Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Entwicklung von Inhibitoren von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch REPLACE: Anwendung auf die Konzeption und Entwicklung Nicht ATP Competitive CDK-Inhibitoren

Published: October 26, 2015 doi: 10.3791/52441
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Drug Discovery and Biomedical Sciences, University of South Carolina

Abstract

REPLACE ist eine einzigartige Strategie entwickelt, um zielgerichteter Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI). Es zielt auf verfügbare Medikament Zielraum durch eine verbesserte Methode für die Identifizierung von Inhibitoren für solche Bindungsstellen und die sich ausdehnen stellen die Mehrheit potentieller Arzneimittelziele. Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, einen methodischen Überblick über die Nutzung und Anwendung des REPLACE-Strategie, die Rechen- und Synthesechemie Ansätze beinhaltet bereitzustellen. REPLACE ist durch seine Anwendung auf die Entwicklung von nicht-ATP Wettbewerbs Cyclin-abhängigen Kinasen (CDK) Inhibitoren als anti-Tumor Therapeutika, beispielhaft dargestellt. CDKs werden häufig in der Krebs dereguliert und damit als wichtige Ziele für die Medikamentenentwicklung berücksichtigt. Inhibition von CDK2 / Cyclin A in der S-Phase ist berichtet worden, um eine selektive Apoptose von Krebszellen in einem p53-unabhängigen Weise durch die E2F1 Wegs zu fördern. Targeting die Protein-Protein-Wechselwirkung an der Cyclin Binding Nut (CBG) ist ein Ansatz, der die spezifische Hemmung des Zellzyklus über Transkriptions CDKs ermöglichen wird. Die CBG wird durch eine Konsensus-Sequenz von CDK Substrate und Tumor-Suppressor-Proteine ​​abgeleitet anerkannt bezeichnet das Cyclin-Bindungsmotiv (CBM). Die CBM hat bereits zu einem Octapeptid aus p21Waf (HAKRRIF) und dann weiter auf ein Pentapeptid Beibehaltung ausreichender Aktivität (RRLIF) abgeschnitten optimiert. Peptide sind im allgemeinen nicht zelldurchlässig ist, metabolisch instabil und damit die REPLACE (Ersetzen mit seitlichem Ligand Alternativen durch Computational Enrichment) Strategie, um mehr arzneimittelähnliche Inhibitoren erzeugen angewendet. Die Strategie beginnt mit der Konstruktion Fragment ligiert inhibitorischen Peptide (FLIPs), die selektiv Zellzyklus CDK / Cyclin-Komplexe hemmen. FLIPs wurden durch iterative Ersetzen von Resten von HAKRRLIF / RRLIF mit Fragment wie kleine Moleküle (Verkappungsgruppen), ausgehend vom N-Terminus (Ncaps) erzeugt, gefolgt von Ersatz fürder C-Terminus. Diese Verbindungen sind Ausgangspunkt für die Erzeugung von nicht-ATP Wettbewerbs CDK-Inhibitoren als anti-Tumor Therapeutika.

Introduction

In diesem Artikel wird eine Fallstudie über die Anwendung des REPLACE (Replacement mit Teilliganden Alternativen mit Rechen Anreicherung) Strategie, peptidische Inhibitoren der Protein-Protein-Interaktionen in mehreren pharmazeutisch relevanter Moleküle umzuwandeln beschrieben 1-3. Während EPI stellen eine reiche, aber wenig genutzt Quelle potentieller Wirkstoff-Targets werden bestehende Methoden weitgehend unzureichenden diese allgemein zugänglich zu machen. Aktuelle Strategien einschließlich Fragment basierte Entwurf 4, Hochdurchsatzscreening 5 und 6 geheftet Peptide haben Fortschritte vorgesehen, aber diese sind in vielen Fällen unwirksam. Als Ergebnis werden mehr Fortschritte und effizienter Ansätze erforderlich. REPLACE ist vollständig in der Entwicklung von Kinase-Inhibitoren, die arzneimittelähnliche verbesserte Eigenschaften haben und Entwicklungspotential als Antitumortherapeutika validiert. Diese Strategie ist in der Entwicklung von nicht-ATP Inhibitoren der Zell exemplifiziertZyklus CDKs und umfasst: 1) Erhalten von 3D Strukturinformationen über die Wechselwirkungen HAKRRLIF / RRLIF mit Cyclin-Bindungsfurche; 2) Bestimmung der wichtigsten Bindungsdeterminanten für Peptid-Wechselwirkung; 3) Verkürzung des Peptids N-Terminus enthält, eine oder mehrere Bindungsfaktoren; 4) rechnerische Ermittlung potentieller kleines Molekül Alternativen (partielle Ligand Alternativen PLAs) für den kegelstumpfförmigen Teil des Peptids und dem Bindung wichtiger Wechselwirkungen des Stammpeptids; 5) Synthese oder gewerblichen Beschaffung von PLAs vorausgesagt, um eifrig mit dem Unter Website zuvor von der gelöscht Peptidrest (n) besetzt binden; 6) Synthese von blättert durch Ligation der besten PLAs, um das verkürzte Peptid unter Verwendung der Festphasensynthese; 7) Test des FLIPs in einem In-vitro-Bindung oder funktionelle Assays (Fluoreszenzpolarisation in der CDK / Cyclin-Kontext), gefolgt von weiteren Charakterisierung in einem Zelllebensfähigkeitstest. Eine schematische Darstellung strateg REPLACEy ist in Figur 1 dargestellt ist. In diesem Artikel werden die Iterationen des REPLACE-Strategie diskutiert und die Anwendung auf CDK2 / Cyclin A im Detail beschrieben. CDKs wird angenommen, dass in der Mehrzahl der Tumoren direkt oder indirekt dereguliert werden und sind daher geeignete Krebs-Medikament Ziele 7 betrachtet. CDKs erfordern Zusammenarbeit mit Cycline für die vollständige Aktivierung und anschließend phosphoryliert Schlüsselproteine ​​in der Zellzyklusregulation 8 beteiligt. Die zwei Hauptgruppen von CDKs sind die Isotypen, die Zellzyklus-Checkpoints kontrollieren [G1 / S (CDK4 / Cyclin D, CDK6 / Cyclin D und CDK4 / Cyclin E), S-Phase (CDK2 / Cyclin A) und G2 / M (CDK1 / Cyclin B)], und die Aufsichtsbehörden der RNA-Polymerase durch Phosphorylierung (CDK7 / Cyclin H, CDK8 / Cyclin C, CDK9 / Cyclin-T). Ein Schlüsselschritt in der S-Phase auftritt, wenn der Fort E2F1 Transkriptionsfaktor einen Komplex mit dem DP-Protein, das eine Bindung mit DNA und initiiert Gentranskription bildet. CDK2 / Cyclin A erforderlich ist, um E2F1 Transkriptions neutralisierenAktivität durch Phosphorylierung wodurch die zu der E2F1-DP-Komplex und dessen nachfolgenden Abbau freigeben. Die Hemmung von CDK2 / Cyclin A wird angenommen, dass E2F1 in seiner DNA-gebundenen Zustand anhaltender Aktivierung führt zu halten. Die sich ergebende Niveau von E2F-1-Aktivität wird die erforderlich ist, um p53 unabhängige Apoptose zu induzieren, damit was auf eine therapeutische Strategie Schwelle zu übertreffen. Aufgrund dereguliert p53 und pRb Wegen hohe E2F-1 häufig in Krebszellen und Inhibierung von CDK2 / Cyclin A auftreten sollten, um eine selektive Apoptose in Tumoren führen und kann als validiert Krebs-Target 7 betrachtet werden.

Klinisch untersucht CDK-Inhibitoren zielen auf den hoch konservierten ATP-Bindungsstelle, die zu Reaktivität unter den mehr als 500 Proteinkinasen im menschlichen Kinoms überqueren und möglicherweise, die zu Wirkungen und Toxizität 9 Seite. Ein alternativer Ansatz ist nicht-ATP-kompetitive Hemmung durch gezielte Substrat Rekrutierung durch die CBGauf Cyclin positive regulatorische Untereinheit vorhanden ist und die daher unterschiedliche und weit entfernt von ATP-Bindungsstelle 10,11 ist. Das CBG ist hauptsächlich eine hydrophobe Rille in Cyclin A, Cyclin D und Cyclin E vorhanden und es wurde gezeigt, um eine Konsensus-Sequenz in Substraten und Tumorsuppressoren gefunden erkennen. Als ein isoliertes Peptid, das Cyclin-Bindungsmotiv (CBM) bindet an das CBG und wurde gezeigt, dass die Kinaseaktivität der Zellzyklus-CDKs inhibieren. Das CBM wurde Octapeptids optimiert (HAKRRLIF, CDK2 / Cyclin A IC 50 0,07 ± 0,02 uM, CDK4 / Cyclin D, IC 50 0,88 ± 0,34 uM) und außerdem an einen trunkierten Pentapeptid repräsentiert einen guten Kompromiss zwischen dem Molekulargewicht für Drogen- Gleichheit und Potenz (RRLIF, CDK2 / Cyclin A IC 50 1,01 ± 0,17 & mgr; M, CDK4 / Cyclin D, IC 50 25,12 ± 2,97 uM) 12,13. Die CBGs bestehen aus einer großen primären und sekundären kleinere hydrophobe Tasche, die durch eine acidi überbrückt werdenc Bereich (beinhaltet Glu220, Glu224 und Asp283). Die wichtigsten Bindungsdeterminanten HAKRRLIF beinhalten die Wechselwirkung von Ala2 mit den sekundären hydrophoben Tasche, Ionenpaarung und Wasserstoffbrückenbindungen Lys3, Arg 4 und arg5 mit dem sauren Bereich und einem hohen Grad an Komplementarität Leu6 und Phe8 mit dem primären lipophilen Ort. Darüber hinaus werden zahlreiche Wasserstoff-Bindungen vom Peptid-Rückgrat beigetragen während Ile7 wirkt als ein Abstandshalter-Rest ermöglicht einen optimalen Kontakt mit dem primären Tasche. Das Bindungsmotiv und Wechselwirkungen HAKRRLIF mit CBG ist in Abbildung 2 dargestellt.

Zur Förderung der CBM / CBG Protein-Protein-Wechselwirkung, wobei die Kinase-Aktivität von CDK2 / Cyclin A, CDK2 / Cyclin E & CDK4 / Cyclin-D zu hemmen, und dies sollte E2F1 auslösen vermittelte Apoptose von Krebszellen, während nicht normale Zellen 7 zu beeinträchtigen. Obwohl CBM abgeleitete Peptide sind wirksame Inhibitoren der CDKs beeinflussen, ist es unwahrscheinlich, dass sie als Arzneimittel nützlich sein, die aufgrund ihrer StoffwechselInstabilität und allgemeiner Mangel an Zellpermeabilität. Zu diesem Zweck haben wir die REPLACE-Strategie, um diese potenten peptidischen Inhibitoren in mehrere wirkstoffähnlichen Verbindungen für die weitere Entwicklung der Anti-Tumor-Therapeutika Ausnutzung dereguliert E2F1 durch CDK2 / Cyclin-A-Hemmung zu konvertieren angewendet. Das folgende Protokoll fasst Arbeit, die bei der Anwendung ersetzen, um die Cyclin Nutfertigung. Im ersten Fall wurden arzneimittelähnliche Cappinggruppe Ersatz für die N-terminale Tetrapeptid der HAKRRLIF identifiziert. Darüber hinaus Verbesserungen in diesen Gruppen wurden in einem zusätzlichen Validierungsstudie für REPLACE sucht. Repräsentative Ergebnisse aus diesen Studien werden ebenfalls vorgestellt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Computational Identifizierung potenzieller Kleinmolekül Verkappungsgruppen

Hinweis: Im Prinzip kann eine Vielzahl von Docken oder Pharmakophor Suchverfahren verwendet werden, um potentielle Verkappungsgruppen vorherzusagen. Der Hauptzweck der theoretischen Studien in REPLACE ist es, kleine Moleküle, die die Eigenschaften und Wechselwirkungen der Aminosäuren, die substituiert sind, behalten zu identifizieren.

  1. Validierung des LigandFit Docking-Protokoll 14

Hinweis: In früheren Studien, die Docking-Verfahren (LigandFit 15, ein Modul in der Molecular Modelling-Programm-Suite, Entdeckung Studio 3.0) wurde überprüft, um sicherzustellen, dass dieser Algorithmus ist ausreichend, um die Bindungsarten bekannt Ncaps zu reproduzieren und zu zeigen, dass die Ergebnisse für die erhaltenen unbekannte Verbindungen sind vorausschauende 14.

  1. Mit den folgenden Schritten (1,2 bis 1,5), zu identifizieren optimalen Parameter für LigandFit wie folgt: PLP1 enEnergiegitter für Pose Generation, Minimierung der erzeugten Posen und der PLP1-Bewertungsfunktion für die Analyse von Posen.
  2. Um die erhaltenen Konformationen zu beschränken und Liganden in geeigneter Weise zur Bildung einer kovalenten Bindung in dem verkappten Peptid Position befindet, die Indol-Stickstoff und Amid-Stickstoffatome von Trp217 und Gln254 jeweils als Wechselwirkung Filter für Wasserstoffbrückenbindung.
  3. Design und Dock eine Bibliothek von Fragment Alternativen in die CDK2 / Cyclin A-Rezeptor (2UUE). Priorisieren Potenzial Capping-Gruppen zur Synthese und kommerzielle Sourcing auf Basis von Scoring-PLP1, Interaktionen mit Interaktionsfilter und Komplementarität mit der CBG. Die verschiedenen Schritte für LigandFit Docking erforderlich sind wie folgt.
  1. Herstellung der Rezeptorbindungsstelle 14
    1. Importieren Sie die CDK2 / Cyclin eine Kristallstruktur (PDB ID: 2UUE) in eine Visualisierungsfenster in der Software. Diese Struktur enthält die zuvor identifizierten FLIP 5-methyl-1-phenyl-1H-1, 2,4-triazol-3-carboxamido (3,5-DCPT) RLIF den Cyclin Nut gebunden (Figur 3).
    2. Löschen oder halten Sie an Ort und Stelle die Reste RLIF (C-Terminus). Wenn die Peptidsequenz beibehalten wird, verwenden die N-terminale Aminogruppe des Peptids als Interaktionsfilter für den Liganden. Von den "Rezeptor-Ligand-Interaktionen" Werkzeuge, erstellen Sie eine Kugel um den N-Kappe 3,5-DCPT von Show / site ausblenden Kugel. Die Kugel wird erstellt, um den aktiven Bereich in der Bindungsstelle in dem die Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen dürfen während der Bindung auftreten definieren.
    3. Definieren Sie die Bindungsstelle weiter von der "zu finden Website als Volumen von ausgewählten Liganden", und löschen Sie den Liganden 3,5-DCPT aus dem Protein. Führen Sie diesen Schritt, um die Lautstärke der Bindung innerhalb der Sphäre geschaffen definieren.
    4. Eingestellt Indolstickstoff und Amid-Stickstoffatome der Reste Trp217 und Gln254 als Interaktionsfilter zur Wasserstoffbrückenbindung. Stellen Sie die Interaktion Filter, so dass nur die Posen, die interact mit den Atomen des Satzes Rückstände während des Docking-Prozess daher die Erhaltung wichtigen Wechselwirkungen in den angedockten Posen gefiltert werden.
  2. Herstellung von Liganden 14
    1. Design eine Bibliothek von 100 Potential Verkappungsgruppen anhand von Kriterien, einschließlich Molekulargewicht von weniger als 500, das Vorhandensein einer Carboxylatgruppe zur Ligation mit dem trunkierten Peptids und Aufnahme geeigneter hydrophober Gruppen (substituierte Phenylgruppe) Van der Waals-Wechselwirkung im Sekundärfach als in Tabelle 1 gezeigt.
    2. Wählen heterocyclische Ringe zum Nachahmen Peptid Wasserstoffbindungswechsel mit Trp217 und Substituenten enthalten zum Ersetzen Ionenpaar-Wechselwirkungen zwischen basischen Seitenketten des HAKRRLIF. Dock und die Liganden als jeweilige Aldehydmolekülen so daß der Carbonylsauerstoff mit dem Amid-Stickstoffatom Gln254 ähnlichen Peptid-Rückgrat in der Stammpeptids (Tabelle 1) zu interagieren.
    3. Vor docKönig, zu minimieren, entwickelt Liganden auf einen niedrigen Energie Konformation und bereiten in geeigneter Ionisationszustand mit der "Prepare-Liganden" Protokoll. Zu ziehen und in die Software importiert exportieren diese potenziellen N-Kappen in der SDF-Datei-Format in ChemDraw für ein Spreadsheet vor.
      Hinweis: Bereiten Liganden-Protokoll wird verwendet, um alle Liganden zu minimieren, um auf den niedrigsten Energiezustände angedockt werden und die Ionisation Kosten wurden den geltenden Atomen angewandt. Default-Parameter für diesen Schritt verwendet.
  3. Docking der Liganden in die Cyclin A Groove 14
    1. Wählen Sie das LigandFit Routine von Rezeptor-Ligand-Interaktionen Protokollsatz der Software. Verwenden Sie den Rezeptor und die vorbereiteten Liganden als Eingabe für dieses Protokoll.
    2. Für diese Läufe wählen PLP1 als Energienetz, stellt fest, dass Energie minimiert werden, und dass die Anzahl der erzeugten Posen als 10. Lassen Sie alle anderen Parameter auf die Standardwerte.
      Hinweis: LigandFit isteine Docking-Verfahren, das mit der aktiven Stelle eines Proteins unter Verwendung einer Form basiert Vergleichsfilter, die mit einer Monte Carlo Konformationssuche Algorithmus kombiniert wird, zu erkennen und erzeugen kann Posen des hohen Grad an Komplementarität und potentielle Affinität. Das Energienetz von der Docking-Programm verwendet wird, ist das Kraftfeld zur Erzeugung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen und mögliche Posen. PLP1 stückweise linear Potential der spezifisch priorisiert Wasserstoffbindungswechsel und wobei die PLP Atomtyp wird für jeden Nicht-Wasserstoffligandenatom oder Nicht-Wasserstoff-Rezeptor Atom zugewiesen.
  4. Analyse der Ergebnisse
    1. In der ersten Instanz, stellt Anzeige im Visualizer Programm und dann sortieren nach absteigenden Werten der PLP1-Score. Verwenden Bewertungsfunktionen wie PLP1 abzuschätzen die Bindungsaffinität eines verankerten Liganden, der einen Ligandenkandidaten darstellen Geometrie und nicht-kovalente Wechselwirkung mit der Zielrezeptorstruktur.
      Hinweis: Hier wird das PLP1 Bewertungsfunktion zu g gefunden wurdeive die besten Ergebnisse, da es eine Abschätzung der Wasserstoffbrückenbindungen enthält.
    2. Analysieren Sie visuell den oberen 25% der erzielte Posen für 1) superimposability mit dem bekannten Capping-Gruppe (mit einer relativen mittlere quadratische Abweichung (RMSD) Wert von weniger als 2 a), 2) erfüllt Interaktion Filter und 3) visuelle Komplementarität mit dem Cyclin Nut . Es wird angenommen, daß ein korrekt angedockt darstellen (im Vergleich zu einem experimentellen Aufbau) eine RMSD-Wert von <2 A.
    3. Untersuchen Posen für visuelle Komplementarität, die als mit effizienten Füllung der Bindungstasche in einer Weise, die mit bekannten Struktur-Wirkungsbeziehungen ist definiert ist. Interaktion Filter sind so eingestellt, Atom Beschränkungen, die intermolekularen Kontakte bekannt kritisch für die Bindung und / oder sind erforderlich, um das Potenzial Capping-Gruppe in die richtige Geometrie für Amidbindungsbildung positionieren zu sein erfordern. Drei Beispiele für angedockt Posen der potentielle N-Verkappungsgruppen machen Wasserstoffbrücken mit Zusan Filter werden in 4 gezeigt.

2. Synthese und Charakterisierung von potentiellen N -capping Gruppen

  1. Synthese von N-Verkappungsgruppen.
  2. Für die Synthese, verwenden alle kommerziellen Ausgangsmaterialien, Lösungsmittel und Reagenzien, wie erhalten. Synthetisieren potentielle N-Verkappungsgruppen mit herkömmlichen organischen Synthesechemie (Figur 5 12,13 für ein Beispiel).
  3. Zuführen Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Kieselgel zum Überwachen Reaktionen.
    1. Löse das Ausgangsmaterial und die Reaktionsmischung (1 mg) in der mobilen Phase und vor Ort sie auf der DC-Platte unter Verwendung von Kapillaren.
    2. Legen Sie die DC-Platte in der Kammer enthält, mobile Phase (Ethylacetat und Hexan in einem 35:65 Verhältnis). Sobald die mobile Phase 90% der DC-Platte erreicht, zu entfernen und an der Luft trocknen Sie die Platte.
    3. Verwenden Sie UV-Licht auf das Ausgangsmaterial und Reaktionsmischungen als sichtbare Flecken zu erkennen. Calculate die R f aller Punkte (Verhältnis der Entfernung von der Stelle und der mobilen Phase gereist).
      Anmerkung: Die Reaktion ist beendet, wenn kein Punkt an der R f des Ausgangsmaterials gesehen.
  4. Nach der Vollendung der Reaktion Aufarbeitung des Reaktionsgemisches, indem in einem Scheidetrichter und Waschen mit wässrigen Säure- oder Basenlösung entsprechend. Sammeln des organischen Lösungsmittels verdampft es in einem Rotationsverdampfer und Trocknen des Rohproduktes im Vakuum erhalten.
  5. Man löst 500 mg Rohprodukt in 3-5 ml geeigneten Lösungsmittel, und fügen Sie zu einer 1 g Kieselsäure oder RP18 Samplet und unter Luft trocknen. Legen Sie die Samplet enthält das rohe Produkt in den Silica / RP SNAP Flash-Kartuschen und das rohe Material mit automatisierten Hochleistungs Flash-Chromatographie (nach Herstellerprotokoll) unter Verwendung eines SNAP 100 g Säule mit einem Gradienten Lauf ausgehend von 6% Ethylacetat: 94 % Hexan bis 50% Ethylacetat und 50% Hexan als15 Säulenvolumina.
  6. Trocknen des gereinigten Produkts mit einem Rotationsverdampfer in einem Lösungsmittel aus dem Flash-Chromatographie gesammelten durch Verdampfen das gesamte Lösungsmittel zur Trockene und das Produkt weiter unter Vakuum getrocknet, um alle Restlösungsmittel zu entfernen. Zuführen Charakterisierung des gereinigten Produkts durch NMR, MS und analytische HPLC.
    1. 1 H-NMR und 13 C-NMR, ein Gewicht von etwa 10 mg des gereinigten Probe, löst ihn in einer entsprechenden deuterierten Lösungsmittel und der Inhalt in einem trockenen NMR-Röhrchen für die Aufnahme der NMR-Spektren 2,14.
    2. Notieren Sie die 1 H-NMR und 13 C-NMR-Spektren mit hoher Feld NMR-Spektrometer (mindestens 300 MHz). Erwerben Massenspektren mit einer QTOF (Tandem Vierfach-1-Flugzeit-Massenspektrometer), Elektrospray-Ionisation (ESI) oder einem VG-70S (Doppelfokus-Magnetsektor-Massenspektrometer, EI) 2,14.
    3. Analyse der Reinheit der Produkte durch HPLC mit Diodenarray-Detektor und ausgestattet mitein C18 (2) 100 A, 250 × 4,6 mm, 5 & mgr; m-Säule für die Analyse. Verwenden Sie einen Farbverlauf Lauf ausgehend von 100% Wasser (0,1% Trifluoressigsäure) auf 60% Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure) über 30 Minuten und halten Sie den Farbverlauf für 4 min. Extrahieren Sie die Chromatogramme bei 226 und 254 nm 2,14.
      Anmerkung: Analytical Reinheiten ausgewertet Verbindungen waren> 95%.

3. Festphasensynthese zur Erzeugung von FLIPs 2

  1. Synthese von N-capped FLIPs
    1. Montieren N bedeckten Peptidverbindungen durch Standard-Festphasen-Syntheseverfahren mit den folgenden Schritten.
      1. Aktivieren 5 Äquivalente der C-terminalen Aminosäure (Fmoc-Phe) in 4,4 Äquivalenten O -Benzotriazole- N, N, N ', N' N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat-Hexafluor-phosphat (HBTU, 221.93 mg) in 2 ml DMF für 5 min. Laden Sie die Fmoc-Phe HBTU Mischung auf die Rink-Harz mit 6 Äquivalenten Diisopropylethylamin (DIPEA, 103,13mg) für 1 h bei RT.
      2. Entfernen der Fmoc-Schutzgruppe von der C-terminalen Rest mit 20% Piperidin in 3 ml DMF für 10 min. Paar nachfolgenden Aminosäuren (beispielsweise Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-PMC) Schritt für Schritt. Bei jedem Schritt Paar 5 Äquiv der nächsten Aminosäure mit 6 Äquivalenten DIPEA (103,13 mg) und 4.4 Äquivalenten HBTU (221.93 mg) in 2 ml DMF 1 Stunde bei RT.
      3. Gelten Waschzyklen (5 x 10 ml DMF + 5 x 10 ml DCM) Nach der oben beschriebenen Aminosäure-Kupplung und Fmoc Entschützungsschritte. Nach der Peptidanordnung Paar N-Verkappungsgruppen mit 6 Äquivalenten DIPEA (103,13 mg) und 4.4 Äquivalenten HBTU (221.93 mg) in 2 ml DMF 1 Stunde bei RT.
      4. Nach Abschluss der Peptidsynthese, Behandlung des Reaktionsgemisches mit 2 ml der Abspaltungsmischung (90: 5: 5 TFA / H 2 O / TIPS) O / N Seitenkettenschutzgruppen zu entfernen, und spalten Flips von dem Harz. Verreiben des resultierenden Produkts mit kaltem Diethylether ausgefällt und if erforderlichen Konzentrat in einem Rotationsverdampfer.
  2. Synthese von N-capped-C bedeckten FLIPs
    1. Wiegen und lösen Sie die N-terminal verschlossen und geschützt Arg-Leu-Peptid (16,1 mg, 0,02 mmol) in Dichlormethan, und fügen Sie [4- (3-Chlorphenoxy) pyridin-2-yl] methan (C-Cap) zusammen mit O - Benzotriazol-N, N, N ', N' N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU; 16,7 mg, 0,02 mmol) und N, N-Diisopropylethylamin (DIPEA, 6,5 mg, 0,02 mmol).
    2. Rühren und Überwachung der Reaktion bei RT, bis die TLC / HPLC zeigt den vollständigen Verbrauch des Ausgangsmaterials. Nach der Beendigung der Reaktion konzentriert man das rohe Reaktionsgemisch mit einem Rotationsverdampfer und dann zwischen Ethylacetat und Wasser.
    3. Trenne die wässrige und organische Schicht; die organische Phase wird mit 1 N NaOH, 1 N HCl und Kochsalzlösung. Trocknen der organischen Schicht mit etwa 1 g Natriumsulfat und konzentriert, um ein Produkt in einem Rotationsverdampfer. Finally Das Produkt O / N mit dem Spaltungsgemisch (95: 2,5: 2,5 Trifluoressigsäure / H 2 O / TIPS) zur Entfernung der Schutzgruppe.
    4. Verreiben des resultierenden Produkts mit kaltem Diethylether und gegebenenfalls Konzentrat in Rotationsverdampfer zur Trockene, um das gesamte Lösungsmittel zu entfernen abzuschließen. Das Produkt weiter zu trocknen unter Vakuum, um alle Restlösemittel zu entfernen.
  3. Reinigung und Charakterisierung von FLIPs
    1. Reinige rohe FLIPs mit halb präparative Umkehrphasen-HPLC-Verfahren. Lyophilisieren die gereinigten Flips und charakterisieren ihre Molekülmasse unter Verwendung von Massenspektrometrie 2,14.
    2. Bestimmung der analytischen Reinheit der FLIPs durch HPLC mit einem Diodenarray-Detektor und mit einem C18 (2) 100 A ausgestattet ist, 250 x 4,6 mm, 5 & mgr; m-Säule. Verwenden ein Gradientenverfahren hend von 95% H 2 O (0,1% Trifluoressigsäure) / 5% Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure) auf 35% H 2 O (0,1% Trifluoressigsäure) / 65% Acetonitril (0,1% trifluoroacetic Säure) über 30 Minuten und halten Sie den Farbverlauf für 4 min. Extract Chromatogramme bei 226 und 254 nm.

4. Fluoreszenzpolarisation Binding Assay zur Bestimmung der kompetitiven Bindung 2,14

  1. Führen Sie den Test in schwarzen 384-Loch (138 ul) Platten mit dem folgenden Verfahren.
  2. Verdünnen der Proben Tracer Peptide (4 nM) und Kinasekomplexe (CDK2 / Cyclin-A - 18 & mgr; g / ml, CDK4 / Cyclin D - 37 ug / ml) zur erforderlichen Konzentrationen in Testpuffer (25 mM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% Nonidet P-40, 1 mM Dithiothreitol (DTT).
  3. Zu jeder Vertiefung der 384-Well-Platte, hinzuzufügen: 5 ul CDK4D1 oder CDK2CA (0,3 ug / Vertiefung gereinigten rekombinanten humanen Kinase-Komplex), 5 ul Verbindungslösung, 5 ul 30 nM Tracer-Peptid (Fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val -Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly oder Fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly-Tracer-Peptid). Verwenden 5 ul jeder DMSO (6%), buffer, Tracer und 5 ul DMSO (6%), Kinase-Komplex, Tracer als Kontrollvertiefungen
  4. Nach der Zugabe der alle Komponenten, zentrifugieren Sie die Platte bei 500 UpM für 1 Minute (41,16 · g) bei RT und dann inkubieren Sie die Platte unter Rühren für 45 min bei RT. Mit Hilfe eines Multimode-Plattenlesegerät und Detektor mit 485 nm / 535 nm Anregungs- / Emissionsfilter und einem dichroitischen Spiegel ausgestattet lesen Sie die Fluorescein Intensität jeder Vertiefung in der Platte.
  5. Berechnung der relativen mittleren Polarisation (mp) für alle Testproben unter Verwendung der unten stehenden Gleichung zeigt. Bestimmen Sie IC 50 -Werte durch logarithmische Regression durch Korrelation gegen mps und Testkonzentrationen.

Gleichung 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Die Wechselwirkungen von HAKRRLIF mit Cyclin Nut sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Peptid-Reste, die die wichtigsten Bindungsdeterminanten dar umfassen Ala2, Arg4, Leu6 und Phe8 mit anderen Resten Bereitstellen kleinere Beiträge 12,13,18. In dieser Fallstudie die REPLACE-Strategie hat, um Fragment Alternativen für Rückstände in der N-terminalen Tetrapeptid der HAKRRLIF, in erster Linie imitiert die Wechselwirkungen von Ala2 und Arg4 finden verwendet worden. Eine Bibliothek potentieller Ncap Fragmente (Tabelle 1) wurde auf der Grundlage der Kriterien konstruiert. Jedes Molekül wurde in den frei gewordenen Bindungsstelle von seiner Kristallstruktur mit Cyclin A (: 2UUE PDB-ID), die durch Verkürzung des N-terminalen Rest angedockt. Potentiellen Liganden wurden Alternativen basierend auf Pose Analyse und PLP1 Scoring als eine Vorhersage Affinität ausgewählt ist (Beispiele für dockt Stellungen sind in Figur 4 gezeigt). Die Synthese einer bestätigten Ncap (1- (3-Chlorphenyl) -5-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-carbonsäure) ist in Figur 5, wobei dieses Molekül wurde in drei Schritten erzeugt und durch automatisierte Blitzchromatographie (Supplementary 1) gereinigt gezeigt. Das 1 H-NMR, 13 C-NMR, MS und HPLC-Charakterisierungsdaten einer repräsentativen Verbindung 1- (3-Chlorphenyl) -5-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-carbonsäure werden in Ergänzungs gezeigten Figuren 1-5 jeweils. Die Synthese von N-capped FLIPs und N-capped-C bedeckten FLIPs sind in den 7 und 8 dargestellt und die Charakterisierungsdaten sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Bindungsaffinität sowohl für CDK2 / Cyclin A und CDK4 / Cyclin-D wurde unter Verwendung die beschriebene FP-Test und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Von den getesteten Verbindungen, Flips enthält Triazol basierten N-Caps waren entschlossen, die größte Affinität für CDK2 / Cyclin A und CDK4 / Cyclin D und repräsentative Verbindung habens wurden in zellbasierten Assays getestet. Als Ganzes, wurden identifiziert FLIP Molekülen mehr Medikament dergleichen, und die meisten der Wechselwirkungen des HAKRRLIF Octapeptid beizubehalten. Bedeckten Tetrapeptide besaßen geringere Potenz im Vergleich zu HAKRRLIF waren jedoch von vergleichbarer Wirkung auf den RRLIF Pentapeptid (Tabellen 3 und 4). Diese Ergebnisse zeigen, dass die erhaltenen Verbindungen hatten verbesserte Wirkstoffähnlichkeit, aber dies wurde auf Kosten der etwas beeinträchtigt Bindungsaffinität erhalten.

Die anti-proliferative Aktivität dieser CGI-Liganden wurde untersucht und zellulären IC 50 -Werte von unter 30 & mgr; M in U2OS und DU145-Zelllinien beobachtet.

Abbildung 1
Abbildung 1. Übersicht über den REPLACE-Strategie. Bitte cl ick hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Bindung und Wechselwirkungen HAKRRLIF in CBG Linker Bereich:. Modelliert Struktur HAKRRLIF auf die CBG gebunden. Die Cyclin Nut besteht aus zwei hydrophoben Taschen - eine größere primäre Tasche (rechts, nach Leu6 und Phe8 besetzt) ​​und eine kleinere Sekundärtasche (links, durch Ala2 belegt) und die von sauren Resten in Rot dargestellt überbrückt sind. Rechts: Weitere wichtige Wechselwirkungen sind Wasserstoffbrücken Kontakte des Peptid-Rückgrat (mit Trp217, Gln254, Ile281) und Ionenpaar-Wechselwirkungen der drei Grundreste des Peptids (mit Glu220, Glu224, Asp283). Bitte klicken Sie hier, um zu sehen eine größere Version dieser Figur.

441 / 52441fig3.jpg "/>
Abbildung 3. Bindungsmodus von 3,5-DCPTRLIF in CBG. Die Bindung von 3,5-DCPT-RLIF mit Wasserstoffbindungswechsel gezeigt (von grünen gestrichelten Linien dargestellt) mit Seitenketten-Atome von Trp217 und Gln254. Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Figur.

Figur 4
Abbildung 4. Ausgewählte Docking-Ergebnisse. Angedockt Posen von 3 repräsentativen N-Cap-Gruppen angezeigt. Jede dieser Verbindungen bilden H-Brücken mit den Interaktionsfilter Atome von Trp217 und Gln254 und durch grün gestrichelten Linien dargestellt. Der Phenylsubstituent macht van der Waals-Wechselwirkungen mit dem sekundären hydrophoben Tasche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Figur 5
Abbildung 5. Synthese von 1- (3-Chlorphenyl) -5-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-Carbonsäure. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6: Synthese von N-capped FLIPs durch Festphasensynthese. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 7
Abbildung 7: Synthese von N-capped-C-capped FLIPs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1

Tabelle 1

Tabelle 1 Bibliothek kleiner Moleküle angedockt und die daraus resultierenden Vorhersagen der Bindungsenergie mit der PLP1 Bewertungsfunktion.

Peptid Reinheit Säulendimensionen Verfahren Fließrate HPLC-Retentionszeit Theoretische MW Beobachtete MW
5843 > 90% 4,6 × 250 mm 5-65% Acetonitril / Wasser / 0,1% TFA 1 ml / min 23,9 732 732,6
5773 > 90% 4,6 × 250 mm 5-65% Acetonitril / Wasser / 0,1% TFA 1 ml / min 22,4 801,77 800,55
5774 > 90% 4,6 × 250 mm 5-65% Acetonitril / Wasser / 0,1% TFA 1 ml / min 24.2 767,33 766,5
5762 > 90% 4,6 × 250 mm 5-65% Acetonitril / Wasser / 0,1% TFA 1 ml / min 9.0 731,91 731,65
5763 > 90% 4,6 × 250 mm 5-65% Acetonitril / Wasser / 0,1% TFA 1 ml / min 11.2 800,8 799,5
5764 > 90% 4,6 × 250 mm 5-65% Acetonitril / Wasser / 0,1% TFA 1 ml / min 10.1 766,34 765,55
5771 > 90% 4,6 × 250 mm 5-65% Acetonitril / Wasser / 0,1% TFA 1 ml / min 9.4 749,9 749,6
5765 > 90% 4,6 × 250 mm 5-65% Acetonitril / Wasser / 0,1% TFA 1 ml / min 10.1 766,35 755,65
5766 > 90% 4,6 × 250 mm 5-65% Acetonitril / Wasser / 0,1% TFA 1 ml / min 9.4 761,9 761,55
5767 > 90% 4,6 × 250 mm 5-65% Acetonitril / Wasser / 0,1% TFA 1 ml / min 20,4 761,9 761,55
5776 > 75% 4,6 × 250 mm 5-65% Acetonitril / Wasser / 0,1% TFA 1 ml / min 23,3 785,7 784,55
5775 > 90% 4,6 × 250 mm 5-65% Acetonitril / Wasser / 0,1% TFA 1 ml / min 9.9 751,34 750,45

Tabelle 2. Analytische Daten für CGI-bindende Peptide und Flips.

Tabelle 3
Tabelle 3. In vitro-Bindung von ausgewählten N-capped FLIPs zu CDK2CA und CDK4CD.

Tabelle 4
Tabelle 4. In-vitro-Bindung von ausgewählten N & C bedeckten FLIPs zu CDK2CA und CDK4CD.

Ergänzende Abbildung 1-5. Reinigung und Charakterisierung von 1- (3-Chlorphenyl) -5-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-carbonsäure.

Sup 1
Ergänzende Abbildung 1. Flash-Chromatogramm des Produkts aus Stufe 1 erhalten Es gibt vier Gipfeln unter Elution, die Hauptspitze Elution mit 55% Ethylacetat / 45% Hexan wurde festgestellt, dass das gewünschte Produkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Abbildung.

Sup 2
Zusatz Abbildung 2. 1 H-NMR 1- (3-Chlorphenyl) -5-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-car Carbonsäure. Das NMR-Spektrum zeigt 3 aliphatischen Methylprotonen und 3 aromatischen Protonen. Die Integration für alle drei Peaks unterhalb des NMR-Spektrum angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Sup 3
Zusatz Abbildung 3. 13 CNMR 1- (3-Chlorphenyl) -5-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-carbonsäure. Es gibt zehn Kohlenstoffatomen in der Struktur, 13 C-NMR mit 10 Signale für jeden Kohlen Atom. Die Integration für jeden Peak unterhalb des NMR-Spektrum angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

ig4.jpg "/>
Zusatz Abbildung 4. MS 1- (3-Chlorphenyl) -5-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-carbonsäure. Das Molekulargewicht der Verbindung wird als Hauptpeak bei 237. Die tatsächliche Molekular gezeigten Gewicht der Verbindung ist 237,64. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Sup 5
Zusatz Abbildung 5. HPLC von 1- (3-Chlorphenyl) -5-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-carbonsäure. Die Reinheit des Produktes wird als 100% bestimmt, wie im HPLC-Chromatogramm gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Computational Chemistry
Accelyrs Discovery studio 3.0
Dell Optiplex Workstations
Synthetic Organic Chemistry
Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).
Flourescence Polarization Assay
384 micro well plates, Micro pipets Grenier Bio-one 110256602
CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) BPS Bio Sciences 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)
assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothretiol (DTT))
25 nM HEPES CALBIOCHEM 375368
NaCl Fisher 127838
Nonidet P-40 US Biological N3500
DTT Aldrich
-70 °C freezer Revco (Ultima II)
DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein Beckman Coulter, Brea, CA
Cell Culture
96 well plates Fisher
Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines ATCC
NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent Fisher, Life technology, Alfa Aesar
Heamocytometer VWR
-70 °C freezer Revco (Ultima II)
Incubator Thermo electron corporation
Centrifuge Eppendorf 5804 R
Refrigerator 4-8 °C Isotemp Fisher
DTX880 multimode detector fitted with 595 nm filter Beckman Coulter, Brea, CA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andrews, M. J., et al. REPLACE: a strategy for iterative design of cyclin-binding groove inhibitors. Chembiochem. 7, 1909-1915 (2006).
  2. Liu, S., et al. Optimization of Non-ATP Competitive CDK/Cyclin Groove Inhibitors through REPLACE-Mediated Fragment Assembly. J Med Chem. 56, 1573-1582 (2013).
  3. McInnes, C. Chapter 29. Annual Reports in Medicinal Chemistry. Bernstein, M., Desai, P. 47, Elsevier. 459-474 (2012).
  4. Bower, J. F., Pannifer, A. Using fragment-based technologies to target protein-protein interactions. Curr Pharm Des. 18, 4685-4696 (2012).
  5. Makley, L. N., Gestwicki, J. E. Expanding the number of 'druggable' targets: non-enzymes and protein-protein interactions. Chemical biology, and drug design. 81, 22-32 (2013).
  6. Walensky, L. D., Bird, G. H. Hydrocarbon-Stapled Peptides: Principles, Practice, and Progress. J Med Chem. , (2014).
  7. Shapiro, G. I. Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment. J Clin Oncol. 24, 1770-1783 (2006).
  8. Thais, M., Sielecki, J. F. B., Enfield, P. A., Trainor, G. l Cyclin dependant kinase inhibitors: Useful targets in cell cycle regulation. Journal of medicinal chemistry. 43, 1-18 (2000).
  9. Morphy, R. Selectively nonselective kinase inhibition: striking the right balance. J Med Chem. 53, 1413-1437 (2010).
  10. Chen, Y. N., et al. Selective killing of transformed cells by cyclin/cyclin-dependent kinase 2 antagonists. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4325-4329 (1999).
  11. Orzaez, M., Gortat, A., Mondragon, L., Bachs, O., Perez-Paya, E. ATP-noncompetitive inhibitors of CDK-cyclin complexes. ChemMedChem. 4, 19-24 (2009).
  12. Kontopidis, G., et al. Insights into cyclin groove recognition: complex crystal structures and inhibitor design through ligand exchange. Structure. 11, 1537-1546 (2003).
  13. McInnes, C., Andrews, M. J., Zheleva, D. I., Lane, D. P., Fischer, P. M. Peptidomimetic design of CDK inhibitors targeting the recruitment site of the cyclin subunit. Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents. 3, 57-69 (2003).
  14. Premnath, P. N., et al. Fragment based discovery of arginine isosteres through REPLACE: towards non-ATP competitive CDK inhibitors. Bioorganic, and medicinal. 22, 616-622 (2014).
  15. Venkatachalam, C. M., Jiang, X., Oldfield, T., Waldman, M. LigandFit: a novel method for the shape-directed rapid docking of ligands to protein active sites. J Mol Graph Model. 21, 289-307 (2003).
  16. Mendoza, N., et al. Selective cyclin-dependent kinase 2/cyclin A antagonists that differ from ATP site inhibitors block tumor growth. Cancer Res. 63, 1020-1024 (2003).
  17. Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods. 89, 271-277 (1986).
  18. Zheleva, D. I., et al. Highly potent p21(WAF1)-derived peptide inhibitors of CDK-mediated pRb phosphorylation: delineation and structural insight into their interactions with cyclin A. The journal of peptide research : official journal of the American Peptide Society. 60, 257-270 (2002).
  19. Ivanov, A. A., Khuri, K. F. R., Fu, H. Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy. Trends in Pharmacological Sciences. 34, (2013).
  20. Thayer, A. M. Improving peptides. Chemical and Engineering News. 89, 13-20 (2011).
  21. Yin, H., Hamilton, A. D. Strategies for targeting protein-protein interactions with synthetic agents. Angew Chem Int Ed Engl. 44, 4130-4163 (2005).
  22. Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural biology and drug discovery for protein-protein interactions. Trends Pharmacol Sci. 33, 241-248 (2012).
  23. Cannon, J. B. Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy. J Pharm Sci. 82, 435-446 (1993).

Tags

Molecular Biology Ausgabe 104 Wirkstoffforschung Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitor Cyclin-Bindungsfurche Protein-Protein-Wechselwirkungen Drogenebenbild Anti-Krebs-
Entwicklung von Inhibitoren von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch REPLACE: Anwendung auf die Konzeption und Entwicklung Nicht ATP Competitive CDK-Inhibitoren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nandha Premnath, P., Craig, S.,… More

Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors. J. Vis. Exp. (104), e52441, doi:10.3791/52441 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter