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Biology

के माध्यम से जगह प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के अवरोधकों की विकास: डिजाइन और विकास गैर एटीपी प्रतियोगी CDK अवरोधकों के आवेदन

Published: October 26, 2015 doi: 10.3791/52441
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Drug Discovery and Biomedical Sciences, University of South Carolina

Abstract

अधिक प्रभावी ढंग से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (पीपीआई) को लक्षित करने के लिए विकसित एक अद्वितीय रणनीति की जगह है। यह संभावित दवा लक्ष्यों के बहुमत का प्रतिनिधित्व ऐसी बाध्यकारी साइटों के लिए अवरोधकों की पहचान और जिसके लिए पद्धति में सुधार कराने के द्वारा उपलब्ध दवा लक्ष्य अंतरिक्ष का विस्तार करना है। इस पत्र का मुख्य लक्ष्य कम्प्यूटेशनल और सिंथेटिक रसायन विज्ञान के दृष्टिकोण शामिल है जो जगह रणनीति के उपयोग और आवेदन की एक पद्धति सिंहावलोकन प्रदान करना है। गैर एटीपी प्रतिस्पर्धी cyclin निर्भर kinases (CDK) विरोधी ट्यूमर चिकित्सा विज्ञान के रूप में अवरोधकों के विकास के लिए अपने आवेदन के माध्यम से उदाहरण है जगह। CDKs अक्सर कैंसर में नियंत्रण मुक्त कर रहे हैं और इसलिए दवा के विकास के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य के रूप में माना जाता है। एस चरण में CDK2 / cyclin एक का निषेध E2F1 मार्ग के माध्यम से एक p53 स्वतंत्र ढंग से कैंसर कोशिकाओं के चुनिंदा एपोप्टोसिस बढ़ावा देने के लिए सूचित किया गया है। Cyclin bindin में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के लक्ष्य निर्धारणजी नाली (सीबीजी) ट्रांसक्रिप्शनल CDKs से अधिक सेल चक्र के विशिष्ट निषेध की अनुमति होगी जो एक दृष्टिकोण है। सीबीजी CDK substrates और ट्यूमर शमन प्रोटीन से ली गई एक आम सहमति अनुक्रम द्वारा मान्यता प्राप्त है मूल भाव (सीबीएम) बाध्यकारी cyclin करार दिया। सीबीएम पहले से आगे पर्याप्त गतिविधि (RRLIF) को बनाए रखना एक pentapeptide को छोटा कर दिया तो p21Waf (HAKRRIF) और से एक octapeptide करने के लिए अनुकूलित किया गया है। पारगम्य सेल नहीं कर रहे हैं सामान्य में पेप्टाइड्स, पाचन अस्थिर और इसलिए रणनीति की जगह (कम्प्यूटेशनल संवर्धन के माध्यम से आंशिक Ligand विकल्प के साथ रिप्लेसमेंट) अधिक दवा की तरह अवरोधकों को उत्पन्न करने के क्रम में लागू किया गया है। रणनीति चुनिंदा कोशिका चक्र CDK / cyclin परिसरों बाधित कि टुकड़ा ligated निरोधात्मक पेप्टाइड (flips) के डिजाइन के साथ शुरू होता है। Flips, iteratively एन टर्मिनस (Ncaps) से शुरू होने वाले छोटे अणुओं (समूहों कैपिंग), जैसे टुकड़ा के साथ HAKRRLIF / RRLIF के अवशेषों की जगह से उत्पन्न पर प्रतिस्थापन द्वारा पीछा किया गयासी टर्मिनस। इन यौगिकों विरोधी ट्यूमर चिकित्सा विज्ञान के रूप में गैर एटीपी प्रतिस्पर्धी CDK अवरोधकों की पीढ़ी के लिए अंक शुरू कर रहे हैं।

Introduction

इस अनुच्छेद में, अधिक pharmaceutically प्रासंगिक अणुओं में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की peptidic अवरोधकों को परिवर्तित करने के लिए रणनीति की जगह (कम्प्यूटेशनल संवर्धन का उपयोग कर आंशिक ligand के विकल्प के साथ रिप्लेसमेंट) को लागू करने के एक मामले का अध्ययन 1-3 वर्णन किया गया है। पीपीआई संभावित दवा लक्ष्यों की एक अमीर लेकिन underexploited स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं, मौजूदा तरीके में इन व्यापक रूप से सुलभ बनाने के लिए काफी हद तक अपर्याप्त हैं। टुकड़ा आधारित डिजाइन 4, उच्च throughput स्क्रीनिंग 5 और 6 अग्रिमों प्रदान की है नत्थी पेप्टाइड्स सहित वर्तमान रणनीतियों, हालांकि इनमें से कई मामलों में अप्रभावी कर रहे हैं। नतीजतन, अधिक प्रगति और अधिक कुशल दृष्टिकोण की आवश्यकता है। पूरी तरह से दवा के समान गुणों में सुधार हुआ और विरोधी ट्यूमर चिकित्सा विज्ञान के रूप में आगे के विकास के लिए क्षमता है है कि काइनेज अवरोधकों के विकास में मान्य किया गया है जगह। इस रणनीति के सेल की गैर एटीपी अवरोधकों के विकास में उदाहरण हैचक्र CDKs और के रूप में शामिल हैं: 1) cyclin नाली बंधन के साथ HAKRRLIF / RRLIF की बातचीत पर 3 डी संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के; 2) पेप्टाइड बातचीत के लिए महत्वपूर्ण बाध्यकारी निर्धारकों का निर्धारण; एक या एक से अधिक बाध्यकारी निर्धारकों युक्त पेप्टाइड एन टर्मिनस के 3) ट्रंकेशन; पेप्टाइड और जिनमें से छोटा कर दिया हिस्से के लिए संभावित छोटे अणु विकल्पों में से 4) कम्प्यूटेशनल पहचान (आंशिक ligand के विकल्प, Plas) माता-पिता पेप्टाइड की कुंजी बातचीत बनाए रखने; 5) संश्लेषण या Plas के वाणिज्यिक सोर्सिंग पहले से नष्ट पेप्टाइड छाछ (एस) के कब्जे में उप साइट के साथ उत्सुकतापूर्वक बाध्य करने के लिए भविष्यवाणी की; 6) ठोस चरण संश्लेषण का उपयोग कर छोटा कर दिया पेप्टाइड करने के लिए सबसे अच्छा Plas की बंधाव के माध्यम से flips के संश्लेषण; बाध्यकारी इन विट्रो में flips या एक सेल व्यवहार्यता परख में आगे लक्षण वर्णन के द्वारा पीछा कार्यात्मक परख (CDK / cyclin संदर्भ में प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण) के 7) परीक्षण। रणनीति की जगह का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्ववाई। चित्रा 1 में दिखाया गया है इस लेख में, बदलें रणनीति की पुनरावृत्तियों चर्चा कर रहे हैं और CDK2 / cyclin एक करने के लिए आवेदन में विस्तार से वर्णन किया। CDKs प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से ट्यूमर के बहुमत में नियंत्रण मुक्त होने का विश्वास कर रहे हैं और इसलिए उचित कैंसर की दवा लक्ष्यों 7 माना जाता है। CDKs पूर्ण क्रियान्वयन के लिए cyclins के सहयोग की आवश्यकता होती है और बाद में सेल चक्र विनियमन 8 में शामिल प्रमुख प्रोटीन phosphorylate। CDKs के दो प्रमुख समूहों सेल चक्र चौकियों पर नियंत्रण है कि आइसोटाइप [G1 / एस (CDK4 / Cyclin डी, CDK6 / cyclin डी और CDK4 / cyclin ई), एस चरण (CDK2 / cyclin ए) और G2 / एम (CDK1 / कर रहे हैं cyclin बी)] और फास्फोरिलीकरण के माध्यम से शाही सेना पोलीमरेज़ के नियामकों (CDK7 / cyclin एच, CDK8 / cyclin सी, CDK9 / cyclin टी)। E2F1 प्रतिलेखन कारक तो डीएनए को बांधता है और जीन प्रतिलेखन शुरू की जो डीपी प्रोटीन के साथ एक जटिल रूपों जब एस चरण प्रगति में एक महत्वपूर्ण कदम होता है। CDK2 / cyclin एक E2F1 ट्रांसक्रिप्शनल बेअसर करने के लिए आवश्यक हैफास्फोरिलीकरण के माध्यम से गतिविधि जिससे E2F1-डी पी जटिल और इसके बाद के क्षरण की रिहाई के लिए अग्रणी। CDK2 / cyclin एक का निषेध इसकी डीएनए बाध्य राज्य लगातार सक्रियण के लिए अग्रणी में E2F1 बनाए रखने के लिए माना जाता है। E2F -1 गतिविधि के एवज स्तर इसलिए एक चिकित्सकीय रणनीति का सुझाव p53 स्वतंत्र apoptosis प्रेरित करने के लिए आवश्यक सीमा को पार करेंगे। कारण E2F -1 का नियंत्रण मुक्त p53 और PRB रास्ते, उच्च स्तर के लिए बार-बार ट्यूमर में चयनात्मक एपोप्टोसिस के लिए नेतृत्व चाहिए कैंसर की कोशिकाओं और CDK2 / cyclin एक के निषेध में होते हैं और एक मान्य कैंसर लक्ष्य 7 के रूप में माना जा सकता है।

चिकित्सकीय जांच CDK अवरोधकों मानव kinome में 500 से अधिक प्रोटीन kinases के बीच जेट को पार करने के लिए अग्रणी अत्यधिक संरक्षित एटीपी बाध्यकारी साइट को निशाना बनाने और संभावित प्रभाव और विषाक्तता 9 पक्ष को जन्म दे रही है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण सीबीजी के माध्यम से सब्सट्रेट भर्ती लक्षित करके गैर एटीपी प्रतिस्पर्धी निषेध हैcyclin सकारात्मक विनियामक सबयूनिट पर वर्तमान और इसलिए अलग और साइट 10,11 बाध्यकारी एटीपी से दूर है। सीबीजी मुख्य रूप से cyclin ए, cyclin डी और cyclin ई में मौजूद एक हाइड्रोफोबिक नाली है और substrates और ट्यूमर शामक में पाया जाने वाला एक आम सहमति अनुक्रम पहचान करने के लिए दिखाया गया है। एक अलग पेप्टाइड के रूप में, cyclin बाध्यकारी मूल भाव (सीबीएम) सीबीजी को बांधता है और कोशिका चक्र CDKs की काइनेज गतिविधि को बाधित करने के लिए दिखाया गया है। सीबीएम दवा के लिए आणविक वजन के बीच एक अच्छा समझौता प्रतिनिधित्व करने वाले एक pentapeptide करने के लिए इसके अलावा छोटा (HAKRRLIF, CDK2 / cyclin एक आईसी 50 0.07 ± 0.02 माइक्रोन, CDK4 / cyclin डी आईसी 50 0.88 ± 0.34 माइक्रोन) के एक octapeptide करने और अनुकूलित किया गया है समानता और शक्ति (RRLIF, CDK2 / cyclin एक आईसी 50 1.01 ± 0.17 माइक्रोन, CDK4 / cyclin डी, आईसी 50 25.12 ± 2.97 माइक्रोन) 12,13। CBGs एक acidi से पाट कर रहे हैं जो एक बड़े प्राथमिक और छोटे माध्यमिक हाइड्रोफोबिक जेब से मिलकर बनता हैग क्षेत्र (Glu220, Glu224 और Asp283 भी शामिल है)। HAKRRLIF की कुंजी बाध्यकारी निर्धारकों अम्लीय क्षेत्र और प्राथमिक lipophilic साइट के साथ Leu6 और Phe8 के पूरक के एक उच्च डिग्री के साथ Lys3, Arg 4 और Arg5 के माध्यमिक हाइड्रोफोबिक जेब, आयन बाँधना और हाइड्रोजन बांड के साथ Ala2 की बातचीत में शामिल हैं। Ile7 प्राथमिक जेब के साथ इष्टतम संपर्क की अनुमति एक स्पेसर अवशेषों के रूप में कार्य करता है, जबकि इसके अलावा, कई हाइड्रोजन बांड पेप्टाइड रीढ़ की हड्डी से योगदान कर रहे हैं। बाध्यकारी मोड और सीबीजी साथ HAKRRLIF की बातचीत चित्रा 2 में दिखाया गया है।

सीबीएम / सीबीजी प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत को टारगेट कर CDK2 / cyclin ए, CDK2 / cyclin ई एंड CDK4 / cyclin डी के kinase गतिविधि को बाधित करेगा और सामान्य कोशिकाओं 7 को प्रभावित नहीं है, जबकि इस E2F1 कैंसर की कोशिकाओं की मध्यस्थता एपोप्टोसिस को गति प्रदान करना चाहिए। सीबीएम व्युत्पन्न पेप्टाइड्स कोशिका चक्र CDKs के प्रभावी अवरोधकों कर रहे हैं, यह है कि वे की वजह से उनके चयापचय को दवाओं के रूप में उपयोगी हो जाएगा संभावना नहीं हैअस्थिरता और सेल पारगम्यता की सामान्य कमी है। यह अंत करने के लिए, हम CDK2 / cyclin के माध्यम से एक अवरोध को नियंत्रण मुक्त E2F1 शोषण विरोधी ट्यूमर चिकित्सा विज्ञान के आगे के विकास के लिए और अधिक दवा की तरह यौगिकों में इन शक्तिशाली peptidic अवरोधकों को परिवर्तित करने के लिए आदेश में बदलने की रणनीति लागू की गई है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल cyclin नाली की जगह के आवेदन में पूरा हो चुका है कि काम का सार। पहले उदाहरण में, HAKRRLIF के एन टर्मिनल tetrapeptide के लिए दवा की तरह कैपिंग समूह प्रतिस्थापन की पहचान की गई। इसके अलावा इन समूहों में सुधार की जगह के लिए एक अतिरिक्त सत्यापन अध्ययन में जांच की गई। इन अध्ययनों से प्रतिनिधि के परिणाम भी प्रस्तुत कर रहे हैं।

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Protocol

संभावित छोटे अणु कैपिंग समूह की 1. कम्प्यूटेशनल पहचान

नोट: सिद्धांत रूप में, डॉकिंग या Pharmacophore खोज के तरीकों की एक किस्म के संभावित कैपिंग समूहों भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जगह में कम्प्यूटेशनल के अध्ययन का मुख्य उद्देश्य प्रतिस्थापित कर रहे हैं कि अमीनो एसिड की सुविधाओं और बातचीत को बनाए रखने कि छोटे अणुओं की पहचान है।

  1. LigandFit डॉकिंग प्रोटोकॉल 14 के मान्यकरण

नोट: पिछले अध्ययनों में, डॉकिंग विधि (LigandFit 15, आणविक मॉडलिंग कार्यक्रम सूट में एक मॉड्यूल, डिस्कवरी स्टूडियो 3.0) इस एल्गोरिथ्म ज्ञात Ncaps के बंधन मोड को पुन: पेश करने के लिए और परिणामों के लिए प्राप्त की है कि दिखाने के लिए पर्याप्त है कि यह सुनिश्चित करने के लिए मान्य किया गया था अज्ञात यौगिकों 14 भविष्यसूचक हैं।

  1. निम्नलिखित कदम (1.2-1.5) का उपयोग कर के रूप में निम्नानुसार LigandFit के लिए इष्टतम मापदंडों की पहचान,: PLP1 एनमुद्रा पीढ़ी उत्पन्न बन गया है की न्यूनीकरण और बन गया के विश्लेषण के लिए PLP1 स्कोरिंग समारोह के लिए ऊर्जा ग्रिड।
  2. प्राप्त रचना को सीमित करने और छाया हुआ पेप्टाइड में सहसंयोजक बंधन गठन के लिए उचित रूप से ligands की स्थिति के लिए आदेश में, हाइड्रोजन संबंधों के लिए बातचीत फिल्टर के रूप में क्रमश: Trp217 और Gln254 की इण्डोल नाइट्रोजन और एमाइड नाइट्रोजन परमाणुओं की स्थापना की।
  3. डिजाइन और एक रिसेप्टर (2UUE) cyclin / CDK2 में टुकड़ा विकल्प की एक पुस्तकालय गोदी। संश्लेषण और PLP1 स्कोरिंग, सीबीजी के साथ बातचीत के फिल्टर और पूरकता के साथ बातचीत पर आधारित व्यावसायिक सोर्सिंग के लिए संभावित कैपिंग समूहों को प्राथमिकता दें। इस प्रकार के रूप LigandFit डॉकिंग के लिए आवश्यक विभिन्न कदम उठाए हैं।
  1. रिसेप्टर बाध्यकारी साइट 14 की तैयारी
    1. सॉफ्टवेयर में एक दृश्य विंडो में: CDK2 / cyclin एक क्रिस्टल संरचना (2UUE PDB आईडी) आयात करें। इस संरचना की पहचान पहले फ्लिप शामिल 5-मिथाइल-1-फिनाइल-1H -1, 2,4-triazole-3-carboxamido (3,5-DCPT) RLIF cyclin नाली के लिए बाध्य (चित्रा 3)।
    2. हटाएं या जगह अवशेषों RLIF (सी टर्मिनस) में रहते हैं। पेप्टाइड अनुक्रम को बरकरार रखा जाता है, तो ligand के लिए एक बातचीत फिल्टर के रूप में पेप्टाइड एन टर्मिनल अमीनो समूह का उपयोग करें। "रिसेप्टर ligand बातचीत" उपकरण से, एन-कैप दिखाएँ / छुपाएँ साइट क्षेत्र से 3,5-DCPT के चारों ओर एक क्षेत्र बना। क्षेत्र ligand- रिसेप्टर बातचीत बाध्यकारी के दौरान होने की अनुमति दी जाती है जहां बाध्यकारी साइट में सक्रिय क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए बनाई गई है।
    3. "चयनित ligand की मात्रा के रूप में मिल साइट" से आगे बाध्यकारी साइट परिभाषित करें और प्रोटीन से ligand 3,5-DCPT हटा दें। बनाया क्षेत्र के भीतर बंधन की मात्रा को परिभाषित करने के लिए यह कदम बाहर ले।
    4. हाइड्रोजन के संबंधों के लिए बातचीत फिल्टर के रूप में अवशेष Trp217 और Gln254 की इण्डोल नाइट्रोजन और एमाइड नाइट्रोजन परमाणुओं सेट करें। बातचीत फिल्टर सेट इतना है कि inte है कि केवल उन बन गया हैसेट अवशेषों के परमाणुओं के साथ ract इसलिए डॉक poses में महत्वपूर्ण बातचीत संरक्षण डॉकिंग प्रक्रिया के दौरान फिल्टर किया जायेगा।
  2. Ligands के 14 वर्ष की तैयारी
    1. आणविक वजन 500 से भी कम है, माध्यमिक जेब में छोटा पेप्टाइड और वान डर वाल्स बातचीत के लिए उचित हाइड्रोफोबिक समूह (प्रतिस्थापित फिनाइल समूह) के शामिल किए जाने के रूप में साथ बंधाव के लिए एक कार्बोक्सिलेट समूह की उपस्थिति सहित मानदंडों के आधार पर 100 संभावित कैपिंग समूहों में से एक पुस्तकालय डिजाइन तालिका 1 में दिखाया गया है।
    2. Trp217 और substituents साथ पेप्टाइड हाइड्रोजन संबंध बातचीत नकल उतार के लिए heterocyclic के छल्ले का चयन करें HAKRRLIF के बुनियादी पक्ष श्रृंखला के आयन बाँधना बातचीत की जगह के लिए शामिल थे। कार्बोनिल ऑक्सीजन माता पिता पेप्टाइड (1 टेबल) में पेप्टाइड रीढ़ की हड्डी के समान Gln254 की एमाइड नाइट्रोजन परमाणु के साथ बातचीत कर सकते हैं ताकि संबंधित एल्डिहाइड अणुओं के रूप में ligands के डॉक।
    3. पहले डॉक्टर कोराजा, एक कम ऊर्जा की रचना करने के लिए डिज़ाइन किया गया ligands के कम से कम और "ligands तैयार" प्रोटोकॉल का उपयोग एक उचित आयनीकरण राज्य में तैयार करते हैं। ड्रा और सॉफ्टवेयर में आयात किया जा रहा करने के लिए एक स्प्रेडशीट के लिए ChemDraw में .sdf फ़ाइल प्रारूप में इन संभावित एन टोपियां से पहले निर्यात।
      नोट: ligands प्रोटोकॉल सब तैयार ligands के लिए कम से कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है उनकी सबसे कम ऊर्जा राज्यों को डॉक किया जा करने के लिए और आयनीकरण शुल्क लागू परमाणुओं के लिए लागू किया गया। तयशुदा मापदंडों इस कदम के लिए उपयोग किया जाता है।
  3. Cyclin एक नाली 14 में ligands की डॉकिंग
    1. सॉफ्टवेयर की रिसेप्टर ligand बातचीत प्रोटोकॉल सेट से LigandFit दिनचर्या का चयन करें। रिसेप्टर और इस प्रोटोकॉल के लिए इनपुट के रूप में तैयार ligands का प्रयोग करें।
    2. ऊर्जा ग्रिड के रूप में इन रन का चयन PLP1 के लिए, ऊर्जा है कि कम से कम हो बन गया है और 10 के रूप में उत्पन्न बन गया है की संख्या के मूलभूत मूल्यों पर अन्य सभी मापदंडों को छोड़ दें कि निर्दिष्ट करें।
      नोट: LigandFit हैएक मोंटे कार्लो गठनात्मक खोज एल्गोरिथ्म के साथ संयुक्त है, जो एक आकार के आधार पर तुलना फिल्टर का उपयोग कर एक प्रोटीन की सक्रिय साइट के साथ उच्च पूरकता और संभावित आत्मीयता का बना हुआ है और पहचान के लिए उत्पन्न कर सकते हैं जो एक डॉकिंग विधि। डॉकिंग कार्यक्रम द्वारा प्रयुक्त ऊर्जा ग्रिड ligand- रिसेप्टर बातचीत और संभावित बन गया है पैदा करने के लिए बल क्षेत्र है। PLP1 विशेष रूप से हाइड्रोजन संबंध बातचीत प्राथमिकता और जो piecewise रैखिक संभावित है पीएलपी परमाणु प्रकार प्रत्येक गैर-हाइड्रोजन ligand के परमाणु या गैर हाइड्रोजन रिसेप्टर परमाणु के लिए सौंपा गया है, जहां।
  4. परिणामों के विश्लेषण
    1. पहले उदाहरण में, प्रदर्शन PLP1 स्कोर के मूल्यों उतरते द्वारा क्रमबद्ध तो विजुअलाइज़र कार्यक्रम में बना हुआ है और। एक उम्मीदवार ligand के आधार पर एक डॉक ligand के बंधन आत्मीयता लक्ष्य रिसेप्टर संरचना के साथ ज्यामिति और गैर-सहसंयोजक बातचीत मुद्रा अनुमान लगाने के लिए इस तरह के PLP1 के रूप में स्कोरिंग कार्यों का प्रयोग करें।
      नोट: यहाँ, PLP1 स्कोरिंग समारोह छ पाया गयायह हाइड्रोजन संबंध के एक अनुमान शामिल है के रूप में सबसे अच्छा परिणाम ive।
    2. नाम से जाना जाता कैपिंग समूह मूल्य कम से कम 2 ए (एक रिश्तेदार मतलब वर्ग विचलन (RMSD वाले)) के साथ नेत्रहीन 1 के लिए रन बनाए बन गया है की शीर्ष 25% का विश्लेषण करें) superimposability, 2) cyclin नाली के साथ बातचीत के फिल्टर और 3) दृश्य पूरकता को पूरा किया । ऐसा लगता है कि में स्वीकार किया जाता है एक सही ढंग से (एक प्रयोगात्मक संरचना की तुलना में) मुद्रा डॉक <2 ए के एक RMSD मूल्य है।
    3. ज्ञात संरचना गतिविधि रिश्तों के साथ संगत है कि एक तरह से बाध्यकारी जेब से कुशल भरने वाले के रूप में परिभाषित किया गया है जो दृश्य पूरकता, के लिए बन गया है जांच करते हैं। इंटरेक्शन फिल्टर बंधन और / या एमाइड बांड गठन के लिए सही ज्यामिति में संभावित कैपिंग समूह की स्थिति के लिए आवश्यक हैं के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए जाना जाता आणविक संपर्कों की आवश्यकता है कि परमाणु मजबूरी को शामिल करने की तैयारी में हैं। Interactio साथ हाइड्रोजन बांड बनाने की क्षमता एन कैपिंग समूहों के डॉक बन गया है की तीन उदाहरणएन फिल्टर 4 चित्र में दिखाया गया है।

2. संश्लेषण और संभावित एन -capping समूह की विशेषता

  1. एन कैपिंग समूहों के संश्लेषण।
  2. प्राप्त के रूप में संश्लेषण के लिए, सभी वाणिज्यिक सामग्री शुरू, सॉल्वैंट्स और अभिकर्मकों का उपयोग करें। पारंपरिक सिंथेटिक कार्बनिक रसायन शास्त्र (एक उदाहरण के लिए चित्रा 5 12,13) ​​द्वारा संभावित एन कैपिंग समूहों synthesize।
  3. प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए सिलिका जेल पर पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) निष्पादित करें।
    1. मोबाइल चरण में शुरू सामग्री और प्रतिक्रिया मिश्रण (1 मिलीग्राम) को भंग करने और केशिका ट्यूब का उपयोग टीएलसी थाली पर उन्हें जगह।
    2. (एक 35:65 के अनुपात में एथिल एसीटेट और हेक्सेन) मोबाइल चरण युक्त कक्ष में टीएलसी थाली रखें। मोबाइल चरण टीएलसी थाली में से 90% तक पहुँच जाता है, को दूर करने और हवा प्लेट सूखी।
    3. दिखाई दे धब्बे के रूप में शुरू सामग्री और प्रतिक्रिया मिश्रण पता लगाने के लिए पराबैंगनी प्रकाश का प्रयोग करें। सीएएलसभी स्थानों में से आर एफ (हाजिर और मोबाइल चरण से कूच दूरी के अनुपात) culate।
      नोट: सामग्री शुरू की आर एफ पर देखा कोई स्थान नहीं है जब प्रतिक्रिया पूरा हो गया है।
  4. प्रतिक्रिया के पूरा होने के बाद जलीय एसिड या उचित रूप में बेस समाधान के साथ एक जुदा कीप और कपड़े धोने में रखकर प्रतिक्रिया मिश्रण तक काम करते हैं। वैक्यूम के अंतर्गत प्राप्त कच्चे तेल उत्पाद, कार्बनिक विलायक लीजिए रोटरी बाष्पीकरण में यह लुप्त हो जाना और सूखी।
  5. उपयुक्त विलायक के 3-5 मिलीलीटर में कच्चे तेल उत्पाद की 500 मिलीग्राम भंग और सिलिका या RP18 samplet की 1 ग्राम के लिए जोड़ सकते हैं और हवा के तहत शुष्क। सिलिका / आरपी स्नैप फ्लैश कारतूस में कच्चे तेल उत्पाद युक्त samplet रखें और 6% एथिल एसीटेट से शुरू होने वाले एक ढाल रन के साथ एक तस्वीर 100 ग्राम स्तंभ रोजगार (निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार) स्वचालित उच्च प्रदर्शन फ्लैश क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कच्चे माल को शुद्ध: 94 % 50% एथिल एसीटेट को hexanes और अधिक से अधिक 50% hexanes15 कॉलम संस्करणों।
  6. सूखापन के लिए सभी विलायक वाष्पन द्वारा एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर फ़्लैश क्रोमैटोग्राफी से विलायक में एकत्र शुद्ध उत्पाद शुष्क और आगे सभी अवशिष्ट सॉल्वैंट्स दूर करने के लिए वैक्यूम के अंतर्गत उत्पाद सूखी। एनएमआर, एमएस और विश्लेषणात्मक एचपीएलसी द्वारा शुद्ध उत्पाद के लक्षण वर्णन प्रदर्शन करते हैं।
    1. 1 एच एनएमआर और 13 सी एनएमआर के लिए, शुद्ध नमूना के लगभग 10 मिलीग्राम तौलना एक उपयुक्त deuterated विलायक में भंग, और एनएमआर स्पेक्ट्रा 2,14 रिकॉर्डिंग के लिए एक सूखी एनएमआर ट्यूब के लिए सामग्री को स्थानांतरित।
    2. 1 एच एनएमआर और एक उच्च क्षेत्र एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर (न्यूनतम 300 मेगाहर्ट्ज) के साथ 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड। एक QTOF (उड़ान मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए मिलकर चौगुनी-1 समय) का उपयोग जन स्पेक्ट्रा, electrospray आयनीकरण (ईएसआई) या एक वी.जी. 70 मोल (डबल-ध्यान केंद्रित चुंबकीय क्षेत्र मास स्पेक्ट्रोमीटर, ईआई) 2,14।
    3. एक डायोड सरणी डिटेक्टर के साथ एचपीएलसी द्वारा उत्पादों की शुद्धता का विश्लेषण करें और के साथ सुसज्जितएक C18 (2) 100 ए, 250 x 4.6 मिमी, विश्लेषण के लिए 5 माइक्रोन स्तंभ। 30 मिनट से अधिक 60% acetonitrile (0.1% trifluoroacetic एसिड) के लिए 100% पानी (0.1% trifluoroacetic एसिड) से शुरू करने के लिए एक ढाल रन का प्रयोग करें और 4 मिनट के लिए ढाल का आयोजन करेगा। 226 और 254 एनएम 2,14 पर chromatograms निकालें।
      नोट: मूल्यांकित यौगिकों का विश्लेषणात्मक शुद्धता> 95% थे।

Flips 2 की पीढ़ी के लिए 3. ठोस चरण संश्लेषण

  1. एन से ढकी flips के संश्लेषण
    1. निम्न चरणों का उपयोग मानक ठोस चरण संश्लेषण विधियों के माध्यम से एन से ढकी peptidic यौगिकों इकट्ठे।
      1. के 2 मिलीलीटर में हे -Benzotriazole- एन, एन, एन ',' एन -tetramethyl-uronium-hexafluoro-फॉस्फेट (HBTU, 221.93 मिलीग्राम) के 4.4 समकक्ष में सी टर्मिनल अमीनो एसिड (Fmoc-पीएचई) के 5 समकक्ष सक्रिय करें 5 मिनट के लिए DMF। Diisopropylethyl एमाइन के 6 समकक्ष का उपयोग कर रिंक राल पर Fmoc-पीएचई HBTU मिश्रण लोड (DIPEA, 103.13आरटी पर 1 घंटे के लिए मिलीग्राम)।
      2. 10 मिनट के लिए DMF के 3 मिलीलीटर में 20% piperidine का उपयोग करते हुए सी टर्मिनल अवशेषों से Fmoc की रक्षा समूह निकालें। युगल बाद में अमीनो एसिड (जैसे, Fmoc-इले, Fmoc-लियू, Fmoc-Arg-पीएमसी) कदम से कदम। हर कदम पर, DIPEA (103.13 मिलीग्राम) और आरटी पर 1 घंटे के लिए DMF के 2 मिलीलीटर में HBTU (221.93 मिलीग्राम) के 4.4 समकक्ष के 6 समकक्ष का उपयोग अगले अमीनो एसिड की जोड़ी 5 equiv।
      3. धोने चक्र ऊपर वर्णित अमीनो एसिड युग्मन और Fmoc deprotection कदम के बाद (DMF डीसीएम की + 5 एक्स 10 मिलीलीटर की 5 एक्स 10 मिलीलीटर) को लागू करें। पेप्टाइड विधानसभा के बाद, कुछ आरटी पर 1 घंटे के लिए DMF के 2 मिलीलीटर में DIPEA (103.13 मिलीग्राम) और HBTU (221.93 मिलीग्राम) के 4.4 समकक्ष के 6 समकक्ष का उपयोग कर समूहों एन कैपिंग।
      4. पेप्टाइड विधानसभा के पूरा होने पर, दरार मिश्रण के 2 मिलीलीटर के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण का इलाज (: 5: 90 5 टीएफए / एच 2 ओ / सुझाव) हे / एन समूहों की रक्षा के पक्ष श्रृंखला को दूर करने के लिए, और फोड़ना राल से flips। ठंड diethyl वेग के लिए आकाश और मैं के साथ परिणामी उत्पाद Triturateएक रोटरी बाष्पीकरण में च आवश्यक ध्यान देना।
  2. एन से ढकी-सी से ढकी flips के संश्लेषण
    1. हे के साथ (16.1 मिलीग्राम, 0.02 mmol) क्लोराइड में, और जोड़ने [4 (3-chlorophenoxy) pyridin-2-YL] methanamine (सी-कैप) वजन और एन टर्मिनली छाया हुआ है और संरक्षित Arg-लियू पेप्टाइड भंग - benzotriazole- एन, एन, एन ',' एन -tetramethyluronium Hexafluorophosphate (HBTU; 16.7 मिलीग्राम, 0.02 mmol) और एन एन -diisopropylethylamine (DIPEA, 6.5 मिलीग्राम, 0.02 mmol)।
    2. हलचल और टीएलसी / एचपीएलसी सामग्री शुरू करने की पूरी खपत का संकेत है जब तक आरटी पर प्रतिक्रिया की निगरानी। प्रतिक्रिया के पूरा होने के बाद, एथिल एसीटेट और पानी के बीच एक रोटरी बाष्पीकरण और फिर विभाजन का उपयोग कच्चे तेल की प्रतिक्रिया मिश्रण ध्यान केंद्रित।
    3. जलीय और जैविक परत अलग; 1 एन NaOH, 1 एन एचसीएल, और नमकीन के साथ कार्बनिक परत धो लें। सोडियम सल्फेट के बारे में 1 ग्राम के साथ कार्बनिक परत सूखी और रोटरी बाष्पीकरण में उत्पाद ध्यान केंद्रित। फिना(: 2.5: 2.5 trifluoroacetic एसिड / एच 2 ओ / सुझाव 95) deprotection के लिए lly दरार मिश्रण के साथ उत्पाद हे / एन इलाज।
    4. ठंड Diethyl ईथर के साथ और रोटरी बाष्पीकरण में आवश्यक ध्यान केंद्रित सभी विलायक हटाने के क्रम में सूखापन को पूरा करने के लिए अगर परिणामी उत्पाद Triturate। इसके अलावा सभी अवशिष्ट सॉल्वैंट्स दूर करने के लिए वैक्यूम के अंतर्गत उत्पाद सूखी।
  3. शोधन और flips के लक्षण वर्णन
    1. अर्द्ध प्रारंभिक रिवर्स चरण एचपीएलसी तरीकों का उपयोग कच्चे flips शुद्ध। शुद्ध flips Lyophilize और मास स्पेक्ट्रोमेट्री 2,14 का उपयोग कर अपने आणविक जन विशेषताएँ।
    2. एक डायोड सरणी डिटेक्टर के साथ एचपीएलसी द्वारा flips के विश्लेषणात्मक पवित्रता का निर्धारण करते हैं और 250 x 4.6 मिमी, 5 माइक्रोन स्तंभ, एक C18 (2) 100 ए के साथ सुसज्जित। 95% एच 2 ओ (0.1% trifluoroacetic एसिड) / 5% acetonitrile (0.1% trifluoroacetic एसिड) 35% करने के लिए एच 2 ओ (0.1% trifluoroacetic एसिड) / 65% acetonitrile (0.1% trifluoroace से शुरू होने वाले एक ढाल विधि का प्रयोग करेंटिक एसिड) 30 मिनट से अधिक और 4 मिनट के लिए ढाल का आयोजन करेगा। निकालें 226 और 254 एनएम पर chromatograms।

प्रतियोगी 2,14 बंधन के निर्धारण के लिए बाध्यकारी परख 4. प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण

  1. काला 384 अच्छी तरह से (138 μl) निम्नलिखित प्रक्रिया का उपयोग कर प्लेट में परख प्रदर्शन।
  2. नमूने, ट्रेसर पेप्टाइड्स (4 एनएम), और काइनेज परिसरों पतला (CDK2 / cyclin एक - 18 माइक्रोग्राम / एमएल, CDK4 / cyclin डी - 37 माइक्रोग्राम / एमएल) परख बफर (25 मिमी HEPES पीएच 7, 10 मिमी में आवश्यक सांद्रता के लिए सोडियम क्लोराइड, 0.01% Nonidet पी-40, 1 मिमी dithiothreitol (डीटीटी)।
  3. 384 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए, जोड़ें: CDK4D1 या CDK2CA (0.3 माइक्रोग्राम / अच्छी तरह से शुद्ध रीकॉम्बीनैंट मानव काइनेज जटिल), 5 μl यौगिक समाधान, 30 एनएम दरियाफ्त पेप्टाइड (fluoresceinyl-AHX-प्रो-वैल के 5 μl के 5 μl -Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly या fluoresceinyl-AHX-प्रो-वैल-लिस-Arg-Arg-लियू-पीएचई-Gly दरियाफ्त पेप्टाइड)। प्रत्येक DMSO (6%), buffe के 5 μl का प्रयोग करेंआर, ट्रेसर और 5 μl DMSO (6%), काइनेज जटिल, नियंत्रण कुओं के रूप में दरियाफ्त
  4. सभी घटकों के अलावा के बाद, आरटी पर 1 मिनट (41.16 XG) के लिए 500 rpm पर थाली अपकेंद्रित्र और फिर आरटी पर 45 मिनट के लिए आंदोलन के साथ थाली सेते हैं। 485 एनएम / 535 एनएम उत्तेजना / उत्सर्जन फिल्टर और एक dichroic दर्पण के साथ लगे एक बहुपद्वति प्लेट पाठक और डिटेक्टर का उपयोग अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक की fluorescein तीव्रता पढ़ा।
  5. नीचे दिखा समीकरण का उपयोग कर सभी नमूने परीक्षण के लिए रिश्तेदार मतलब ध्रुवीकरण (मध्य प्रदेश) की गणना। रिश्तेदार सांसदों correlating और सांद्रता के परीक्षण के द्वारा आईसी लघुगणक प्रतिगमन द्वारा 50 मूल्यों का निर्धारण करते हैं।

1 समीकरण

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Representative Results

cyclin नाली के साथ HAKRRLIF की बातचीत चित्रा 2 में दिखाया गया है। कुंजी बाध्यकारी निर्धारकों का प्रतिनिधित्व करने वाले पेप्टाइड अवशेषों अन्य अवशेषों छोटे योगदान 12,13,18 प्रदान करने के साथ Ala2, Arg4, Leu6 और Phe8 शामिल हैं। इस मामले का अध्ययन में बदलने की रणनीति मुख्य रूप से Ala2 और Arg4 की बातचीत की नकल उतार HAKRRLIF के एन टर्मिनल tetrapeptide में अवशेषों के लिए टुकड़ा विकल्प खोजने के लिए उपयोग किया गया है। संभावित NCAP टुकड़े (1 टेबल) के एक पुस्तकालय मानदंडों के आधार पर निर्माण किया गया था। प्रत्येक अणु cyclin ए (: 2UUE PDB आईडी) के साथ अपने क्रिस्टल संरचना से एन कैपिंग समूह की ट्रंकेशन द्वारा बनाई खाली कर बाध्यकारी साइट में जुर्माना लगाया गया है। संभावित ligand के विकल्पों की आत्मीयता की एक भविष्यवाणी के रूप में खड़ा विश्लेषण और PLP1 स्कोरिंग के आधार पर चयन किया गया था (डॉक बन गया है की उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया जाता है)। एक बात की पुष्टि की NCAP (1- (3-chlorophenyl) -5 मिथाइल-1 के संश्लेषणएच-1,2,4-triazole-3-कार्बोक्जिलिक एसिड) इस अणु तीन चरणों में उत्पन्न होता है और स्वचालित फ्लैश क्रोमैटोग्राफी (पूरक चित्रा 1) द्वारा शुद्ध किया गया था जहां चित्रा 5 में दिखाया गया है। 1 HNMR, एक प्रतिनिधि यौगिक 1- (3-chlorophenyl) -5 मिथाइल-1H-1,2,4-triazole-3-कार्बोक्जिलिक एसिड के 13 CNMR, एमएस और एचपीएलसी लक्षण वर्णन डेटा अनुपूरक में दिखाया जाता है 1-5 आंकड़े क्रमशः। एन से ढकी flips और एन से ढकी-सी से ढकी flips के संश्लेषण के आंकड़े 7 और 8 में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं और लक्षण डेटा तालिका 2 में दिखाया गया है। दोनों CDK2 / cyclin ए के लिए बाध्यकारी आत्मीयता और CDK4 / cyclin डी का उपयोग निर्धारित किया गया था वर्णित एफपी परख और परिणाम तालिका 3 में दिखाया जाता है। यौगिकों का परीक्षण किया है, triazole आधारित एन टोपियां CDK2 / cyclin ए और CDK4 / cyclin डी और प्रतिनिधि यौगिक के लिए सबसे बड़ा आकर्षण है करने के लिए निर्धारित किए गए थे युक्त flipsसेल आधारित assays में परीक्षण किया गया। एक पूरे के रूप में पहचान फ्लिप अणुओं की तरह अधिक दवा हो, और HAKRRLIF octapeptide की बातचीत के अधिकांश बनाए रखने के लिए पाए गए। छाया tetrapeptides तथापि (टेबल्स 3 और 4) RRLIF pentapeptide के लिए तुलनीय गतिविधि के थे HAKRRLIF की तुलना में कम शक्ति के पास थी। ये परिणाम प्राप्त यौगिकों सुधार दवा समानता थी, लेकिन यह कुछ हद तक समझौता बंधन आत्मीयता की कीमत पर प्राप्त हुई थी कि पता चलता है।

विरोधी proliferative गतिविधि इन सीजीआई ligands मूल्यांकन किया गया था और 30 माइक्रोन से नीचे सेलुलर आईसी 50 U2OS और DU145 कैंसर कोशिका लाइनों में मनाया गया।

चित्र 1
जगह रणनीति की चित्रा 1. अवलोकन। सीएल करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ Ick।

चित्र 2
सीबीजी में चित्रा बाध्यकारी 2. और HAKRRLIF की बातचीत वाम पैनल:। सीबीजी के लिए बाध्य HAKRRLIF की मॉडलिंग संरचना। एक बड़ा प्राथमिक जेब (सही, Leu6 और Phe8 के कब्जे में) और लाल रंग में दर्शाया अम्लीय अवशेषों से पाट रहे हैं जो एक छोटे माध्यमिक (बाएं, Ala2 के कब्जे में) जेब और - cyclin नाली दो हाइड्रोफोबिक जेब के होते हैं। राइट पैनल:। अन्य महत्वपूर्ण बातचीत, और (Glu220, Glu224, Asp283 के साथ) पेप्टाइड के तीन बुनियादी अवशेषों की आयन बाँधना बातचीत (Trp217, Gln254, Ile281 के साथ) पेप्टाइड रीढ़ की हाइड्रोजन संबंध संपर्कों शामिल देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।

441 / 52441fig3.jpg "/>
सीबीजी में 3,5-DCPTRLIF की चित्रा 3. बंधन मोड। 3,5-DCPT-RLIF के बंधन Trp217 और Gln254 की sidechain परमाणुओं के साथ (हरी बिंदीदार रेखा द्वारा दर्शाया) हाइड्रोजन संबंध बातचीत के साथ दिखाया गया है। एक को देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का बड़ा संस्करण।

चित्रा 4
3 प्रतिनिधि एन कैपिंग समूहों की चित्रा 4. चयनित डॉकिंग का परिणाम है। डॉक बन गया दिखाए जाते हैं। हरी बिंदीदार रेखा के रूप में चित्रित इन यौगिकों के प्रत्येक Trp217 और Gln254 की बातचीत फिल्टर परमाणुओं के साथ एच बांड बनाने के लिए और। फिनाइल substituent माध्यमिक हाइड्रोफोबिक जेब के साथ वान डर वाल्स बातचीत में आता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 5
चित्रा 1- (3-chlorophenyl) 5. संश्लेषण -5 मिथाइल-1H-1,2,4-triazole-3-कार्बोक्जिलिक एसिड। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा ठोस चरण संश्लेषण द्वारा एन से ढकी flips 6. संश्लेषण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
एन-सीए की 7 चित्रा संश्लेषणpped-सी से ढकी flips। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक

तालिका एक

डॉक छोटे अणुओं और PLP1 स्कोरिंग समारोह का उपयोग ऊर्जा बाध्यकारी के परिणामस्वरूप भविष्यवाणी की तालिका 1. लाइब्रेरी।

पेप्टाइड पवित्रता कॉलम आयाम विधि प्रवाह दर एचपीएलसी अवधारण समय सैद्धांतिक मेगावाट मनाया मेगावाट
5843 > 90% 4.6 × 250 मिमी 5-65% acetonitrile / पानी / 0.1% TFA 1 मिलीग्राम / मिनट 23.9 732 732.6
5773 > 90% 4.6 × 250 मिमी 5-65% acetonitrile / पानी / 0.1% TFA 1 मिलीग्राम / मिनट 22.4 801.77 800.55
5774 > 90% 4.6 × 250 मिमी 5-65% acetonitrile / पानी / 0.1% TFA 1 मिलीग्राम / मिनट 24.2 767.33 766.5
5762 > 90% 4.6 × 250 मिमी 5-65% acetonitrile / पानी / 0.1% TFA 1 मिलीग्राम / मिनट 9.0 731.91 731.65
5763 > 90% 4.6 × 250 मिमी 5-65% acetonitrile / पानी / 0.1% TFA 1 मिलीग्राम / मिनट 11.2 800.8 799.5
5764 > 90% 4.6 × 250 मिमी 5-65% acetonitrile / पानी / 0.1% TFA 1 मिलीग्राम / मिनट 10.1 766.34 765.55
5771 > 90% 4.6 × 250 मिमी 5-65% acetonitrile / पानी / 0.1% TFA 1 मिलीग्राम / मिनट 9.4 749.9 749.6
5765 > 90% 4.6 × 250 मिमी 5-65% acetonitrile / पानी / 0.1% TFA 1 मिलीग्राम / मिनट 10.1 766.35 755.65
5766 > 90% 4.6 × 250 मिमी 5-65% acetonitrile / पानी / 0.1% TFA 1 मिलीग्राम / मिनट 9.4 761.9 761.55
5767 > 90% 4.6 × 250 मिमी 5-65% acetonitrile / पानी / 0.1% TFA 1 मिलीग्राम / मिनट 20.4 761.9 761.55
5776 > 75% 4.6 × 250 मिमी 5-65% acetonitrile / पानी / 0.1% TFA 1 मिलीग्राम / मिनट 23.3 785.7 784.55
5775 > 90% 4.6 × 250 मिमी 5-65% acetonitrile / पानी / 0.1% TFA 1 मिलीग्राम / मिनट 9.9 751.34 750.45

सीजीआई बंधन पेप्टाइड्स के लिए तालिका 2 विश्लेषणात्मक डेटा और flips।

टेबल तीन
CDK2CA और CDK4CD करने के लिए चयनित एन से ढकी flips के बंधन विट्रो में 3 तालिका।

तालिका 4
चयनित एन एंड सी के बंधन इन विट्रो तालिका 4. CDK2CA और CDK4CD के लिए flips छाया हुआ है।

पूरक चित्रा 1-5। शोधन और 1- (3-chlorophenyl) के लक्षण वर्णन -5 मिथाइल-1H-1,2,4-triazole-3-कार्बोक्जिलिक एसिड।

समर्थन चित्रा 1
उत्पाद की पूरक चित्रा 1. फ्लैश वर्णलेख, 55% एथिल एसीटेट में eluting प्रमुख शिखर eluting चार चोटियों / 45% hexanes वांछित उत्पाद होना पाया गया हैं चरण 1 से प्राप्त की। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा।

समर्थन चित्रा 2
पूरक चित्रा 2. 1 1- (3-chlorophenyl) -5 मिथाइल-1H-1,2,4-triazole-3-कार की HNMR boxylic एसिड। एनएमआर स्पेक्ट्रम 3 स्निग्ध मिथाइल प्रोटॉन और 3 खुशबूदार प्रोटॉन से पता चलता है। सभी तीन चोटियों के लिए एकीकरण एनएमआर स्पेक्ट्रम नीचे दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

समर्थन चित्रा 3
पूरक चित्रा 3. 13 CNMR 1- (3-chlorophenyl) -5 मिथाइल-1H-1,2,4-triazole-3-कार्बोक्जिलिक एसिड। प्रत्येक कार्बन के लिए 10 संकेतों के साथ संरचना में दस कार्बन परमाणुओं, 13 CNMR रहे हैं परमाणु। प्रत्येक चोटी के लिए एकीकरण एनएमआर स्पेक्ट्रम नीचे दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ig4.jpg "/>
1- (3-chlorophenyl) -5 मिथाइल-1H-1,2,4-triazole-3-कार्बोक्जिलिक एसिड। यौगिक की आणविक वजन 4. एमएस 237. वास्तविक आणविक पर माता पिता के शिखर के रूप में दिखाया गया है पूरक चित्रा परिसर के वजन 237.64 है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

समर्थन चित्रा 5
एचपीएलसी वर्णलेख के रूप में दिखाया पूरक चित्रा 1- (3-chlorophenyl) 5. एचपीएलसी -5 मिथाइल-1H-1,2,4-triazole-3-कार्बोक्जिलिक एसिड। उत्पाद की शुद्धता 100% के रूप में चुना गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Computational Chemistry
Accelyrs Discovery studio 3.0
Dell Optiplex Workstations
Synthetic Organic Chemistry
Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).
Flourescence Polarization Assay
384 micro well plates, Micro pipets Grenier Bio-one 110256602
CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) BPS Bio Sciences 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)
assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothretiol (DTT))
25 nM HEPES CALBIOCHEM 375368
NaCl Fisher 127838
Nonidet P-40 US Biological N3500
DTT Aldrich
-70 °C freezer Revco (Ultima II)
DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein Beckman Coulter, Brea, CA
Cell Culture
96 well plates Fisher
Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines ATCC
NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent Fisher, Life technology, Alfa Aesar
Heamocytometer VWR
-70 °C freezer Revco (Ultima II)
Incubator Thermo electron corporation
Centrifuge Eppendorf 5804 R
Refrigerator 4-8 °C Isotemp Fisher
DTX880 multimode detector fitted with 595 nm filter Beckman Coulter, Brea, CA

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References

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