätning (EFIRM) är en metod för att specifikt extrahera exosomes från Biofluids, lossning deras last, och testa deras interna halt RNA / protein. Använda en anti-human CD63 specifik antikropp magnetiska mikropartikel är exosomes först ut från Biofluids. Efter utvinning, lågspänning elektriska cykliska fyrkantsvågor (CSW) tillämpas för att störa vesikulär membran och orsaka last lossning. Innehållet i Exosome hybridiseras till DNA-primers eller antikroppar immobiliserade på en elektrodyta för quantification av molekylär innehåll.
Den EFIRM Metoden är fördelaktig för utvinning av exosomes och lossning för analys utan lysbuffert. Denna metod är kapabel att utföra specifik detektion av både RNA och protein biomarkörer mål i Exosome. EFIRM extraherar exosomes specifikt utifrån deras ytmarkörer i motsats till storleksbaserade tekniker.
Transmissionselektronmikroskopi (TEM) och analysen demonstrerar funktionaliteten av metoden för Exosome avskiljning och analys. Den EFIRM Metoden tillämpades på exosomal analys av nio möss som injicerats med humana lungcancer H640-celler (en cellinje transfekterad för att uttrycka Exosome markör humant CD63-GFP) i syfte att testa deras Exosome profil mot 11 möss som erhöll saltlösningskontroller. Förhöjda nivåer av exosomal biomarkörer (referens gen GAPDH och proteinytan markör mänskligt CD63-GFP) påträffades för H640 injicerade möss i både serum och salivprov. Vidare saliva och serumprover visat sig ha linjäritet (R = 0,79). Dessa resultat tyder på livskraft spott Exosome biomarkörer för detektion av distala sjukdomar.
Introduction
Exosome forskningen är en framväxande området utredning som undersöker lipid mikrovesiklar som bär RNA 1, DNA 2, och protein 3 last. Tidigare undersökningar av Exosome biologi har lett till identifiering av exosomer i Biofluids såsom blod 4, urin 5, bröstmjölk 6, och saliv 7. Studier har visat att exosomer spela en roll i olika cellulära vägar, distans medi kommunikation mellan olika system i kroppen 8. På grund av den roll exosomer spela i kommunikationen mellan, är det en hypotes om att de kan paketera biomolekyler mål (protein, RNA, och DNA) korrelerade med sjukdomstillstånd. In vitro 3 och djurmodell 9 studier tycks bekräfta denna hypotes. Vid utredning exosomal innehåll för upptäckt av biomarkörer, är det nödvändigt att utveckla en metod för selektiv Exosome isolering från Biofluids, framkallad expulsipå av last från exosomer, och kvantifiering av Exosome biomolekyler. I omfattningen av detta arbete kommer exosomes definieras som en struktur med en diameter på ca 70-100 nm och som har ytmarkör CD63.
Forskare vanligtvis först rena exosomes genom ultracentrifuge 10 och sedan bearbeta exosomal innehåll genom användandet av lys buffert kit. Användning lysbuffert metoder kräver inkubationstider som sträcker sig från minuter till timmar. Denna process kan potentiellt skada Exosome last och leda till prov nedbrytning. Till exempel, spott Exosome RNA frigöras via lysbuffert till den omgivande extracellulära miljön besitter en halveringstid på mindre än en minut, vilket gör mätningen av exosomal RNA efter lysbuffert en särskilt svår uppgift utan tillsats av stabiliseringsreagens 11. Den sammansatta effekten av att tillsätta olika reagenser för lys och stabilisering får införa agenter som komplicerar och störa analysis av exosomal innehåll. Ett alternativt tillvägagångssätt kan vara till hjälp för att snabbt lossning exosomal innehåll och säkert bevara lasten för karakterisering.
I detta arbete föreslår vi användning av en icke-enhetlig elektriskt fält för frisläppandet av exosomal innehåll. Elektriska fält har varit kända för att bära förmåga att polarisera och störa lipiddubbelskiktet som bildar cellmembran. Vår experimentella arbetet utforskar användningen av icke-enhetliga cykliska fyrkantsvågor (CSW) för att störa mikrovesikel struktur exosomes och släppa transporteras gods. Denna metod använder spänningar i flera hundra millivolt intervall, vilket innebär att de flesta biomolekyler inte kommer att störas. Vi visar att användningen av en cyklisk-fyrkantvåg är kunna påverka frisättning av saliv Exosome mRNA innehållet i den omgivande fluidmiljön. Den här versionen av exosomal innehåll är sömlöst integrerad med ett elektrodsystem som kan användas för att kvantifiera biomarkör expressionsnivåer 12,13. Denna föreslagna metoden möjliggör snabb, känslig och lysisbuffert fri analys av Exosome innehåll.
Figur 1. Översikt över EFIRM Workflow.. Är EFIRM metoden grovt delas in i tre huvudfaser som är nödvändiga för rening och analys exosomes.
Denna CSW baserad exosomal innehålls release och analysmetod används tillsammans med CD63-specifika magnetiska mikrokulor för Exosome isolering. Dessa CD63-affinitetspärlor möjliggöra selektiv isolering av exosomer från spottprov (och andra Biofluids). Efter inkubation och utvinning av exosomes hjälp av magnetiserade pärlor, är pärlorna migreras till den elektrokemiska sensorsystem för CSW baserat innehåll frigivning och analys delen av experimentet. Figur 1 ger en översikt av arbetetflöde av EFIRM metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Magnetisk Bead-baserade Exosome Extraktion
- Pipettera en väl blandad lösning av 5 | il streptavidinbelagda magnetiska mikropartiklar i 495 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS) buffert i ett mikrocentrifugrör för att återsuspendera pärlorna. Tvätta och resuspendera kulorna med 500 l PBS tre gånger med hjälp av en magnetisk rack. Kuggstången är en array av magneter på den sida av en bostadsenhet, som kan hålla provet mikrocentrifugrör.
- För varje tvätt, låt först rören sitta på rack för en minut, och sedan använda en pipettspets för att försiktigt avlägsna supernatanten bufferten utan att störa pärlorna.
- Placera rören på en vanlig rack utan magneter på sidan. Lägg 500 l PBS i rören, och använd pipetten för att blanda lösningen och pärlor tillsammans. Lägg sedan rören tillbaka på den magnetiska rack för att återigen skilja pärlorna från lösningen.
- Utför denna avlägsna buffert via magnetisering och resuspension i PBS atotalt tre gånger. Denna fyller en initial tvätt av de magnetiska partiklarna.
- Resuspendera pärlor i 490 l PBS-buffert, med röret placeras på den icke-magnetiserade delen av den magnetiska rack. Pipettera 5 ul av biotinylerad mus-anti-human-CD63-antikropp vid 1,0 mg / ml förrådskoncentration i blandningen av pärlor. Använd pipetten för att blanda de pärlor och antikropp i lösning.
- Placera mikrocentrifugrör med pärla och biotinylerad antikropp blandningen på ett prov rotator. Ställ in rotator parametrar för prov rotator för ömsesidig rotation vid 90 ° tilt i 5 sek och vibrerande på 5 ° i 1 sek. Rotera prov-kornsblandningen rör vid dessa parametrar för 30 min vid RT.
- Avlägsna obunden antikropp efter konjugering.
- Efter 30 min av rotationen vid RT, placera rören tillbaka i magnet rack för 5 minuter.
- Utför tre tvättar av pärlor genom att avlägsna den flytande fasen med hjälp av en mikropipett och tvätta med 500 μ; L PBS. Efter trippel tvätten, resuspendera pärlor i 490 l av kasein-PBS och plats på omagnetiserad delen av racket.
- Exosome extraktion med användning av antikroppsbelagda pärlor.
- Märk varje rör med riktad prov-ID. Pipettera ett prov av serum eller saliv 10 pl i mikrocentrifugrör. Använd pipetten för att blanda provet och magnetiska kulor genom att pipettera flera gånger.
- Placera rören med prov och antihumana pärlor CD63 antikropps på rotator och rotera under 2 h vid RT. Använd samma rotator parametrar som beskrivs i steg 1.2.
- Efter 2 h av provet roterande, utför en trippel tvätt genom att magnetisera till separata kulor från lösning, avlägsnande vätskefas med mikropipett och återsuspendering pärlor i 500 | il Tris-HCl-buffert. De resulterande pärlorna är nu bundna till exosomes och är redo för det elektriska fältet frisättning och mätning.
2. Electric Field Induced Släppt ennd Mätning av Exosomal innehåll
- Initial Precoating av elektrod med GADPH Primer
- Applicera en plast väl till en elektrod array för att förhindra korskontaminering av de enskilda elektroder. För detta experiment, använd en 16-sensorelektrod array med varje enhet elektrod i uppsättningen som består av en arbetsgrupp, disk, och referenselektrod av nakna guld.
- Bered en förrådsblandning av 100 nM DNA-sond, 0,3 M KCl och 10 mM pyrrol genom pipettering lagerreagens i ett rör med ultrarent destillerat vatten. Blanda noggrant genom att vortexa.
OBS: För denna studie, DNA-sonden väljs motsvarar GAPDH referens gen, som är känd att existera inom exosomer. Den probsekvens som användes är: 5'-biotin-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 '. Använd denna blandning på alla elektroderna. - Pipettera 60 | il av monomer-DNA-sondblandningen på ytan av varje guldelektrod. Undersök elektroderna för att säkerställa att det finns tillräcklig täckning av den arbetande, counter, och referenselektroder från vätskeblandningen.
- Electropolymerize monomer-sondblandningen för att skapa en ledande polymerskiktet på elektrodytan genom applicering av en cyklisk fyrkantvåg (CSW) elektriska fältprofil till elektrodytan. Denna elektriska fältet består av att tillämpa +350 mV för 9 sek och omedelbart byte till 950 mV i 1 sek. Tillämpa denna cykliska fyrkantig vågprofil till elektroden för 10 cykler, för totalt 100 sek av pålagt elektriskt fält.
- Skölj sensoryta tre gånger med destillerat vatten och torka med kvävgas för att avlägsna vätska från ytan av elektroden. Se till att vätska har tagits bort ordentligt från elektroden.
- Exosome Cargo Lossning
- Load 5 pl 1 iM av en detektor sond i 495 pl av pärlan-Exosome komplex blandning och använda en pipett för att blanda.
OBS: Detektorn sond är en DNA-primersekvens konjugerad till en fluorescein molekyl vid 3'-änden. Detektorn probe sekvens som används för denna studie motsvarar GAPDH-mRNA hittades inom exosomer. Sekvensen för den fluorescein-konjugerad detektorsonden är: 5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-fluorescein-3 '. - Pipettera 60 | il av sonden och pärl-Exosome komplex blandningen på en guldelektrod yta med en magnetuppsättning under. Denna magnet array består av sexton 2,54 mm neodymium diameter magneter inriktade för att motsvara de arbetande elektroderna hos sensorn. Fig 2A illustrerar placeringen av magneterna och pärla-Exosome lösning.
- När provet är laddad på elektrodytan, tillämpa 20 cykler av CSW elektriska fältet med 9 sek vid -300 mV och 1 sek vid 200 mV (200 sek totalt). Den exosomal last som frigörs kommer att hybridisera till primrama på ytan av elektroden. Om ytmarkörer av Exosome är föremål för undersökning, hoppa över denna del av experimentet. Figur 2B illustrerar denna process. <li> avtvättning de obundna analyter på elektrodytan genom trippel sköljning av elektrodytan med destillerat vatten. Torka elektroden med kvävgas.
- Load 5 pl 1 iM av en detektor sond i 495 pl av pärlan-Exosome komplex blandning och använda en pipett för att blanda.
- Lägg 60 pl av 150 enheter / ml anti-fluorescein-antikropp konjugerad till pepparrotsperoxidas (HRP i 1: 1000 utspädning) utspädda i Kasein / PBS.
- Använd ett elektriskt fält driven konjugering till komplexa anti fluorescein HRP till sond smörgås. Ansök -200 mV i 1 sek och +500 mV i 1 sek för 5 cykler till elektrodytan. Figur 2A visar fånga och detektorsondkomplex för både ett protein och nukleinsyra systemet.
- Triple tvätta sensorytan med destillerat vatten och torka med kvävgas.
- Efter avtvättning av obundet överskott anti-fluorescein-antikropp, tillsätt 60 ul av 3,3 ', 5,5'-tetrametylbensidin (TMB). Ladda detta substrat på varje sensorytan med hjälp av en flerkanalig pipett.
- Utför amperometrisk avläsning av den aktuella genom att mäta elektrodströmmen vid -200 mV för 60 s med användning av en elektrokemisk potentiostat med förmåga att samtidig mätning av 16 kanaler. Figur 2C är ett exempel på aktuella profilen under utläsning.
Figur 2. Komponenter i EFIRM Method. (A) Metod för att utvinna exosomer från Kroppsvätska använda anti-humant CD63 belagd magnetiska mikropartiklar och sedan lossning Exosome last med hjälp cykliska fyrkantsvågor tillämpas på partikel Exosome komplex. (B) Scheme of elektrod biosensor används för att detektera RNA / DNA / protein mål från släppt Exosome. (C) Ett representativt exempel på amperometrisk utläsning från EFIRM metodik, där större ström magnitud motsvarar to högre nivåer av en biomolekyl. Denna siffra är från Wei et al. 14 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validering av Exosome Capture av pärlor Använda TEM
Isolering av exosomer från saliv som använder anti humana CD63 magnetiska kulor validerades efter extraktion protokollet genom att använda transmissionselektronmikroskop (TEM) bilder. TEM visar magnetiska pärlor med 70-100 nm granulat omedelbart intill (se figur 3A och 3B), i överensstämmelse med den kända profilen exosomes. Inga 70-100 nm granulat observerades för de magnetiska pärlor i saliv som inte hade anti-humana CD63 antikroppar konjugerade till dem tidigare (se figur 3C och 3D).
Figur 3. TEM bilder av magnetiska mikropartikel. (A) Bild av anti-humana CD63 magnetiska nanopartiklar med små korn av 70-100 nm intill. (B) Enlarged vy av magnetisk nanopartikel och observerade granuler. (C) Bild av magnetiska kulor utan antikropp konjugerad. (D) Förstorad bild av magnetiska pärlor utan antikropp konjugerad. Denna siffra är från Wei et al. 14 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Studie av Utsläpp av Exosomal Innehåll Använda CSW Electric Field
TEM-bilder av anti-humana CD63 pärlor visar 70-100 nm granulat angränsande till magnetiska pärlor (se figur 3A). Efter erövringen av exosomes med hjälp av magnetiska kulor, prover behandlas med två olika metoder parallellt. Den första metoden som användes var Triton-X 100 rengöringsmedel för att lysera exosomes och den andra metoden var den cykliska fyrkantvåg (CSW) elektriskt fält lysbuffert fri metod som diskuteras i detta arbete (uppgifter om Triton-X 100-metoden are beskrivs av Wei e t al. 14). Dessa bearbetade Exosome-pärla komplex analyserades med TEM och en mRNA referens gen kvantifierades med hjälp av elektrokemisk metod som beskrivs i detta arbete. Referens gen som används i denna studie var GAPDH, som finns i de flesta exosomes.
TEM-bilder visar att i båda de behandlade proverna Triton-X 100 och CSW elektriska fält, fanns en noterad frånvaro av Exosome strukturerna vidhäftade till de magnetiska pärlorna efter både CSW och Triton-X 100 behandlingsmetoder (se figur 4B-II och Figur 4B-iv). Mätningen av GAPDH uttryck nivåer i båda de behandlade proverna Triton-X 100 och CSW elektriska fält besatt en liknande profil: nämligen att följa de olika lyseprotokoll, fanns det en minskning i uppmätta GAPDH nivåer som tiden fortskred, vilket indikerar en exponering av exosomal mRNA för den extravesicular miljön i saliven (se figur 4C).
<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always">
Figur 4. Resultat avseende Cykliska Square Wave Exosome Cargo Release. (A) Diagram över elektriska CSW frigörmetod. (B) TEM-bilder av exosomer: (i) Före CSW frisättning, (ii) Efter CSW-metoden, (iii) Före lysbuffert metod, (iv) Efter lysbuffert metod. Bakgrunden av TEM-bilder är spetsstöd. (C) Kvantifiering av Exosome GAPDH mRNA-nivåer när lysbuffert och elektriskt fält CSW appliceras. Denna siffra är från Wei et al. 14 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Undersöka Utförande av EFIRM för detektion av ytproteiner och hyste mRNA
Utvärdering av EFIRM och compaförelse med traditionella metoder genomfördes. EFIRM jämfördes med kvantifiering av protein med hjälp av Western blöt (för human CD63-GFP, en ytmarkör för exosomer) och qPCR för kvantifiering av RNA (med användning av GAPDH som en mRNA-målet). Eftersom den mänskliga CDP63-GFP var på ytan av Exosome ades CSW tillämpas inte lasta Exosome last. Resultaten av protein- och RNA-tester är respektive visas i figur 5A och 5B.
Specificitet tester genomfördes också för EFIRM genom att blanda de mänskliga exosomes med exosomes från mus prover. Dessa specificitet tester involverade olika ratio blandningar av musen för att mänskliga prover. Resultat av experiment visar att när musen exosomal innehåll var fem gånger större än den mänskliga innehåll, mänskliga exosomal proteiner och mRNA kan fortfarande identifieras och kvantifieras (se figur 5C och 5D för protein och RNA, respektive).
Figur 5. EFIRM Performance värdering för mRNA och proteinnivåer med hjälp av utspädda prover av exosomes. (A) Jämförelse av EFIRM och western blöt på GFP-delen. (B) Jämförelse av EFIRM och qPCR för GAPDH mRNA. (C) Relativa detekterade GFP signalnivåer för mänskliga exosomes utspädda i olika mängder av mus Exosome. (D) Relativ detekterad signal för GAPDH mRNA för mänskliga exosomes utspädda i olika mängder av mus Exosome. Denna siffra är från Wei et al. 14 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Exosomal Innehåll kvantifieras från mus Saliv
För att bestämma lönsamheten för detektering exoSomal innehåll i spottprov, var en naken musmodell som används. Denna naken musmodell erhöll en interpleural injektion av 1 x 10 6 humana lungcancercell H460 (en cellinje som transfekterades att också uttrycka Exosome markör humant CD63-GFP) eller saltlösning. Det fanns 11 möss som erhöll en negativ kontroll av 100 | il koksaltlösning och nio möss erhöll cellinjektion. Efter 20 dagar, testades serum och salivprover som samlats in från de två grupperna av möss.
Användning av EFIRM metoden tillåts kvantifiering av de relativa nivåerna av mänskligt CD63-GFP protein i möss serum och saliv. En jämförelse av de relativa nivåerna mellan de två serum och saliv av mössen visade linjär korrelation mellan de två Biofluids (R = 0,79). Dessutom var signifikant skillnad observerades i de humana CD63-GFP nivåer för H460 injicerade möss mot saltlösning injiceras mössen. Detta tyder på att exosomes från distala tumörceller smugglas into vaskulaturen och saliv. Resultaten jämfördes serum och saliv visas i figur 6.
Figur 6. EFIRM utvärdering av relativa nivåer av mänsklig CD63-GFP i serum och saliv. Jämförande studier mellan de relativa nivåerna av mänskligt CDP63-GFP från möss som injicerats med humana lungcancerceller. Linjäritet finns mellan serum och salivprov för humant CD63-GFP. Nivåer av mänskligt CD63-GFP är förhöjda hos möss som injicerats med celler (jämfört med saltlösning injiceras möss). Denna siffra är från Wei et al. 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som resultaten visar, anti-human CD63 betäckta magnetiska nanopartiklar är i stånd att specifikt fånga små partiklar som har en storlek inom intervallet 70-100 nm. Detta fångade partikeln är i överensstämmelse med den tidigare observerade profilen av exosomer. Vidare är användningen av lågspänning CSW efter tillfångatagandet av partiklarna visade att ta bort dem från pärlytan och orsaka DNA nedbrytningsprofiler som liknar en traditionell lysisbuffert baserad metod för last release. Dessa data tyder på att arbetsflödet av exosomal lastfrigör kan förenklas genom tillämpning av en cyklisk fyrkantvåg för störningar av Exosome lipidmembranet. Denna förenklade metod möjliggör snabb last frigivning utan behov av lyse buffertar som negativt kan påverka Exosome last, och som ett resultat av EFIRM metoden verkar vara en föredragen metod för exosomal innehållsstudier jämfört med traditionella metoder för ultracentrifuge och användning av lysbuffertar. Känsligheten, specificiteten, och enkel att EFIRM metoden gör det idealiskt för att extrahera exosomes från en Kroppsvätska och snabbt testa intern innehåll för både nukleinsyror och protein mål.
Den EFIRM metod användes för studien av en naken musmodell som injicerades med H460 humana lungcancercell. De H460 mänskliga lungcancerceller transfekterades dessutom med humant CD63-GFP så att Exosome ytmarkörer CD63 skulle ha en självlysande egenskap. Efter en period av 20 dagar, var musserum och salivprov uppsamlades och EFIRM metod användes för att analysera deras exosomal innehåll. Denna studie visade linjära korrelationer mellan serum- och salivprov (R = 0,79). Konsekvenserna av dessa resultat är två: För det första föreslår förmågan att fånga exosomes från Biofluids att distala cancerceller kan överföra exosomes till andra segment av kroppen, framför allt i denna studie munhålan. SNDRA föreslår linearitet observer mellan serum och salivprov som saliv kan vara en trovärdig Kroppsvätska för fångst av exosomer som produceras i ett sjukdomstillstånd i kroppen (dvs cancer) och analys av deras molekylära innehåll.
Den beskrivna metoden och de efterföljande resultaten visar att metoden är lämplig för att extrahera exosomes från Biofluids baserat på deras ytmarkörer (inom ramen för detta arbete, CD 63 är ytan markör vald). För framtida projekt är det meriterande att undersöka om inriktning ytterligare ytmarkörer exosomes (t.ex. CD 9) eller kombinera EFIRM metoden med andra tekniker kommer att förbättra utvinningen och testning av Exosome innehåll.
Exosome biologi är ett lovande område för studien för translationell medicin, och följande studiens data antyder att saliv exosomal analys kan vara en plats för att identifiera sjukdoms diskriminerande biomarkörer. Framtida undersökningarförefaller lämpligt att avgöra om distala biomarkörer sjukdoms kan användas för icke-invasiv diagnostik. EFIRM som metod kan bidra till att bana väg för en effektivare analys av sådana mål inom exosomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
David Wong är en av grundarna av RNAmeTRIX Inc., ett molekylärt diagnostikföretag. PeriRx LLC licensierat intellektuella egenskaper avseende molekylär diagnostik från RNAmeTRIX. David Wong är konsult till PeriRx.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Center for Research Resources och National Center for Advancing Translation Sciences, National Institutes of Health, genom Grant UL1TR000124 (till FW); Felix & Mildred Yip Begåvad professuren och Barnes Family Fund (till DTWW), National Institute of Dental & Craniofacial Forskning av National Institutes of Health i Award Number T90DE022734 (till MT). Innehållet är ensamt ansvar författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
| 16x Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
| Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
| Neodynium Magnetics (1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
| Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
| Mettler Toldeo 3 M KCl Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
| Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
| 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
| Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
| Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |
References
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer. Clinical Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
- Lau, C. S., Wong, D. T. W. Breast Cancer Exosome-like Microvesicles and Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-Derived Exosome-like Microvesicles In. Vitro. PLoS ONE. 7 (3), e33037 (2012).
- Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatolog. 56 (5), 1946-1957 (2012).
- Dear, J. W., Street, J. M., Bailey, M. A. Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling. Proteomics. 13 (10-11), 1572-1580 (2013).
- Lässer, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9 (1), 9 (2011).
- Palanisamy, V., et al. Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes. PLoS ONE. 5 (1), e8577 (2010).
- Camussi, G., et al. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lau, C., et al. Role of pancreatic cancer-derived exosomes in salivary biomarker development. The Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26888-26897 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids. Current Protocols in Cell Biology. 3 (22), (2001).
- Park, N. J., Li, Y., Yu, T., Brinkman, B. M. N., Wong, D. T. Characterization of RNA in Saliva. Clinical Chemistry. 52 (6), 988-994 (2006).
- Wei, F., et al. Bio/Abiotic Interface Constructed from Nanoscale DNA Dendrimer and Conducting Polymer for Ultrasensitive Biomolecular Diagnosis. Small. 5 (15), 1784-1790 (2009).
- Wei, F., et al. Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection. Clinical Cancer Research. 15 (13), 4446-4452 (2009).
- Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM). Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).
