Introduction
multiforme גליובלסטומה (GBM) הוא (60%) הגידול הנפוץ ביותר העיקרי המוח במבוגרים, עם חציון הישרדות של 15-21 חודשים, כאשר טופל בניתוח, הקרנות, וכימותרפיה 1. טיפולים חדשניים לGBM הם הכרחיים. טיפולים ניסיוניים דורשים בדיקה במודלים של בעלי חיים שכראוי לשחזר את המאפיינים הבולטים של המחלה האנושית. אסטרטגיות כדי לגרום GBM במכרסמים כוללים mutagenesis הכימי עם סוכני אלקילציה, בתאי מין או שינויים גנטיים סומטיים, או השתלה באמצעות תא גליומה קווים 2. הנפוץ ביותר המודלים להעסיק את ההשתלה של שורות תאי גליומה, או orthotopically, למוח או תת עורי באמצעות תאי syngeneic בבעלי חיים עם גנוטיפ הזהה; או תאי xenogeneic, קווים הנפוצים ביותר אדם GBM תא, שהושתלו בעכברים חיסוניים חלש 3. Xenografts מציע יתרונות רבים למחקר של גידולים תוך-גולגולתי: נוחות של שחזור, standaשיעורי rdized צמיחה, זמן של לוקליזציה מוות וגידול. עם זאת, יש לי מודלים אלה מגבלות בשל הגישה המלאכותית, פולשני כירורגי המשמשת להשתלות ויכולת מוגבלת לשחזר במדויק היסטולוגית כולל מאפיין של GBM האנושי (IV הכיתה WHO): נמק פסאודו-pallisading, atypias הגרעיני, פלישה מפוזרת, ריבוי מיקרו-וסקולרית והיווצרות של כלי דם glomeruloid חריגות 4-7. אינדוקציה של GBM על ידי שינוי הגנום של תאים סומטיים עם DNA שעור, או עם וקטורים ויראליים 8-12, או עם שילוב בתיווך transposon 13, מתרבה באופן הדוק יותר אטיולוגיה של מחלות בבני אדם ומשחזרת תכונות histo-פתולוגי של GBM האנושי.
מבחינה הסטורית, גידולים של מערכת העצבים המרכזית שמאורגנים על בסיס התא הנתפס של מקור, שבו נצפה, יהיה גורם מנבא להישרדות 14. GBMs מסווג ליסודי ותיכוני. טוד ראיות המתעורריםאיי מצביע על אופי הטרוגני מאוד של גליובלסטומה העיקרית 15. GBM המשני (15%), כתוצאה משינוי הממאיר של astrocytomas הנמוך כיתה (WHO אני כיתה) וastrocytomas anaplasic (WHO כיתה II), המשויכים תחילת מוקדמת של המחלה, הפרוגנוזה טובה יותר ודפוס "proneural" של ביטוי גנים , ואילו GBM הראשוני (85%) מראה תחילת סוף, הפרוגנוזה וגליה (קלסית) עלובות, עצבית או דפוסי ביטוי mesenchymal. אם דפוסי ביטוי גנים אלה לתאם עם התא בפועל המוצא של הגידול הוא עדיין נחקר באופן פעיל. צבירת נתונים מראה כי השילוב של מוטציות גנטיות הקשורות לGBMs מנבא להישרדות. לדוגמא, אובדן heterozygocity (LOH) של כרומוזומים 1p / 19q, מוטציות IDH1, amplifications PDGFRα, המשויכים GBMs המשני, דפוס ביטוי proneural ופרוגנוזה טובה יותר, ואילו EGFR ביטוי היתר, Notch והפעלת מסלול קיפוד סוניק, NFאובדן ומוטציות של p53 1 וPTEN מתואמים עם עצבי, קלאסי, או GBM הראשוני mesenchymal ופרוגנוזה גרועה 16,17. כניסתו של פרויקטים לקביעת רצף בקנה מידה גדולים וההצטברות של דגימות מטופל רבות זמינות לבדיקה מביאה שפע של מידע החדש ביחס למוטציות גנטיות ומסלולים מעורבים בפתוגנזה GBM והתקדמות והאפשרות של רפואה מותאמת אישית, שבו טיפולים יכולים להיות מותאמים באופן ספציפי ל מומים הגנטיים של המטופל. סופו של דבר, כדי להעריך את הערך המנבא של מוטציות אלה ומסלולים באופן שיטתי, ולבחון טיפולים אפשריים בכל מקרה ומקרה, דורש מודלים של בעלי חיים של GBM עם שינויים גנטיים שנקבע מראש. אינטגרציה בתיווך transposon של הדנ"א הגנומי מציעה גישה אפשרית.
המערכת היפיפייה הנרדמת transposon, חבר Tc1 ספן הכיתה / של transposons, הייתה "מתעורר" (נבנה) בproce רב שלביםss של mutagenesis הספציפי אתר מגן transposase salmonoid, שהפך לפני רדום יותר מ -10 מ'שנים 18,19. בעיקרו של דבר, transposons DNA מוקף רצפים ספציפיים (חוזר הפוך / חזרות ישירות: IR / DR) ניתן לשלב לתוך הגנום באופן "גזור והדבק" באמצעות הפעילות של transposase היפיפה הנרדם. Transposase מכיר את הקצוות של אתרי IR, בולה transposon ומשלב אותו באופן אקראי לאתר DNA אחר בין הבסיסים T ו, בסיסים שישוכפלו בכל קצה של transposon בשכול (איור 1 א). Transposase היפיפה הנרדם מורכב משלושה תחומים, תחום transposon מחייב, רצף לוקליזציה גרעיני ותחום קטליטי. ארבע מולקולות transposase נדרשות להביא את שני קצוות של transposon יחד ולאפשר לשכול, לעומת זאת, אם מולקולות רבות מדי של transposase נמצאות, הם יכולים dimerize וtetramerize לעכבתגובת טרנספוזיציה 20. תגובת טרנספוזיציה יעילה דורשת יחס אופטימלי של transposase לtransposons. DNA קידוד transposase יכול להיות מועבר באותו פלסמיד עם transposon (בcis) או על פלסמיד שונה (בטראנס). כדי להבטיח את היחס האופטימלי בין transposase וtransposons, ניתן לבחור אמרגן עם פעילות מתאימה לביטוי של transposase (למודל "ציס") או היחס של פלסמידים בפתרון ההזרקה יכולה להיות מותאם (ל מודל "טראנס"). מערכת transposon היפיפייה הנרדמת יכולה לשמש בהצלחה לגנומיקה הפונקציונלית, mutagenesis insertional, transgenesis וריפוי גנטי סומטיים 21. להיות מבנה סינטטי מחדש הנדסת מולקולה פונקציונלית מגרסת salmonoid רדומה, transposase היפיפה הנרדם לא להיקשר transposons האחר בבני אדם או יונקים אחרים 20. מאז גילויו, יש הנדסה מולקולרית העשרתed את היעילות של מערכת transposon SB טרנספוזיציה דרך שינויים ברצפי IR ותוספת של dinucleotides TATA איגוף transposon, וכתוצאה מכך transposons pt2. transposons אלה מותאמים מחייב של SB לאתר IR והגדיל את היעילות של כריתה. Transposase SB גם עבר שיפור משמעותי; transposase המשמש בניסויים שהוצגו במסמך זה SB100X, transposase היפראקטיבי שנוצר על ידי אסטרטגית דשדוש DNA ואחריו מסך גנטי בקנה מידה גדולה בתאי יונקים 22.
בדוח זה אנו מציגים שיטה מהירה, תכליתית ושחזור כדי לגרום GBM המהותי בעכברים עם שילוב הלא-נגיפי, בתיווך transposon של פלסמיד דנ"א לתוך תאים של האזור תת-חדרית של עכברי יילודים 23. אנו מציגים דרך פשוטה ליצור transposons עם גני רומן נוח לשילוב הגנומי באמצעות transposase היפיפה הנרדם ומדגים כיצד לפקח על ספיגת פלסמיד והתקדמות מחלה באמצעות פליטת אור. אנחנו גם לאפיין תכונות היסטולוגית והחיסונית histochemical של GBM לשכפל עם המודל הזה. בנוסף, אנו מציגים שיטה מהירה ליצירת שורות תאים ראשוניות GBM מגידולים אלה. המודל היפיפה הנרדם, שבו גידולים הנגרמים מהתאים מקוריים לבעלי החיים, מאפשר הערכה התפקודית של התפקיד של גני GBM מועמד באינדוקציה וההתפתחות של גידולים. מערכת זו גם מתאימה גם לבדיקות של טיפולי GBM רומן, כוללים טיפולים חיסוניים בעכברים חיסוניים מוסמכת, ללא הצורך בניתוחים פולשניים דלקתיים, אשר עשוי לשנות את המיקרו-הסביבה המקומית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הפרוטוקולים של בעלי החיים שאושרו על ידי אוניברסיטת מישיגן הוועדה לשימוש וטיפול של בעלי חיים (UCUCA).
1. שיבוט של הרצף של הריבית לtransposons היפיפה הנרדם החדש
הערה: כדי להכניס גנים או אלמנטים מעכבים (כshRNA) באמצעות מערכת transposase היפיפייה הנרדמת, לשכפל את הרצף של עניין לעמוד השדרה של PKT או פלסמיד pt2. כוון את השיבוט כזה שאלמנטי הרגולציה, גן של עניין וסמנים יישארו מוקף חוזר ההפוך (IR / DR). דוגמא לשיבוט PDGFβ לשדרת PKT המפורטת להלן (ראה גם איור 1).
- לעכל 5 מיקרוגרם של וקטור פלסמיד PKT-IRES-Katushka במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם 5-10 יחידות של אנזימי הגבלת XbaI / XhoI ב -50 μl של נפח תגובה.
- לעכל את cDNA mPDGFβ של 5 מיקרוגרם של פלסמיד pGEM-T-mPDGFβ במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם 5-10 יחידהים של אנזימי הגבלת NcoI / SACI.
- להאיץ את ה- DNA הכולל ידי הוספת 2.5 כרכים של 100% אתנול, ו1/10 נפח של 3 M Na Acetate, pH 5.8 ודגירת הלילה ב -20 ° C.
- צנטריפוגה דגימות ב13800 XG במשך 15 דקות.
- שטוף את כדור DNA עם 500 μl של 70% אתנול, צנטריפוגות ב 13800 XG דקות 1, חזור פעם אחת מחדש להשעות ב -19 μl של מים חופשיים DNase סטרילי.
- בצע את הוראות היצרן במהיר ההקהיה Kit כדי להקהות את הקצוות של שני הווקטורים (PKT-IRES-Katushka) ולהוסיף (mPDGFβ).
- טען את הווקטור הקהה והכנס על 1.2% agarose ג'ל מוכתם ברומיד ethidium ולהפעיל ב 80 V 40 דקות. דמיינו את הלהקות, הבלו עם סכיני גילוח וג'ל נקיים לטהר את ה- DNA באמצעות ערכת טיהור ג'ל על פי הפרוטוקול של היצרן.
- ולקשור DNA להוסיף ווקטור מטוהר בשלב 1.7 על ידי הוספה אותם בצינור ב-4: 1 טוחנת (להוסיף: וקטור). לתוך הצינור, p זהipette 1 μl של האנזים T4 ו- 2 μl של חיץ האנזים T4 (המכיל ATP), ולהתאים את עוצמת הקול עד 20 μl עם מים סטריליים. דגירה תגובת קשירה במשך 18 שעות על 16 מעלות צלזיוס.
- להפוך תאי חיידקי DH5α כימיים מוסמכים עם מוצרי ligated.
- להפשיר את התאים המוסמכים על קרח.
- הוסף את כל הנפח של תגובת קשירת 50 μl של תאים מוסמכים, נער בעדינות את השפופרת והדגירה לערבב על קרח למשך 30 דקות. חום-לזעזע את החיידקים במשך 45 שניות על 42 מעלות צלזיוס ולחזור מייד לקרח; לדגור על קרח לעוד 2 דקות.
- להוסיף 950 μl של וריא מרק לתרבות ולדגירה עם הרועד ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. חיידקי צנטריפוגות ב 2400 XG במשך 3 דקות ומחדש להשעות את גלולה ב200 μl של קילו
- מורחים את החיידקים הופכים על צלחת פטרי המצופה בLB-agarose והאנטיביוטיקה המתאימה. דגירה את צלחת הלילה בשעה 37 ° C.
- לבסוף, לאסוף 5-10 bacteמושבות ריאל ותרבות הלילה בשעה 37 ° C ב 5 מיליליטר של תקשורת LB עם אנטיביוטיקה.
- לטהר DNA פלסמיד באמצעות ערכת מיני פלסמיד דנ"א לפי הוראות יצרן. לבצע הגבלת אבחון לעכל כדי לאמת את ההתאגדות הנכונה של להכניס לתוך הווקטור ולהגיש שיבוטים חיוביים לרצפי DNA על מנת להבטיח את הכיוון הנכון של הכנס.
- בחר המושבות הנכונות ולהרחיב את ייצור ה- DNA באמצעות איכות גבוהה, רעלן פנימי ערכת הכנת פלסמיד חופשית.
- Elute DNA במים סטריליים או 1 מ"מ טריס-HCl. DNA החנות ב -20 ° C עד מוכן להזרים לילודים.
2. Intra-חדרית זריקות ילודים
- שלושה עד ארבעה שבועות לפני הניסוי, להגדיר את כלוב רבייה עכבר עם זכר אחד ונקבה אחת עכבר, ואיגלו פלסטיק צבעוני. זה מספק סביבה מועשרת ומסייע בתהליך ההזדווגות.
- כאשר הריון הוא אישר, להסיר את מ 'אייל לכלוב חדש. שמונה עשרה ימים לאחר ההזדווגות, לפקח כלוב יומי למסירה. לבצע זריקות תוך חדרים ביום הלידה 1 (P1).
- הכנת התמיסה להזרקה
הערה: פתרון ההזרקה נעשה על ידי ערבוב פלסמיד דנ"א עם מגיב transfection ליצור החלקיקים לtransfection. להלן דוגמא על הכנת פתרון הזרקה באמצעות פלסמיד קידוד transposase היפיפה הנרדמת ולוציפראז: pt2 / SB100x-לוק ושני פלסמידים transposon: PT / CAGGS-NRASV12 וPT / CMV-SV40-LGT, ביחס של 1: 2: 2. כל פלסמידים ריכוז של 2 מיקרוגרם / μl. פרטים חשובים על הכנת פתרון ההזרקה מוצגים בדיון.- הכן את פתרון ה- DNA על ידי הוספה: 4 מיקרוגרם (2 μl) של pt2 / SB100x-לוק, 8 מיקרוגרם (4 μl) של PT / CAGGS-NRASV12 ו -8 (μl 4) מיקרוגרם של PT / CMV-SV40-LGT ו -10 μl 10% גלוקוז לנפח סופי של 20 μl בריכוז של 1 מיקרוגרם / מיליליטרDNA וגלוקוז 5%.
- הכן את פתרון PEI על ידי הוספת 2.8 μl של in vivo סילון PEI, 7.2 μl של מים סטריליים, ו -10 μl של גלוקוז 10% לריכוז סופי של גלוקוז 5%.
- מוסיף את פתרון PEI לפתרון ה- DNA, לערבב ומערבולת ולתת לשבת בטמפרטורת חדר (RT) במשך 20 דקות. הפתרון הוא מוכן להזרקה עכשיו. לאחר שעה אחת בRT, לשמור על הפתרון על קרח.
- להתאים מזרק נקי 10 μl מצויד במחט מזרק 30 מד עם 12.5 מעלות פוע לmicropump (איור 2 # 1).
- כדי לוודא תפקוד תקין של מערכת ההזרקה, להשתמש במזרק האוטומטי (איור 2 # 1) למשוך 10 μl מים לתוך המזרק ולאחר מכן רוקן את המזרק לחלוטין
- לקרר את שלב stereotaxic הילוד (איור 2 # 3) עם תערובת נוזלית של קרח יבש ואלכוהול לטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
- לגרום להרדמה על ידי הצבת את הגורים על קרח רטוב2 דקות. ההרדמה תמשיך במסגרת stereotaxic המקורר למשך השארית של ההליך. שמירה על הטמפרטורה של המסגרת מעל לאפס, בין 2-8 מעלות צלזיוס תמנע פציעות לשרוף תרמית. כפי שניתן עטופים בגזת גורי אמצעי זהירות מיוחדת לפני הצבת על קרח רטוב.
- מלא את המזרק עם פתרון ה- DNA / PEI.
- לשתק את הגור במסגרת stereotaxic ידי הצבת ראשו בין סורגי הגזה מכוסות אוזן (איור 2b). ודא שהצד הגבי של הגולגולת הוא אופקי, במקביל למשטח של המסגרת ושתפרי הגולגולת נראה בבירור. נגב את הראש עם 70% אתנול.
- מנמיכים את המחט של המזרק ולהתאים קואורדינטות stereotaxic באמצעות חיוג של מסגרת stereotaxic עד המחט נוגעת למבדה (צומת קו האמצע של הקודקודית ועצמות עורפיות) (איור 2b).
- הרם את המחט ולהתאים את קואורדינטות stereotaxic 0.8 מ"מ לרוחב 1.5 מ 'ומקורי מ 'למבדה (איור 2b).
- מנמיכים את המחט עד שהוא נוגע ומעט גומות בעור. מדוד את הקואורדינטות. מנמיכים את המחט עוד 1.5 מ"מ. המחט לחדור את העור והגולגולת, ועוברת דרך הקליפה להיכנס לחדר לרוחב (איור 2 ג).
- שימוש במזרק האוטומטי, להזריק 0.75 μl של פתרון ה- DNA / PEI בשיעור של 0.5 μl / min
- שמור את הגור במסגרת עוד דקה כדי לאפשר הפתרון לפיזור לתוך החדרים. בינתיים, להרדים גור אחר, על קרח למשך 2 דקות בהכנה להזרקה הבאה.
- בעדינות ולאט לאט להרים את המחט, והנח את הגור תחת מנורת חימום. לפקח נשימה ופעילות. במידת צורך, לספק גירוי עדין של הגפיים עד הנשימה הראשונה מתפתחת.
- להחזיר את הגור לאמו לאחר שהתחמם, הגיע צבע ורוד, הוא נושם באופן קבוע ופעיל, בדרך כלל 5-7 דקות. אם מומחדש מגור אחד מוזרק בכל פעם, לשמור את כל הגורים ביחד עד שכל הזריקות נעשות. אם זריקות להימשך זמן רב יותר מ -30 דקות, לחזור מחצית מהגורים לאחר 30 דקות הראשונות והשאר בסוף ההליך.
- לפקח כי הסכר הוא מגיב וטיפוח לגוריה. במידת צורך, להוסיף את אמא פונדקאית לכלוב.
- ודא שהמרווח בין הצבת הגור על קרח ומניח אותה מתחת לפנס ההתחממות הוא פחות מ -10 דקות. ההליך מהיר יותר ההישרדות. בדרך כלל, הזמן שנדרש כדי להרדים ולהזריק גור הוא 4 דקות.
3. ניטור פליטת אור של היווצרות גידול והתקדמות
3.1) ניטור פלסמיד ספיג לאחר הזרקה
- 24-72 שעות לאחר הזרקה, להסיר את כל הגורים מהכלוב של האמא והמקום בצלחת 6 תרבית רקמה גם נקייה, גור אחד בכל טוב.
- הכן פתרון 30 מ"ג / מיליליטר של luciferin המומס בתמיסת מלח או phosphat רגיליםמאגר דואר. הכן את הפתרון הזה מראש ולשמור בaliquots הקטן ב -20 ° C.
- באמצעות מזרק 1 מיליליטר מצויד במחט מזרק 30 מד להזריק 30 μl של תת-עורית luciferin בין השכמות של הגור. ודא שהמחט לא לנקב כל איברים, על ידי צובט את העור והרמתו מעט לפני החדרת המחט.
- תמונה באופן מיידי, באמצעות vivo מערכת הדמיה פליטת אור ב. לספקטרום IVIS, השתמש בהגדרות הבאות לרכישות: החשיפה אוטומטית, binning הגדולה, וצמצם f = 1.
3.2) היווצרות גידול ניטור והתקדמות
הערה: בעלי חיים יתחילו להרכיב גידולים מקרוסקופית לזיהוי על ידי פליטת אור והיסטולוגיה בתוך ½ 2-6 שבועות, בהתאם לפלסמידים שהעור המוזרקים.
- באמצעות מזרק 1 מיליליטר מצויד במחט 26 מד להזריק של פתרון luciferin 30 מ"ג / מיליליטר 100 μl התוך peritoneally.
- מניחים את החיה בתא ההרדמה. להזריק עד חמישה בעלי חיים באותו הזמן.
- חכה 5 דקות ואז להתחיל את זרימת החמצן / isoflurane (1.5-2.5% isoflurane) כדי להרדים את בעלי החיים. לאחר 3-4 דקות, להסיר את בעלי החיים מחדר ההרדמה, להתחיל את זרימת החמצן / isoflurane בתא פליטת אור. מניחים את החיות במשבצות המתאימות מצוידים בקונוסים האף זכוכית כדי לאפשר להרדמה והמעבר בלא הפרעה של אור.
- בדרך כלל, לרכוש סדרה של 6 תמונות, ב -2 דקות במרווחים עם זמן אוטומטי חשיפה, binning החציון וצמצם פתוח של f = 1.
- הגדר את האזור של עניין לכל החיות הדמיה, בדרך כלל סגלגל על אזור הראש, ולמדוד את עוצמת הארה באמצעות הפוטונים יחידות מכוילים / sr / סנטימטר / s 2.
- רשום את הערך המקסימאלי עבור כל חיה. בהמשך לכך, ניתן להשוות הקלטות במהלך ההתקדמות של הגידול עבור כל חיה ו / או בין בעלי החיים, למשל when טיפולים שונים מועסקים.
4. ניתוח היסטולוגית ואימונוהיסטוכימיים של ניו GBMs
הערה: כאשר הגידולים הגיעו לנקודת זמן הניסוי הרצויה, אפשר להקריב בעלי חיים, מוח perfused, קבוע ונותח. להישרדות מנתח את השלב הגוסס מייצג את נקודת הסיום של הניסוי, כאשר בעלי חיים מוקרבים באנושיות בסימנים הראשונים של נטל גידול, כפי שהוגדרו על ידי השלב הקליני כאשר החיה הופכת את הניידות מראה סימפטומטי לקוי, יציבה כפופה ופרווה מוזנחת. תיאור קצר של השיטות היסטולוגית וחיסוניות histochemical הסטנדרטי המשמשות מוצג להלן.
4.1) זלוף וקיבוע
- להרדים את העכבר עם זריקה תוך הצפק של 100 מ"ג / קילוגרם של קטמין ו -10 מ"ג / קילוגרם של xylazine.
- בדוק את רפלקס הדוושה ידי צובט את הרגל של העכבר. כאשר הרפלקס הזה בוטל, הרדמה עמוקה מצביעה, immobilize את העכבר על קרש חיתוך עם סיכות, לפתוח את חלל הבטן, לנתח את הסרעפת ולפתוח את חלל בית החזה כדי להמחיש את הלב.
- הכנס צינורית 20 מד בוטה לתוך החדר השמאלי של הלב. חבר את הצינורית עם צינורות פלסטיק עוברים דרך משאבת peristaltic למכל עם הפתרון של Tyrode מחומצן וheparinized (0.8% NaCl, .0264% CaCl 2 2H 2 O, 0.005% לאא 2 PO 4, גלוקוז 0.1%, 0.1% 3 NaHCO, 0.02 % KCl). התחל את הזרימה של הפתרון של Tyrode על ידי התאמת המהירות של משאבת peristaltic כדי להבטיח זרימה איטית וקבועה, כ טיפה אחת לשנייה או פחות, אם בעלי החיים הם קטנים יותר.
- לעשות חתך קטן לעלייה הימנית של הלב, כדי לאפשר הניקוז של דם וTyrode של.
- צג יעילות זלוף על ידי התבוננות לבנה לאיברים פנימיים (ברורים ביותר בכבד ובכליות) כאשר הם הופכים נטולי דם.
- כשפתרון ניקוז מהלב הוא ברור (3-5 דקות), לעבור את הפתרונות מTyrode של לparaformaldehyde 4% לקיבוע (4% PFA, pH 7.34 בנאגרו מלוח פוספט).
- צג קיבעון טוב של הרקמות על ידי הקשיחות המוגברת של הצוואר והזנב.
- לערוף את העכבר ולנתח בזהירות את המוח מהגולגולת.
- משוך את הפרווה שמכסה את הגולגולת rostrally, לכיוון האף, ולתפוס אותו בחוזקה כדי לייצב את הראש, צד עד גב.
- באמצעות אזמל חד, לחתוך כלפי מטה לאורך קצה המסלול, ותחצה את השרירים מסלולית והקשתות הזיגומטית הבסיסיות.
- לסובב את הראש כלפי מעלה הגחון ולהסיר את שרירי צוואר מצורפים באמצעות rongeur. לרסק את החוליה הראשונה ולהסיר אותו מגזע המוח.
- דמיין את השבלול, לתפוס את העצם הטמפורלית שמעליה עם rongeur וליצור פתיחה בין העצם הטמפורלית ועורפי. לקלף את העצם העורף מפני שטח של המוח הקטן.
- הפעל צד הגחוני למעלה הראש. המוח יהיה להחליק למטה משאר הגולגולת, מחובר כעת אך ורק דרך עצבי גולגולת. מספריים קטנים באמצעות לחתוך את חוש הריח, ראייה ועצבי trigeminal. זה ישחרר את המוח.
- מניחים מוח PFA 4% בין לילה ב 4 מעלות צלזיוס במשך פוסט-קיבעון.
- לניתוח היסטולוגית וצביעת hematoxylin-eosin, להעביר את המוח לחיץ פוספט למשך 24 שעות ולאחר מכן להמשיך לפרפין הטבעה.
- לניתוח חיסוני היסטולוגית, להעביר את מוח לפתרון סוכרוז 30% בנאגרו מלוח פוספט במשך 24-48 שעות (עד המוח לשקוע לתחתית של התחתית)
- המוח של סעיף במחצית במרכזו של אזור הגידול, למקם את החתךצד למטה לתוך תבנית הקפאה, להטביע לתקשורת הטבעה-cryo (מתחם אוקטובר), ובזק-הקפאה בתרחיף של אתנול קרח יבש, איזופנטאן קרח יבש או בחנקן נוזלי. שמור קפואים בלוקים ב -80 ° C עד חתך וצביעה.
4.2) Hematoxylin-Eosin הכתמה של פרפין Embedded מוח לניתוח HISTO-פתולוגי של הפנימי GBMs
- פרפין סעיף מוטבע מוח בעובי 4 מיקרומטר, לרדת באמבט מים 42 מעלות צלזיוס והר על גבי שקופיות זכוכית.
- שקופיות De-paraffinize ידי הצבת אותם במשך 10 דקות בתנור שC ° 60 ולאחר מכן העביר אותם בשעה 5 דקות במרווחים באמצעות סדרה של שלוש מכולות שקופית מלאות בקסילן.
- מימה השקופיות באמצעות סדרה של אמבטיות אתנול: 100% אתנול למשך 2 דקות, חזור פעם אחת, 95% אתנול למשך 2 דקות, חזור פעם אחת, 70% אתנול למשך 2 דקות ולאחר מכן להעביר שקופיות למים.
- להכתים את השקופיות על ידי טבילתם במכל מלא בשקופיות האריס Hematoxylin עבור 2 דקות.
- יש לשטוף במים ברז עד המים הוא ברורים.
- טובלים מחליק פעמיים לתוך הפתרון מכחיל (0.1% סודיום ביקרבונט).
- בואו שקופיות לעמוד במים ברז למשך 2 דקות, ולאחר מכן להעביר עד 80% אתנול למשך 2 דקות.
- להכתים את השקופיות על ידי טבילתם במכל מלא בEosin במשך 5 דקות.
- מייבשי שקופיות בסדרה של אמבטיות אתנול (מטבלים 3-4 אתנול 80%, 95% אתנול דקות 2, חוזרים פעם אחת, 100% אתנול דקות 2, חוזרים פעם אחת).
- בהיר עם 3 אמבטיות רצופות של קסילן, 3 דקות כל אחד.
- Coverslip עם הרכבה בינונית מבוסס קסילן ולתת להתייבש על משטח שטוח בטמפרטורת חדר עד מוכן להדמיה. אחסן בטמפרטורת חדר.
4.3) חיסונית-היסטוכימיה של השתמר Cryo מוח המשובץ למולקולרי והתאי של אפיון De Novo המושרה GBMs
- אחזר קפואים בלוקים מאחסון -80 מעלות צלזיוס, המקום לתוך cryostat ולאפשר טמפרטורות לאזן למשך 30 דקות.
- סעיף 12-14 סעיפים ועבים מיקרומטר הר 2-3 חלקים על גבי שקופיות זכוכית טעונות חיובי. לחתוך קטעי סדרתי, על ידי איסוף חלקים סמוכים בשקופיות שונות. זה מאפשר צביעה עם נוגדנים שונים בסעיפי רקמות סמוכים בתוך הגידול.
- מגלשות יבשים בתא ייבוש במשך שעה לפחות 1 לאחר חתך כדי לאפשר לדבקות טובה של הרקמה.
- צור מחסום הידרופובי (עם סמן הידרופובי) בכל קצה של השקופית כדי לאפשר לנוזלים כדי לכסות את החלקים ולהישאר על השקופיות במהלך שוטף. מכסה את החלקים עם פתרון של בופר פוספט עם 0.1% Triton-X (PBS 0.1% Tx) ובעדינות לנער במשך 5 דקות על שייקר אופקי לpermeabilize הרקמה. חזור פעמיים.
- לחסום ספציפי מחייב עם פתרון של 10% בסרום נורמלי עז (או סרום מהחיה שבו הנוגדנים משני הועלו) למשך 30 דקות עם רעד עדין
- הכן פתרון נוגדן ראשוני ב 2% עזים בסרום נורמלי בPBS 0.1%Tx ופיפטה הפתרון על הסעיפים. הנח שקופיות בתא לח מכוסה בחושך ולשמור בטמפרטורת חדר למשך לילה.
- למחרת, לשטוף חלקים שלוש פעמים ל5 דקות עם PBS 0.1% Tx דגירה בנוגדנים משני פלורסנט המדולל ב -2% עזים בסרום נורמלי PBS 0.1% Tx לשעה אחת.
- לשטוף חלקים שלוש פעמים ל5 דקות עם PBS 0.1% Tx, counterstain עם כתם גרעיני (למשל, DAPI) למשך 2 דקות, לשטוף פעם נוספת, ברור במים וcoverslip עם מים הרכבה בינונית שישמרו על הקרינה מבוססת. הנח שקופיות על משטח שטוח ולתת להם לרפא לפחות 24 שעות, בחושך, עד מוכן להדמיה. שמור על 4 מעלות צלזיוס לאחר מכן.
5. דור של שורות תאי גידול ראשוני עם שינויים גנטיים ספציפיים.
- כדי ליצור שורות תאים משנת עכברי נושאי גידול יופי לבחור עכבר עם גידול גדול אישר (פליטת אור 10 7 -10 8 פוטונים / s / סנטימטר2 / sr).
- להרדים את העכבר עם מנת יתר של חומר ההרדמה isoflurane, לערוף את החיה ובזהירות לנתח את המוח מהגולגולת (כמפורט בסעיף 4). מניחים את המוח בצלחת פטרי נקייה.
- באמצעות סכין גילוח, להפוך קדמי קיצוצי העטרה ואחורית לגידול. המיקום של הגידול הוא בדרך כלל לזיהוי בשל השקיפות של המוח.
- לנתח את הגידול, בדרך כלל 5-7 מ"מ קוטר עם מלקחיים עדינים ומקום לתוך צינור 1.5 מיליליטר מלא Media תאי גזע עצבי 300 μl (NSC מדיה: DMEM / F12 עם B-27 תוסף, תוסף N2, וNormocin, בתוספת EGF האנושי רקומביננטי וbFGF בריכוז של 20 ng / ml כל אחד).
- בעדינות homogenize גידול עם העלי פלסטיק, אשר מתאים לקירות של הצינור.
- הוסף 1 מיליליטר של תמיסת דיסוציאציה רקמות ללא אנזים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- עובר השעיה תא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר, לשטוף את המסננת עם 10 מיליליטר שלתקשורת NSC, צנטריפוגות ב 300 XG למשך 4 דקות, supernatant למזוג מחדש להשעות גלולה ל7 מיליליטר של תקשורת NSC.
- צלחת על בקבוק תרבות T25 ותרבות על 37 מעלות צלזיוס בחממה רקמת תרבות עם ואווירה של 95% אוויר, 5% CO 2. אחרי 3 ימים, כמה תאים שמתו, כמה דבקו בתחתית צלחת התרבות, וחלקם neurospheres יוצרים, צף בחופשיות בתקשורת.
- הסרת תאים אלה מושעים ומחדש צלחת על בקבוק תרבות רקמת T75.
- אחרי עוד שלושה ימים של תרבות, לאסוף neurospheres, לנתק כמתואר בשלב 5.6, מתח דרך מסננת תא ולספור תאים. להקפיא aliquots של תאים בעובר בסרום שור 10% DMSO ותאי מעבר בצפיפות של מיליון תאים ב 14 מיליליטר של המועצה לביטחון לאומי בתוספת EGF וFGF לבקבוק T75. שיעור הצמיחה יהיה תלוי באונקוגנים המשמשים ליצירת גידולים. להתאים תנאי תרבית תאים, כדי למנוע צמיחת יתר ולשמור על תאים בצפיפות גבוהה יחסית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאפיין תכונות histo-פתולוגי של glioblastomas המושרה SB, עכברים בילוד C57 / BL6 הוזרקו בP1 עם לוציפראז קידוד פלסמיד (pt2 / SB100x-לוק) בשילוב עם פלסמידים קידוד transposons עם DNA שעור, כלומר, NRAS (PT / CAGGS -NRASV12) וSV40 LGT (PT / CMVSV40-LGT) (איור 3c) או קידוד פלסמיד p53 קצר סיכת ראש עם PDGFβ וכתב ה- GFP (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) בשילוב עם NRAS (3D איור). בעלי חיים היו במעקב במשך פליטת אור היום לאחר ההזרקה (איור 2 א) ומעת לעת עד שמגיע לשלב הגוסס כשהם היו מורדמים. שלב גוסס מוגדר כשלב הקליני כאשר החיה הופכת את הניידות מראה סימפטומטי לקוי, יציבה כפופה, פרווה מוזנחת וירידה במשקל. לפעמים, בעלי חיים לפתח התקפים או דפוסים חריגים של תנועה, כמו הליכה במעגלים וקפיצה פתאומית. בסופו של בעלי החיים הניסויים היו מורדם. המוח היה perfused, משובץ בפרפין, ומעובד לhematoxylin והכתים eosin. גידולי תכנית נתונים בו מוצגות סימני ההיכר של GBM האנושי (IV הכיתה WHO) עם דימומים (איור 3c), נמק pallisading-פסאודו (3E איור) ופלישת perivascular והמפוזרת לparenchyma המוח (איור 3G, ו). ההיווצרות של pseudopallisades קדמה הקרע של כלי glomeruloid גדולים עם endothelia הדולף (איור 3i) אשר תוצאת האזורים של דימום עם חדירה מסיבית של תאי mononuclear (3H איור). mitoses לא טיפוסי (איור י 3) ותאי גידול multinucleated ענקיים (איור 3k) הם גם pathognomonic של GBM האנושי.
Glioblastomas נוצר באמצעות מערכת transposase היפיפייה הנרדמת יכול להיות במעקב לאורך ההתקדמות של גידול עם פליטת אור, אם פלסמידים הזריקולוציפראז לקודד. דוגמא לניסוי מוצג באיור 4 א. בעלי חיים בדרך כלל להיכנע של נטל גידול כאשר הארה מגיעה בעוצמה של 10 7 -10 9 פוטונים / 2 / סנטימטר s / SR. חציון ההישרדות של בעלי חיים היא, כצפוי, תלויה בשילובים של transposons שהעור שהוזרק למוח הילוד, כפי שמודגם בעקומות ההישרדות מוצגות באיור 4. שים לב שהגידולים האגרסיביים ביותר מושרה עם NRAS ואנטיגן SV40 LGT (חציון הישרדות של 30 ימים), ואילו חציון ההישרדות של בעלי חיים עם GBM מושרה עם NRAS shp53 וPDGF היא 62.5 ימים ושל בעלי חיים שהוזרקו עם shp53 וNRAS 83 ימים.
דה נובו ניתן לאפיין גידולים נוצרו חיסוני histochemically על ידי הביטוי שלהם מולקולות אופייניות לגידולי גליה. איור 5 מראה גידול המתהווה (22 dpi, פליטת אור 2x10 5 פוטונים / s / סנטימטר 2 / sr), מושרה עם shp53וNRAS. פלסמיד shp53 הזריק מקודד לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כדי לאפשר זיהוי של תאי transfected וצאצאיהם (pt2 / shp53 / GFP). תאי GFP + גידול להביע nestin העצבי תאי גזע הסמן וחלק GFP + תאים גם להביע את החלבון חומצי גליה fibrillary (GFAP). איור 6 ממחיש גידול מחיה גוססת על 56 dpi, גידול שגם היה מושרה עם shp53 / GFP וNRAS. GFAP + האסטרוציטים רבים מקיפים את הגידול. תאי GFP + גידול להביע nestin, אבל לא GFAP.
יתרון גדול בעת השימוש בטכניקה זו כדי לגרום לGBMs הוא היכולת ליצור שורות תאי GBM רומן עם שינויים גנטיים ייחודיים באמצעות transposons המוזרק. בנוסף, יכולות להיות שנוצרו שורות תאים מותאמות אישית באמצעות בעלי חיים מהונדסים עם מבנה גנטי מסוים. שורות תאים אלה סייעו בלשאול שאלות מכניסטית רבות באמצעות מבחני ביוכימיים. הם מתאימים בצורה אידיאלית ללימודי cytotoxicity עם ch הרומןemotherapeutic סוכנים. איור 7 ממחיש neurosphere מגידול יפהפה נרדם מושרה עם shp53, PDGF וNRAS, מראה ביטוי של ה- GFP, אשר מקודד על אחד פלסמידים המוזרקים. הערה הביטוי שאינו אינטנסיבי במידה שווה בכל התאים, המציינת את האופי ההטרוגני של תאי GBM הראשוניים אלה.
איור 1: (א) ייצוג סכמטי הממחיש את מנגנון "גזור והדבק" המשמש את transposase היפיפה הנרדם לשלב transposons לDNA כרומוזומליות מארח פלסמיד transposon תורם מתואר בגן של העניין מוקף חוזרים ההפוך / חזרות ישירות. (IR / DR; קופסות חץ אדומות) רצפים. Transposase SB (הירוק) נקשר לIR / DR, בלה transposon ומשלב מחדש בזה בין זוגות בסיסי dinucleotide אקראיים ת"א על הדנ"א בכרומוזומים מארח. (ב) דוגמא של שיבוטגן של עניין (mPDGFβ) לעמוד השדרה של וקטור SB (PKT-IRES-Katushka). וקטור SB מכיל שני IR / רצפי DR חוזרים (אדום) וקלטת ביטוי גנים הכוללת רצפי אמרגן ומשפר, אתר שיבוט מרובה (MCS; כחול), אתרי כניסת ריבוזומלי פנימיים (IRES), סמן כתב ניאון (Katushka: צהוב), ואתר polyadenilation (פולה). אונקוגן של עניין (mPDGFβ; כתום) כלול בpGEMT וקטור שיבוט. אונקוגן, מוקף אתרי הגבלה ספציפיים (NcoI / SACI) הוא שוחרר על ידי עיכול אנזימטי, והקהה ידי אנזים ההקהיה. וקטור לינארית וקהה, כמו גם. לבסוף, אונקוגן mPDGFβ מוכנס לתוך וקטור התורם באמצעות תגובת קשירה בוטה סוף ליצור וקטור transposon פלסמיד החדש:. PKT-mPDGFβ-IRES-Katushka אנא לחץ כאן לצפייה בo גרסה גדולה יותר f נתון זה.
איור 2: התקנה ניסיונית ומדריכים לזריקות תוך חדרית בעכברים בילוד (א) מסגרת stereotaxic (2) עם חוגות מיקרומטר מצוידים במזרק אוטומטי מחזיק מזרק 10 μl (4). בתוך מסגרת U, מסגרת מתאם ילוד מהודקת (3). לוח הבקרה של המזרק (1) האוטומטי מאפשר בחירה מדויקת של מזרק, היקף וקצב הזרימה (ב) תצלום של עכבר בילוד (P1) עם מחט המוחדרת בקואורדינטות הנדרשות לזריקות לתוך החדר לרוחב:. 1.5 הגחון מ"מ ו- 0.8 מ"מ לרוחב למבדה. אילוסטרציה (ג) לסעיף העטרה דרך המוח של עכבר בילוד (P1) המדגישה את הממדים ומיקום של החדרים יחסית.
e = "תמיד"> 
איור 3: גידולים מושרה עם מערכת transposon היפיפייה הנרדמת להראות סימני ההיכר היסטולוגית של (א) תמונת פליטת אור האנושית GBM של hr גור 24 יילודים לאחר הזרקה תוך-עם פלסמידים קידוד NRAS, SV40 LGT (ב) תמונת פליטת אור של בעלי חיים בוגרים (. 50 dpi) עם גידול גדול מושרה עם NRAS shp53 וPDGF. (). () סעיף Hematoxilin וכתם eosin של סעיף העטרה ממוח של עכבר גוסס עם גידול מושרה עם NRAS וLGT (dpi 28) ג ד עטרה ממוח של עכבר גוסס עם גידול גורם עם shp53 NRAS וPDGF. (ה) נמק Pseudopalisading, סימן היכר היסטולוגית של GBM אדם שנצפה בגידולים שנוצרו דה נובו. חץ מצביע על תאים המסודרים בPalisades הנודד הרחק מהאזור של הנמק (N) המרכזי (ו) ו- (גידולי ז) דה נובו שנוצר הם פולשני מאוד, מראים פלישה לאורך כלי דם (ז) ומפוזר (ו) לparenchyma המוח הנורמלי. אזור של דימום עם פלישה מסיבית של תאי mononuclear (חץ), בשלב הראשוני של שטח נימק pseudopalisading (ח). (I) כלי שיט glomeruloid גדולים עם האנדותל דולף (חץ) במקורו של דימום לשדר בתוך גידול מושרה עם NRAS וSV40 -LgT. (י) מיטוזה לא טיפוסית בתאים סרטניים (ראש חץ). תאי גידול ענקיים עם גרעינים גדולים מרובים (ראש חץ) (k).
ניתן לנטר בעלי חיים גידול נושאות עם פליטת אור בכל משך הזמן להתקדמות מחלה: איור 4. חציון ההישרדות של בעלי חיים שנחזתה על ידי השילוב שלשעור DNA מוזרק. (א) דוגמא של עקבות bioluminescent מקבוצה של 7 C57 עכברי BL6 /. שים לב שעכברים להיכנע כשבוע לאחר פליטת אור מגיעה ל- 10 8 פוטונים / s / סנטימטר 2 / sr. (ב) עקומות הישרדות לדוגמא השוואת חציון הישרדות של בעלי חיים עם גידולי שינה יופי שנוצרו עם שילובים שונים פלסמיד. חציון הישרדות של גידולים מושרה עם NRAS וSV40 LGT היא 30 dpi ואילו של בעלי חיים עם גידולים מושרה עם NRAS shp53 וPDGF או shp53 וNRAS הוא 62.5 dpi או 83 dpi בהתאמה. dpi: ימי הזרקת הודעה.
איור 5: GBM (dpi 22) מקרוסקופית ינוקא מושרה עם shp53 וNRAS להראות ביטוי של nestin וGFAP בתאי GFP + גידול (micrographs confocal) לוח () מראה גידול המתהווה להביע GFP.. לוח (ב) מייצג את אותו שדה המציג ביטוי nestin. לוח
איור 6: GBM מושרה עם shp53, NRAS וPDGF מחיה גוססת (56 dpi) מראה GFP וביטוי nestin בתאי גידול וצביעה בשפע לGFAP סמן גליה הבוגר המקיף את גידול לוח () מייצג כתם Nissl סעיף acoronal. דרך המוח של חיה גוססת עם גידול (ו כתמי כחולים עזיםתאי rom מוגבר) מושרה עם מערכת transposon היפיפייה הנרדמת באמצעות shp53, PDGFΒ וNRAS. (ב) לוח, סעיף סמוך העטרה לאחד שמודגם בלוח (א) מוכתם בכתם הגרעיני DAPI, מראה ביטוי של ה- GFP בתאי גידול. לוח (ג) מייצג מיקרוסקופ confocal של גבול הגידול מראה ביטוי של GFP בגידול, שזוהה על ידי הצפיפות הגרעינית הגבוהה עם DAPI. לוח (ד) ממחיש את אותו שדה הראייה כמו ב( א), המציג ביטוי GFAP אינטנסיבי בתאים סמוכים לגידול. לוח (ה) מייצג את השכבה של לוחות (ג) ו- (ד). לוח (ו) הוא מיקרוסקופ confocal של גבול הגידול, מראה ביטוי של GFP בתאי גידול. לוח (ז) מייצג את אותו שדה הראייה כמו ב( ו), מראה ביטוי של nestin בתאי גידול. לוח (ח) הוא הקרנת הכיסוי של לוחות (ו) ו- (ז) 
איור 7:. Neurospheres מגידול יפהפה נרדם מושרה עם shp53, PDGF וNRAS לאחר 5 ימים בתרבות, קטע 2. התאים מביעים GFP מקודדים על פלסמיד PDGF shp53 (pT2shp53 / GFP4 / mPDGF β) לוח (א) הוא מיקרוסקופ brightfield של neurosphere. לוח (ב) מייצג מיקרוסקופ עלית ניאון של אותו נוף כמו ב( א) מראה ביטוי של ה- GFP בתאי neurosphere. לוח (ג) מייצג את השכבה של לוחות (א) ו- (ב).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה, אנו פירוט שיטה תכליתית ושחזור ליצירת מודלים חדשים של GBM באמצעות שילוב transposase- SB בתיווך של פלסמיד דנ"א שעור לתאים המקיפים את אזור subventricular של עכברים בילוד. אנו מציגים פרוטוקול להפקת פלסמידים transposon עם גנים חדשים של עניין, להמחיש כיצד לפקח על ההתקדמות של הגידולים בבעלי חיים, וכיצד לאפיין תכונות histo-פתולוגי וחיסוני histochemical של גידולים אלה.
כמעבדה שלנו (איור 3) ואחרים 13 הראו, מודל זה באופן מהימן יוצרים גידולים עם המאפיינים הבולטים של GBM האנושי כוללים (1) נמק פסאודו-palisading, (2) התפשטות של כלי דם, (3) atypia הגרעיני, (4) mitoses החריג ו( 5) perivascular ופלישה מפוזרת. השימוש בעכברים בילוד הוא אופטימלי מבחינה לוגיסטית, מתן הליך טכני קל יחסית עם ציוד מינימאלי וseמהמגזר העסקי / התאוששות זמן, המאפשר לדור מהיר של גדלי מדגם גדולים של גידולים עם שינויים גנטיים ספציפיים. גידולים אלו גורמים לבעלי חיים להיכנע לעול גידול עם חציון הישרדות צפויה תלויה בשינויים הגנטיים המושרה. לבסוף, מודל SB שמש כמסך התערבות טיפולי לתגובה לטיפול 24.
יש מספר גורמים חשובים להביא בחשבון בעת הכנת הפתרונות המשמשים לזריקות בילוד. פתרונות DNA צריכים להיות סטרילי, (2-7 מיקרוגרם / μl) החופשי והמרוכז רעלן הפנימי, כדי לאפשר נפח מינימאלי של זריקות. היחס האופטימלי של שאריות חנקן בpolyethyleneimine (PEI) לשאריות פוספט בDNA (היחס / P N) הוא 7. זה מבטיח את היווצרות חלקיקים טעונים חיובי מתחמים אשר יחייבו moieties anionic על משטחי תא ויהיה endocytosed. ברגע שבציטופלסמה, זרם האוסמוטי יגרום החלקיקים להתפוצץ ולשחרר את encapsulated פלסמיד דנ"א. יש פתרון הסילון-PEI in vivo ריכוז של 150 מ"מ מבוטא שאריות חנקן. בהתחשב בכך שיש DNA מיקרוגרם אחד 3 nmol פוספט anionic, הסכום של מגיב transfection צורך ניתן לחשב עם הנוסחה:
μl של in vivo סילון-PEI = [(DNA מיקרוגרם x 3) x יחס N / P] / 150.
לדוגמה, כדי להכין 40 μl של 0.5 מיקרוגרם / פתרון ה- DNA μl עם יחס / P N של 7, 20 מיקרוגרם של ה- DNA יש צורך. הנפח של PEI הנדרש יהיה 20 * 3 * 7/150 = 2.8 μl.
ניתן להזריק עד חמישה פלסמידים שונים בו זמנית. ניסויים שהוצגו במסמך זה לספק transposase היפיפה הנרדם בטראנס על פלסמיד שגם מקודד לוציפראז (SBLuc). כפי שצוין במבוא, היחס של מולקולות transposase לtransposons חשוב לוודא טרנספוזיציה אופטימלית. היחס האופטימלי (שהוקם באופן אמפירי) של פלסמיד SB100x לTransposon פלסמיד דנ"א הוא 1: 4. לפיכך, אם אחד משתמש בשני פלסמידים שונים transposon, T1 ו- T2 למשל, היחס של SBLuc: T1: T2 יהיה 1: 2: 2; או עבור הסכום כולל של 20 מיקרוגרם DNA בפתרון 40 μl 4 מיקרוגרם של SBLuc יהיה מעורב עם 8 מיקרוגרם של T1 ו -8 מיקרוגרם של T2. במשך שלושה transposon שונה פלסמידים היחס יהיה SBLuc: T1: T2: T3 = 1: 1.33: 1.33: 1.33 ובמשך ארבעה transposons: 1: 1: 1: 1: 1.
זה שימושי כדי לאמת את הספיגה של DNA פלסמיד על ידי hr 24-72 פליטת אור לאחר הזרקה. כבעלי החיים לגדול, הצפיפות האופטית המוגברת של הפרווה, עור, הגולגולת והמוח, מונעת ניטור של התקדמות הגידול עד הגידול הגיע לגודל סף, בערך 1-2 מ"מ 3 לעכברי C57BL6 כהה פיגמנט. שידור טוב יותר של האור אפשרי בעכברים אלה אם פרוותם מגולחת, או בעת שימוש בעכברים עם פרווה לבנה או לא.
כמה מגבלות צריכים להילקח בחשבון בעת השימוש במודל זה. ראשית, הגןניתן לשלב בחומר הטיק הציג עם פלסמידים המוזרקים באופן אקראי בגנום המארח במקומות ומספר העותקים שונים. זה עשוי להוביל לשונות בין תאים הסרטניים ובין גידולים. שנית, DNA הציג מוכנס לתוך רצפים חוזרים בעיקר ת"א אינטרוניים DNA 25, לעומת זאת, האפשרות של התערבות בקידוד הדנ"א הגנומי מארח נשארה. זריקות שלישיים, תוך חדרים עלולות לגרום לשיעור קטן אך עיקש של הידרוצפלוס בעכברים צעירים, אשר הופך קליני גלוי וסימפטומטי בשבוע של ה -3 חיים-4. כמה זנים של עכברים נוטים יותר מאחרים הידרוצפלוס (כלומר, C57 / BL6 יותר מ FVB). כדי למזער את הסיכון לגרימת הידרוצפלוס, מומלץ להזריק קטן כנפח ככל האפשר (μl פחות מ 1 בעכברי C57 / BL6), על מנת להבטיח כי המחטים חדות, יש לי הפתרונות מליחות נמוכה ולספק גורים הולכים וגדלו עם מועשר מזון, על מנת לאפשר להתאבנות בזמן של bon הגולגולתes. לבסוף, גידולים בשלב מאוחר לעתים קרובות לפתח נמק, אשר יש לשקול בעת ניטור עכברים על ידי פליטת אור. קריאה נמוכה עשויה להצביע על גידול מתקדם עם שטחים גדולים של נמק ולא בהכרח ברזולוציה של הגידול כתוצאה מטיפול. סופו של דבר, ניתוח היסטולוגית נשאר סטנדרטי על מנת להעריך התקדמות גידול הזהב.
כניסתו של רצף הגנום כל גידול בשנים האחרונות פתחה את הדלת לחקר התפקיד של גנים שעברו מוטציה חוזרת ונשנה בGBM. המודל היפיפה הנרדם הוא אופטימלי לאימות אונקוגנים פוטנציאליים או מדכאי גידול. כמו בדוגמא שניתנה במאמר זה עם יגנד PDGFβ, שיבוט רצף cDNA עכבר של אונקוגן מועמד לשדרת פלסמיד SB הוקמה יוביל לביטוי מכונן בתוך תאי transfected. הערכה של תפקיד מדכאי גידול יכולה להתבצע ביעילות על ידי שיבוט לעמוד השדרה של פלסמיד SB עם רצפי מועמד, (vailable למשל באתר קודקס RNAi 26), כדי ליצור ביטוי חזק של דור השני קצר סיכות ראש miR.
דיון נוכחי בתחום מחקר GBM הוא קשור לזהותו של מקור תא-of-. לאחרונה הוכח שבעכברים, גידולים הנגרמים על ידי p53 למטה הוויסות וNF1 בתאי גזע עצביים, מקורן בתאי מבשר oligodendrocyte 27. שימוש במודל transposon היפיפה הנרדמת, יכולים להיות מתוכננים מחקרים דומים כדי לבדוק אם שינויים גנטיים אחרים מעדיפים למקד אוכלוסיות אחרות של תאי גזע / תאים אב ליצירת GBMs. ידע ממחקרים כאלה יהיה מאוד לשפר את ההבנה של אטיולוגיה GBM שלנו ולספק דרכים לגישות טיפוליות חדשניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors | Stoelting | 51670 | Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Injections can be made without it, ,but the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience |
| 10 μl 700 series hand fitted MICROLITER syringe | Hamilton | Model 701 | This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used |
| 30 gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel) |
Hamilton | S/O# 197462 | This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced. |
| in vivo-jetPEI | Polyplus Transfection | 201-10G | Aliquot in small volumes and keep at -20 oC |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio.com | LuckK-1g | Other sources of firefly lucifierase are just as adequate |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich | HHS128-4L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | For embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry |
| Advanced DMEM/F-12, no glutamine | Life Technologies | 12634-010 | For the culture of neurospheres |
| B-27¨ Supplement (50X), serum free | Life Technologies | 17504-044 | Serum free supplement for the culture of neurospheres |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | Serum free supplement for the culture of neurospheres |
| Normocyn | InvivoGen | ant-nr-1 | Anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human EGF | PEPROTECH | AF-100-15 | Growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human FGF-basic | PEPROTECH | 100-18B | Growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone HyQTase Cell Detachment Reagent | Thermo Scientific | SV3003001 | For the dissociation of neurospheres |
| Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749510-0590 | For the dissociation of freshly dissected tumors |
| Falcon Cell Strainers mesh size 70 um | Fisher Scientific | 08-771-2 | For generating single cell suspensions of dissociated neurospheres |
| Xylenes Histological grade | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Protocol Harris Hematoxylin Mercury free (acidified) | Fisher Scientific | 245-678 | |
| Protocol Eosyn Y Solution (intensified) | Fisher Scientific | 314-631 |
References
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet. Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).
- Dai, C., Holland, E. C. Glioma models. Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).
- Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Riblet, S. M., Slagel, D. E. Human brain tumor xenografts in nude mice as a chemotherapy model. Eur J Cancer Clin Oncol. 19 (6), 799-805 (1983).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. J Neurooncol. 85 (2), 133-148 (2007).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Rojiani, A. M., Dorovini-Zis, K. Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study. J Neurosurg. 85 (6), 1078-1084 (1996).
- Hambardzumyan, D., Amankulor, N. M., Helmy, K. Y., Becher, O. J., Holland, E. C. Modeling Adult Gliomas Using RCAS/t-va Technology. Translational Oncology. 2 (2), 89-95 (2009).
- Friedmann-Morvinski, D., et al. Dedifferentiation of neurons and astrocytes by oncogenes can induce gliomas in mice. Science. 338 (6110), 1080-1084 (2012).
- Lynes, J., et al. Lentiviral-Induced High-Grade Gliomas in Rats: The Effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutic. , (2014).
- Uhrbom, L., Hesselager, G., Nister, M., Westermark, B. Induction of brain tumors in mice using a recombinant platelet-derived growth factor B-chain retrovirus. Cancer Res. 58 (23), 5275-5279 (1998).
- Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15 (1), 110-116 (2009).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69 (2), 431-439 (2009).
- Bailey, O. T. Genesis of the Percival Bailey-Cushing classification of gliomas. Pediatr Neurosci. 12 (4-5), 261-265 (1985).
- Patel, A. P., et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science. 344 (6190), 1396-1401 (2014).
- Agnihotri, S., et al. Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 61 (1), 25-41 (2013).
- Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Ivics, Z., Izsvak, Z., Minter, A., Hackett, P. B. Identification of functional domains and evolution of Tc1-like transposable elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (10), 5008-5013 (1996).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
- Hackett, P. B., Ekker, S. C., Largaespada, D. A., McIvor, R. S. Sleeping beauty transposon-mediated gene therapy for prolonged expression. Adv Genet. 54, 189-232 (2005).
- Ammar, I., Izsvak, Z., Ivics, Z. The Sleeping Beauty transposon toolbox. Methods Mol Biol. 859, 229-240 (2012).
- Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
- Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
- Fujita, M., et al. COX-2 blockade suppresses gliomagenesis by inhibiting myeloid-derived suppressor cells. Cancer Research. 71 (7), 2664-2674 (2011).
- Geurts, A. M., et al. Gene transfer into genomes of human cells by the sleeping beauty transposon system. Molecular Therapy: The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 8 (1), 108-117 (2003).
- Dickins, R. A., et al. Probing tumor phenotypes using stable and regulated synthetic microRNA precursors. Nat Genet. 37 (11), 1289-1295 (2005).
- Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146 (2), 209-221 (2011).
