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Medicine

Transposon Mediated Integração de DNA plasmídeo na zona subventricular de Neonatal Ratos para gerar modelos novela de Glioblastoma

Published: February 22, 2015 doi: 10.3791/52443

Introduction

O glioblastoma multiforme (GBM) é o (60%) de tumor cerebral primário mais comum em adultos, com uma sobrevivência média de 15-21 meses, quando tratados com cirurgia, radioterapia, quimioterapia e 1. Os novos tratamentos para GBM são imperativos. Terapias experimentais requerem testes em modelos animais que se reproduzem de forma adequada as principais características da doença humana. Estratégias para induzir GBM em roedores incluem mutagênese química com agentes alquilantes, germline ou alterações genéticas somáticas, ou transplante utilizando linhas celulares de glioma 2. Os modelos mais correntemente utilizados empregam a implantação de linhas de células de glioma, ou ortotopicamente, para dentro do cérebro ou por via subcutânea, utilizando células singeneicas em animais com genótipo idêntico; ou xenogénicas, linhas mais comumente humanos de células de GBM, implantados em camundongos 3 imunológico comprometido. Os xenoenxertos oferecem muitas vantagens para o estudo de tumores intracranianos: conveniência de reprodutibilidade, Standataxas de crescimento rdized, hora da morte e localização do tumor. No entanto, estes modelos têm limitações devido à abordagem cirúrgica artificial, invasivo utilizado para implantes e limitada capacidade de reproduzir com precisão histológico apresenta característica de GBM humano (OMS grau IV): necrose pseudo-pallisading, atipias nucleares, invasão difusa, a proliferação de micro-vascular e a formação de anormalidades vasculares glomerulóides 4-7. Indução de GBM por alterar o genoma de células somáticas com ADN oncogénico, ou com vectores virais 8-12, ou com integração mediada por transposão 13, reproduz mais de perto a etiologia da doença humana e recapitula características histopatológicas de GBM humano.

Historicamente, os tumores do SNC foram classificados com base na célula percebida de origem, o que foi observado, seria um fator preditivo de sobrevivência 14. GBMs são classificadas em primárias e secundárias. Emergentes evidência today aponta para a natureza altamente heterogêneo de glioblastoma 15 primário. GBM secundário (15%), o resultado da transformação maligna de astrocitoma de baixo grau (OMS grau I) e astrocytomas anaplasic (OMS grau II), estão associados com início mais precoce da doença, melhor prognóstico e um padrão de "proneural" da expressão gênica , enquanto que GBM primário (85%) mostram um início tardio, o prognóstico pobre e glial (clássica), neural ou padrões de expressão mesenquimais. Se estes padrões de expressão de genes correlacionam-se com a célula de origem real do tumor é ainda a ser activamente investigados. A acumulação de dados mostra que a combinação de mutações genéticas associadas com GBMs são preditivos para a sobrevivência. Por exemplo, a perda de heterozigose (LOH) de cromossomos 1p / 19q, mutações IDH1, PDGFRα ampliações, estão associados com GBMs secundárias, padrão de expressão proneural e melhor prognóstico, enquanto que a superexpressão de EGFR, Notch e Sonic hedgehog ativação da via, Nf1 e PTEN perda e mutações do p53 estão correlacionados com neural, clássica, ou GBM primário mesenquimais e pior prognóstico 16,17. O advento dos projetos de seqüenciamento em larga escala e da acumulação de numerosos espécimes de pacientes disponíveis para teste traz uma riqueza de novas informações no que diz respeito a mutações genéticas e os caminhos envolvidos na GBM patogênese e progressão ea possibilidade de medicina individualizada, onde terapias pode ser adaptado especificamente para as anormalidades genéticas do paciente. Em última análise, para avaliar o valor preditivo destas mutações e caminhos de uma forma sistemática, e para testar possíveis tratamentos para cada caso, requer modelos animais de GBM com alterações genéticas pré-determinados. Transposon integração mediada de DNA genômico oferece uma abordagem viável.

O sistema transposon Bela Adormecida, membro da classe / mariner Tc1 de transposons, foi "acordado" (construído) em um proce multi-passoss de mutagênese sítio específico de um gene transposase salmonóide, que se tornou mais dormente de 10 milhões de anos atrás 18,19. Em essência, os transposons de ADN flanqueadas por sequências específicas (repetições invertidas / repetições directas: IR / DR) podem ser integrados no genoma de uma maneira "corta e cola" por meio da actividade da transposase sono de beleza. A transposase reconhece os extremos dos sites de RI, extirpa o transposão e integra aleatoriamente em um outro local de ADN entre as bases de T e A, bases que são duplicados em cada uma das extremidades do transposão durante transposição (Figura 1a). O sono transposase beleza é composta por três domínios, um domínio de ligação de transposões, uma sequência de localização nuclear e um domínio catalítico. Quatro moléculas de transposase são necessárias para aproximar as duas extremidades do transposão em conjunto e permitir a transposição, no entanto, se demasiadas moléculas de transposase estiver presente, pode dimerizar e tetramerize para inibira reacção de transposição 20. Uma reação transposição eficiente requer uma ótima relação de transposase de transposons. O ADN que codifica para a transposase pode ser entregue no mesmo plasmídeo com o transposão (em cis) ou num plasmídeo diferente (em trans). Para assegurar a relação óptima entre a transposase e os transposões, um promotor com actividade adequada pode ser escolhido para a expressão da transposase (para o modelo de "cis") ou a relação de plasmídeos na solução injectável podem ser optimizados (para o modelo de "trans"). O sistema transposon Bela Adormecida pode ser utilizado com sucesso para a genómica funcional, mutagênese insercional, transgenia e terapia genética somática 21. Sendo uma construção sintética re-projetado para uma molécula funcional a partir de uma variante salmonóide dormente, Sleeping Beauty transposase não se liga a outros transposons em seres humanos ou outros mamíferos 20. Desde a sua descoberta, a engenharia molecular tem enhanced transposição a eficácia do sistema de transposão SB através da modificação das sequências IR e adição de dinucleótidos TATA flanqueando o transposão, resultando nos transposões PT2. Estes transposons tem otimizado ligação do SB ao site IR e aumento da eficácia da excisão. A transposase SB também passou por melhorias significativas; transposase utilizado em experiências aqui apresentadas é o SB100X, uma transposase hiperactivo gerado por uma estratégia de arranjo combinatório de ADN seguido por um rastreio genético em larga escala em células de mamífero 22.

Neste relatório apresentamos um método rápido, versátil e reprodutível para induzir intrínseca GBM em camundongos com, integração mediada por transposon não-viral de DNA plasmídeo em células da zona sub-ventricular de ratos neonatal 23. Nós apresentamos uma maneira simples de criar transposons com novos genes passíveis de integração genômica usando o sono transposase Beleza e demonstrar como monitorar a captação plasmídeo eprogressão da doença usando a bioluminescência. Nós também caracterizar as características histológicas e imuno-histoquímica do GBM reproduzido com este modelo. Além disso, apresentamos um método rápido para gerar linhas de células de GBM primárias destes tumores. O modelo de beleza do sono, em que os tumores são induzidos a partir de células originais ao animal, permite a avaliação funcional do papel dos genes candidatos GBM na indução e a progressão de tumores. Este sistema também é bem adequado para o teste de tratamentos novos GBM, incluindo terapias imunológicas em ratos imuno-competentes, sem a necessidade de procedimentos cirúrgicos invasivos inflamatórias, que podem alterar o microambiente local.

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Protocol

NOTA: Todos os protocolos de animais foram aprovados pela Universidade de Michigan Comitê para o Uso e tratamento dos animais (UCUCA).

1. Clonagem da sequência de interesse em novos dormir Transposons Beleza

Observação: para inserir genes ou elementos inibidores (como shRNA), utilizando o sistema de transposase Bela Adormecida, clonar a sequência de interesse para a espinha dorsal de uma pKT ou pT2 plasmídeo. Dirigir a clonagem de tal modo que os elementos reguladores, o gene de interesse e marcadores permanecem flanqueado pelas repetições invertidas (IR / DR). Um exemplo de clonagem PDGFβ em uma espinha dorsal pKT é detalhado abaixo (ver também a Figura 1b).

  1. Digest 5 ug do plasmídeo vector pKT-IRES-Katushka durante 4 horas a 37 ° C, com 5-10 unidades de enzimas de restrição Xbal / Xhol em 50 uL de volume de reacção.
  2. Digerir o mPDGFβ ADNc de 5 ug do plasmídeo pGEM-T-mPDGFβ durante 4 horas a 37 ° C, com 5-10 unidadess de enzimas de restrição NcoI / SacI.
  3. Precipitar o DNA total por adição de 2,5 volumes de etanol a 100%, e 1/10 de volume de 3 M acetato de Na, pH 5,8 e incuba-se durante a noite a -20 ° C.
  4. Centrifuga-se as amostras a 13.800 xg durante 15 min.
  5. Lava-se a pelete de ADN com 500 ul de etanol a 70%, centrifugar a 13.800 xg durante 1 min, repetir uma vez e re-suspender em 19 ul de água estéril livre de DNase.
  6. Siga as instruções do fabricante na rápida embotamento Kit para diminuir as extremidades de ambos vetor (pKT-IRES-Katushka) e insira (mPDGFβ).
  7. Coloque o vector embotado e inserir em um 1,2% brometo de etídio gel de agarose corado e executado em 80 V para 40 min. Visualizar as bandas, extirpar-los com uma lâmina de barbear e gel limpa purificar o ADN utilizando um kit de purificação em gel de acordo com o protocolo do fabricante.
  8. Ligadura da inserção e vector DNA purificado no passo 1.7, adicionando-os em um tubo em uma proporção de 4: 1 molar (insert: vector). Dentro deste tubo, pipette 1 ml de T4 ligase e 2 mL de tampão de ligase T4 (contendo ATP), e ajustar o volume para 20 l com água estéril. A reacção de ligação incubar durante 18 horas a 16 ° C.
  9. Transformar células bacterianas DH5ct quimicamente competentes os produtos ligados.
    1. Descongele as células competentes no gelo.
    2. Adicionar o volume total de reacção de ligação a 50 ul de células competentes, agitar suavemente o tubo e incubar a mistura em gelo durante 30 min. De choque de calor as bactérias para 45 segundos a 42 ° C e retornar imediatamente para gelo; incubar em gelo durante mais 2 min.
    3. Adicionar 950 mL de caldo de Luria para a cultura e incuba-se com agitação a 37 ° C durante 1 h. Bactérias centrifugar a 2400 xg por 3 min e re-suspender o sedimento em 200 mL de LB.
    4. Espalhe as bactérias transformadas em placas de Petri revestidas com LB-agarose e o antibiótico correspondente. Incubar a placa durante a noite a 37 ° C.
    5. Finalmente, coletar 5-10 bactericidarial colónias e cultura durante a noite a 37 ° C em 5 ml de meio LB com antibióticos.
    6. Purifica-se o ADN de plasmídeo utilizando um mini-kit de plasmídeo de ADN de acordo com as instruções do fabricante. Realizar uma restrição de diagnóstico digerir para verificar a incorporação correcta da inserção no vector e submeter os clones positivos por sequenciação de ADN para assegurar a orientação correcta da inserção.
  10. Selecione as colônias corretos e ampliar a produção de ADN usando uma alta qualidade, livre de endotoxina kit preparação plasmídeo.
  11. Elui-se o ADN em água estéril ou 1 mM Tris-HCl. DNA Armazenar a -20 ° C até estar pronto para injetar em recém-nascidos.

2. intra-ventriculares Neonatais As injecções

  1. Três a quatro semanas antes de experimentar, criar um mouse de reprodução gaiola com um macho e uma fêmea de ratinho, e um iglu de plástico colorido. Isso proporciona um ambiente enriquecido e auxilia o processo de acasalamento.
  2. Quando a gravidez é confirmada, remover o male para uma nova gaiola. Dezoito dias depois do acasalamento, monitorar gaiola diariamente para a entrega. Realizar injecções intraventriculares no dia pós-natal 1 (P1).
  3. Preparação da solução injectável
    NOTA: A solução para injecção é preparada por mistura de ADN de plasmídeo com o reagente de transfecção para criar as partículas para a transfecção. Abaixo está um exemplo sobre a preparação de uma solução de injeção utilizando um plasmídeo que codifica a transposase Bela Adormecida e luciferase: pT2 / SB100x-Luc e dois plasmídeos transposon: PT / CAGGS-NRASV12 e pT / CMV-SV40-LGT, em uma proporção de 1: 2: 2. Todos os plasmídeos têm uma concentração de 2 ug / uL. Detalhes importantes sobre a preparação da solução injectável são apresentados na discussão.
    1. Preparar a solução de DNA pela adição: 4 mg (2 ul) de pT2 / SB100x-Luc, 8 mg (4 ul) da PT / CAGGS-NRASV12 e 8 mg (4 ul) de pT / CMV-SV40-LGT e 10 ul de glucose a 10% para um volume final de 20 uL a uma concentração de 1 ug / mlADN e 5% de glucose.
    2. Preparar a solução de PEI por adição de 2,8 ul de jacto in vivo PEI, 7,2 ul de água estéril, e 10 ml de glicose a 10% para uma concentração final de 5% de glucose.
    3. Adicionar a solução de PEI para a solução de ADN, misturar e agitar com vortex e deixar repousar à temperatura ambiente (TA) durante 20 min. A solução já está pronto para a injecção. Após uma hora à temperatura ambiente, manter a solução em gelo.
    4. Coloque um 10 jul seringa limpa equipada com uma agulha hipodérmica de calibre 30 com 12,5 ° bisel na micropump (Figura 2 # 1).
  4. Para verificar o bom funcionamento do sistema de injecção, utilizar o injector automático (Figura 2 # 1) para retirar 10 mL de água para dentro da seringa e, em seguida, esvaziar a seringa totalmente
  5. Arrefece-se a fase neonatal estereotáxico (Figura 2 # 3) com uma suspensão de gelo seco e álcool a uma temperatura de 2-8 ° C.
  6. Induzir a anestesia, colocando os filhotes no gelo molhadodurante 2 min. Anestesia continuará na armação estereotáxica arrefecida para o resto do procedimento. Mantendo a temperatura do quadro acima de zero, entre 2-8 ° C irá impedir queimaduras térmicas. Como filhotes de precaução especial pode ser envolto em gaze, antes de colocar no gelo molhado.
  7. Encher a seringa com a solução de ADN / PEI.
  8. Imobilizar o cachorro no quadro estereotáxico, colocando sua cabeça entre os cobertos com gaze barras de ouvido (Figura 2B). Assegurar que o lado dorsal do crânio é horizontal, paralelo à superfície da armação e que as suturas cranianas são claramente visíveis. Limpe a cabeça com etanol 70%.
  9. Abaixe a agulha da seringa e ajustar coordenadas estereotáxica usando mostradores do quadro estereotáxico até que a agulha toca o lambda (a intersecção da linha média do parietal e occipital ossos) (Figura 2b).
  10. Levante a agulha e ajustar coordenadas estereotáxica para 0,8 mm lateral e 1,5 mm rostral para o lambda (Figura 2b).
  11. Abaixe a agulha até que ela toque e um pouco ondulações na pele. Medir as coordenadas. Abaixe a agulha mais 1,5 mm. A agulha vai perfurar a pele e crânio, e passar através do córtex para entrar no ventrículo lateral (Figura 2c).
  12. Usando o injector automático, 0,75 ul de injectar a solução de ADN / PEI a uma taxa de 0,5 mL / min
  13. Manter o cachorro na armação por mais um minuto para permitir a solução para dispersar para os ventrículos. Nesse meio tempo, anestesiar outro cachorro, em gelo durante 2 min, em preparação para a próxima injeção.
  14. Devagar e com cuidado levante a agulha, e coloque o filhote sob uma lâmpada de aquecimento. Controlar a respiração e atividade. Se necessário, fornecer estimulação suave das pernas até a primeira respiração segue.
  15. Retorne o cachorro para sua mãe depois de ter aquecido, atingiu uma cor rosada, está respirando regularmente e está ativo, normalmente 5-7 min. Se more de um cachorro é injectada a um tempo, manter todas as crias em conjunto até que todas as injecções são feitas. Se demorar mais injecções de 30 min, regresso metade dos bebés após os primeiros 30 min e o resto no final do procedimento.
  16. Monitorar que a barragem é sensível e carinho para seus filhotes. Se necessário, adicione uma mãe de aluguel para a jaula.
  17. Certifique-se de que o intervalo entre a colocação do filhote em gelo e colocando-o sob a lâmpada de aquecimento é inferior a 10 min. Quanto mais rápido o processo, melhor a sobrevivência. Geralmente, o tempo que leva para anestesiar e injectar um cachorro é 4 min.

3. Bioluminescência Monitoramento de formação de tumores e Progressão

3.1) Monitoramento plasmídeo Captação após a injeção

  1. 24-72 horas após a injeção, remova todos os filhotes de gaiola da mãe e coloque em um 6 bem limpo prato de cultura de tecidos, um filhote de cachorro por poço.
  2. Prepara-se uma solução / ml 30 mg de luciferina dissolvido em solução salina normal ou phosphate tampão. Prepara-se esta solução com antecedência e manter em pequenas alíquotas a -20 ° C.
  3. Usando uma seringa de 1 ml equipado com uma agulha hipodérmica de calibre 30 injetar 30 ul de luciferina via subcutânea entre as omoplatas do filhote. Certifique-se de que a agulha não perfurar quaisquer órgãos, por beliscar a pele e levantando-a ligeiramente antes de inserir a agulha.
  4. Imagem de imediato, usando um sistema in vivo de imagem de bioluminescência. Para o IVIS Spectrum, use as seguintes configurações para aquisições: Exposição automática, grande binning, ea abertura de f = 1.

3.2) Formação Monitoramento e progressão tumoral

NOTA: Os animais irão começar a formar tumores macroscópicos detectáveis ​​por bioluminescência e histologia dentro 2½-6 semanas, dependendo dos plasmídeos injectados oncogénicos.

  1. Usando uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de calibre 26, injectar 100 ul de uma solução / luciferina ml 30 mg intra-peritonealmente.
  2. Colocar o animal na câmara de anestesia. Injectar até cinco animais ao mesmo tempo.
  3. Espere 5 min, em seguida, iniciar o fluxo de oxigênio / isoflurano (1,5-2,5% de isoflurano) para anestesiar os animais. Depois de 3-4 minutos, remover os animais a partir da câmara de anestesia, iniciar o fluxo de oxigénio / isoflurano na câmara de bioluminescência. Colocar os animais nas respectivas ranhuras equipadas com cones de nariz de vidro para permitir a passagem desobstruída de anestesia e da luz.
  4. Tipicamente, adquirir uma série de seis imagens, a intervalos de 2 min com um tempo de exposição automática, bins mediana e uma abertura aberta da f = 1.
  5. Defina a região de interesse para todos os animais fotografados, tipicamente um oval sobre a região da cabeça, e medir a intensidade da luminescência utilizando as unidades fótons calibrados / s / cm 2 / sr.
  6. A partir do valor máximo para cada animal. Subsequentemente, as gravações podem ser comparados durante a progressão do tumor para cada animal e / ou entre os animais, por exemplo when diferentes tratamentos são empregados.

4. histológica e imunohistoquímica Analysis of New GBMs

NOTA: Quando os tumores atingiram o momento experimental desejada, os animais podem ser sacrificados, os cérebros perfundidos, fixas e analisados. Para a sobrevivência analisa o estágio moribundo representa o ponto final do experimento, quando os animais são sacrificados humanamente aos primeiros sinais de carga tumoral, como definido pelo estágio clínico quando o animal se torna mostrando sintomático mobilidade prejudicada, postura arqueada e pele desalinhado. Uma breve descrição dos métodos histológicos e imuno-histoquímica padrão utilizados é apresentada abaixo.

4.1) Perfusão e Fixação

  1. Anestesiar o rato com uma injecção intra-peritoneal de 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina.
  2. Confira o reflexo pedal apertando o pé do mouse. Quando esse reflexo é abolido, anestesia profunda indicando, IMMOBilize o mouse em uma placa de dissecção com pinos, abrir a cavidade abdominal, dissecar o diafragma e abrir a cavidade torácica para visualizar o coração.
  3. Inserir uma cânula romba de calibre 20 para o ventrículo esquerdo do coração. Ligar-se a cânula com um tubo de plástico que passa através de uma bomba peristáltica para um recipiente com solução de Tyrode oxigenada e heparinizado (NaCl a 0,8%, 0,0264%, CaCl 2 2H 2 O, 0,005% de NaH 2 PO 4, 0,1% de glucose, 0,1% de NaHCO3, 0,02 % de KCl). Iniciar o fluxo de solução de Tyrode, ajustando a velocidade da bomba peristáltica para proporcionar um fluxo lento e constante, aproximadamente, uma gota por segundo ou menos, se os animais são menores.
  4. Fazer uma pequena incisão na aurícula direita do coração para permitir a drenagem de sangue e de Tyrode.
  5. Monitorar a eficiência de perfusão observando branqueamento de órgãos internos (mais óbvias no fígado e rim), como eles ficaram sem sangue.
  6. Quando osolução de drenagem a partir do coração é clara (3-5 min), alternar as soluções de Tyrode do que 4% de paraformaldeído durante a fixação (4% PFA, pH 7,34 em tampão fosfato salino).
  7. Monitorar boa fixação dos tecidos pelo aumento da rigidez do pescoço e a cauda.
  8. Decapitar o mouse e cuidadosamente dissecar o cérebro do crânio.
    1. Puxe a pele que cobre o crânio rostralmente, em direção ao nariz, e agarrá-lo firmemente para estabilizar a cabeça, dorsal para cima.
    2. Usando um bisturi afiado, cortar para baixo ao longo da borda da órbita, para transecção os músculos orbitais e os arcos zigomática subjacentes.
    3. Vire a cabeça ventral lateral-se e remover os músculos do pescoço anexados usando um rongeur. Esmagar a primeira vértebra e removê-lo do tronco cerebral.
    4. Visualize a cóclea, pegue o osso temporal de sobreposição com o rongeur e criar uma abertura entre o osso temporal e occipital. Descascar o osso occipital da superfície do cerebelo.
    5. Gire a cabeça ventral lateral-se. O cérebro vai deslizar para baixo a partir do restante do crânio, agora conectado unicamente através dos nervos cranianos. Com uma tesoura pequena cortar o olfativo, ótico e nervos trigêmeos. Isso vai liberar o cérebro.
  9. Coloque cérebro em PFA a 4% durante a noite a 4 ° C para pós-fixação.
  10. Para a análise histológica e coloração hematoxilina-eosina, transferir os cérebros para tampão fosfato durante 24 horas e, em seguida, proceder à inclusão em parafina.
  11. Para a análise imuno-histológica, transferir cérebro em solução de sacarose a 30% em solução salina tamponada com fosfato, durante 24-48 h (até os cérebros afundar para o fundo do tubo)
  12. Cérebros seção na metade através do meio da região do tumor, coloque o cortelado para baixo dentro de um molde congelamento, embutir em media-incorporação crio (OCT composto) e flash-freeze em uma pasta de etanol de gelo seco, isopentano de gelo seco ou em nitrogênio líquido. Manter blocos congelados a -80 ° C, até o seccionamento e coloração.

4.2) Hematoxilina-eosina de Parafina Brains para Histo-patológico Análise de Intrínseca GBMs Incorporado

  1. Seção parafina cérebros incorporado a 4 mm de espessura, cair em um banho de água a 42 ° C e montagem em lâminas de vidro.
  2. Lâminas de-paraffinize, colocando-os durante 10 minutos em um forno a 60 ° C e, em seguida, transferi-los em intervalos de 5 min através de uma série de três recipientes cheios de deslizamento com xileno.
  3. Hidratar as lâminas por meio de uma série de banhos de etanol: etanol a 100% durante 2 minutos, repetir uma vez, etanol a 95% durante 2 minutos, repetir uma vez, etanol a 70% durante 2 min e, em seguida, transferir lâminas de água.
  4. Coloração das lâminas mergulhando-as em um recipiente de slides preenchido com hematoxilina de Harris por 2 min.
  5. Enxágüe em água corrente até que a água é clara.
  6. Dip desliza duas vezes em solução azulados (0,1% Bicarbonato de Sódio).
  7. Vamos lâminas ficar na água da torneira por 2 min, em seguida, transferir para o etanol de 80% para 2 min.
  8. Coloração das lâminas mergulhando-as em um recipiente cheio de Eosina para 5 min.
  9. Desidratar diapositivos numa série de banhos de etanol (80% etanol, 95 mergulhos 3-4% de etanol 2 min, repetir uma vez, com 100% de etanol 2 min, repetir uma vez).
  10. Limpar com 3 banhos consecutivos de xileno, 3 min cada.
  11. Lamela com um meio de montagem à base de xileno e deixar secar sobre uma superfície plana, à temperatura ambiente até estar pronta para a imagiologia. Guarde-o em temperatura ambiente.

4.3) Imuno-histoquímica de Brains incorporados Cryo-preservados para Molecular and Cellular Caracterização de De Novo Induced GBMs

  1. Recuperar blocos congelados a partir do armazenamento a -80 ° C, colocar em criostato e permitir que as temperaturas para equilibrar durante 30 min.
  2. Seção 12-14 Mm de espessura e montar 2-3 seções em lâminas de vidro com carga positiva. Os cortes em série, através da recolha de seções adjacentes em diferentes slides. Isto permite que a coloração com anticorpos diferentes em secções de tecido adjacentes dentro do tumor.
  3. Lâminas secas num exsicador durante pelo menos 1 hora após o corte para permitir uma boa aderência do tecido.
  4. Criar uma barreira hidrofóbica (com um marcador hidrófobo) em cada extremidade da lâmina para permitir o líquido para cobrir as secções e para permanecer na corrediça durante as lavagens. Cobrir as secções com uma solução de salino tamponado com fosfato com 0,1% de Triton-X (PBS 0,1% Tx) e agitar suavemente durante 5 minutos num agitador horizontal para permeabilizar o tecido. Repita duas vezes.
  5. Bloquear a ligação não específica com uma solução de 10% de soro normal de cabra (ou soro de animal em que o anticorpo secundário foi elevada) durante 30 min com agitação suave
  6. Preparar a solução de anticorpo primário em 2% de soro normal de cabra em PBS 0,1%Tx e pipeta a solução sobre as seções. Colocar as lâminas em câmara úmida coberta no escuro e manter a temperatura ambiente durante a noite.
  7. No dia seguinte, lavam secções três vezes durante 5 min com PBS 0,1% Tx e incuba-se o anticorpo secundário fluorescente diluído em 2% de soro de cabra normal a 0,1% Tx PBS durante uma hora.
  8. Lave os cortes três vezes durante 5 min com PBS 0,1% Tx, contracoloração com um corante nuclear (por exemplo, DAPI) durante 2 min, lavar uma vez mais, em água e clara lamela com um meio de montagem à base de água que irá preservar a fluorescência. Colocar as lâminas em uma superfície plana e deixá-los curar durante pelo menos 24 horas, no escuro, até estar pronto para a imagiologia. Mantenha a 4 ° C em seguida.

5. Geração de tumor primário linhas celulares com Genéticos alterações específicas.

  1. Para gerar linhas de células de A Bela Adormecida camundongos portadores de tumor selecionar um mouse com tumor grande confirmou (bioluminescência 10 7 8 -10 fótons / s / cm2 / jc).
  2. Eutanásia o mouse com uma overdose de anestésico isoflurano, decapitar o animal e cuidadosamente dissecar o cérebro do crânio (conforme descrito no capítulo 4). Coloque o cérebro em um prato limpo Petri.
  3. Usando uma lâmina de barbear, fazer cortes coronais anterior e posterior ao tumor. A localização do tumor é geralmente reconhecido devido à transparência do cérebro.
  4. Dissecar o tumor, geralmente 5-7 mm de diâmetro, com pinça fina e coloque em um tubo de 1,5 ml cheio com 300 ul Neural Stem Cell Mídia (NSC Mídia: DMEM / F12 com B-27 suplemento, suplemento N2, e Normocin, suplementado com EGF e bFGF recombinante humano numa concentração de 20 ng / ml cada).
  5. Suavemente homogeneizar tumor com um pilão de plástico, que se encaixa nas paredes do tubo.
  6. Adicionar 1 ml de solução de dissociação de tecido-enzima livre e incubar a 37 ° C durante 5 min.
  7. Passe suspensão de células através de um coador de células de 70 mm, lavar o filtro com 10 ml deMedia NSC, centrifugar a 300 xg por 4 min, o sobrenadante decantar e re-suspender pellet em 7 ml de mídia NSC.
  8. Placa para um balão de cultura T25 e a cultura a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos e com atmosfera de 95% de ar e 5% de CO 2. Após 3 dias, algumas células morreram, alguns aderiram ao fundo da placa de cultura, e alguns são neuroesferas formando, flutuando livremente nos meios de comunicação.
  9. Remover essas células em suspensão e re-placa em um frasco de cultura de tecidos T75.
  10. Depois de mais de três dias de cultura, coletar neurospheres, dissociar como descrito no passo 5.6, a tensão através de filtro de células e contagem de células. Congelar aliquotas de células em soro fetal de bovino 10% de DMSO e células de passagem, a uma densidade de um milhão de células em 14 ml de NSC suplementado com EGF e FGF para um frasco T75. A taxa de crescimento dependerá dos oncogenes utilizados para gerar tumores. Adaptar as condições de cultura de células para prevenir o crescimento excessivo de células e manter a densidade relativamente elevada.

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Representative Results

Para caracterizar as alterações histopatológicas de glioblastomas induzidas-SB, ratinhos neonatais C57 / BL6 foram injectados em P1 com um plasmídeo que codifica a luciferase (pT2 / SB100x-Luc), em combinação com plasmídeos codificando os transposons com ADN oncogénico, ou seja, NRAS (pT / CAGGS -NRASV12) e SV40 LGT (pT / CMVSV40-LGT) (Figura 3c) ou um plasmídeo que codifica uma p53 curto hairpin PDGFβ e com um repórter GFP (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) em combinação com NRAS (Figura 3d). Os animais foram monitorizados quanto a bioluminescência do dia após a injecção (Figura 2a) e periodicamente até atingir o estágio moribundo quando eles foram submetidos a eutanásia. Moribund fase é definida como a fase clínica, quando o animal se torna a mobilidade mostrando sintomático prejudicada, postura arqueada, pele desalinhado e perda de peso. Às vezes, os animais desenvolvem convulsões ou padrões anormais de movimento, como andar em círculos e salto repentino. No final da experiência o animals foram anestesiados. Os cérebros foram perfundidos, embebidos em parafina e processado para coloração de hematoxilina e eosina. Os dados apresentam tumores que apresentam as características de GBM humano (OMS grau IV) com hemorragias (Figura 3C), necrose pseudo-pallisading (Figura 3e) e invasão perivascular e difusa para o parênquima cerebral (Figura 3G, f). A formação de pseudopallisades é precedida pela ruptura de vasos grandes glomerulóides com endotélios gotejante (Figura 3i) que resultam em áreas de hemorragia com infiltração massiva de células mononucleares (Figura 3h). Mitoses atípicas (Figura 3J) e células tumorais gigantes multinucleadas (Figura 3k) também são patognomônicos de GBM humano.

Glioblastomas gerado usando o sistema da transposase Adormecida pode ser monitorizada ao longo da progressão do crescimento do tumor com a bioluminescência, se os plasmídeos injectadosluciferase codificação. Um exemplo experiência é apresentado na Figura 4a. Animais geralmente sucumbem de carga tumoral quando luminescência atinge uma intensidade de 10 7 -10 9 fótons / s / cm 2 / SR. A média de sobrevivência dos animais previsivelmente é dependente das combinações de transposões oncogénicos injetadas no cérebro neonatal, como ilustrado nas curvas de sobrevivência apresentadas na Figura 4b. Note-se que os tumores mais agressivos são induzidas com estas e com antígeno SV40 LGT (sobrevivência média de 30 dias), enquanto que a média de sobrevivência de animais com GBM induzidos com NRAS shp53 e PDGF é de 62,5 dias, e de animais injectados com shp53 e NRAS 83 dias.

De novo tumores formados pode ser caracterizada imuno-histoquimicamente pela sua expressão de moléculas característicos de tumores gliais. A Figura 5 mostra um tumor incipiente (22 dpi, bioluminescência 2x10 5 fotões / s / cm 2 / SR), induzida com shp53e ARN. O plasmídeo shp53 injetado codifica para a proteína verde fluorescente (GFP) para permitir a identificação de células transfectadas e sua progênie (pT2 / shp53 / GFP). Células GFP + tumorais expressam a células estaminais marcador nestina neural e alguns GFP + células também expressar a proteína glial fibrilar ácida (GFAP). A Figura 6 ilustra um tumor de um animal moribundo a 56 dpi, tumor, que também foi induzida com shp53 / GFP e NRAS. Numerosos GFAP + astrócitos são em torno do tumor. GFP + tumorais expressam nestin, mas não GFAP.

Uma grande vantagem ao utilizar esta técnica para induzir GBMs é a capacidade para gerar novas linhas celulares de GBM com alterações genéticas únicas por meio dos transposões injectados. Além disso, as linhas celulares personalizados podem ser gerados utilizando animais transgénicos com a composição genética específica. Estas linhas de células são fundamentais para fazer muitas perguntas mecanicistas usando ensaios bioquímicos. Eles são ideais para estudos de citotoxicidade com romance chemotherapeutic agentes. A Figura 7 ilustra uma neuroesfera a partir de um tumor de sono induzido com shp53 beleza, PDGF e ARN, que mostra a expressão de GFP, que é codificada por um dos plasmídeos injectados. Note-se que a expressão não é igualmente intensa em todas as células, indicando a heterogeneidade dessas células GBM primários.

Figura 1
Figura 1: (a) Representação esquemática ilustrando o mecanismo de "corta e cola" usada pela transposase sono beleza transposões para integrar-se no ADN cromossómico do hospedeiro um plasmídeo dador transposão está representado com o gene de interesse ladeado pelas repetições invertidas / repetições directas. (IR / DR; caixas de seta vermelha) sequências. A transposase SB (verde) liga-se ao IR / DR, extirpa o transposão e reintegra-lo entre pares aleatórios de bases dinucleótido TA no DNA cromossómico do hospedeiro. (B) Exemplo de clonagemum gene de interesse (mPDGFβ) na espinha dorsal de um vector SB (pKT-IRES-Katushka). O vector SB contém duas sequências IR / DR de repetição (vermelho) e uma cassete de expressão do gene que inclui sequências de promotor e intensificador, um local de clonagem múltipla (MCS; azul), locais internos de entrada do ribossoma (IRES), um marcador repórter fluorescente (Katushka: amarela), e um local de poliadenilação (poliA). O oncogene de interesse (mPDGFβ; laranja) está contido em um pGEMT vetor de clonagem. O oncogene, flanqueada por locais de restrição específicos (NcoI / SacI) é libertada através de digestão enzimática, e tornado rombo pela enzima de embotamento. O vector é linearizado e embotadas tão bem. Finalmente, o oncogene mPDGFβ é inserido no vector dador por meio de uma reacção de ligação de extremidade romba para gerar o novo vector plasmídeo transposão:. PKT-mPDGFβ-IRES-Katushka favor clique aqui para ver uma versão maior oesta figura f.

Figura 2
Figura 2: Configuração Experimental e guias para injecções intra ventricular em ratos neonatais (a) Um quadro estereotáxico (2) com relógios comparadores é equipado com um injector automático segurando uma seringa de 10 mL (4). Dentro do U quadro, um quadro adaptador neonatal está fixado (3). O painel do injector automático (1) controle permite a seleção precisa de seringa, volume e velocidade de fluxo (b) A fotografia de um rato neonatal (P1) com uma agulha inserida nas coordenadas necessárias para injeções no ventrículo lateral: 1,5. mm ventral e 0,8 mm lateral à lambda. (c) Ilustração de uma secção coronal através do cérebro de um rato neonatal (P1) destacando as dimensões relativas e posição dos ventrículos.


Figura 3: Os tumores induzidos com o sistema transposon Bela Adormecida mostrar as características histológicas imagem humana GBM (a) Bioluminescência de um filhote de cachorro neonatal 24 horas após a injeção de intraventricular com plasmídeos que codificam NRAS, SV40 LGT (b) imagem Bioluminescência de um animal adulto (. 50 dpi) com um grande tumor induzida com NRAS shp53 e PDGF. (c) (d) Secção coronal Hematoxilina e eosina de uma secção coronal de um cérebro de um rato moribundo com um tumor induzida com NRAS e LGT (28 dpi). a partir de um cérebro de um rato com um tumor moribundo induz com shp53 NRAS e PDGF. (e), necrose pseudopaliçadas, característica histológica de GBM humano é observada em tumores de novo gerados. Seta aponta para as células dispostas em paliçada que migram para fora da área central da necrose (N) (f) e (g) de novo gerado tumores são altamente invasivo, que mostra os vasos sanguíneos ao longo de invasão (g) e difusa (f) para o parênquima cerebral normal. (H) A região de hemorragia com uma massiva invasão de células mononucleares (seta), a fase inicial de uma área de necrose pseudopaliçadas. (I) glomerulóides vaso grande com endotélio gotejante (seta) na origem da difusão de hemorragia no interior de um tumor induzido com NRAS e SV40 -LgT. (j) mitose atípica em um células tumorais (seta). (k) de células tumorais Gigantic com múltiplos núcleos grandes (seta).

Figura 4
Figura 4: Tumor-bearing animais podem ser monitorizados com bioluminescência durante toda a duração da progressão da doença. A média de sobrevivência de animais é previsto pela combinação deADN oncogénico injectado. (A) Exemplo de vestígios bioluminescentes de uma coorte de 7 C57 / BL6. Note-se que os ratos sucumbir cerca de uma semana depois de bioluminescência atinge 10 8 fótons / s / cm2 / sr. (B) as curvas de sobrevida Sample comparando sobrevida mediana de animais com tumores de sono de beleza gerados com diferentes combinações de plasmídeos. A sobrevida média dos tumores induzidos com NRAS e SV40 LGT é de 30 dpi enquanto que de animais com tumores induzidos com NRAS shp53 e PDGF ou shp53 e NRAS é de 62,5 dpi ou 83 dpi, respectivamente. dpi: dias após a injecção.

Figura 5
Figura 5: Nascente macroscópica GBM (22 dpi) induzida com shp53 e NRAS mostrar expressão de nestin e GFAP em GFP + tumor células (micrografias confocal) Painel (a) mostra um tumor nascente expressando GFP.. O painel (b) representa o mesmo campo que mostra a expressão da nestina. Painel de (a) e (b) ilustra a co-localização de nestina e GFP. (D) expressão da GFP em células tumorais. (E) a expressão de GFAP em algumas células tumorais e em células vizinhas do tumor nascente. (F) sobreposição de projecção de (d) e (e) ilustra algumas células tumorais (branco) que co-expressam GFAP e GFP. As barras de escala em (a) e (d) representam 75 mm.

Figura 6
Figura 6: GBM induzida com shp53, NRAS e PDGF a partir de um animal moribundo (56 dpi) mostrando o GFP e a expressão da nestina nas células tumorais e coloração abundante para o marcador glial GFAP madura envolve o tumor Painel (a) representa coloração de Nissl de secção acoronal. através do cérebro de um animal moribundo com um tumor (intensa coloração com azul de from aumento da celularidade) induzida com o sistema transposon Bela Adormecida usando shp53, PDGFΒ e NRAS. O painel (b), uma secção coronal adjacente ao ilustrado no painel (a) corados com o corante nuclear DAPI, que mostra a expressão da GFP em células tumorais. O painel (c) representa uma micrografia confocal da fronteira do tumor que mostra a expressão da GFP no tumor, identificado pela densidade nuclear alta com DAPI. Painel (d) ilustra o mesmo campo de visão como em (a), mostrando intensa expressão de GFAP em células adjacentes ao tumor. Painel (e) representa a sobreposição dos painéis (c) e (d). Painel (f) é uma micrografia confocal da fronteira do tumor, que mostra a expressão da GFP em células tumorais. Painel (g) representa o mesmo campo de visão como em (f), que mostra a expressão de nestina nas células tumorais. Painel (h) é a projecção de sobreposição de painéis (f) e (g)

Figura 7
Figura 7:. As neuroesferas a partir de um tumor de sono induzido com shp53 beleza, PDGF e NRAS após 5 dias em cultura, passagem 2. As células expressando GFP são codificados no plasmídeo shp53 PDGF (pT2shp53 / GFP4 / mPDGF β) painel (a) é uma micrografia de campo claro de um neuroesfera. O painel (b) representa uma micrografia de epi-fluorescência da mesma vista como em (a) mostra a expressão da GFP nas células de neuroesferas. O painel (c) representa a sobreposição dos painéis (a) e (b).

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Discussion

Neste artigo, que detalhe um método versátil e reprodutível para a geração de novos modelos de GBM utilizando integração mediada SB transposase- de ADN plasmídeo oncogénica em células vizinhas da zona subventricular dos ratinhos neonatais. Nós apresentamos um protocolo para gerar plasmídeos transposon com novos genes de interesse, ilustrar como monitorar a progressão dos tumores em animais vivos, e como caracterizar características histopatológicas e imuno-histoquímica destes tumores.

Como nosso laboratório (Figura 3) e os outros 13 têm mostrado, este modelo cria de forma confiável tumores com as características marcantes do GBM humano, incluindo (1) necrose pseudo-paliçada, (2) proliferação vascular, (3) atipia nuclear, (4) mitoses anormais e ( 5) perivascular e invasão difusa. O uso de ratos neonatal é o ideal do ponto de vista logístico, fornecendo um procedimento técnico relativamente fácil com o mínimo de equipamento e sedação tempo / recuperação, permitindo a geração rápida de grandes amostras de tumores com alterações genéticas específicas. Estes tumores causar animais sucumbir a carga tumoral com uma mediana de sobrevivência previsível dependente das alterações genéticas induzidas. Finalmente, o modelo de BS foi usado como uma tela de intervenção terapêutica para o tratamento de resposta 24.

Há vários fatores importantes a considerar na preparação das soluções utilizadas para as injeções neonatais. As soluções de ADN necessita de ser estéril, livre de endotoxinas e concentradas (2-7 mg / mL) para permitir o volume mínimo de injecções. A proporção óptima de resíduos de azoto na polietilenoimina (PEI) para os resíduos de fosfato no DNA (relação N / P) é 7. Isto assegura a formação de complexos de partículas carregadas positivamente que se ligam a radicais aniónicos nas superfícies das células e irão ser endocitose. Uma vez no citoplasma, o influxo osmótico fará com que as partículas de rebentar e libertar o Encapsulamentoed plasmídeo de ADN. A solução in vivo de jacto de PEI tem uma concentração de 150 mM expressa como resíduos de azoto. Dado que um ug de ADN tem 3 nmol de fosfato aniónico, a quantidade de reagente necessária pode ser calculada com a fórmula de transfecção:

ul in vivo de jacto de PEI = / 150 [(ug de ADN x 3) relação N / P x].

Por exemplo, para preparar a 40 ul de solução de ADN de 0,5 mg / mL, com uma relação N / P de 7, 20 ug de ADN são necessários. O volume de PEI necessário será de 20 * 3 * 7/150 = 2,8 ul.

Até cinco plasmídeos diferentes pode ser injectado simultaneamente. Os experimentos aqui apresentados entregar o sono transposase Beauty in trans em um plasmídeo que também codifica a luciferase (SBLuc). Como mencionado na introdução, a proporção de moléculas de transposase para transposões é importante para garantir a transposição óptima. A razão óptima (empiricamente estabelecida) do plasmídeo SB100x ao transpOSON DNA de plasmídeo é 1: 4. Assim, se se usa dois plasmídeos diferentes transposões, T1 e T2, por exemplo, a proporção de SBLuc: T1: T2 será de 1: 2: 2; ou para um total de 20 ug de ADN em 40 ul de uma solução de 4 g de SBLuc vai ser misturado com 8 ug de T1 e de T2 8 ug. Para três diferentes plasmídeos de transposão a relação será de SBLuc: T1: T2: T3 = 1: 1,33: 1,33: 1,33 e para quatro transposões: 1: 1: 1: 1: 1.

É útil para verificar a absorção de ADN de plasmídeo por bioluminescência de 24-72 h após a injecção. À medida que os animais crescem, o aumento da densidade óptica da pele, pele, cérebro e do crânio, impede a monitorização da progressão do tumor até que o tumor atingiu um tamanho limiar, aproximadamente 1-2 mm 3 para ratinhos C57BL6 pigmentadas. Melhor transmissão da luz é possível nestes ratos, se a sua pele é raspada, ou quando usar camundongos com branco ou nenhuma pele.

Várias limitações precisam ser considerados quando se utiliza este modelo. Primeiro, o genematerial de tic introduzido com os plasmídeos injectados pode ser integrado aleatoriamente no genoma do hospedeiro em diferentes localidades e número de cópias. Isto pode conduzir a variabilidade entre as células de tumor e entre tumores. Em segundo lugar, o ADN é inserido em primeiro lugar introduzida em sequências de ADN intrónicas TA repetição 25, no entanto, a possibilidade de interferência com a codificação de DNA genómico hospedeiro permanece. Terceiro, as injeções intraventricular pode causar uma taxa pequena, mas persistente de hidrocefalia em ratos jovens, que se torna visível clinicamente e sintomático na semana 3o-4o de vida. Algumas cepas de camundongos são mais propensas a hidrocefalia do que outros (ou seja, C57 / BL6 mais de FVB). Para minimizar o risco de indução de hidrocefalia, recomenda-se a injectar um volume tão pequeno quanto possível (menos de 1 ml em C57 / BL6 ratinhos), para assegurar que as agulhas são afiadas, as soluções têm baixa salinidade e para fornecer crescentes com filhotes alimentos enriquecidos, a fim de permitir que para a ossificação atempada do bon crânioes. Finalmente, os tumores em estágio avançado geralmente desenvolvem necrose, o que tem que ser considerado ao monitorar camundongos por bioluminescência. A leitura mais baixa pode indicar um tumor avançado, com grandes áreas de necrose e não necessariamente uma resolução do tumor, como consequência do tratamento. Em última análise, a análise histológica continua sendo o padrão ouro para avaliar a progressão do tumor.

O advento de todo tumor de sequenciamento do genoma nos últimos anos abriu a porta para a exploração do papel dos genes mutados recorrentemente em GBM. O modelo A Bela Adormecida é ideal para a validação oncogenes potenciais ou supressores de tumor. Tal como no exemplo dado no presente documento com PDGFβ ligando, a clonagem da sequência de cDNA de ratinho de um oncogene candidato em um plasmídeo de esqueleto SB estabelecida conduzirá a expressão constitutiva nas células transfectadas. Avaliação do papel de supressores tumorais pode ser eficazmente realizada clonando na espinha dorsal do plasmídeo SB com sequências candidatas, (umvailable por exemplo no banco de dados códice ARNi 26), para criar expressão robusta de segunda geração curtos miR-grampos.

Um debate atual no campo da investigação GBM está relacionada com a identidade de origem de células-de-. Foi recentemente demonstrado que, em ratinhos, tumores induzidos pelo p53-regulação para baixo e Nf1 em células estaminais neurais, se originam de células precursoras de oligodendrócitos 27. Usando o modelo de transposon Bela Adormecida, estudos similares podem ser projetados para testar se outras alterações genéticas preferencialmente como alvo outras populações de células-tronco / células precursoras para gerar GBMs. Conhecimento de tais estudos vai melhorar muito a nossa compreensão da etiologia GBM e criam caminhos para novas abordagens terapêuticas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors Stoelting 51670 Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable 
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) Stoelting 53311 Injections can be made without it, ,but    the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience
10 μl 700 series hand fitted MICROLITER syringe Hamilton Model 701 This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used
30 gauge hypodermic needle
(1.25", 15o bevel) 
Hamilton S/O# 197462 This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced.
in vivo-jetPEI Polyplus Transfection 201-10G Aliquot in small volumes and keep at -20 oC 
D-Luciferin, Potassium Salt Goldbio.com LuckK-1g Other sources of firefly lucifierase are just as adequate
Hematoxylin Solution, Harris Modified Sigma Aldrich HHS128-4L
Tissue-Tek O.C.T. Compound Electron Microscopy Sciences 62550-01 For embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry
Advanced DMEM/F-12, no glutamine Life Technologies 12634-010 For the culture of neurospheres
B-27¨ Supplement (50X), serum free  Life Technologies 17504-044 Serum free supplement for the culture of neurospheres
N2 Supplement (100x) Life Technologies 17502-048 Serum free supplement for the culture of neurospheres
Normocyn InvivoGen ant-nr-1 Anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres
Recombinant Human EGF PEPROTECH AF-100-15 Growth factor supplement for the culture of  neurospheres
Recombinant Human FGF-basic PEPROTECH 100-18B Growth factor supplement for the culture of  neurospheres
Name Company Catalog Number Comments
HyClone HyQTase  Cell Detachment Reagent  Thermo Scientific SV3003001 For the dissociation of neurospheres
Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle Fisher Scientific K749510-0590 For the dissociation of freshly dissected tumors
Falcon Cell Strainers mesh size 70 um Fisher Scientific 08-771-2 For generating single cell suspensions of dissociated neurospheres
Xylenes Histological grade Fisher Scientific C8H10
Protocol Harris Hematoxylin Mercury free (acidified) Fisher Scientific 245-678
Protocol Eosyn Y Solution (intensified) Fisher Scientific 314-631

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References

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Transposon Mediated Integração de DNA plasmídeo na zona subventricular de Neonatal Ratos para gerar modelos novela de Glioblastoma
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Calinescu, A. A., Núñez,More

Calinescu, A. A., Núñez, F. J., Koschmann, C., Kolb, B. L., Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma. J. Vis. Exp. (96), e52443, doi:10.3791/52443 (2015).

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