Abstract
REPLACE è una strategia unica sviluppata per indirizzare più efficacemente le interazioni proteina-proteina (PPI). Ha lo scopo di ampliare lo spazio disponibile altro obiettivo fornendo una migliore metodologia per l'identificazione di inibitori di tali siti di legame e che rappresentano la maggior parte dei potenziali bersagli farmacologici. L'obiettivo principale di questo lavoro è quello di fornire una visione metodologica di utilizzo e applicazione della strategia REPLACE che prevede approcci di chimica computazionale e sintetiche. Replace è esemplificata attraverso la sua applicazione allo sviluppo di non-ATP chinasi ciclina dipendenti competitivo (CDK) inibitori come terapie antitumorali. CDK sono spesso deregolamentati nel cancro e, quindi, sono considerati come obiettivi importanti per lo sviluppo di farmaci. Inibizione di CDK2 / ciclina A in fase S è stato segnalato a promuovere l'apoptosi selettiva delle cellule tumorali in modo indipendente p53 attraverso la via E2F1. Targeting l'interazione proteina-proteina in bindin ciclinag scanalatura (CBG) è un approccio che permetterà l'inibizione specifica del ciclo cellulare nel corso CDK trascrizionali. La CBG è riconosciuto da una sequenza consenso derivato da substrati CDK e proteine oncosoppressori definito il legame motivo (CBM) ciclina. Il CBM è stato precedentemente ottimizzato per un octapeptide da p21Waf (HAKRRIF) e poi ulteriormente troncato ad un pentapeptide ritegno sufficiente attività (RRLIF). Peptidi, in generale, non sono delle cellule permeabili, sono metabolicamente instabile e quindi il REPLACE (sostituzione con Parziale Ligand Alternative attraverso computazionale arricchimento) strategia è stata applicata al fine di generare inibitori più farmaco-simili. La strategia inizia con la progettazione di Frammento legatura peptidi inibitori (flip), che inibiscono selettivamente ciclo cellulare complessi CDK / ciclina. Capovolge sono stati generati da iterativamente sostituendo residui di HAKRRLIF / RRLIF con frammento come piccole molecole (gruppi capping), a partire dalla N-terminale (Ncaps), seguita da sostituzione inil C-terminale. Questi composti sono punti di partenza per la generazione di non-ATP inibitori CDK competitivi come terapie anti-tumorali.
Introduction
In questo articolo, un caso di studio di applicare il REPLACE (sostituzione con alternative ligando parziali utilizzando computazionale arricchimento) strategia per convertire inibitori peptidici di interazioni proteina-proteina in più molecole farmacologicamente rilevanti è descritta 1-3. Mentre PPI rappresentano una ricca ma poco sfruttato fonte di potenziali bersagli farmacologici, metodologie esistenti sono largamente insufficienti a rendere questi ampiamente accessibile. Le attuali strategie, tra cui frammento basato design a 4, high-throughput di screening 5 e peptidi pinzati 6 sono previsti anticipi, ma questi sono in molti casi inefficace. Di conseguenza, sono necessari ulteriori progressi e approcci più efficienti. SOSTITUIRE è stato pienamente convalidato per lo sviluppo di inibitori della chinasi che hanno migliorato le proprietà farmaco-simili e hanno il potenziale per un ulteriore sviluppo come terapie antitumorali. Questa strategia è esemplificato nello sviluppo di inibitori non-ATP della cellaCDK ciclabili e coinvolge i seguenti: 1) ottenere informazioni strutturali 3D sulle interazioni di HAKRRLIF / RRLIF con la ciclina solco vincolante; 2) determinare i fattori determinanti vincolanti per l'interazione peptide; 3) troncamento del peptide N-terminale contenente uno o più determinanti vincolanti; 4) identificazione di potenziali computazionale piccole molecole alternative (alternative ligando parziali, PLA) per la parte troncata del peptide e che mantengono interazioni chiave del peptide controllante; 5) sintesi o approvvigionamento commerciale di PLA previsto di impegnare avidamente con il sito sub precedentemente occupato da residuo peptide soppresso (s); 6) sintesi di sfoglia legatura dei migliori PLA al peptide troncato utilizzando sintesi in fase solida; 7) prove di lanci in un in vitro di legame o saggio funzionale (polarizzazione di fluorescenza nel contesto / ciclina CDK), seguita da un'ulteriore caratterizzazione in un test di vitalità cellulare. Una rappresentazione schematica di REPLACE strategy è mostrato in Figura 1. In questo articolo, iterazioni della strategia REPLACE sono discussi e l'applicazione di CDK2 / ciclina A descritto in dettaglio. CDK si crede di essere, direttamente o indirettamente deregolato nella maggior parte dei tumori e sono quindi considerati bersagli tumorali appropriata droga 7. CDK richiede associazione con cicline per la piena attivazione e successivamente fosforilare proteine chiave coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare 8. I due principali gruppi di CDK sono gli isotipi che controllano i punti di controllo del ciclo cellulare [G1 / S (CDK4 / ciclina D, CDK6 / ciclina D e CDK4 / ciclina E), fase S (CDK2 / ciclina A) e G2 / M (CDK1 / ciclina B)] e le autorità di regolamentazione di RNA polimerasi, attraverso la fosforilazione (CDK7 / ciclina H, CDK8 / ciclina C, CDK9 / ciclina T). Un passaggio chiave nella progressione fase S si verifica quando il fattore di trascrizione E2F1 forma un complesso con la proteina DP, che poi si lega al DNA e inizia la trascrizione del gene. CDK2 / ciclina A è necessario per neutralizzare E2F1 trascrizionaleattività attraverso la fosforilazione determinando così liberare del complesso E2F1-DP e la sua successiva degradazione. Inibizione di CDK2 / ciclina A si ritiene di mantenere E2F1 nel suo stato legato DNA che porta all'attivazione persistente. Del conseguente livello di E2F-1 supererà la soglia necessaria per indurre l'apoptosi p53 indipendente suggerendo quindi una strategia terapeutica. A causa di p53 deregolamentato e percorsi pRb, alti livelli di E2F-1 spesso si verificano nelle cellule tumorali e l'inibizione della CDK2 / ciclina A dovrebbe portare all'apoptosi selettivi nei tumori e può essere considerato come un obiettivo cancro convalidato 7.
Clinicamente inibitori CDK indagati bersaglio il sito altamente conservata ATP legame che porta ad attraversare reattività tra le proteine chinasi maggiore di 500 nel kinome umano e potenzialmente dando luogo a effetti collaterali e la tossicità 9. Un approccio alternativo è non-ATP inibizione competitiva di mira substrato reclutamento attraverso il CBGpresente su ciclina subunità normativo positivo, e che è quindi distinto e distante dal sito ATP 10,11 vincolante. La CBG è principalmente un solco idrofobico presente in ciclina A, ciclina D e ciclina E e ha dimostrato di riconoscere una sequenza di consenso trovata in substrati e soppressori tumorali. Come un peptide isolato, il legame ciclina motivo (CBM) si lega al CBG e ha dimostrato di inibire l'attività chinasica del CDK ciclo cellulare. Il CBM è stato ottimizzato per un octapeptide (HAKRRLIF, CDK2 / ciclina A IC50 0,07 ± 0,02 micron, CDK4 / ciclina D, IC50 0,88 ± 0,34 micron) e inoltre troncato a un pentapeptide che rappresenta un buon compromesso tra peso molecolare per droga somiglianza e potenza (RRLIF, CDK2 / ciclina A IC50 1,01 ± 0,17 micron, CDK4 / ciclina D, IC50 25.12 ± 2.97 micron) 12,13. I CBGs costituiti da un grande primario e più piccola tasca idrofobica secondario che sono collegate da un ACIDIc regione (include Glu220, Glu224 e Asp283). Le principali determinanti vincolanti HAKRRLIF includono l'interazione dei Ala2 con la tasca idrofoba secondaria, accoppiamento ionico e legami di idrogeno Lys3, Arg 4 e Arg5 con la regione acida e un alto grado di complementarità di Leu6 e Phe8 con il sito primario lipofilo. Inoltre, numerosi legami idrogeno sono fornite dal scheletro peptidico mentre Ile7 agisce come residuo spaziatore consente un contatto ottimale con la tasca principale. La modalità di rilegatura e le interazioni di HAKRRLIF con CBG è mostrato nella Figura 2.
Targeting l'interazione proteina-proteina CBM / CBG inibisce l'attività chinasi CDK2 / ciclina A, CDK2 / ciclina E e CDK4 / ciclina D e questo dovrebbe far scattare E2F1 apoptosi mediata delle cellule tumorali mentre non interessano le cellule normali 7. Anche se CBM derivati peptidi sono efficaci inibitori di CDK ciclo cellulare, è improbabile che essi saranno utili come farmaci a causa del loro metabolismoinstabilità e mancanza generale di permeabilità cellulare. A tal fine, abbiamo applicato la strategia REPLACE al fine di convertire questi inibitori peptidici potenti in più composti farmaco-simili per l'ulteriore sviluppo di terapie antitumorali sfruttando E2F1 liberalizzato attraverso CDK2 / ciclina A inibizione. Il protocollo seguente riassume lavoro che è stato completato l'applicazione della REPLACE alla scanalatura ciclina. Nel primo caso, sono state identificate sostituzioni gruppo capping-farmaci per il tetrapeptide N-terminale di HAKRRLIF. Inoltre, i miglioramenti in questi gruppi sono stati esaminati in un ulteriore studio di validazione per REPLACE. Risultati rappresentativi di questi studi sono anche presentati.
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Protocol
1. computazionale identificazione di potenziali piccola molecola Tappatrici gruppi
Nota: In linea di principio, una varietà di attracco o farmacofori metodi di ricerca può essere utilizzato per prevedere i potenziali gruppi di tappatura. Lo scopo principale di studi computazionali in REPLACE è quello di identificare piccole molecole che mantengono le caratteristiche e le interazioni degli aminoacidi che vengono sostituiti.
- Validazione del protocollo LigandFit attracco 14
Nota: In studi precedenti, il metodo di aggancio (LigandFit 15, un modulo della suite programma di modellazione molecolare, Discovery Studio 3.0) è stato validato per garantire che questo algoritmo è sufficiente a riprodurre le modalità vincolanti conosciuti Ncaps e dimostrare che i risultati ottenuti per composti sconosciuti sono predittivi 14.
- Utilizzando la procedura seguente (1,2 - 1,5), identificare i parametri ottimali per LigandFit come segue: PLP1 itGriglia ERGIA per la generazione di posa, la riduzione al minimo di pose generati e la funzione di scoring PLP1 per l'analisi di pose.
- Per limitare le conformazioni ottenuti e posizionare ligandi appropriato per la formazione del legame covalente del peptide capped, impostare l'azoto e azoto ammidico indolo atomi di Trp217 e Gln254 rispettivamente come filtri di interazione per legami idrogeno.
- Progettazione e ancorare una biblioteca di alternative frammento nel CDK2 / ciclina A recettore (2UUE). Dare priorità potenziali gruppi di tappatura per la sintesi e il sourcing commerciale basata su PLP1 punteggio, le interazioni con i filtri di interazione e complementarità con il CBG. Le varie fasi necessarie per LigandFit aggancio sono i seguenti.
- Preparazione del recettore sito di legame 14
- Importare il CDK2 / ciclina A struttura cristallina (PDB id: 2UUE) in una finestra di visualizzazione nel software. Questa struttura contiene il FLIP precedentemente identificato 5-metil-1-fenil-1H-1, 2,4-triazolo-3-carbossammido (3,5-DCPT) RLIF vincolato alla scanalatura ciclina (Figura 3).
- Eliminare o mantenere in essere i residui RLIF (C-terminale). Quando la sequenza peptidica viene mantenuta, utilizzare il gruppo amminico N-terminale del peptide come un filtro per l'interazione ligando. Dalle "recettore-ligando" strumenti, creare una sfera intorno alla N-3,5-cap DCPT da Mostra / Nascondi sito sfera. La sfera viene creato per definire la regione attiva nel sito di legame che accettano le interazioni ligando-recettore a verificarsi durante il collegamento.
- Definire il sito di legame più lontano dalla "trovare posto come volume di legante selezionato" ed eliminare il legante 3,5-DCPT dalla proteina. Eseguire questo passo per definire il volume di legare nell'ambito creato.
- Impostare i azoto e di azoto ammide indolo atomi dei residui Trp217 e Gln254 come filtri di interazione per legami idrogeno. Impostare i filtri di interazione in modo che solo le pose che inteRACT con gli atomi di residui set sarà filtrata durante la procedura di attracco quindi preservare interazioni importanti pose ormeggiate.
- Preparazione di ligandi 14
- Progettare una biblioteca di 100 potenziali gruppi tappatura sulla base di criteri tra cui peso molecolare inferiore a 500, la presenza di un gruppo carbossilato per legatura con il peptide troncato e inserimento di opportuni gruppi idrofobici (gruppo fenile sostituito) per van der Waals nella tasca secondaria mostrato nella Tabella 1.
- Selezionare anelli eterociclici per mimare interazioni di legame peptidico idrogeno con Trp217 e sostituenti inclusi per sostituire le interazioni ione-accoppiamento delle catene laterali di base del HAKRRLIF. Ancorare la ligandi come rispettive molecole aldeide in modo che l'ossigeno carbonilico può interagire con l'atomo di azoto ammidico di Gln254 simile a scheletro peptidico nel peptide genitore (Tabella 1).
- Prima di docre, ridurre al minimo leganti progettate per una conformazione a bassa energia e di preparare in uno stato di ionizzazione appropriato utilizzando il protocollo "Preparare ligandi". Disegnare ed esportare tali limiti potenziali N nel formato di file .sdf in ChemDraw per un foglio prima di essere importato nel software.
Nota: Preparare protocollo ligandi viene utilizzato per ridurre al minimo tutti i ligandi per essere agganciato ai loro stati energetici più bassi e le cariche di ionizzazione sono stati applicati agli atomi applicabili. I parametri di default vengono utilizzati per questo passaggio.
- Docking dei leganti nella ciclina A Groove 14
- Selezionare la routine LigandFit da recettore-ligando insieme protocollo interazioni del software. Utilizzare il recettore e leganti preparati come input per questo protocollo.
- Per queste corse selezionare PLP1 come rete energetica, precisano che pone sia energia ridotto al minimo e che il numero di pose generati 10. Lasciare tutti gli altri parametri ai valori di default.
Nota: è LigandFitun metodo di aggancio che può identificare e generare pose di alta complementarità e potenziale affinità con il sito attivo di una proteina mediante un filtro di confronto figura basata che si combina con un Monte Carlo algoritmo di ricerca conformazionale. La griglia di energia utilizzata dal programma di espansione è il campo di forza per generare interazioni ligando-recettore e potenziali pose. PLP1 è potenziale lineare a tratti che privilegia in particolare le interazioni di legame idrogeno e dove viene assegnato il tipo di atomo di PLP per ogni non-idrogeno ligando atomo o non idrogeno recettore atomo.
- Analisi dei risultati
- Nel primo caso, il display pone nel programma visualizzatore e poi ordinare per i valori della partitura PLP1 discendente. Utilizzare funzioni di punteggio come PLP1 stimare l'affinità di legame di un ligando ancorata sulla base di un legante candidato posa geometria e interazione non covalente con la struttura del recettore bersaglio.
Nota: Qui, la funzione PLP1 punteggio è risultato give i migliori risultati in quanto include una stima di legami idrogeno. - Analizzare visivamente il primo 25% delle pose segnati per 1) sovrapponibilità con il gruppo di tappatura noto (con uno scarto quadratico medio relativo RMSD () valore inferiore a 2 A), 2) soddisfatta filtri di interazione e 3) la complementarità visivo con la scanalatura ciclina . E 'accettato in quanto un corretto ormeggiata posa (a fronte di una struttura sperimentale) ha un valore RMSD di <2 Å.
- Esaminate pose per complementarietà visivo, che è definita come avente riempimento efficiente della tasca di legame in un modo che è coerente con note relazioni struttura-attività. Interazione filtri sono impostati per includere restrizioni atomo che richiedono contatti intermolecolari notoriamente critica per il legame e / o sono necessari per posizionare il gruppo di potenziale capping nella geometria corretta per la formazione del legame ammidico. Tre esempi di pose attraccate di potenziali gruppi N-capping facendo legami idrogeno con interaction filtri sono mostrati in Figura 4.
- Nel primo caso, il display pone nel programma visualizzatore e poi ordinare per i valori della partitura PLP1 discendente. Utilizzare funzioni di punteggio come PLP1 stimare l'affinità di legame di un ligando ancorata sulla base di un legante candidato posa geometria e interazione non covalente con la struttura del recettore bersaglio.
2. Sintesi e caratterizzazione di potenziali N -capping Gruppi
- Sintesi dei gruppi N-capping.
- Per sintesi, utilizzare tutte commerciali a partire materiali, solventi e reagenti come ottenuti. Synthesize potenziali gruppi N-tappatura convenzionale chimica organica sintetica (Figura 5 12,13 per un esempio).
- Eseguire cromatografia su strato sottile (TLC) su gel di silice per reazioni monitoraggio.
- Sciogliere il materiale di partenza e la miscela di reazione (1 mg) nella fase mobile e posto sulla piastra TLC utilizzando tubi capillari.
- Posizionare la piastra TLC in alla camera contenente fase mobile (acetato di etile ed esano in rapporto 35:65). Una volta che la fase mobile raggiunge il 90% della piastra TLC, rimuovere e aria asciugare la piastra.
- Utilizzare la luce UV per rilevare le miscele materiale di partenza e di reazione come macchie visibili. Calcolare il R f di tutti i punti (rapporto della distanza percorsa dal punto e la fase mobile).
Nota: La reazione è completa quando non vi è alcun punto visto alla R f del materiale di partenza.
- Dopo il completamento della reazione lavorare la miscela di reazione introducendo in un imbuto separatore e lavaggio con acido acquoso o soluzione di base come appropriato. Raccogliere il solvente organico, evaporare in evaporatore rotante e seccare il prodotto grezzo ottenuto sotto vuoto.
- Sciogliere 500 mg di prodotto grezzo in 3-5 ml di solvente adeguato e aggiungere ad un 1 g di silice o RP18 samplet e secca sotto aria. Posizionare il samplet contenente il prodotto grezzo in / RP SNAP cartucce Flash silice e purificare il materiale grezzo mediante cromatografia automatizzata flash ad alte prestazioni (secondo il protocollo del produttore) che impiega un g colonna SNAP 100 con una corsa di pendenza a partire dal 6% acetato di etile: 94 % esano al 50% di acetato di etile e 50% esani oltre15 volumi di colonna.
- Essiccare il prodotto purificato raccolto in solvente dalla cromatografia flash utilizzando un evaporatore rotativo per evaporazione tutto il solvente a secchezza ed asciugare ulteriormente il prodotto sotto vuoto per eliminare tutti i solventi residui. Eseguire caratterizzazione del prodotto purificato mediante NMR, MS e HPLC analitica.
- Per 1 H NMR e 13 C NMR, pesare circa 10 mg del campione purificato, scioglierlo in un appropriato solvente deuterato, e trasferire il contenuto di un tubo NMR secco per registrare gli spettri NMR 2,14.
- Registrare il 1H NMR e 13 C NMR con un campo di alta NMR Spectrometer (minimo 300 MHz). Acquisire spettri di massa utilizzando un QTOF (Tandem quadrupla-1 tempo di spettrometro di massa di volo), ionizzazione electrospray (ESI) o di un VG 70S (doppio fuoco spettrometro di massa a settore magnetico, EI) 2,14.
- Analizzare la purezza dei prodotti mediante HPLC con un rivelatore a serie di diodi e dotateun C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 micron colonna per l'analisi. Utilizzare una corsa pendenza a partire dal 100% di acqua (0,1% di acido trifluoroacetico) al 60% di acetonitrile (0,1% di acido trifluoroacetico) su 30 minuti e tenere premuto il gradiente per 4 min. Estrarre i cromatogrammi a 226 e 254 nm 2,14.
Nota: purezze analitici di composti sono stati valutati> 95%.
3. Sintesi in fase solida per la generazione di lanci 2
- Sintesi di lanci N-capped
- Montare composti peptidici N-capped attraverso metodi di sintesi in fase solida standard usando la seguente procedura.
- Attivare 5 equivalenti di aminoacidi C-terminale (Fmoc-Phe) in 4,4 equivalenti di O -Benzotriazole- N, N, N ', N' tetrametil-uronium-esafluoro-fosfato (HBTU, 221,93 mg) in 2 ml di DMF per 5 min. Caricare la miscela HBTU Fmoc-Phe sulla resina di pattinaggio con 6 equivalenti di diisopropylethyl ammina (DIPEA, 103.13mg) per 1 ora a RT.
- Rimuovere il gruppo protettore Fmoc dal residuo C-terminale utilizzando 20% piperidina in 3 ml di DMF per 10 min. Coppia successive amminoacidi (ad esempio, Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-PMC) passo passo. Ad ogni passo, coppia 5 equiv del successivo amminoacido usando 6 equivalenti di DIPEA (103.13 mg) e 4,4 equivalenti di HBTU (221,93 mg) in 2 ml di DMF per 1 ora a RT.
- Applicare cicli di lavaggio (5 x 10 ml di DMF + 5 x 10 ml di DCM) dopo accoppiamento amminoacidi Fmoc e deprotezione fasi sopra descritte. Dopo il montaggio peptide, gruppi che utilizzano 6 equivalenti di DIPEA (103.13 mg) e 4,4 equivalenti di HBTU (221,93 mg) Coppia N-tappatura in 2 ml di DMF per 1 ora a RT.
- Al termine del montaggio peptide, trattare la miscela di reazione con 2 ml della miscela fenditura (90: 5: 5 TFA / H 2 O / TIPS) O / N per rimuovere catena laterale gruppi protettori, e cleave Capovolge dalla resina. Triturare il prodotto risultante con etere etilico freddo per precipitare e iof concentrato necessario in un evaporatore rotante.
- Montare composti peptidici N-capped attraverso metodi di sintesi in fase solida standard usando la seguente procedura.
- Sintesi di lanci N-capped-C-capped
- Pesare e sciogliere il peptide Arg-Leu N-terminale livellata e protetta (16,1 mg, 0,02 mmol) in diclorometano e aggiungere [4- (3-clorofenossi) piridin-2-il] methanamine (C-cap) insieme a O - benzotriazole- N, N, N ', N' esafluorofosfato -tetramethyluronium (HBTU; 16,7 mg, 0,02 mmol) e N, N -diisopropylethylamine (DIPEA; 6,5 mg, 0,02 mmol).
- Mescolare e controllare la reazione a temperatura ambiente fino TLC / HPLC indica il consumo totale di materiale di partenza. Dopo il completamento della reazione, concentrare la miscela di reazione grezza usando un evaporatore rotante e poi partizione tra acetato di etile ed acqua.
- Separare il acquosa e strato organico; lavare la fase organica con 1 N NaOH, 1 N HCl, e salamoia. Essiccare lo strato organico con circa 1 g di solfato di sodio e concentrare il prodotto in evaporatore rotante. Finally trattare il prodotto O / N con la miscela di scissione (95: 2,5: 2,5 acido trifluoroacetico / H 2 O / TIPS) per deprotezione.
- Triturare il prodotto risultante con fredda dietiletere ed eventualmente il concentrato in evaporatore rotante a completo essiccamento per eliminare tutto il solvente. Ulteriori essiccare il prodotto sotto vuoto per eliminare tutti i solventi residui.
- Purificazione e caratterizzazione di lanci
- Purificare ribalta greggio con semi metodi HPLC inversa in fase di preparazione. Lyophilize i lanci purificati e caratterizzare la loro massa molecolare mediante spettrometria di massa 2,14.
- Determinare la purezza dei flips mediante HPLC con un rivelatore a serie di diodi e dotato di C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 micron colonna. Utilizzare un metodo del gradiente a partire dal 95% H 2 O (0,1% di acido trifluoroacetico) / 5% acetonitrile (0,1% di acido trifluoroacetico) al 35% H 2 O (0,1% di acido trifluoroacetico) / 65% acetonitrile (0,1% trifluoroaceL'acido tic) su 30 minuti e tenere premuto il gradiente per 4 min. Estratto cromatogrammi a 226 e 254 nm.
4. fluorescenza polarizzata Binding Assay per la determinazione del legame competitivo 2,14
- Eseguire il test in nero 384 pozzetti (138 ml) lastre con la seguente procedura.
- Diluire i campioni, peptidi traccianti (4 Nm), e complessi chinasi (CDK2 / ciclina A - 18 mcg / ml, CDK4 / ciclina D - 37 mg / ml) alle concentrazioni necessarie a tampone (25 mM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% Nonidet P-40, 1 mM ditiotreitolo (DTT).
- In ciascun pozzetto della piastra da 384 pozzetti, aggiungere: 5 ml di CDK4D1 o CDK2CA (0,3 mcg / ben purificata complesso ricombinante umano chinasi), soluzione del composto 5 ml, 5 ml di 30 nm tracciante peptide (fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val -Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly o fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly tracciante peptide). Utilizzare 5 ml di ogni DMSO (6%), buffer, tracciante e 5 microlitri DMSO (6%), complesso chinasi, come tracciante pozzetti di controllo
- Dopo l'aggiunta dei tutti i componenti, centrifugare la piastra a 500 rpm per 1 min (41.16 xg) a temperatura ambiente e poi incubare la piastra con agitazione per 45 minuti a temperatura ambiente. Utilizzo di un lettore di piastre multimodale e rilevatore dotato di 485 nm / 535 nm di eccitazione / filtri di emissione e uno specchio dicroico leggere l'intensità fluoresceina di ogni pozzetto della piastra.
- Calcolare la polarizzazione media relativa (mp) per tutti i campioni di prova con l'equazione che mostra sotto. Determinare valori di IC 50 di regressione logaritmica, correlando relativi mps e testare le concentrazioni.
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Representative Results
Le interazioni di HAKRRLIF con scanalatura ciclina sono mostrati in Figura 2. I residui peptidici che rappresentano le principali determinanti di legame includono Ala2, Arg4, Leu6 e Phe8 con altri residui fornendo contributi piccole 12,13,18. In questo caso di studio la strategia REPLACE è stato utilizzato al fine di trovare alternative frammento di residui nel tetrapeptide N-terminale HAKRRLIF, imitando soprattutto le interazioni di Ala2 e Arg4. Una libreria di potenziali frammenti NCAP (Tabella 1) è stato costruito sulla base dei criteri. Ogni molecola è stata ormeggiata nel sito di legame lasciato libero creato da troncamento del gruppo N-capping dalla sua struttura di cristallo con la ciclina A (PDB ID: 2UUE). Alternative ligando potenziali sono stati selezionati sulla base di analisi posa e PLP1 punteggio come una previsione di affinità (esempi di pose attraccate sono mostrati in Figura 4). La sintesi di un NCAP confermata (1- (3-clorofenil) -5-metil-1H-1,2,4-triazolo-3-carbossilico) è mostrato in Figura 5, dove questa molecola è stata generata in tre fasi e purificato mediante cromatografia flash automatico (figura complementare 1). Il 1 H NMR, 13 CNMR, MS e HPLC dati di caratterizzazione di un composto rappresentativo 1- (3-clorofenil) Acido -5-metil-1H-1,2,4-triazolo-3-carbossilico sono mostrati in Figure 1-5 complementare rispettivamente. La sintesi di lanci N-capped e la ribalta N-capped-C-capped sono rappresentati nelle figure 7 e 8 ed i dati di caratterizzazione sono riportati nella tabella 2. L'affinità di legame per entrambi CDK2 / ciclina A e CDK4 / ciclina D è stato determinato utilizzando il test descritto FP ed i risultati sono riportati nella tabella 3. Tra i composti testati, ribalta contenente triazolo N-caps basato sono stati determinati ad avere la più grande affinità per CDK2 / ciclina A e CDK4 / ciclina D e composto rappresentativos sono stati testati in saggi cellulari. Nel complesso, le molecole FLIP identificati sono stati trovati per essere più farmaco come e mantenere molte delle interazioni del octapeptide HAKRRLIF. Tetrapeptidi Capped possedevano minore potenza rispetto a HAKRRLIF tuttavia erano di attività paragonabile al pentapeptide RRLIF (tabelle 3 e 4). Questi risultati mostrano che i composti ottenuti erano migliorate somiglianza farmaco, ma questo è stato ottenuto a costo di un po 'compromessa affinità di legame.
L'attività anti-proliferativa questi ligandi CGI stata valutata e cellulari IC 50 's sotto 30 mM sono stati osservati in linee cellulari tumorali U2OS e DU145.
Figura 1. Panoramica della strategia REPLACE. Si prega di cl ick qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. rilegatura e interazioni di HAKRRLIF in CBG pannello sinistro:. Struttura Modellato di HAKRRLIF legato al CBG. La scanalatura ciclina consiste di due tasche idrofobiche - una tasca principale più grande (destra, occupate da Leu6 e Phe8) e una tasca più piccola secondaria (sinistra, occupata da Ala2) e che sono collegate da residui acidi raffigurati in rosso. A destra: Altre interazioni importanti sono idrogeno legame contatti della spina dorsale peptide (con Trp217, Gln254, Ile281), e le interazioni di ioni-pairing dei tre residui di base del peptide (con Glu220, Glu224, Asp283). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. Modalità vincolante di 3,5-DCPTRLIF in CBG. Il legame di 3,5-DCPT-RLIF è mostrato con interazioni di legame idrogeno (rappresentato da linee verdi tratteggiate) con gli atomi di sidechain Trp217 e Gln254. Clicca qui per visualizzare un versione più grande di questa figura.
Sono mostrati Figura 4. di docking risultati selezionati. Ancorata pose di 3 rappresentativi gruppi N-capping. Ciascuno di questi composti rendono H legami con gli atomi del filtro di interazione Trp217 e Gln254 e come rappresentato da linee verdi tratteggiate. Il sostituente fenil rende interazioni di van der Waals con la tasca idrofobica secondario. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 5. Sintesi di 1- (3-clorofenil) Acido -5-metil-1H-1,2,4-triazolo-3-carbossilico. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Sintesi di lanci N-capped di sintesi in fase solida. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Sintesi di N-caCapovolge pped-C-capped. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. Biblioteca di piccole molecole attraccate e le previsioni risultanti di energia di legame utilizzando la funzione di PLP1 punteggio.
| Peptide | Purezza | Colonna Dimensioni | Metodo | Portata | HPLC Tempo di conservazione | MW teorica | Osservato MW |
| 5843 | > 90% | 4.6 × 250 millimetri | 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% | 1 ml / min | 23.9 | 732 | 732,6 |
| 5773 | > 90% | 4.6 × 250 millimetri | 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% | 1 ml / min | 22.4 | 801,77 | 800,55 |
| 5774 | > 90% | 4.6 × 250 millimetri | 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% | 1 ml / min | 24.2 | 767,33 | 766,5 |
| 5762 | > 90% | 4.6 × 250 millimetri | 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% | 1 ml / min | 9.0 | 731,91 | 731,65 |
| 5763 | > 90% | 4.6 × 250 millimetri | 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% | 1 ml / min | 11.2 | 800,8 | 799,5 |
| 5764 | > 90% | 4.6 × 250 millimetri | 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% | 1 ml / min | 10.1 | 766,34 | 765,55 |
| 5771 | > 90% | 4.6 × 250 millimetri | 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% | 1 ml / min | 9.4 | 749,9 | 749,6 |
| 5765 | > 90% | 4.6 × 250 millimetri | 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% | 1 ml / min | 10.1 | 766,35 | 755,65 |
| 5766 | > 90% | 4.6 × 250 millimetri | 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% | 1 ml / min | 9.4 | 761,9 | 761,55 |
| 5767 | > 90% | 4.6 × 250 millimetri | 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% | 1 ml / min | 20.4 | 761,9 | 761,55 |
| 5776 | > 75% | 4.6 × 250 millimetri | 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% | 1 ml / min | 23.3 | 785.7 | 784,55 |
| 5775 | > 90% | 4.6 × 250 millimetri | 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% | 1 ml / min | 9.9 | 751,34 | 750,45 |
Tabella 2. Dati analitici per CGI Peptidi di rilegatura e la ribalta.
Tabella 3. In vitro il legame di selezionati lanci N-capped a CDK2CA e CDK4CD.
Tabella 4. Nel legame di N & C selezionato vitro ricoperto ribalta a CDK2CA e CDK4CD.
Supplementare Figura 1-5. Purificazione e caratterizzazione di 1- (3-clorofenil) Acido -5-metil-1H-1,2,4-triazolo-3-carbossilico.
Figura supplementari 1. Flash cromatogramma di prodotto ottenuto dalla fase 1. Ci sono quattro picchi eluiscono, il picco principale eluizione a 55% acetato di etile / 45% esani è risultato essere il prodotto desiderato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questo figura.
Figura 2. complementare 1 HNMR di 1- (3-clorofenil) -5-metil-1H-1,2,4-triazolo-3-car L'acido carbossilico. Lo spettro NMR mostra 3 protoni metilici alifatici e 3 protoni aromatici. L'integrazione di tutte le tre cime Di seguito si riporta lo spettro NMR. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. complementare 13 CNMR 1- (3-clorofenil) Acido -5-metil-1H-1,2,4-triazolo-3-carbossilico. Ci sono dieci atomi di carbonio nella struttura, 13 CNMR con 10 segnali per ogni carbonio atomo. L'integrazione per ogni picco è mostrato sotto lo spettro NMR. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 4. complementare MS di 1- (3-clorofenil) Acido -5-metil-1H-1,2,4-triazolo-3-carbossilico. Il peso molecolare del composto viene mostrata come picco parent a 237. L'attuale molecolare peso del composto è 237,64. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. complementare HPLC di 1- (3-clorofenil) Acido -5-metil-1H-1,2,4-triazolo-3-carbossilico. La purezza del prodotto è determinata come 100%, come mostrato nel cromatogramma HPLC. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computational Chemistry | |||
| Accelyrs Discovery studio 3.0 | |||
| Dell Optiplex Workstations | |||
| Synthetic Organic Chemistry | |||
| Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI). | |||
| Flourescence Polarization Assay | |||
| 384 micro well plates, Micro pipets | Grenier Bio-one | 110256602 | |
| CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) | BPS Bio Sciences | 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A) | |
| assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothretiol (DTT)) | |||
| 25 nM HEPES | CALBIOCHEM | 375368 | |
| NaCl | Fisher | 127838 | |
| Nonidet P-40 | US Biological | N3500 | |
| DTT | Aldrich | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
| Cell Culture | |||
| 96 well plates | Fisher | ||
| Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines | ATCC | ||
| NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent | Fisher, Life technology, Alfa Aesar | ||
| Heamocytometer | VWR | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| Incubator | Thermo electron corporation | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| Refrigerator 4-8 °C | Isotemp Fisher | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 595 nm filter | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
References
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