Transposon Mediated intégration du plasmide ADN dans le zone sous-ventriculaire de souris néonatale pour générer des modèles nouveaux de glioblastome

Introduction

Le glioblastome multiforme (GBM) est la plus fréquente (60%) tumeur primaire du cerveau chez les adultes, avec une médiane de survie de 15 à 21 mois lorsqu'ils sont traités avec la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie ^1. De nouvelles thérapies pour GBM sont impératives. Thérapies expérimentales exigent des tests dans des modèles animaux qui reproduisent de manière adéquate les principales caractéristiques de la maladie humaine. Les stratégies visant à induire GBM chez les rongeurs comprennent la mutagenèse chimique avec des agents alkylants, des altérations génétiques de lignée germinale ou somatique, ou une transplantation utilisant des lignées cellulaires de gliome ^2. Les modèles les plus couramment utilisées emploient l'implantation de lignées cellulaires de gliome, soit orthotopique, dans le cerveau ou sous-cutanée en utilisant des cellules syngéniques chez les animaux de génotype identique; ou xénogéniques, lignes le plus souvent de cellules humaines de glioblastome, implantées dans des souris immunodéficientes ^3. Xénogreffes offrent de nombreux avantages pour l'étude des tumeurs intracrâniennes: commodité de reproductibilité, Standataux de croissance rdized, moment de la mort et de la tumeur localisation. Cependant, ces modèles ont des limites en raison de l'approche chirurgicale artificielle, invasive utilisée pour implantations et une capacité limitée de reproduire fidèlement histologique caractéristiques de GBM humaine (OMS note IV): pseudo-pallisading nécrose, atypies nucléaires, l'invasion diffuse, micro-vasculaire prolifération et la formation d'anomalies vasculaires glomeruloid ^4-7. L'induction de la GBM en modifiant le génome des cellules somatiques avec de l'ADN oncogene, soit avec des vecteurs viraux ^8-12, ou avec l'intégration d'un transposon à médiation ^13, reproduit plus étroitement l'étiologie de la maladie humaine et récapitule les caractéristiques histopathologiques de glioblastome humain.

Historiquement, les tumeurs du système nerveux central ont été classés sur la base de la cellule perçue d'origine, où il a été observé, serait un facteur prédictif de la survie ^14. GBM sont classés en primaire et secondaire. Nouvelles preuves today des points de la nature très hétérogène de glioblastome primaire ^15. GBM secondaire (15%), le résultat de la transformation maligne des astrocytomes de bas grade (OMS grade I) et l'astrocytome anaplasique (OMS grade II), sont associés à l'apparition précoce de la maladie, un meilleur pronostic et un motif "proneural" de l'expression génique , alors que GBM primaire (85%) montrent un début tardif, mauvais pronostic et gliale (classique), de neurones ou de profils d'expression mésenchymateuses. Que ces modes d'expression du gène en corrélation avec la cellule d'origine réel de la tumeur est encore étudié activement. Accumuler des données montre que la combinaison de mutations génétiques associées à GBM sont prédictifs de survie. Par exemple, la perte d'hétérozygotie (LOH) des chromosomes 1p / 19q, mutations IDH1, PDGFRa amplifications, sont associés à GBM secondaires, profil d'expression proneural et meilleur pronostic, alors que la surexpression de l'EGFR, Notch et Sonic activation de la voie de hérisson, Nf1 et la perte de PTEN et les mutations de p53 sont corrélées avec neuronal, classique ou GBM primaire mésenchymateuses et pire pronostic ^16,17. L'avènement de grands projets de séquençage à grande échelle et l'accumulation de nombreux échantillons de patients disponibles pour les tests apporte une richesse de nouvelles informations par rapport à des mutations génétiques et des voies impliquées dans le GBM pathogenèse et la progression et la possibilité de la médecine individualisée, où les thérapies peuvent être spécifiquement adaptés aux les anomalies génétiques du patient. En fin de compte, pour évaluer la valeur prédictive de ces mutations et les voies d'une manière systématique, et de tester les traitements possibles dans chaque cas, nécessite des modèles animaux de GBM à des altérations génétiques pré-déterminée. Transposon intégration médiation de l'ADN génomique offre une approche possible.

The Sleeping Beauty système de transposon, membre de la Tc1 / mariner classe de transposons, a été "réveillée" (construit) dans une procé multi-étapess de mutagenèse dirigée d'un gène de transposase salmonidés, qui est devenu il ya plus de dormance de 10.000.000 années ^18,19. En substance, transposons ADN flanqués par des séquences spécifiques (répétitions inversées / répétitions directes: IR / DR) peuvent être intégrés dans le génome d'une manière "couper et coller" au moyen de l'activité de la transposase Sleeping Beauty. La transposase reconnaît les extrémités des sites de IR, excise le transposon et l'intègre au hasard dans un autre site de l'ADN entre les bases T et A, des bases qui sont dupliquées à chaque extrémité du transposon au cours de transposition (figure 1a). La transposase Sleeping Beauty est composée de trois domaines, un domaine de liaison d'un transposon, une séquence de localisation nucléaire et un domaine catalytique. Quatre molécules de transposase sont nécessaires pour amener les deux extrémités du transposon ensemble et permettre la transposition, cependant, si un trop grand nombre de molécules de transposase sont présents, ils peuvent se dimériser et d'inhiber tetramerizela réaction de transposition ^20. Une réaction de transposition efficace nécessite un rapport optimal de transposase de transposons. L'ADN codant pour la transposase peut être expédié sur le même plasmide avec le transposon (en cis) ou sur un autre plasmide (en trans). Pour assurer le rapport optimal entre la transposase et les transposons, un promoteur ayant une activité adéquate peut être choisie pour l'expression de la transposase (pour le modèle «cis») ou le rapport des plasmides dans la solution d'injection peuvent être optimisés (par la modèle «trans»). Le système de Sleeping Beauty transposon peut être utilisé avec succès pour la génomique fonctionnelle, la mutagenèse par insertion, la transgenèse et la thérapie génique somatique ^21. Être une construction synthétique repensé à une molécule fonctionnelle d'une variante de salmonidés en sommeil, la transposase Sleeping Beauty ne se lie pas à d'autres transposons chez l'homme ou d'autres mammifères ^20. Depuis sa découverte, l'ingénierie moléculaire a enhanced efficacité de la transposition du système de transposon SB par des changements dans les séquences d'IR et plus de dinucléotides TATA flanquant le transposon, d'où les transposons pT2. Ces transposons ont optimisé la liaison de la SB le site IR et une efficacité accrue de l'excision. La transposase SB a également subi une amélioration significative; la transposase utilisé dans les expériences présentées ici est le SB100X, une transposase hyperactive générée par une stratégie de réarrangement d'ADN suivie par un criblage génétique à grande échelle dans des cellules de mammifères ^22.

Dans ce rapport, nous présentons une méthode rapide, polyvalent et reproductible pour induire GBM intrinsèque chez la souris avec des non-virale, l'intégration du transposon médiation de l'ADN plasmidique dans des cellules de la zone sous-ventriculaire de souris néonatale ^23. Nous présentons une façon simple de créer transposons avec de nouveaux gènes qui se prêtent à l'intégration génomique en utilisant la transposase Sleeping Beauty et démontrer comment surveiller plasmide absorption etla progression de la maladie en utilisant la bioluminescence. Nous caractérisons également histologiques et immuno-histochimie caractéristiques de la GBM reproduit avec ce modèle. En outre, nous présentons une méthode rapide pour générer des lignées de cellules primaires GBM de ces tumeurs. Le modèle Sleeping Beauty, dans lequel les tumeurs sont induites à partir de cellules d'origine à l'animal, permet l'évaluation fonctionnelle du rôle des gènes candidats GBM dans l'induction et la progression des tumeurs. Ce système est également bien adapté pour les essais de nouveaux traitements GBM, y compris les thérapies immunitaires chez des souris immuno-compétentes, sans la nécessité d'interventions chirurgicales invasives inflammatoires, qui peuvent modifier le microenvironnement local.

Protocol

REMARQUE: Tous les protocoles d'animaux ont été approuvés par l'Université de Michigan Comité pour l'utilisation et l'entretien des animaux (UCUCA).

1. Clonage de la séquence d'intérêt dans de nouveaux couchage transposons Beauté

REMARQUE: Pour insérer des gènes ou des éléments inhibiteurs (comme shRNA) en utilisant le système de transposase Sleeping Beauty, cloner la séquence d'intérêt dans le squelette d'un pKT ou pT2 plasmide. Diriger le clonage de telle sorte que les éléments de régulation, gène d'intérêt et des marqueurs restent flanqués par les séquences répétées inverses (IR / DR). Un exemple de clonage PDGFβ dans un squelette de pKT est détaillé ci-dessous (voir aussi la figure 1b).

1. Digest 5 pg de vecteur plasmidique pKT-IRES-Katushka pendant 4 heures à 37 ° C avec 5 à 10 unités de Xbal / Xhol enzymes de restriction dans 50 ul de volume réactionnel.
2. Digérer l'ADNc mPDGFβ de 5 pg du plasmide pGEM-T mPDGFβ pendant 4 heures à 37 ° C avec 5-10 unités de Ncol / Sacl enzymes de restriction.
3. Précipiter l'ADN total en ajoutant 2,5 volumes d'éthanol à 100% et 1/10 de volume de 3M acétate de Na, pH 5,8 et on incube pendant une nuit à -20 ° C.
4. Centrifuger les échantillons à 13 800 xg pendant 15 min.
5. Laver le culot d'ADN avec 500 pi d'éthanol à 70%, centrifuger à 13 800 g pendant 1 min, répéter une fois et remettre en suspension dans 19 pi d'eau libre de DNase stérile.
6. Suivez les instructions du fabricant dans le Blunting Kit rapide pour émousser les extrémités de deux vecteur (PKT-IRES-Katushka) et insérez (mPDGFβ).
7. Chargez le vecteur émoussé et insérer sur un bromure d'éthidium gel d'agarose coloré de 1,2% et de fonctionner à 80 V pendant 40 min. Visualiser les bandes, les exciser avec une lame de rasoir propre et purifier l'ADN du gel en utilisant un kit de purification de gel selon le protocole du fabricant.
8. Ligaturer l'ADN insert et le vecteur purifié dans l'étape 1.7 en les ajoutant dans un tube à un ratio de 4: 1 molaire (insert: vecteur). Dans ce tube, pipette 1 pl de ligase T4 et 2 pi de tampon de ligase T4 (contenant de l'ATP), et ajuster le volume à 20 pi avec de l'eau stérile. Incuber la réaction de ligature pendant 18 heures à 16 ° C.
9. Transformer des cellules bactériennes compétentes DH5a chimiquement avec les produits ligaturés.
   1. Décongeler les cellules compétentes sur la glace.
   2. Ajouter la totalité du volume de la réaction de ligature à 50 pi de cellules compétentes, secouer doucement le tube et incuber le mélange sur de la glace pendant 30 min. Choc thermique pour les bactéries 45 sec à 42 ° C et de retourner immédiatement à la glace; incuber sur de la glace pendant 2 min.
   3. Ajouter 950 pi de bouillon de Luria à la culture et incuber sous agitation à 37 ° C pendant 1 heure. bactéries de centrifugeuses à 2400 g pendant 3 min et remettre en suspension le culot dans 200 pi de LB.
   4. Répartir les bactéries transformées sur une boîte de Petri revêtue de LB-agarose et l'antibiotique correspondant. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C.
   5. Enfin, la collecte 5-10 bactecolonies Rial et culture de la nuit à 37 ° C dans 5 ml de milieu LB avec antibiotiques.
   6. On purifie l'ADN plasmidique en utilisant un kit de mini-plasmide d'ADN selon les instructions du fabricant. Effectuer une restriction de diagnostic digérer pour vérifier la bonne intégration de l'insert dans le vecteur et soumettre clones positifs pour le séquençage de l'ADN afin d'assurer la bonne orientation de l'insert.
10. Sélectionnez les colonies correctes et intensifier la production d'ADN en utilisant une haute qualité, endotoxine libre kit de préparation de plasmide.
11. Eluer l'ADN dans de l'eau stérile ou 1 mM de Tris-HCl. ADN Conserver à -20 ° C jusqu'au moment de injecter dans les nouveau-nés.

2. intra-ventriculaires néonatales Injections

1. Trois à quatre semaines avant d'expérimenter, mettre en place un élevage cage de souris avec un mâle et une souris femelle, et un igloo de plastique coloré. Ceci fournit un environnement enrichi et facilite le processus d'accouplement.
2. Lorsque la grossesse est confirmée, retirez le male à une nouvelle cage. Dix-huit jours après l'accouplement, surveiller cage tous les jours pour la livraison. Effectuer injections intraventriculaire jours après la naissance 1 (P1).
3. Préparation de la solution d'injection
   REMARQUE: La solution d'injection est préparée en mélangeant l'ADN plasmidique avec le réactif de transfection pour créer des particules pour la transfection. Voici un exemple sur la préparation d'une solution d'injection à l'aide d'un plasmide codant pour la transposase Sleeping Beauty et la luciférase: pT2 / SB100x-Luc et deux plasmides de transposons: PT / CAGGS-NRASV12 et Pt / CMV-SV40-LGT, dans un rapport de 1: 2: 2. Tous les plasmides ont une concentration de 2 ug / ul. Des détails importants sur la préparation de la solution d'injection sont présentées dans l'analyse.
   1. Préparer la solution d'ADN en ajoutant: 4 ug (2 pi) de pT2 / SB100x-Luc, 8 pg (4 pi) de Pt / CAGGS-NRASV12 et 8 pg (4 pi) du Pt / CMV-SV40-LGT et 10 pi de glucose à 10% à un volume final de 20 ul à une concentration de 1 ug / mlADN et 5% de glucose.
   2. Préparer la solution par addition de PEI 2,8 ul de jet PEI in vivo, 7,2 ul d'eau stérile et 10 ul de 10% de glucose à une concentration finale de 5% de glucose.
   3. Ajouter la solution de PEI à la solution d'ADN, mélanger et vortex et laisser reposer à température ambiante (RT) pendant 20 min. La solution est maintenant prête pour l'injection. Après une heure à température ambiante, maintenir la solution sur de la glace.
   4. Monter une seringue propre de 10 pi équipé d'une aiguille hypodermique de calibre 30 avec 12,5 ° biseau dans la micropompe (Figure 2 # 1).
4. Pour vérifier le bon fonctionnement du système d'injection, utiliser l'injecteur automatique (Figure 2 # 1) de retirer 10 ul d'eau dans la seringue, puis vider la seringue complètement
5. Refroidir le stade néonatal stéréotaxique (Figure 2 # 3) avec une suspension de neige carbonique et d'alcool à une température de 2-8 ° C.
6. Induire une anesthésie en plaçant les petits sur la glace mouilléependant 2 min. Anesthésie continuera sur le cadre stéréotaxique réfrigérés pour le reste de la procédure. Le maintien de la température du cadre-dessus de zéro, entre 2-8 ° C permettra d'éviter les brûlures thermiques. Comme chiots de précaution spéciale peuvent être enveloppés dans de la gaze avant de placer sur de la glace.
7. Remplir la seringue avec la solution ADN / PEI.
8. Immobiliser le chiot dans le cadre stéréotaxique en plaçant sa tête entre les barreaux de l'oreille de gaze couvert (Figure 2b). Se assurer que la face dorsale du crâne est horizontal, parallèle à la surface du cadre et que les sutures crâniennes sont clairement visibles. Essuyez la tête avec 70% d'éthanol.
9. Abaissez l'aiguille de la seringue et ajuster coordonnées stéréotaxiques utilisant cadrans du cadre stéréotaxique ce que l'aiguille touche le lambda (l'intersection de la ligne médiane du pariétal et occipital) (Figure 2b).
10. Soulevez l'aiguille et ajuster coordonnées stéréotaxiques à 0,8 mm latéral et 1,5 mm rostral au lambda (figure 2b).
11. Abaissez l'aiguille jusqu'à ce qu'elle touche et fossettes légèrement la peau. Mesurer les coordonnées. Abaissez l'aiguille encore 1,5 mm. L'aiguille risque de transpercer la peau et le crâne, et passer à travers le cortex pour entrer dans le ventricule latéral (figure 2c).
12. Utilisation de l'injecteur automatique, injecter 0,75 ul de la solution d'ADN / PEI à un débit de 0,5 ul / min
13. Gardez le chiot sur le cadre pour une autre minute pour permettre la solution de se disperser dans les ventricules. Dans l'intervalle, anesthésier un autre chiot, sur de la glace pendant 2 minutes pour préparer l'injection suivante.
14. Doucement et lentement soulever l'aiguille, et placez le chiot sous une lampe chauffante. Surveiller la respiration et de l'activité. Si nécessaire, fournir une stimulation douce des membres jusqu'à la première respiration se ensuit.
15. Retour le chiot à sa mère après qu'il se est réchauffé, a atteint une couleur rose, respire régulièrement et est actif, normalement 5-7 min. Si more d'un chiot est injecté à la fois, garder tous les chiots ensemble jusqu'à ce que toutes les injections sont faites. Si injections prennent plus de temps de 30 min, retourner la moitié des petits après les 30 premières minutes et le reste à la fin de la procédure.
16. Surveiller que le barrage est sensible et stimulant à ses chiots. Si nécessaire, ajouter une maman de substitution à la cage.
17. Assurez-vous que l'intervalle entre plaçant le chiot sur la glace et en la plaçant sous la lampe chauffante est inférieure à 10 min. Le plus rapide la procédure meilleure est la survie. Habituellement, le temps nécessaire pour anesthésier et injecter un chiot est de 4 min.

3. La bioluminescence le suivi des tumeurs formation et la progression

3.1) Surveillance plasmide Absorption Après injection

1. 24-72 h après l'injection, retirez tous les chiots de la cage et la place de la mère dans un six puits propre boîte de culture de tissu, un seul petit par puits.
2. Préparer une solution à 30 mg / ml de luciférine dissous dans une solution saline normale ou phosphate tampon. Préparer cette solution à l'avance et de garder en petites aliquotes à -20 ° C.
3. En utilisant une seringue de 1 ml munie d'une aiguille hypodermique de calibre 30 injecter 30 pl de luciférine voie sous-cutanée entre les omoplates du chiot. Assurez-vous que l'aiguille ne perce pas tous les organes, en pinçant la peau et en le soulevant légèrement avant d'insérer l'aiguille.
4. Photo immédiatement, en utilisant un système d'imagerie in vivo de bioluminescence dans. Pour le spectre IVIS, utilisez les paramètres suivants pour les acquisitions: exposition automatique, binning grande, et l'ouverture f = 1.

3.2) Formation surveillance et la progression tumorale

REMARQUE: Les animaux commencent à se former des tumeurs macroscopiques détectables par bioluminescence et l'histologie dans les 2½-six semaines, selon les plasmides oncogènes injectés.

1. En utilisant une seringue de 1 ml munie d'une aiguille de calibre 26 injecter 100 ul d'une / ml solution de 30 mg de luciférine intra-péritonéale.
2. Placer l'animal dans la chambre d'anesthésie. Injecter un maximum de cinq animaux en même temps.
3. Attendre 5 min, puis démarrer le flux d'oxygène / isoflurane (1.5 à 2.5% d'isoflurane) pour anesthésier les animaux. Après 3-4 min, retirer les animaux de la chambre de l'anesthésie, démarrer le flux d'oxygène / isoflurane dans la chambre de bioluminescence. Placez les animaux dans les fentes respectives équipées de cônes de nez du verre pour permettre un passage non obstrué anesthésie et de la lumière.
4. Typiquement, l'acquisition d'une série de 6 images, à intervalles de 2 min avec un temps d'exposition automatique, binning médiane et une ouverture ouverte de f = 1.
5. Définir la région d'intérêt pour tous les animaux imagées, typiquement un ovale sur la région de la tête, et de mesurer l'intensité de luminescence en utilisant les unités photons calibrés / s / cm ² / sr.
6. Notez la valeur maximale pour chaque animal. Par la suite, les enregistrements peuvent être comparées au cours de la progression de la tumeur pour chaque animal et / ou entre les animaux, par exemple WHEn différents traitements sont employés.

4. histologique et immunohistochimique Analyse de la Nouvelle-GBM

REMARQUE: Lorsque les tumeurs ont atteint le expérimentale point de temps désiré, les animaux peuvent être sacrifiés, perfusés cerveaux, fixes et analysées. Pour les analyses de survie au stade moribond représente le critère de l'expérience, lorsque les animaux sont sacrifiés humainement dès les premiers signes de la charge tumorale, tel que défini par le stade clinique lorsque l'animal devient symptomatique démontrant une mobilité réduite, une posture voûtée et la fourrure miteuse. Une brève description des méthodes histologiques et immunohistochimiques standard utilisés est présenté ci-dessous.

4.1) Fixation de perfusion et

1. Anesthésier la souris par une injection intra-péritonéale de 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine.
2. Vérifier le réflexe de pédale en pinçant le pied de la souris. Lorsque ce réflexe est aboli, indiquant anesthésie profonde, immobilize la souris sur une planche de dissection avec des épingles, ouvrir la cavité abdominale, disséquer le diaphragme et ouvrir la cavité thoracique de visualiser le coeur.
3. Insérez une canule de calibre 20 émoussée dans le ventricule gauche du cœur. Connectez la canule avec des tubes en plastique en passant par une pompe péristaltique dans un récipient avec une solution oxygénée et héparine de Tyrode (NaCl à 0,8%, 0,0264% _CaCl2 2H ₂ O, 0,005% de NaH ₂ PO _4, 0,1% de glucose, 0,1% NaHCO _3, 0,02 % KCl). Démarrer l'écoulement de la solution de Tyrode en ajustant la vitesse de la pompe péristaltique afin d'assurer un écoulement lent et constant, à environ une goutte par seconde ou moins si les animaux sont plus petites.
4. Faire une petite incision dans l'oreillette droite du cœur pour permettre la fuite de sang et de Tyrode.
5. Surveiller l'efficacité de perfusion par l'observation de blanchiment d'organes internes (plus évidents dans le foie et les reins) dès qu'ils sont dépourvus de sang.
6. Lorsque lesolution vidange du cœur est clair (3-5 min), passer les solutions de Tyrode à 4% de paraformaldéhyde pour la fixation (4% PFA, pH 7,34 en tampon phosphate salin).
7. Contrôler la bonne fixation des tissus par la rigidité accrue du cou et de la queue.
8. Décapiter la souris et disséquer soigneusement le cerveau du crâne.
   1. Tirez la fourrure qui couvre le crâne rostralement, vers le nez, et de saisir fermement à stabiliser la tête, dorsale vers le haut.
   2. Avec un scalpel aiguisé, couper vers le bas le long du bord de l'orbite, à sectionner les muscles orbitaux et les arcades zygomatiques sous-jacents.
   3. Tourner la tête face ventrale et enlever les muscles du cou attaché à l'aide d'un rongeur. Écraser la première vertèbre et le retirer de le tronc cérébral.
   4. Visualisez la cochlée, saisir l'os temporal recouvrant avec le rongeur et de créer une ouverture entre l'os temporal et occipital. Décoller l'os occipital de la surface du cervelet.
   5. Tournez la tête ventrale vers le haut. Le cerveau va glisser vers le bas du reste du crâne, connecté maintenant uniquement par les nerfs crâniens. Utilisation de petits ciseaux coupent le olfactif, optique et nerfs trijumeau. Cela libérera le cerveau.
9. Placez cerveau dans 4% PFA nuit à 4 ° C pour la post-fixation.
10. Pour l'analyse histologique et hématoxyline-éosine, transférer les cerveaux de tampon phosphate pendant 24 heures, puis procéder à l'inclusion en paraffine.
11. Pour l'analyse immuno-histologique, transférer cerveau dans une solution de saccharose à 30% dans une solution saline tamponnée au phosphate pour 24 à 48 h (jusqu'à ce que le cerveau se déposent au fond du tube)
12. Section cerveaux moitié par le milieu de la région de la tumeur, placent la coupevers le bas dans un moule de congélation, intégrer dans les milieux de cryo-enrobage (OCT composé), et le flash-gel dans une suspension d'éthanol de glace sèche, isopentane glace sèche ou dans l'azote liquide. Gardez blocs congelés à -80 ° C jusqu'à ce que la coupe et la coloration.

4.2) Brains d'analyse de intrinsèque GBM Histo-pathologique hématoxyline-éosine de inclus en paraffine

1. Section inclus en paraffine cerveaux à 4 um d'épaisseur, déposer dans un bain-marie à 42 ° et le monter sur des lames de verre.
2. De paraffinize-lames en les plaçant pendant 10 min dans un four à 60 ° C, puis de les transférer à intervalles de 5 min à travers une série de trois récipients remplis de diapositives avec du xylene.
3. Hydrater les diapositives à travers une série de bains d'éthanol: l'éthanol 100% pendant 2 min, répéter une fois, 95% d'éthanol pendant 2 min, répéter une fois, 70% d'éthanol pendant 2 min puis transférer diapositives à l'eau.
4. Colorer les lames en les trempant dans un récipient rempli de glissement avec l'hématoxyline de Harris pendant 2 min.
5. Rincer à l'eau du robinet jusqu'à l'eau est claire.
6. Tremper les lames deux fois dans une solution de bleuissement (0,1% de bicarbonate de sodium).
7. Laissez diapositives sont dans l'eau du robinet pendant 2 min, puis transfert à l'éthanol à 80% pendant 2 min.
8. Colorer les lames en les trempant dans un récipient rempli d'éosine pendant 5 min.
9. Déshydrater diapositives dans une série de bains d'éthanol (80% d'éthanol 3-4 trempettes, 95% d'éthanol 2 min, répéter une fois, 100% d'éthanol 2 min, répéter une fois).
10. Effacer avec 3 salles de bains consécutifs de xylène, 3 min chacun.
11. Lamelle avec un milieu de montage à base de xylène et laisser sécher sur une surface plane à la température ambiante avant d'être prêt pour l'imagerie. Entreposer à la température ambiante.

4.3) Immuno-histochimie de Brains embarqués Cryo-préservés pour la caractérisation moléculaire et cellulaire de De Novo induite GBM

1. Récupérer blocs congelés de la C de stockage -80 °, placer dans cryostat et permettent des températures se équilibrer pendant 30 min.
2. Section 12-14 Um sections épaisses et montage 2-3 sections sur des lames de verre chargées positivement. Couper des sections en série, en recueillant des sections adjacentes sur différentes diapositives. Cela permet à la coloration avec des anticorps différents sur des coupes de tissus adjacents à l'intérieur de la tumeur.
3. Diapositives sécher dans un dessiccateur pendant au moins 1 heure après la coupe pour permettre une bonne adhérence du tissu.
4. Créer une barrière hydrophobe (avec un marqueur hydrophobe) à chaque extrémité de la lame pour permettre de liquide pour recouvrir les sections et de rester sur la diapositive pendant les lavages. Couvrir les sections avec une solution de saline tamponnée au phosphate avec 0,1% de Triton-X (PBS 0,1% Tx) et agiter doucement pendant 5 min sur un agitateur horizontal pour perméabiliser le tissu. Répéter deux fois.
5. Bloquer la liaison non spécifique avec une solution de 10% de sérum de chèvre normal (ou de sérum provenant de l'animal dans lequel l'anticorps secondaire a été élevée) pendant 30 min en agitant doucement
6. Préparer la solution d'anticorps primaire dans 2% de sérum de chèvre normal dans du PBS 0,1%Tx et pipette la solution sur les sections. Placer les lames dans une chambre humide couvert de l'obscurité et de garder à température ambiante jusqu'au lendemain.
7. Le lendemain, laver sections trois fois pendant 5 min avec du PBS 0,1% Tx et incuber dans l'anticorps secondaire fluorescent dilué dans 2% de sérum de chèvre normal du PBS 0,1% Tx pendant une heure.
8. Lavez sections trois fois pendant 5 min avec du PBS 0,1% Tx, contre-colorer avec un colorant nucléaire (par exemple, DAPI) pendant 2 min, laver une fois de plus, clairement dans l'eau et avec une lamelle à base d'eau milieu de montage qui permettra de préserver la fluorescence. Placer les lames sur une surface plane et laissez-les sécher au moins 24 heures, dans l'obscurité, avant d'être prêt pour l'imagerie. Conserver à 4 ° C par la suite.

5. Génération de lignées cellulaires tumorales primaires présentant des altérations génétiques spécifiques.

1. Pour générer des lignées cellulaires à partir de couchage souris porteuses de tumeurs de beauté sélectionner une souris avec grande tumeur (par bioluminescence 10 ⁷ -10 ⁸ photons / s / cm confirmé2 / sr).
2. Euthanasier la souris avec une surdose d'anesthésique isoflurane, décapiter l'animal et soigneusement disséquer le cerveau du crâne (comme décrit à la section 4). Placez le cerveau dans une boîte de Petri propre.
3. En utilisant une lame de rasoir, faire des coupes coronales antérieure et postérieure à la tumeur. La localisation de la tumeur est généralement reconnaissable du fait de la transparence du cerveau.
4. Disséquer la tumeur, généralement 5-7 mm de diamètre avec une pince fine et placer dans un tube de 1,5 ml remplie avec 300 pi Neural Stem Cell Media (NSC Médias: DMEM / F12 avec B-27 en sus, N2 et Normocin, complétée par EGF et bFGF humain recombinant à une concentration de 20 ng / ml chaque).
5. Homogénéiser doucement la tumeur avec un pilon en plastique, qui se adapte aux parois du tube.
6. Ajouter 1 ml de solution de dissociation des tissus sans enzyme et incuber à 37 ° C pendant 5 min.
7. Faire passer la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 70 pm, laver le filtre avec 10 ml deMédias NSC, centrifuger à 300 g pendant 4 min, surnageant décanter et remettre en suspension plomb dans 7 ml de médias NSC.
8. Plate sur un flacon de culture T25 et culture à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire avec l'atmosphère et de 95% d'air et 5% de CO _2. Après trois jours, certaines cellules sont morts, certains ont adhéré au bas de la boîte de culture, et certains sont neurosphères formant, flottant librement dans les médias.
9. Enlevez ces cellules en suspension et re-plaque sur un flacon de culture de tissu T75.
10. Après trois autres jours de culture, recueillir neurosphères, dissocier, comme décrit dans l'étape 5.6, la souche passoire cellulaire et compter les cellules. Congeler les cellules dans des aliquotes de sérum bovin fœtal 10% de DMSO et les cellules de passage à une densité de un million de cellules dans 14 ml de NSC supplémenté avec de l'EGF et FGF pour un flacon T75. Le taux de croissance dépendra des oncogènes utilisées pour produire des tumeurs. Adapter les conditions de culture cellulaire pour empêcher la prolifération et de maintenir les cellules à densité relativement élevée.

Representative Results

Afin de caractériser les caractéristiques histopathologiques de glioblastomes SB-induites, les souris néonatales C57 / BL6 ont été injectés en P1 avec une luciférase de plasmide codant pour (PT2 / SB100x-Luc) en combinaison avec des plasmides codant pour des transposons avec de l'ADN oncogene, ce est à dire, les ARN (pT / CAGGS -NRASV12) et SV40 LGT (PT / CMVSV40-LGT) (Figure 3c) ou un plasmide codant pour un p53 en épingle à cheveux court avec PDGFβ et un rapporteur GFP (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) en combinaison avec les ARN (Figure 3d). Les animaux ont été surveillés pour la bioluminescence jours après l'injection (figure 2a) et de façon périodique jusqu'à ce qu'il atteigne le stade moribond quand ils ont été euthanasiés. Stade moribond est défini comme le stade clinique lorsque l'animal devient altérée démontrant symptomatique mobilité, la posture voûtée, fourrure miteuse et la perte de poids. Parfois, les animaux développent des convulsions ou des tendances anormales du mouvement, comme la marche et le saut dans les milieux soudaine. A la fin de l'animal d'expérimentations ont été anesthésiés. Les cerveaux ont été perfusés, inclus dans la paraffine, et traitées à l'hématoxyline et à l'éosine. Les données montrent tumeurs présentant les caractéristiques de GBM humaine (OMS classe IV) avec hémorragies (figure 3C), la nécrose de pseudo-pallisading (Figure 3e) et d'invasion périvasculaire et diffuse dans le parenchyme cérébral (figure 3g, f). La formation de pseudopallisades est précédée de la rupture de gros vaisseaux qui fuient glomeruloid avec endothélium (figure 3i) qui en résultent dans les régions d'hémorragie avec une infiltration massive de cellules mononucléées (figure 3h). Mitoses atypiques (figure 3j) et les cellules tumorales multinucléées gigantesques (figure 3k) sont également pathognomonique de GBM humain.

Les glioblastomes générée en utilisant le système de transposase Sleeping Beauty peut être surveillé tout au long de la progression de la croissance tumorale avec bioluminescence, si les plasmides injectésencode luciférase. Une expérience d'exemple est représenté sur la figure 4a. Animaux succombent généralement la charge tumorale lors luminescence atteint une intensité de 10 ⁷ -10 ⁹ photons / s / cm ² / SR. La médiane de survie des animaux est prévisible dépend des combinaisons de transposons oncogènes injectées dans le cerveau du nouveau-né, comme l'illustrent les courbes de survie présentées à la figure 4b. Notez que les tumeurs les plus agressives sont induites avec les ARN et l'antigène SV40 LGT (survie médiane de 30 jours), alors que la médiane de survie des animaux avec GBM induites avec shp53 ARN et PDGF est 62,5 jours et des animaux injectés avec shp53 et NRAS 83 jours.

De novo tumeurs formées peuvent être caractérisés immuno-histochimique par leur expression de molécules caractéristiques de tumeurs gliales. La figure 5 montre une tumeur naissante (22 ppp, bioluminescence 2x10 ⁵ photons / s / cm ² / sr), induite avec shp53et les ARN. Le plasmide injecté shp53 code pour la protéine fluorescente verte (GFP) pour permettre l'identification de cellules transfectées et leur progéniture (PT2 / shp53 / GFP). cellules GFP + tumorales expriment la neuronal cellules souches marqueur nestine et certaines cellules GFP + expriment également la protéine gliale fibrillaire acide (GFAP). La figure 6 illustre une tumeur provenant d'un animal moribond à 56 dpi, une tumeur qui a également été induite avec shp53 / GFP et les ARN. Nombreux GFAP + astrocytes entourent la tumeur. cellules GFP + tumorales expriment la nestine, mais pas GFAP.

Un grand avantage pour l'utilisation de cette technique pour induire la GBM est la capacité de générer de nouvelles lignées de cellules de glioblastome avec des altérations génétiques uniques au moyen des transposons injectés. En outre, les lignées cellulaires personnalisées peuvent être générés en utilisant des animaux transgéniques avec constitution génétique spécifique. Ces lignées cellulaires sont essentiels à poser de nombreuses questions mécanistiques utilisant des dosages biochimiques. Ils sont parfaitement adaptés pour des études de cytotoxicité avec roman chagents emotherapeutic. La figure 7 illustre un neurosphère d'une tumeur induite par Sleeping Beauty shp53, PDGF et les ARN, montrant l'expression de la GFP, qui est codé sur un des plasmides injectés. Notez que l'expression ne est pas aussi intense dans toutes les cellules, indiquant la nature hétérogène de ces cellules de glioblastome primaire.

Figure 1: (a) Représentation schématique illustrant le mécanisme "couper et coller" utilisée par la transposase Sleeping Beauty à intégrer transposons dans l'ADN chromosomique de l'hôte Un plasmide donneur de transposon est représenté avec le gène d'intérêt flanqué par les répétitions inversées / répétitions directes. (IR / DR; boîtes flèche rouge) séquences. La transposase SB (vert) se lie à l'IR / DR, excise le transposon et réintègre entre aléatoires TA paires de bases dinucléotide sur l'ADN chromosomique de l'hôte. (B) Exemple de clonageun gène d'intérêt (mPDGFβ) dans le squelette d'un vecteur SB (PKT-IRES-Katushka). Le vecteur SB contient deux IR / DR séquences répétées (en rouge) et une cassette d'expression du gène qui comprend promoteurs et amplificateurs séquences, un site de clonage multiple (MCS; bleu), les sites d'entrée interne des ribosomes (IRES), un marqueur rapporteur fluorescent (Katushka: jaune), et un site de polyadenilation (polyA). L'oncogène d'intérêt (mPDGFβ; orange) est contenu dans un pGEMT vecteur de clonage. L'oncogène, flanquée par des sites de restriction spécifiques (Ncol / Sacl) est libéré par digestion enzymatique, et émoussée par l'enzyme émousser. Le vecteur est linéarisé et émoussé ainsi. Enfin, l'oncogène mPDGFβ est inséré dans le vecteur donneur au moyen d'une réaction de ligature émoussée de gamme pour générer le nouveau plasmide vecteur de transposon:. PKT-mPDGFβ-IRES-Katushka Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande of ce chiffre.

Figure 2: Installation expérimentale et guides pour les injections intra ventriculaires chez les souris néonatales (a) Un cadre stéréotaxique (2) avec des cadrans micrométriques est équipé d'un injecteur automatique tenant une seringue de 10 pi (4). L'intérieur du cadre en U, un cadre d'adaptation néonatale est solidement fixé (3). Le panneau de l'injecteur automatique (1) de commande permet la sélection précise de la seringue, le volume et le débit (b) Photographie d'une souris néonatale (P1) avec une aiguille insérée dans les coordonnées nécessaires pour les injections dans le ventricule latéral: 1,5. mm et 0,8 mm ventral latéral à la lambda. (c) Illustration d'une section coronale à travers le cerveau d'une souris néonatale (P1) en soulignant les dimensions et la position relative des ventricules.

Figure 3: Les tumeurs induites avec le Sleeping système de transposon Beauté montrent les caractéristiques histologiques GBM (a) image humaine de bioluminescence d'un néonatale chiot 24 heures de après l'injection intraventriculaire avec des plasmides codant NRAS, SV40 LGT (b) image de bioluminescence d'un animal adulte (. 50 dpi) avec une grosse tumeur induite par shp53 ARN et PDGF. (c) hématoxiline éosine d'une section coronale d'un cerveau d'une souris moribonde avec une tumeur induite avec les ARN et LGT (28 dpi). (d) Coupe coronale d'un cerveau d'une souris moribonde avec une tumeur induit avec shp53 ARN et PDGF. (e) la nécrose Pseudopalisading, caractéristique histologique de GBM humaine est observée dans de novo tumeurs générées. La flèche pointe vers des cellules disposées en palissades migration loin de la zone centrale de la nécrose (N) (f) et (g) de novo généré tumeurs sont très envahissantes, montrant l'invasion le long des vaisseaux sanguins (g) et diffuse (f) dans le parenchyme cérébral normal. (H) Région de l'hémorragie avec invasion massive de cellules mononucléaires (flèche), l'étape initiale d'un espace de pseudopalisading nécrose. (I) Grand navire glomeruloid avec l'endothélium qui fuit (flèche) à l'origine de l'hémorragie de diffusion à l'intérieur d'une tumeur induite par NRAS et -LgT SV40. (j) de la mitose atypiques dans des cellules tumorales (tête de flèche). (k) de la cellule géante de la tumeur avec de grands noyaux multiples (tête de flèche).

Figure 4: les animaux portant une tumeur peuvent être surveillés avec la bioluminescence pendant toute la durée de progression de la maladie. La médiane de survie des animaux est prédit par la combinaison deoncogène ADN injecté. (A) Exemple de traces bioluminescents d'une cohorte de sept souris C57 / BL6. Notez que les souris succombent environ une semaine après la bioluminescence atteint 10 ⁸ photons / s / cm2 / sr. (B) courbes de survie de l'échantillon de comparaison médiane de survie des animaux avec Sleeping Beauty tumeurs générées avec différentes combinaisons de plasmide. La médiane de survie des tumeurs induites avec les ARN et SV40 LGT est 30 dpi alors que d'animaux atteints de tumeurs induites par le shp53 ARN et PDGF ou shp53 et les ARN est 62,5 ppp ou dpi 83 respectivement. dpi: jours après l'injection.

Figure 5: Nascent macroscopique GBM (22 dpi) induite par shp53 et les ARN montrent expression de la nestine et GFAP dans GFP + tumorales cellules (micrographies confocales) Groupe (a) montre une tumeur naissante exprimant la GFP.. Panneau (b) représente le même champ montrant l'expression de la nestine. Panneau (a) et (b) illustrant la co-localisation de la GFP et de la nestine. (D) de l'expression de GFP dans les cellules tumorales. (E) d'expression de la GFAP dans certaines cellules tumorales et dans les cellules entourant la tumeur naissante. (F) de projection de superposition (d) et (e) illustrant certaines cellules tumorales (blanc) co-exprimant GFAP et GFP. Barres d'échelle dans (a) et (d) représentent 75 um.

Figure 6: GBM induite avec shp53, ARN et PDGF à partir d'un animal moribond (56 dpi) montrant GFP et expression de la nestine dans les cellules tumorales et la coloration abondante pour la GFAP marqueur glial arboré qui entoure la tumeur Groupe (a) représente Nissl tache de l'article acoronal. à travers le cerveau d'un animal moribond avec une tumeur (bleu intense coloration from cellularité accrue) induite avec le système de Sleeping Beauty transposon utilisant shp53, PDGFΒ et les ARN. Panneau (b), une section coronaire adjacent à celui illustré dans la partie (a) colorées avec le colorant nucléaire DAPI, montrant l'expression de la GFP dans les cellules tumorales. Panneau (c) représente une micrographie confocale de la frontière de la tumeur montrant l'expression de la GFP dans la tumeur, identifié par la forte densité nucléaire au DAPI. Panneau (d) illustre le même champ de vision que dans (a), montrant l'expression de la GFAP intense dans les cellules adjacentes à la tumeur. Panneau (e) représente la superposition de panneaux (c) et (d). Panneau (f) est une micrographie par microscopie confocale de la frontière de la tumeur, montrant l'expression de la GFP dans les cellules tumorales. Panneau (g) représente le même champ de vision que dans (f), montrant l'expression de la nestine dans les cellules tumorales. Panneau (h) est la projection de recouvrement de panneaux (f) et (g)

Figure 7:. Neurosphères d'une tumeur induite par Sleeping Beauty shp53, PDGF et NRAS après 5 jours de culture, le passage 2. Les cellules expriment la GFP codé sur le plasmide shp53 PDGF (pT2shp53 / GFP4 / mPDGF β) Groupe (a) est une micrographie d'un fond clair neurosphère. Panneau (b) représente une micrographie épi-fluorescence de la même vue que (a) montrant l'expression de la GFP dans les cellules de neurosphères. Panneau (c) représente la superposition des panneaux (a) et (b).

Discussion

Dans cet article, nous détaillons une méthode polyvalente et reproductible pour générer de nouveaux modèles de GBM à l'aide intégration SB transposase- médiation d'ADN plasmidique oncogène dans les cellules entourant la zone sous-ventriculaire de souris néonatales. Nous présentons un protocole pour générer des plasmides de transposons avec de nouveaux gènes d'intérêt, illustrons comment surveiller la progression des tumeurs chez les animaux vivants, et comment caractériser caractéristiques histopathologiques et immuno-histochimique de ces tumeurs.

Comme notre laboratoire (Figure 3) et d'autres ¹³ ont montré, ce modèle crée de manière fiable les tumeurs avec les principales caractéristiques de GBM humaine, y compris (1) pseudo-palissade nécrose, (2) la prolifération vasculaire, (3) atypies nucléaires, (4) mitoses anormales et ( 5) périvasculaire et l'invasion diffuse. L'utilisation de souris néonatale est optimale d'un point de vue logistique, prévoyant une procédure technique relativement facile avec un équipement minimal et de soidation de temps / de récupération, ce qui permet pour la production rapide de grandes tailles de tumeurs avec des altérations génétiques spécifiques de l'échantillon. Ces tumeurs causent animaux succombent à la charge tumorale avec une médiane de survie prévisible dépend des altérations génétiques induites. Enfin, le modèle SB a été utilisé comme un écran d'intervention thérapeutique pour ²⁴ réponse au traitement.

Il ya plusieurs facteurs importants à considérer lors de la préparation des solutions utilisées pour les injections néonatales. solutions d'ADN doivent être stériles, et l'endotoxine libre concentré (7.2 ug / ul) pour permettre des injections de volume minimal. Le rapport optimal des résidus d'azote dans la polyéthylèneimine (PEI) pour les résidus phosphate dans l'ADN (N ratio / P) est de 7. Ceci assure la formation de complexes de particules chargées positivement qui se lieront groupements anioniques sur la surface des cellules et sera endocytose. Une fois dans le cytoplasme, l'afflux osmotique entraîne les particules éclatent et libèrent de l'encapsulated ADN plasmidique. La solution in vivo jet-PEI a une concentration de 150 mM, exprimée en résidus d'azote. Étant donné qu'un pg d'ADN a 3 nmol de phosphate anionique, la quantité de réactif nécessaire peut être calculé avec la formule de transfection:

pi de vivo en jet-PEI = [(x pg d'ADN 3) x rapport N / P] / 150.

Par exemple, pour préparer 40 pi d'/ solution d'ADN de 0,5 ug ul avec un rapport N / P de 7, 20 pg d'ADN sont nécessaires. Le volume de PEI nécessaire sera de 20 * 3 * 7/150 = 2,8 pi.

Jusqu'à cinq plasmides différents peuvent être injectés simultanément. Les expériences présentées ici offrent la transposase Sleeping Beauty en trans sur un plasmide qui code aussi luciférase (SBLuc). Comme mentionné dans l'introduction, le rapport des molécules de transposase de transposons est important pour assurer une transposition optimale. Le rapport optimal (établie empiriquement) du plasmide SB100x à l'transpOson ADN plasmidique est de 1: 4. Par conséquent, si l'on utilise deux plasmides de transposon différentes T1 et T2, par exemple, le rapport de SBLuc: T1: T2 sera de 1: 2: 2; ou pour un total de 20 pg d'ADN dans une solution à 40 ug de 4 ul SBLuc seront mélangés avec 8 pg de T1 et T2 de 8 pg. Pour trois transposon différents plasmides le rapport sera SBLuc: T1: T2: T3 = 1: 1,33: 1,33: 1,33 et pendant quatre transposons: 1: 1: 1: 1: 1.

Il est utile de vérifier la fixation de l'ADN plasmidique par bioluminescence de 24 à 72 h après l'injection. Étant donné que les animaux grandissent, augmentation de la densité optique de la fourrure, de la peau, du crâne et du cerveau, empêche le suivi de la progression de la tumeur jusqu'à ce que la tumeur a atteint une taille de seuil, plus ou moins 2.1 mm ³ pour les souris C57BL6 pigmentation foncée. Une meilleure transmission de la lumière est possible chez ces souris si leur fourrure est rasée, ou lorsque vous utilisez la souris avec du blanc ou pas de fourrure.

Plusieurs limites doivent être considérées lors de l'utilisation de ce modèle. Premièrement, le gènetic matériau introduit par les plasmides injectés peut être intégré de manière aléatoire dans le génome de l'hôte dans des endroits différents, le nombre de copies. Cela peut conduire à une variabilité entre les cellules tumorales et les tumeurs. Deuxièmement, l'ADN introduit est inséré principalement dans introniques séquences répétées de l'ADN TA ^25, cependant, la possibilité d'interférence avec le codage ADN génomique hôte reste. Troisièmement, les injections intraventriculaires peuvent causer une petite mais persistante taux de hydrocéphalie chez les jeunes souris, qui devient cliniquement visible et symptomatique dans le troisième-quatrième semaine de vie. Certaines souches de souris sont plus susceptibles que d'autres de l'hydrocéphalie (c.-C57 / BL6 plus de FVB). Pour minimiser le risque d'induire une hydrocéphalie, il est recommandé d'injecter un volume aussi faible que possible (moins de 1 pi chez les souris C57 / BL6), pour se assurer que les aiguilles sont tranchantes, les solutions ont une faible salinité et de fournir des chiots en croissance avec aliments enrichis, afin de permettre l'ossification en temps opportun du bon du crânees. Enfin, les tumeurs à un stade avancé développent souvent une nécrose, qui doit être considéré lors de la surveillance des souris par bioluminescence. Une lecture inférieure peut indiquer une tumeur avancée avec de grandes zones de nécrose et pas nécessairement une résolution de la tumeur à la suite du traitement. En fin de compte, l'analyse histologique reste l'étalon-or pour évaluer la progression tumorale.

L'avènement de la totalité de la tumeur séquençage du génome au cours des dernières années a ouvert la porte à l'exploration du rôle des gènes mutés dans récurrente GBM. Le modèle Sleeping Beauty est optimale pour la validation des oncogènes potentiels ou des suppresseurs de tumeurs. Comme dans l'exemple donné dans ce papier avec ligand PDGFβ, clonage de la séquence d'ADNc de la souris d'un oncogène candidat dans un SB squelette plasmidique établie conduira à une expression constitutive dans les cellules transfectées. Évaluation du rôle de suppresseurs de tumeur peut être efficacement réalisée par clonage dans le squelette du plasmide avec SB séquences candidates, (available par exemple dans la base de données codex ARNi ^26), pour créer une expression robuste de deuxième génération miR courts-épingles à cheveux.

Un débat actuel dans le domaine de la recherche GBM est liée à l'identité de l'origine des cellules-of. Il a été démontré récemment que des souris, les tumeurs induites par régulation de p53 et Nf1 dans des cellules souches neurales, proviennent de cellules précurseurs d'oligodendrocytes ^27. En utilisant le modèle de Sleeping Beauty transposon, des études similaires peuvent être conçus pour tester si d'autres altérations génétiques cibler préférentiellement les autres populations de cellules souches / cellules précurseurs pour générer GBM. Connaissance de ces études permettra d'améliorer grandement notre compréhension de GBM étiologie et fournir des pistes pour de nouvelles approches thérapeutiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors	Stoelting	51670	Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Injections can be made without it, ,but    the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience
10 μl 700 series hand fitted MICROLITER syringe	Hamilton	Model 701	This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used
30 gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel)	Hamilton	S/O# 197462	This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced.
in vivo-jetPEI	Polyplus Transfection	201-10G	Aliquot in small volumes and keep at -20 oC
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio.com	LuckK-1g	Other sources of firefly lucifierase are just as adequate
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich	HHS128-4L
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Electron Microscopy Sciences	62550-01	For embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry
Advanced DMEM/F-12, no glutamine	Life Technologies	12634-010	For the culture of neurospheres
B-27¨ Supplement (50X), serum free	Life Technologies	17504-044	Serum free supplement for the culture of neurospheres
N2 Supplement (100x)	Life Technologies	17502-048	Serum free supplement for the culture of neurospheres
Normocyn	InvivoGen	ant-nr-1	Anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres
Recombinant Human EGF	PEPROTECH	AF-100-15	Growth factor supplement for the culture of  neurospheres
Recombinant Human FGF-basic	PEPROTECH	100-18B	Growth factor supplement for the culture of  neurospheres

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone HyQTase  Cell Detachment Reagent	Thermo Scientific	SV3003001	For the dissociation of neurospheres
Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749510-0590	For the dissociation of freshly dissected tumors
Falcon Cell Strainers mesh size 70 um	Fisher Scientific	08-771-2	For generating single cell suspensions of dissociated neurospheres
Xylenes Histological grade	Fisher Scientific	C8H10
Protocol Harris Hematoxylin Mercury free (acidified)	Fisher Scientific	245-678
Protocol Eosyn Y Solution (intensified)	Fisher Scientific	314-631