Introduction
多形性膠芽腫（GBM）は、手術、放射線療法、および化学療法1で処理された15-21ヶ月の生存期間中央値で、成人における最も一般的な（60％）の原発性脳腫瘍である。 GBMのための新規治療法は不可欠である。実験的治療は十分にヒトの疾患の顕著な特徴を再現する動物モデルでのテストが必要。げっ歯類でGBMを誘導するための戦略は、神経膠腫細胞株2を用いた化学アルキル化剤誘発、生殖細胞または体細胞の遺伝的変化、または移植を含む。最も一般的に使用されるモデルは、脳内に、または皮下に同一の遺伝子型を有する動物における同系細胞を使用して、いずれかの同所、神経膠腫細胞株の注入を用いる。または異種細胞は、免疫に移植最も一般的ヒトGBM細胞株は、マウス3を損なわ。再現性の利便性、standa：異種移植片は、頭蓋内腫瘍の研究のための多くの利点を提供rdized成長率、死亡および腫瘍局在の時間。しかし、これらのモデルが原因注入し、正確に組織学的に再現する限られた能力のために使用される人工、侵襲的な外科的アプローチに限界がある人間のGBM（WHOグレードIV）の特性を備えています：擬似pallisading壊死、核atypias、びまん性浸潤、微小血管増殖とglomeruloid血管異常4-7の形成。ウイルスベクター8-12と、またはトランスポゾン媒介インテグレーション13のいずれかで、発癌性DNAでの体細胞のゲノムを変更することによってGBMの誘導は、より厳密にヒト疾患の病因を再現し、ヒトGBMの組織病 理学的特徴を再現する。
歴史的には、CNSの腫瘍は生存14の予測因子となることが観察された起源の感知セルに基づいて分類されている。 GBMのは、プライマリとセカンダリに分類される。新たな証拠のTODAY主要神経膠芽15の非常に不均一な性質を指す。二次GBM（15％）、低悪性度星状細胞腫（WHOグレードI）およびanaplasic星状細胞腫（WHOグレードII）の悪性形質転換の結果は、疾患の初期発症、予後良好および遺伝子発現の「前神経」パターンに関連付けられている、原発性GBM（85％）のに対し、後期発症、予後不良とグリア（古典）、神経または間葉発現パターンを示している。遺伝子発現のこれらのパターンは、腫瘍の起源の実際のセルと相関するかどうかはまだ活発に研究されている。データを蓄積することのGBMに関連する遺伝子変異の組み合わせは生存のための予測であることを示しています。例えば、染色体1P / 19Qのヘテロ接合の消失（LOH）は、IDH1変異、PDGFRα増幅は、NFは、EGFRの過剰発現、Notchおよびソニックヘッジホッグ経路の活性化のに対し、二次性GBM、前神経発現パターンおよび良好な予後と関連している1およびPTEN損失およびp53の変異は、神経、古典的な、または間葉原発性GBMと悪い予後16,17と相関している。大規模な配列決定プロジェクトの出現とテストのために利用可能な多数の患者検体の蓄積は、GBMの病因および進行および治療法を具体的に合わせて調整することができる個別化医療の可能性に関与する遺伝子変異および経路に関して新しい情報を豊富にもたらし患者の遺伝的異常。最終的に、体系的な方法でこれらの突然変異および経路の予測値を評価するために、それぞれの場合において可能な治療を試験するために、予め決められた遺伝的変化でGBMの動物モデルを必要とする。ゲノムDNAのトランスポゾン仲介統合が実現可能なアプローチを提供しています。
眠れる森の美女トランスポゾンシステム、トランスポゾンのTc1が/ マリナークラスのメンバは、マルチステップproceで（構築）「覚醒」した休眠より10万年前に18,19となったサケトランスポザーゼ遺伝子、からサ イト特異的変異のSS。本質的には、特定の配列（逆方向反復/ダイレクトリピート：IR / DR）に挟まれたDNAトランスポゾンは、眠れる森の美女トランスポザーゼの活動によって、「カット＆ペースト」の方法でゲノムに統合することができます。トランスポザーゼは、IRサイトの両端を認識しトランスポゾンを切除および塩基TとA、転置（ 図1a）の間にトランスポゾンの各末端に複製された塩基の間に別のDNA部位にランダムにそれを統合します。眠れる森の美女トランスポザーゼは、3つのドメイン、トランスポゾン結合ドメイン、核局在化配列および触媒ドメインから構成されている。四つトランスポザーゼ分子が一緒にトランスポゾンの両端をもたらし、転位を可能にするために必要とされるトランスポゼースのあまりに多くの分子が存在する場合、しかし、それらは二量体化を阻害するとtetramerizeでき転位反応20。効率的な転位反応は、トランスポゾンのトランスポザーゼの最適な比率を必要とする。トランスポザーゼをコードするDNAは、（シス）トランスポゾンと同じプラスミド上または（トランスで）別のプラスミド上に供給することができる。トランスポザーゼ及びトランスポゾンの間の最適な比率を確保するために、十分な活性を有するプロモーターは、（「シス」モデルの場合）トランスポザーゼの発現のために選択することができるか、注射液中のプラスミドの比は、のために（最適化することができる「トランス」モデル）。眠れる森の美女トランスポゾンシステムは、機能ゲノミクス、挿入突然変異、遺伝子導入および体細胞遺伝子治療の21のために成功裏に使用することができます。合成構築物は休眠サケバリアントから機能性分子に再設計され、眠れる森の美女トランスポザーゼは、ヒトまたは他の哺乳動物20内の他のトランスポゾンに結合しない。その発見以来、分子工学はenhancを持ってpT2をトランスポゾンで、その結果、IR配列及びトランスポゾンに隣接するTATAジヌクレオチドの追加の変化を通じてSBトランスポゾンシステムの転置有効性を編。これらのトランスポゾンは、IRサイトにSBの結合を最適化し、切除の有効性を増加している。 SBトランスポザーゼも大幅な改善を行った。本明細書に提示した実験で使用されるトランスポザーゼSB100X、哺乳動物細胞22の大規模遺伝子スクリーニングに続いてDNAシャッフリング戦略によって生成された機能亢進性トランスポザーゼである。
本報告書では、新生仔マウス23のサブ脳室帯の細胞へのプラスミドDNAの非ウイルス、トランスポゾン媒介統合を有するマウスにおいて本質的なGBMを誘導するために、迅速な汎用性と再現性のある方法を提示する。私たちは、眠れる森の美女のトランスポザーゼを用いてゲノム統合のための従順な新規遺伝子とトランスポゾンを作成し、プラスミドの取り込みを監視する方法を実証するための簡単な方法を提示し、生物発光を用いて、疾患の進行。我々はまた、このモデルで再現GBMの組織学的および免疫組織化学的な特徴を特徴づける。さらに、我々は、これらの腫瘍からの一次GBM細胞株を生成するために迅速な方法を提示する。腫瘍が動物に元の細胞から誘導されている眠れる森の美女モデルは、誘導及び腫瘍の進行中の候補GBM遺伝子の役割の機能的評価を可能にする。このシステムは、局所微小環境を変化させることができる侵襲性外科手術手順を必要とせず、免疫適格マウスにおける免疫療法を含めた新規GBM治療の試験のためにも適している。
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Protocol
注：すべての動物のプロトコルは、動物の使用とケアのためのミシガン大学委員会（UCUCA）によって承認されている。
新眠れる森の美女トランスポゾンに目的の配列の1。クローニング
注：遺伝子または眠れる森の美女トランスポザーゼシステムを使用して（shRNAのような）の阻害要素を挿入するには、PKTまたはpT2をプラスミドの主鎖に目的の配列のクローンを作成する。クローニングを指示調節要素は、関心とマーカーの遺伝子が逆方向反復（IR / DR）が隣接したままになるように。以下に詳述するPKT骨格にPDGFβのクローンを作成する例は（も参照図1B）。
- 反応容積50μl中のXbaI / XhoI制限酵素の5~10単位を用いて37℃で4時間、プラスミドベクターPKT-IRES-Katushka5μgのダイジェスト。
- 5-10ユニット37℃で4時間をpGEM-T-mPDGFβプラスミド5μgののmPDGFβcDNAのダイジェストをNcoI / SacI制限酵素のS。
- 100％エタノール2.5容量、および3 M酢酸Na、pHが5.8 1/10容量を追加することによって、全DNAを沈殿させ、-20℃で一晩インキュベートする。
- 15分間13,800×gでサンプルを遠心。
- 無菌のDNアーゼを含まない水の19μlの一回繰り返して、再懸濁、70％エタノール500μlを、1分間13,800×gで遠心分離してDNAペレットを洗浄。
- 両方のベクター（PKT-IRES-Katushka）の末端を平滑化し、（mPDGFβ）を挿入するクイックブランティングキットで、製造元の指示に従ってください。
- 平滑化ベクトルをロードし、1.2％のエチジウムブロマイド染色したアガロースゲル上で挿入し、40分間80 Vで動作します。製造業者のプロトコルに従ってゲル精製キットを用いてDNAを精製し、バンドを可視化クリーンかみそり刃とゲルとそれらを切り出す。
- 1のモル比（挿入：ベクター）4でチューブ内に追加することによって、ステップ1.7において精製挿入物およびベクターDNAを連結する。このチューブ、Pにipette T4リガーゼ1μlのと（ATPを含む）をT4リガーゼ緩衝液2μlの、そして滅菌水で20μlに音量を調整する。 16℃で18時間ライゲーション反応をインキュベートする。
- 連結した製品と化学的にコンピテント細菌細胞を形質転換する。
- 氷上でコンピテント細胞を解凍する。
- 軽くチューブを振ると30分間氷上でミックスをインキュベート、有能な細胞の50μlに連結反応のボリューム全体を追加します。 42℃で45秒間の細菌を熱ショックと氷にすぐに返します。別の2分間氷上でインキュベートする。
- 文化にルリアブロスの950μl加え、1時間、37℃で振とうしながらインキュベートする。遠心細菌2400×gで3分間及びLBの200μlの中でペレットを再懸濁
- LB-アガロースおよび対応する抗生物質でコーティングされたペトリ皿の上に形質転換細菌を広げた。 37℃で一晩プレートをインキュベート。
- 最後に、5〜10 bacteを収集リアルコロニーを抗生物質を含むLB培地5ml中、37℃で一晩培養する。
- 製造業者の説明書に従って、プラスミドDNAミニキットを用いてプラスミドDNAを精製する。診断制限ベクターへの挿入の適切な組込みを確認し、挿入物の正しい方向を確保するために、DNA配列決定のために陽性クローンを提出するダイジェスト行う。
- 無料のプラスミド調製キットをエンドトキシン、正しいコロニーを選択し、高品質を使用してDNAの生産をスケールアップ。
- 滅菌水、または1 mMのトリス-HClでDNAを溶出する。新生児に注入する準備まで-20℃で保存するDNA。
2.イントラ心室新生児注射
- 実験の前に3〜4週間、1人の男性と1雌マウス、およびプラスチック色のイグルーとマウスの飼育ケージを設定します。これは、豊かな環境を提供し、嵌合プロセスを助ける。
- 妊娠が確認されると、メートルを削除新しいケージにエール。 18日交配後に、配信のために毎日ケージを監視します。生後1日目（P1）上の脳室内注射を実行します。
- 注射液の調製
注：注射溶液は、トランスフェクションのための粒子を作成するために、トランスフェクション試薬を用いてプラスミドDNAを混合することによって製造される。 pT2を/ SB100xリュックと2トランスポゾンプラスミド：PT / CAGGS-NRASV12とPt / CMV-SV40-LGTの割合で、以下は眠れる森の美女トランスポザーゼとルシフェラーゼをコードするプラスミドを使用した注射液の調製に例がある1：2：2。全てのプラスミドはを2μg/μlの濃度を持っている。注射液の調製に重要な詳細が議論に提示されている。- pT2を/ SB100xリュックの4μgの（2μL）、PT / CMV-SV40-LGTと10μlとPT / CAGGS-NRASV12と8μgの（4μL）の8μgの（4μl）を：追加することによって、DNA溶液を準備1μg/ mlの濃度の20μlの最終容量の10％グルコースDNAおよび5％グルコース。
- 5％グルコースの最終濃度になるように、インビボでジェットPEIの2.8μlの滅菌水7.2μlを、10％グルコースを10μl添加することにより、PEI溶液を調製する。
- DNA溶液をPEI溶液を添加混合し、ボルテックスし、20分間室温（RT）で放置。ソリューションは、現在、注射の準備ができている。 RTで1時間後、氷の上で解決策を維持する。
- マイクロポンプに12.5°の斜面に30ゲージの皮下注射針を装備した10μlのきれいな注射器を取り付けます（ 図2＃1）。
- 噴射システムの適切な機能を確認するには、（ 図2＃1）シリンジに水10μlを撤回してから完全に注射器を空に自動注入器を使用
- 新生児定位段階（ 図2＃3）2〜8℃の温度にドライアイスとアルコールのスラリーでクール。
- 濡れた氷の上に子犬を置くことによって麻酔を誘導する2分間。麻酔は手順の残りのために冷やした定位フレームに続けます。 2〜8℃の間、凍結上記フレームの温度を維持することは、熱火傷を防ぐことができます。特別な予防措置の仔は、濡れた氷の上に置く前に、ガーゼに包まれられるように。
- DNA / PEI溶液で注射器を埋める。
- ガーゼカバー耳棒（ 図2b）との間でその頭を配置することによって、定位フレームに子犬を固定化。頭蓋骨の背側が水平であることを確認し、フレームの表面に平行し、頭蓋縫合がはっきり見えること。 70％エタノールで頭を拭きます。
- 注射器の針を下げ、針がラムダ（頭頂と後頭部の骨の正中線の交点）（ 図2b）を触れるまで定位フレームのダイヤルを使って定位座標を調整します。
- 針を持ち上げて、0.8ミリメートル、横と1.5メートルに定位座標を調整ラムダ（ 図2b）にm個の吻側。
- それが触れると少し皮膚をディンプルまで針を下げます。座標を測定します。針に別の1.5ミリメートルを下げます。針が皮膚や頭蓋骨を貫通し、側脳室（ 図2c）を入力する皮質を通過することになる。
- 自動注射器を使用して、0.5μlの/分の速度でDNA / PEI溶液を0.75μLを注入する
- 心室に分散するためのソリューションを可能にするために、別の分のためのフレームに子犬を保管してください。その間に、次の注射の準備のために2分間氷上に、別の子犬を麻酔。
- 静かにゆっくりと針を持ち上げ、加熱ランプの下に子犬を置く。呼吸と活動を監視します。必要に応じて、最初の呼吸がすさまじいまで、手足の穏やかな刺激を与える。
- それはウォームアップ、定期的に呼吸している、バラ色の色に達しており、通常は、5〜7分でアクティブになっていた後、その母親に子犬を返します。 MOの場合複数の子犬を一度に注入され、再すべての注射が行われるまで、一緒にすべての子犬を保つ。注射は30分以上の時間がかかる場合は、手順の最後に最初の30分で、残りの後に仔の半分を返す。
- ダムが彼女の子犬に応答性と育成であることを監視します。必要に応じて、ケージにサロゲートママを追加します。
- 氷の上に子犬を配置し、温暖化ランプの下に置くとの間隔が10分未満であることを確認してください。生存より良い手続き迅速。通常、それは麻酔と子犬を注入するのにかかる時間は4分である。
腫瘍形成および進行の3生物発光の監視
3.1）注入後のプラスミドの取り込みを監視
- 注射後24〜72時間後には、6ウェルクリーンな組織培養皿、1子犬に母親のケージと場所からすべての仔を削除ウェル当たり。
- 生理食塩水またはphosphatに溶解ルシフェリンの30 mg / mlの溶液を調製Eバッファ。事前にこの溶液を調製し、-20℃で小分けしてください。
- 30ゲージの皮下注射針を装備した1ミリリットル注射器を使用すると、子犬の肩甲骨の間μLのルシフェリン皮下に30を注入する。針が皮膚をつまん、針を挿入する前に少しそれを持ち上げて、すべての臓器を貫通していないことを確認してください。
- 画像すぐに、 インビボでの生物発光イメージングシステムを使用して。自動露出、大ビニング、絞りF = 1：IVISスペクトラムについては、買収のための次の設定を使用します。
3.2）腫瘍形成および進行のモニタリング
注：動物は、注入された発癌性のプラスミドに応じて、2.5-6週間以内に生物発光および組織学によって検出可能な巨視的な腫瘍を形成することが開始されます。
- 26ゲージ針を備えた1mlシリンジを使用して、30 mg / mlのルシフェリン溶液100μlを腹腔内に注入する。
- 麻酔室で動物を置きます。同時に5匹まで注入する。
- 動物を麻酔するために酸素/イソフルランフロー（1.5から2.5パーセントイソフルラン）を起動した後、5分待ってください。 3~4分後、麻酔チャンバーから動物を削除する生物発光室の酸素/イソフルランの流れを開始する。麻酔と光の遮るもののない通過を可能にするために、ガラスのノーズコーンを搭載し、それぞれのスロットに動物を配置します。
- 典型的には、自動露光時間、メジアンビニングおよびf = 1の開口絞りと2分間隔で6一連の画像を取得する。
- 頭部の上、通常は楕円形に結像全ての動物についての関心領域を設定し、かつ/秒/ cm 2の/ srで較正さユニット光子を用いて発光強度を測定する。
- 各動物の最大値を記録します。続いて、記録は、各動物および/または動物の間、WHE例えば、腫瘍の進行の間に比較することができるn個の異なる治療法が使用される。
4. [新しいGBMのの組織学的および免疫組織化学的分析
注：腫瘍が目的の実験時間点に達したとき、動物を犠牲にすることができ、脳灌流固定し、そして分析した。生存のための動物は、症候上映減損モビリティ、猫背の姿勢とだらしない毛皮になると臨床病期で定義されている動物を人道的に、腫瘍負荷の最初の兆候で犠牲にされたとき瀕死のステージは、実験のエンドポイントを表し分析する。使用される標準的な組織学的および免疫組織化学法の簡単な説明を以下に示す。
4.1）灌流および固定
- 100ケタミンのミリグラム/ kgおよびキシラジン10mg / kgの腹腔内注射でマウスを麻酔。
- マウスの足をつまんでペダル反射を確認してください。この反射は深い麻酔を示し、廃止された場合、immobピンと解剖ボード上にマウスをilize、腹腔を開き、ダイアフラムを解剖し、心臓を視覚化するために胸腔を開きます。
- 心臓の左心室に鈍20ゲージのカニューレを挿入します。 NaClの0.8％（プラスチックチューブは酸素及びヘパリン化タイロード溶液を容器に蠕動ポンプを通過してカニューレを接続して、0.0264パーセントのCaCl 2·2H 2 O、0.005％のNaH 2 PO 4、0.1％グルコース、0.1％のNaHCO 3、0.02 ％のKCl）。動物が小さい場合、秒以下当たり約一滴をゆっくりと一定の流れを確保するために蠕動ポンプの速度を調節することにより、タイロード液のフローを開始する。
- 血液のドレインとタイロードを可能にするために心臓の右心房に小さな切開を行います。
- 彼らは血を欠いになるように（肝臓と腎臓の中で最も明白な）内臓のブランチングを観察することによって灌流効率を監視します。
- いつ心の底から排水ソリューションは、固定のために4％パラホルムアルデヒド（リン酸緩衝生理食塩水で4％PFA、pH値7.34）にタイロードからソリューションを切り替える、（3-5分）は明らかである。
- 首と尾の増加剛性により組織の良好な固定を監視します。
- マウスを斬首し、慎重に頭蓋骨から脳を解剖。
- 鼻に向けて、吻側頭蓋骨をカバー毛皮を引き、頭、背側を上にして安定させるためにしっかりとそれをつかむ。
- 鋭いメスを用いて、軌道の筋肉と基礎頬骨のアーチを横断するために、軌道の端に沿って下向きにカット。
- 頭部腹側を上に回し、骨鉗子を使用して取り付け、首の筋肉を取り除く。最初の椎骨を粉砕し、脳幹から取り外します。
- 、蝸牛を視覚化骨鉗子で上を覆う側頭骨をつかみ、時間的、後頭骨の間に開口部を作成します。小脳の表面から後頭骨をはがし。
- 頭腹側を上にしてください。脳はもっぱら脳神経を通して今接続、頭蓋骨の残りの部分から下にスライドします。小さなハサミを使用すると、嗅覚、視神経と三叉神経をカット。これは、脳を解放します。
- ポスト固定のために4℃で一晩4％PFA中で脳を置きます。
- 組織学的分析およびヘマトキシリン - エオシン染色のために、24時間のリン酸緩衝液に脳を転送した後、パラフィン包埋に進みます。
- （脳がチューブの底に沈むまで）、免疫組織学的分析のために、24〜48時間、リン酸緩衝生理食塩水で30％ショ糖溶液中に脳を転送する
- 腫瘍領域の中央を半分の区間脳は、カットを配置ダウン凍結金型への側は、ドライアイスエタノール、ドライアイスイソペンタンのスラリー中または液体窒素中に凍結包埋メディア（OCT化合物）、およびフラッシュ凍結に埋め込む。切片と染色まで-80℃で凍結したブロックを保管してください。
4.2）パラフィンのヘマトキシリン - 染色は、固有のGBMの組織病理学的分析のための頭脳を組み込み
- 4μmの厚さで、セクション、パラフィン包埋した脳を、42℃の水浴中に落下し、スライドガラス上にマウント。
- 60℃のオーブンに10分間置くこと、次いでキシレンで満たされた3スライドコンテナ一連の5分間隔でそれらを転送することにより、脱paraffinizeスライド。
- 、2分間100％エタノールを一度繰り返し、95％エタノールを2分間、一回繰り返して、70％エタノールに2分間、次いで水にスライドを転送：エタノール浴一連のスライドを水和する。
- 2分間ハリスヘマトキシリンで満たさスライド容器でそれらを浸漬することによりスライドを染色。
- 水が透明になるまで水道水ですすぎます。
- ディップは、二回ブルーイング液（0.1％重炭酸ナトリウム）にスライド。
- スライドを2分間水道水で放置し、次に2分間80％エタノールに移す。
- 5分間エオシンで充填された容器でそれらを浸漬することによりスライドを染色する。
- エタノール浴一連のスライドを脱水し（80％エタノール3-4ディップ、95％エタノールで2分間、一回繰り返して、100％エタノールで2分間、一回繰り返す）。
- キシレンの3連続の浴場、3分間ずつとクリア。
- キシレン系封入剤とカバーガラスとイメージングのための準備ができるまで、室温で平らな面に乾燥させてください。室温で保管してください。
デ·ノボ誘発性GBMの分子細胞の特徴付けのために凍結保存組込みブレインズの4.3）免疫組織化学
- 、-80℃ストレージから凍結されたブロックを検索クライオスタットに配置し、温度は30分間平衡を可能にする。
- 第12節-14ミクロンの厚さの切片と正に荷電したガラススライド上に2-3のセクションをマウントします。別のスライドに隣接するセクションを収集することにより、連続的にセクションをカット。これは、腫瘍内の隣接する組織切片上の異なる抗体での染色を可能にする。
- 組織の良好な接着を可能にするために、切片後少なくとも1時間デシケーター中で乾燥スライド。
- セクションをカバーし、洗浄中のスライド上にとどまるために、液体を可能にするために、スライドの各端部（疎水性マーカーを有する）は、疎水性バリアを作成する。 0.1％のTriton-Xを含むリン酸緩衝生理食塩水の溶液（PBS、0.1％のTx）とのセクションをカバーし、静かに組織を透過性にするために、水平シェーカー上に5分間振る。二回繰り返します。
- 穏やかに振盪しながら30分間、非特異的（二次抗体を上昇させた動物から、または血清）10％正常ヤギ血清溶液での結合をブロックする
- PBS、0.1％、2％正常ヤギ血清中の一次抗体溶液を調製するTxとは、セクションかけて溶液をピペット。暗闇の中で覆われた湿度の高いチャンバー内でスライドを置き、室温で一晩保つ。
- 次の日は、PBS、0.1％のTxで5分間のセクションを3回洗浄し、1時間、2％正常ヤギ血清PBS、0.1％のTx中で希釈した蛍光二次抗体でインキュベートする。
- 2分間、PBS、0.1％のTx、核染色（ 例えば 、DAPI）との対比を洗浄セクション5分間3回は、蛍光を保持しますメディアをマウントベースの水と水とカバーガラスの明確な、もう一度洗う。平らな面にスライドを置き、それらを画像化するための準備ができるまで、暗闇の中で、少なくとも24時間、治すましょう。その後、4℃で保管してください。
具体的な遺伝的変化と原発腫瘍細胞株の5世代。
- 美容担癌マウススリーピングから細胞株を作製するには、確認された大きな腫瘍（生物発光10 7〜10 8の光子/ S / cmのマウスを選択2 / SR）。
- （セクション4で説明したように）、イソフルラン麻酔薬の過剰投与によりマウスを安楽死させる動物を斬首し、慎重に頭蓋骨から脳を解剖。きれいなペトリ皿に脳を置きます。
- カミソリの刃を使用して、腫瘍への冠状カットの前部と後部を作る。腫瘍の位置は、脳の透明性は、通常認識可能である。
- 細かいピンセットで直径腫瘍、出荷までの時間5〜7 mmの解剖と300μlの神経幹細胞のメディアで満たさ1.5ミリリットルチューブに置く（NSCメディアは：B-27サプリメント、N2サプリメント、そしてノルモシンを含むDMEM / F12、補充したそれぞれ20ng / mlの濃度のヒト組換えEGFおよびbFGF）。
- 静かにチューブの壁にフィットするプラスチック乳棒で腫瘍を均質化する。
- 酵素を含まない組織解離溶液1mlを加え、5分間37℃でインキュベートする。
- 10mlのストレーナーを洗って、70μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液を渡すNSCメディア、4分間300×gで遠心、上清をデカントし、再サスペンドペレットNSC培地の7ミリリットルに。
- 95％空気および5％CO 2の組織培養インキュベーター、大気中37℃でのT25培養フラスコ、培養プレート上に。 3日後、いくつかの細胞がいくつかの培養皿の底に付着して、死亡した、いくつかは自由に媒体中に浮遊し、ニューロスフェアを形成している。
- T75組織培養フラスコ上にこれらの浮遊細胞および再プレートを取り外します。
- 文化の別の3日後、ニューロスフェアを収集し、ステップ5.6で説明したようにセルストレーナーを通して、歪みを解離して細胞を数える。 T75フラスコのためのEGF及びFGFを補充したNSC 14mlの中に100万個の細胞の密度で、ウシ胎児血清、10％DMSO中の細胞および継代細胞のアリコートを凍結する。成長速度は、腫瘍を生成するために使用される癌遺伝子に依存するであろう。異常増殖を防止し、比較的高い密度で細胞を維持するために細胞培養条件を適合させる。
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Representative Results
SB-誘発性神経膠芽の組織病 理学的特徴を特徴づけるために、C57 / BL6新生児マウスは、発癌性DNAとトランスポゾンをコードするプラスミドと組み合わせてルシフェラーゼをコードするプラスミド（pT2を/ SB100xリュック）とP1で注入した、 すなわち 、NRAS（PT / CAGGS NRAS（ 図3d）との組み合わせで-NRASV12）およびSV40 LGT（PT / CMVSV40-LGT）（ 図3c）またはPDGFβと短いヘアピンp53およびGFPレポーターをコードするプラスミド（pT2shp53 / GFP4 /mPDGFβ）。動物は、注射（ 図2a）の後に、定期的にそれらを安楽死させたときに瀕死段階に達するまで毎日生物発光をモニターした。瀕死のステージは、動物が症候上映減損モビリティ、猫背の姿勢、だらしない毛皮、体重減少となった臨床病期として定義されている。時々、動物は円や突然のジャンプで歩いているような、発作または動きの異常パターンを開発。実験動物の終了時sが麻酔した。脳を灌流し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色のために処理した。脳実質に出血（ 図3c）、擬似pallisading壊死（ 図3e）、および血管周囲と拡散侵入ヒトGBM（WHOグレードIV）の特徴を表示するデータが示す腫瘍（ 図3G、F）。 pseudopallisadesの形成は、単核細胞の大量の浸潤（ 図3H）と出血の地域につながる漏れやすい内皮（ 図3I）を持つ大規模なglomeruloid血管の破裂が先行する。非定型有糸分裂（ 図3J）と巨大な多核腫瘍細胞（ 図3K）も、人間のGBMの疾病である。
プラスミドが注入された場合、神経膠芽腫は、生物発光と腫瘍増殖の進行を通してモニターすることができ眠れる森の美女トランスポザーゼシステムを使用して生成されたエンコードルシフェラーゼ。実験例は、 図4aに示されている。発光は10 7〜10 9光子/秒/ cm 2の/ srの強度に達したとき、動物は、通常、腫瘍負荷の屈する。 図4bに提示生存曲線に示されるように、動物の生存期間中央値は、新生児の脳に注入発癌性トランスポゾンの組み合わせに予想通りに依存している。 shp53 NRASおよびPDGFで誘導しGBMを用いた動物の生存期間の中央値は62.5日とshp53とNRAS 83日を注射した動物であるのに対し、最も積極的な腫瘍は、NRASおよびSV40 LGT抗原（30日の生存期間の中央値）を用いて誘導されることに注意してください。
デノボ形成された腫瘍が神経膠腫瘍の特性分子の発現により免疫組織化学的に特徴づけることができる。 図5は、発生期の腫瘍（22 DPI、生物発光2×10 5の光子/秒/ cm 2に / SR）を示し 、shp53で誘導しとNRAS。注入されたshp53プラスミドは、トランスフェクトされた細胞の同定およびそれらの子孫（pT2を/ shp53 / GFP）を可能にするために、緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする。 GFP +腫瘍細胞は、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）を発現する神経幹細胞マーカーであるネスチンおよびいくつかのGFP +細胞を発現する。 図6は shp53 / GFPおよびNRASで誘導した腫瘍を、56 dpiで瀕死の動物からの腫瘍を示している。数多くのGFAP +アストロサイトは、腫瘍の周囲している。 GFP +腫瘍細胞はネスチンではなく、GFAPを発現する。
GBMのを誘導するためにこの技術を使用する大きな利点は、注入されたトランスポゾンを用いてユニークな遺伝子変化を有する新規のGBM細胞株を生成する能力である。また、カスタムの細胞株は、特定の遺伝子構成を有するトランスジェニック動物を用いて生成することができる。これらの細胞株は、生化学的アッセイを使用して、多くの機構的な質問をしに役立っている。これらは理想的に小説CHと細胞毒性試験のために適していますemotherapeuticエージェント。 図7は、注入されたプラスミドの1に符号化されているGFPの発現を示す、shp53、PDGFおよびNRASで誘導し眠れる森の美女腫瘍から神経球を示している。これらの一次GBM細胞の不均一な性質を示す、式はすべての細胞でも同様に激しいないことに注意してください。
図1：（a）の宿主染色体DNAにトランスポゾンを統合する眠れる森の美女トランスポザーゼによって使用されるドナートランスポゾンプラスミドは逆方向反復/直接反復に隣接目的の遺伝子で描かれている「カット＆ペースト」メカニズムを説明するための模式図。 （IR / DR、赤い矢印ボックス）配列。 SBトランスポザーゼ（緑）IR / DRに結合し、トランスポゾンを切除し、宿主の染色体DNAにランダムTAジヌクレオチド塩基対の間にそれを再統合。 クローニングの（b）の例SBベクトル （PKT-IRES-Katushka） の主鎖に目的の遺伝子（mPDGFβ）。 SBベクターは、2つのIR / DR反復配列（赤）およびプロモーターおよびエンハンサー配列、マルチクローニングサイト（MCS;青）を含む遺伝子発現カセットが含まれ、内部リボソーム侵入部位（IRES）、蛍光レポーターマーカー（Katushkaた：黄色）、およびポリアデニル化部位（ポリA）。関心（mPDGFβ、オレンジ）の癌遺伝子は、クローニングベクターをpGEMTに含まれています。特定の制限部位（のNcoI / SacIで）が隣接して癌遺伝子は、鈍化酵素による酵素消化によって放出し、平滑化されている。ベクターは、線状化し、同様に平滑化されている。最後に、mPDGFβ癌遺伝子は、新しいプラスミドトランスポゾンベクターを生成するための平滑末端ライゲーション反応によってドナーベクターに挿入されます。PKT-mPDGFβ-IRES-Katushkaを拡大版Oを表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図F。
図2：新生仔マウスにおけるイントラ心室注射のための実験のセットアップとガイド（A）定位フレーム（2）マイクロメーターダイヤルで10μLシリンジ（4）を保持する自動注射器が装備されています。 Uフレームの内側に、新生児アダプタフレームがしっかりと固定されている（3）。自動注射器（1）のコントロールパネルは、注射器、体積および流速の正確な選択を可能にする（b）は側脳室に注射するために必要な座標に挿入された針新生児マウス（P1）の写真：1.5腹側および0.8mmラムダに横方向。心室の相対的な寸法及び位置を強調新生仔マウスの脳を通る冠状断面（c）のイラスト（P1）。
図3：眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いて誘導された腫瘍は NRAS、SV40 LGTをコードするプラスミドと脳室内注射後の新生児の子犬24時間の（a）の生物発光画像人間のGBMの組織学的特徴を示して大人の動物の（b）の生物発光イメージ（。 shp53 NRASおよびPDGFで誘導し、大きな腫瘍を50 DPI）。（c）のヘマトキシリン及びNRASとLGT（28 DPI）で誘導した腫瘍と瀕死のマウスの脳からの冠状断面のエオシン染色。（d）の冠状断面腫瘍を有するマウスの瀕死の脳からshp53 NRASおよびPDGFで誘導する。（e）の壊死を偽柵、ヒトGBMの組織学的特徴は、 デノボ生成された腫瘍で観察される。 （壊死（N）の中心部から離れて移行パリセーズに配置されたセルへのポイントを矢印（f）とデノボ g）で生成された腫瘍は、正常な脳実質に血管（g）および拡散（f）に沿った浸潤を示す、非常に侵襲的である。 （H）単核細胞（矢印）、偽柵壊死の領域の初期段階の大規模な侵攻と出血の地域を（I）漏出性内皮（矢印）との大glomeruloid容器NRASで誘導された腫瘍内部の拡散出血の原点にそしてSV40 -LgT。（j）は 、腫瘍細胞における異型、有糸分裂（矢頭）。（k）は 、複数の大核（矢印）を有する巨大腫瘍細胞。
図4：腫瘍を有する動物は、疾患進行の期間中の生物発光をモニターすることができる。動物の生存期間の中央値は、の組み合わせによって予測され発癌性DNAが注入された。 7 C57 / BL6マウスのコホートからの生物発光トレースの（a）の例。生物発光は、10 8の光子/秒/ 2 / SRに到達した後のマウスは約一週間屈することに注意してください。（b）試料生存曲線は、異なるプラスミドの組み合わせで生成された美しさの腫瘍を眠ると動物の生存期間の中央値を比較する。 NRASとSV40 LGTで誘導された腫瘍の生存期間中央値はshp53 NRASで誘導した腫瘍およびPDGFまたはshp53による動物のに対し、30 DPIで、NRASはそれぞれ62.5 DPIまたは83 DPIです。解像度：注射後の日。
図5：新生巨視的GBM（22 DPI）shp53とNRASで誘導しは、GFP +腫瘍細胞（共焦点顕微鏡写真）でネスチンおよびGFAPの発現を示すパネル（a）は、GFPを発現する発生期の腫瘍を示している。。パネル（b）は、ネスチン発現を示す同一のフィールドを表す。パネル
図6：GBM GFP及び腫瘍の周囲の成熟したグリアマーカーGFAPのための腫瘍細胞におけるネスチン表現と豊かな染色を示す瀕死動 物（56 DPI）からshp53、NRASおよびPDGFで誘導しパネル（a）は、acoronalセクションのニッスル染色を表します。腫瘍と瀕死の動物の脳（強い青色染色からFshp53、PDGFβとNRASを使用してスリーピングビューティートランスポゾンシステムを用いて誘導ROM増加細胞性）。パネル（b）は、パネルに示したものに隣接した冠状セクション（a）は、腫瘍細胞におけるGFPの発現を示す、核染色DAPIで染色した。パネル（c）は、DAPIで高い核密度によって同定された腫瘍におけるGFP発現を示す腫瘍の境界線の共焦点顕微鏡写真を表す。パネル（d）は 、腫瘍に隣接する細胞に激しいGFAP発現を示す、（a）のように同じ視野を示している。パネル（e）は、パネル（c）および（d）のオーバーレイを表す。パネル（f）は、腫瘍細胞におけるGFP発現を示す、腫瘍境界の共焦点顕微鏡写真である。パネル（g）は 、腫瘍細胞におけるネスチンの発現を示す、（f）のように同じ視野を表す。パネル（h）は 、オーバーレイパネルの突起（f）および（g）である
図7：培養5日後にshp53、PDGFおよびNRASで誘導し眠れる森の美女腫瘍からニューロスフェア、セル2通路はshp53 PDGFプラスミド（pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ）でエンコードされたGFPを発現しているパネルは、（A）である。ニューロスフェアの明視野顕微鏡写真。パネル（b）は （a）の神経球細胞におけるGFPの発現を示すと同じ視野落射蛍光顕微鏡写真を表す。パネル（c）は 、パネルのオーバーレイを表す（a）および（b）。
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Discussion
この記事では、細部SBを使用したGBMの新たなモデルを生成するための汎用性と再現性のある方法は、新生児マウスの脳室下帯を周囲の細胞に発癌性プラスミドDNAの仲介統合をtransposase-。我々は、新たな注目遺伝子を有するトランスポゾンプラスミドを作製するためのプロトコルを提示し、生きた動物における腫瘍の進行を監視する方法、およびこれらの腫瘍の組織病理学的および免疫組織化学的特徴を特徴付ける方法を示す図である。
私たちの研究室として、 （ 図3）など13を示しているが、このモデルは確実に（1）疑似柵状壊死、（2）血管増殖、（3）核の異型、（4）異常 な有糸分裂を含む、ヒトGBMの顕著な特徴を有する腫瘍を（作成5）血管周囲と拡散侵入。新生児マウスの使用は、最小限の機器とそれとの比較的容易な技術的手順を提供し、物流の観点から最適であるdation /回復時間、特定の遺伝的変化を伴う腫瘍の大きなサンプルサイズの急速な世代を可能に。これらの腫瘍は、動物が誘発される遺伝的変化に依存して予測可能な生存期間の中央値で腫瘍負荷に屈するする原因。最後に、SBモデルは、治療応答24に対する治療的介入のスクリーンとして用いられてきた。
新生児の注射剤に用いられる溶液を調製する際に考慮すべきいくつかの重要な要因があります。 DNA溶液は、エンドトキシンを含まないし、濃縮（2-7μgの/μL）を注射の最小容量を可能にするために、無菌である必要があります。 DNA中のリン酸残基のポリエチレンイミン（PEI）中の窒素残基の最適比（N / P比）これは、細胞表面上のアニオン性部分を結合し、エンドサイトーシスされ、正に帯電した粒子複合体の形成を確実に7である。細胞質に一度、浸透圧流入は、粒子が破裂しencapsulatをリリースすることになりますプラスミドDNAを編インビボでのジェットPEI溶液は、150 mMの濃度は、窒素残基として表されている。 1μgのDNAは、アニオン性リン酸塩の3ナノモルを有することを考慮すると、必要なトランスフェクション試薬の量は、式で計算することができる。
in vivoでのジェット-PEI =のμL/ 150 [（μgのDNAを×3）は、N / P比をX]。
例えば、7のN / P比は0.5μg/μlのDNA溶液40μlを調製するために、20μgのDNAが必要とされている。 PEI必要なの音量は20 * 3 * 150分の7 = 2.8μLになります。
最大5つの異なるプラスミドを同時に注入することができる。ここに提示実験はまた、ルシフェラーゼをコードするプラスミド（SBLuc）上で、トランスで眠れる森の美女トランスポザーゼをお届け。冒頭で述べたように、トランスポゾンのトランスポザーゼ分子の比率は、最適な転位を確保することが重要である。 TRANSPにSB100xプラスミドの最適な比率（経験的に確立された）4：OSONのDNAプラスミドは、1である。 T1：一つは二つの異なるトランスポゾン、プラスミド、例えばT1およびT2、SBLucの比率を使用する場合、したがって、2：T2が1になる2。または40μlの溶液中の20μgのDNAの合計SBLuc4μgのは、T1の8μgの、T2の8μgのと混合される。 T1：T2：T3 = 1：1.33：1.33：1.33四トランスポゾンのための：1：1：1：1つの異なるトランスポゾンための比はSBLucなりプラスミド1。
これは、注射後の生物発光によるプラスミドDNAの取り込み24〜72時間を確認するのに便利です。動物が成長する腫瘍が閾値サイズ、暗く着色されたC57BL6マウスについておよそ1〜2ミリメートル3に達するまで、毛皮、皮膚、頭蓋骨と脳の増大した光学濃度は、腫瘍の進行のモニタリングを防ぐ。毛皮を剃毛された場合、または白色または無毛でマウスを使用した場合の光の良い伝送がこれらのマウスで可能である。
いくつかの制限は、このモデルを使用するときに考慮する必要がある。まず、遺伝子注入されたプラスミドを導入したチック材料は、異なる場所及びコピー数の宿主ゲノムにランダムに統合することができる。これは、腫瘍細胞間の腫瘍間の変動につながる可能性がある。第二に、導入されたDNAは、主にイントロンTA反復配列DNA 25に挿入され、しかし、宿主のゲノムDNAのコーディングとの干渉の可能性が残る。第三に、脳室内注射は人生の3〜4週間で臨床的に見えると症候性となり、若いマウスでの水頭の小さいが永続的な速度を引き起こすことがあります。マウスのいくつかの株（ すなわち 、C57 / BL6 FVBより）他より頭症になりやすいです。水頭症を誘発する危険性を最小限に抑えるためには、（C57 / BL6マウスにおける1未満μl）をできるだけ小さな容積を注入することが推奨され、針が鋭利であることを確実にするために、溶液は、低塩分を持ってして成長仔を提供すること頭蓋骨ボンのタイムリーな骨化を可能にするために、食品濃縮ES。最後に、後期段階の腫瘍は、多くの場合、生物発光によりマウスを監視するときに考慮しなければならない壊死を開発。低い読み出しが大きな壊死領域と必ずしも治療の結果としての腫瘍の分解能で高度な腫瘍を示してもよい。最終的には、組織学的分析は、腫瘍の進行を評価するためのゴールドスタンダードのまま。
近年の腫瘍全ゲノム配列の出現は、GBMにおける反復的に変異した遺伝子の役割の探査への扉を開いた。眠れる森の美女モデルは、潜在的な癌遺伝子または腫瘍抑制を検証するために最適である。確立されたSBプラスミドバックボーンに候補癌遺伝子のマウスcDNA配列をクローニング、PDGFβリガンドと本論文で与えられた例のように、トランスフェクションされた細胞内の構成的発現をもたらすであろう。腫瘍抑制因子の役割の評価を効果的に、候補配列とSBプラスミドのバックボーンにクローニングすることにより行うことができ、は、（available RNAiのコーデックスデータベース26）の例では、第二世代のmiRショートヘアピンの強固な式を作成する。
GBM研究の分野における現在の議論は、セル·オブ·オリジンのアイデンティティに関連しています。最近、マウスにおいて、神経幹細胞において下方調節p53およびNF1によって誘導される腫瘍は、オリゴデンドロサイト前駆細胞27に由来することが示されている。スリーピングビューティートランスポゾンモデルを用いて、同様の研究は、他の遺伝的変化を優先性GBMを生成するために、幹細胞/前駆細胞の他の集団を標的とするかどうかをテストするように設計することができる。このような研究からの知識が大幅にGBMの病因の我々の理解を高め、新たな治療アプローチのための道を提供します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors | Stoelting | 51670 | Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Injections can be made without it, ,but the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience |
| 10 μl 700 series hand fitted MICROLITER syringe | Hamilton | Model 701 | This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used |
| 30 gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel) |
Hamilton | S/O# 197462 | This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced. |
| in vivo-jetPEI | Polyplus Transfection | 201-10G | Aliquot in small volumes and keep at -20 oC |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio.com | LuckK-1g | Other sources of firefly lucifierase are just as adequate |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich | HHS128-4L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | For embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry |
| Advanced DMEM/F-12, no glutamine | Life Technologies | 12634-010 | For the culture of neurospheres |
| B-27¨ Supplement (50X), serum free | Life Technologies | 17504-044 | Serum free supplement for the culture of neurospheres |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | Serum free supplement for the culture of neurospheres |
| Normocyn | InvivoGen | ant-nr-1 | Anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human EGF | PEPROTECH | AF-100-15 | Growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| Recombinant Human FGF-basic | PEPROTECH | 100-18B | Growth factor supplement for the culture of neurospheres |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone HyQTase Cell Detachment Reagent | Thermo Scientific | SV3003001 | For the dissociation of neurospheres |
| Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749510-0590 | For the dissociation of freshly dissected tumors |
| Falcon Cell Strainers mesh size 70 um | Fisher Scientific | 08-771-2 | For generating single cell suspensions of dissociated neurospheres |
| Xylenes Histological grade | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Protocol Harris Hematoxylin Mercury free (acidified) | Fisher Scientific | 245-678 | |
| Protocol Eosyn Y Solution (intensified) | Fisher Scientific | 314-631 |
References
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