Abstract
لقد كان تحديد سمية الإنجابية من آلاف المواد الكيميائية الموجودة في بيئتنا واحدة من أكثر التحديات محيرة في مجال الصحة البيئية. ويرجع ذلك جزئيا إلى ندرة نظم النموذج الذي يمكن (1) تلخيص بدقة ملامح مفاتيح العمليات الإنجابية و(2) القيام بذلك في المتوسط إلى الإنتاجية العالية الموضة، من دون الحاجة إلى وجود عدد كبير من الحيوانات الفقارية.
وصفنا هنا مقايسة في C. الخيطية ايليجانس التي تسمح للالتعرف السريع على المواد السامة الجرثومية من خلال رصد تحريض الأجنة مختل الصيغة الصبغية. من خلال الاستفادة من خط مراسل GFP، وأخطاء في العزل الصبغي الناجمة عن انقطاع سلالة الجرثومية وتصور بسهولة وكميا بواسطة المجهر الآلي مضان. وهكذا فإن فحص مجموعة معينة من المركبات لسميتها يمكن أن يؤديها في شكل لوحة 96- إلى 384 جيدا في غضون أيام. تحليل ثانوي للح إيجابيةلها يمكن القيام بها لتحديد ما إذا كان الشذوذ الصبغي نشأت من اختلال الانتصافي أو من أوائل الجنينية أخطاء كروموسوم الفصل. وإجمالا، يمثل هذا الاختبار استراتيجية مرور الأول-سريعة للتقييم السريع من اختلال وظيفي الجرثومية التالية التعرض للمواد الكيميائية.
Introduction
هناك ما يقرب من 87،000 من المواد الكيميائية المسجلة للتجارة في الولايات المتحدة، ولكن فقط عدد قليل من هذه قد تم اختبارها للآثار الصحية المحتملة 1. من تلك التي تم اختبارها، تم تقييم سوى جزء للآثار الصحية الإنجابية ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة في تحديد تحوير الأحداث الإنجابية المبكرة في الثدييات، وخصوصا خلال الإناث تطوير الخلية الجرثومية والتمايز. في الواقع، أول الأحداث الانتصافي تجري خلال المراحل الأولى من التطور الجنيني في الثدييات الإناث، وبالتالي فهي صعبة للوصول إلى وجمع بأعداد مناسبة لأغراض الفحص.
يوفر الجرثومية على الرابط الحاسم بين الأجيال، وظيفتها المناسبة تعتمد على التنفيذ الدقيق للبرنامج معقد من الانقسام الخلوي والكروموسومات يسمى الانقسام الاختزالي. ديسريغولاتيون عملية الانتصافي قد يؤدي إلى انخفاض الخصوبة وإنتاجالأمشاج والأجنة مع عدد غير طبيعي من الكروموسومات، وصفته حالة عدم توازن الصبغيات. أخطاء العزل الصبغي في الانقسام الاختزالي هي ذات أهمية كبيرة لصحة الإنسان. شذوذ صبغي شائعة، مع تردد من 1 في 150 ولادة حية، تثلث الصبغي 21 و 18 و 13 وكذلك X و Y أخطاء كروموسوم يجري أنواع الأكثر انتشارا 2،3. وعلاوة على ذلك، والتشوهات الخلقية، بما في ذلك أصول الكروموسومات، هي السبب الرئيسي للوفاة الرضع في الولايات المتحدة 4 إن فكرة أن التأثيرات البيئية يمكن أن تؤثر على الفصل الكروموسومات والسلوك ليس جديدا 5، ولكن لا تزال غير مفهومة. ولذا فمن الأهمية بمكان لتحقيق أي من المواد الكيميائية التي أدخلت بيئتنا تتداخل مع خصوبة الإنسان والتنمية في وقت مبكر والصحة الإنجابية الشاملة.
في ضوء هذه القيود المفروضة على نماذج الثدييات، وقد وضعنا شاشة الفحص الإنتاجية العالية لاختبار سمية الإنجابية في الدودة <م> C. ايليجانس. لقد حشدت العديد من الميزات الهامة التي يوفرها هذا النظام النموذجي الوراثية التي يشيع استخدامها مثل صغر حجمها، وانخفاض التكلفة، ودورة التكاثر قصيرة، نسبة عالية من الخلايا الجرثومية وسهولة التلاعب 6. يمكن زراعتها الديدان في لوحات 96-جيدا أو في الثقافات السائل حجم عالية وذلك بسبب شفافيتها يمكن تصوير مباشرة على لوحات للكشف عن صحفيين الفلورسنت. الفحص هو موضح أدناه يستفيد من هذه الخصائص ويستفيد من سلالة دودة تحتوي على مراسل الفلورسنت Pxol-1 :: GFP للكشف عن انقطاع سلالة الجرثومية وتحريض عدم توازن الصبغيات الجنينية.
ويستند استخدام هذه السلالة المراسل على البروز نادر عموما من الذكور في السكان دودة خنثوي في المقام الأول. هذه الذكور (<0.2٪) تنشأ بشكل طبيعي من خطأ في الفصل بين كروموسوم X 7. لكن، وكما تعطل الجرثومية يؤدي في كثير من الأحيان إلى أخطاء في فصل الجسميةوheterochromosomes، فإنه يرتبط على حد سواء مع ارتفاع معدل انتشار الإصابة الذكور النمط الظاهري (X missegregation)، وكذلك الفتك الجنينية (صبغي جسدي missegregation). للكشف بسهولة تحريض من الذكور في حين الالتفاف على قضية الفتك الجنينية، ويستخدم مروج المحدد لذكر (XOL-1) لدفع التعبير عن GFP في الأجنة المبكرة لا يزال الواردة في الرحم الدودة. على هذا النحو، ويستخدم ظهور الأجنة، معربا عن GFP كبديل لوجود الأجنة مختل الصيغة الصبغية. تم عرض هذه الطريقة تستخدم في السابق لتحديد الجينات المتورطة في صيانة سلالة الجرثومية والانقسام الاختزالي 8،9. تكييفها لفحص الكيميائي، وتوظيف هذه السلالة في المتوسط إلى شاشة عالية الإنتاجية. الأهم من ذلك أن سلالة تقارير بأمانة aneugenicity من المواد الكيميائية وبالتالي فهي ذات الصلة لنقاط النهاية الإنجابية الثدييات 10. سوف مقايسة الموصوفة هنا تكون مفيدة بشكل خاص لعلماء السموم في إعدادات صناعة الكيماويات الدوائية وتبحثلتقييم بسرعة سمية المواد الكيميائية نحو النهاية الإنجابية. وعلاوة على ذلك، هذا الاختبار محاذاة تماما مع الأولويات الحكومية سلط عليها الضوء في سمية في 21 تقرير القرن الحادي و11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد البكتيريا تغذية
ملاحظة: يصف هذا القسم إعداد البكتيريا تغذية (E. القولونية سلالة OP50).
- عزل مستعمرة واحدة من E. القولونية سلالة OP50 من مرق استذابة (LB) لوحة أجار وجو معقم و مطهر تطعيم في 300 مل من مرق LB تعقيمها.
- السماح للثقافة تلقيح لتنمو بين عشية وضحاها في شاكر في 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية، حتى يتم التوصل التشبع.
- نقل OP50 إلى 6 العقيمة، 50 مل أنابيب مخروطية وزنه مسبقا. بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 6،000 دورة في الدقيقة (5،000 x ج).
- تجاهل طاف ويغسل البكتيريا مع 50 مل من العقيمة M9. كرر مرتين.
- بعد غسل الثاني إزالة M9 المتبقية، وضمان أن لا M9 المتبقي في الأنبوب.
- تحديد وزن بيليه عن طريق وزن الأنبوب الذي يحتوي على بيليه البكتيريا وطرح وزن 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- Resuspend وأنا بيليهن M9 بتركيز 100 ملغ / مل.
- تخزين حل OP50 في 4 درجات مئوية حتى يتم استخدامه للثقافة دودة.
2. إعداد نيماتودا النمو المتوسطة لوحات (NGM) بيتري
ملاحظة: يصف هذا القسم إعداد لوحات NGM بيتري، والتي هي لوحات حيث C. تتم المحافظة على الديدان ايليجانس بشكل روتيني في المختبر.
- الأوتوكلاف آغار المتوسطة NGM.
- باستخدام الإجراءات العقيمة، والاستغناء 17 مل من NGM حل أجار إلى 6 سم لوحات بيتري باستخدام مضخة تمعجية.
ملاحظة: هناك كمية ثابتة من أجار في لوحات يقلل من الحاجة إلى إعادة تركيز المجهر عند التبديل من لوحة إلى أخرى. - ترك لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 أيام قبل الاستخدام للسماح للأجار يصلب والسماح للرطوبة الزائدة لتتبخر.
- البذور لوحات NGM باستخدام تقنية معقمة. تطبيق 1-2 قطرات من الثقافة السائلة OP50 وتنتشر باستخدام قضيب الزجاج. تأكد من عدملنشر العشب البكتيريا على طول الطريق إلى حواف الصفائح.
- اسمحوا العشب OP50 لتنمو لمدة 1-2 أيام في درجة حرارة الغرفة قبل استخدام لوحات لتنمو الديدان.
3. إعداد السكان دودة متزامن
ملاحظة: دورة حياة C. وتتألف ايليجانس من المرحلة الجنينية، وأربع مراحل اليرقات (L1-L4) والبلوغ. يصف هذا القسم إعداد السكان في سن متزامن من الديدان. جميع المواد القادمة في اتصال مع C.elegans بعد العلاج التبييض يجب أن تكون معقمة.
- يوم 1 - إعداد حامل دودة السكان
- استخدام لوحات NGM فيها غالبية السكان دودة تتكون من تجويع اليرقات L1.
- جمع اليرقات L1 مع دودة تعقيمها انتقاء ونقلها إلى الطازج 6 لوحات سم NGM المصنف مع OP50. احتضان لمدة ما يقرب من 65 ساعة على 20 درجة مئوية حتى غالبية الديدان هم من البالغين حامل. إلىتجنب لوحة الاكتظاظ والسماح للديدان أن ينمو دون استنفاد البكتيريا، لا نقل أكثر من واحد أو اثنين مجموعات من L1 اليرقات إلى كل لوحة NGM الطازجة.
- يوم 4 - إنشاء المتزامنة L1 اليرقات السكان
- جمع الديدان الحاملة للبيض من لوحات NGM من قبل غسلها مع 1-2 مل من M9 ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- السماح للديدان الحاملة للبيض الرواسب في قاع 15 مل أنبوب مخروطي لحوالي 5-10 دقيقة. إزالة طاف دون الإخلال بيليه دودة.
- نقل بيليه الدودة إلى 2-4 أنابيب microcentrifuge وإضافة 1 مل من التبييض / هيدروكسيد الصوديوم الحل. احتضان لمدة 2-3 دقيقة في RT. رصد التقدم المحرز في رد الفعل تحت stereomicroscope لتأكيد كل الديدان قد لقوا حتفهم. لا التبييض أطول من 5 دقائق كما الأجنة يمكن أن يموت.
- جمع الديدان بواسطة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 3،000 دورة في الدقيقة (900 x ج). إزالة طاف وإضافة 1 مل من العقيمة M9 لتحييد رد فعل.
- غسل الديدان مرتين من قبل الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 3،000 دورة في الدقيقة (900 x ج).
- إزالة طاف وإضافة M9 ليصل الى 100-200 ميكرولتر.
- باستخدام الزجاج ماصة باستير إضافة قطرة من دودة / M9 مزيج لمسح لوحات NGM واحتضان لهم لمدة 24 ساعة على الأقل عند 20 درجة مئوية للسماح للأجنة ليفقس.
ملاحظة: بدون الغذاء سيتم توقف نمو اليرقات في المرحلة L1.
- اليوم 5 - إنشاء المتزامنة L4 اليرقات السكان
- جمع اليرقات L1 من لوحات NGM واضحة من قبل غسل لوحات مع 1-2 مل من M9 ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- السماح للالديدان البالغة ميت الرواسب إلى أسفل أنبوب 15 مل المخروطية لمدة 5 دقائق تقريبا.
- جمع طاف، حيث الديدان L1 هي، في الجديد مخروطي 15 مل أنبوب، ويعجل الديدان بواسطة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 2،600 دورة في الدقيقة (1،000 x ج).
- إزالة طاف جنيهأفينغ ما يقرب من 500 ميكرولتر.
- تحديد تركيز الديدان في حل M9 عن طريق حساب عدد من الديدان في 10 ميكرولتر قطرات باستخدام stereomicroscope. عدد لا يقل عن 5 قطرات.
- ضبط تركيز الديدان إلى 20-25 الديدان / ميكرولتر وإضافة 50 ميكرولتر من دودة / M9 مزيج لوحات NGM المصنف مع OP50.
- احتضان لمدة 65 ساعة على 15 درجة مئوية (للحضانة من خلال نهاية الأسبوع) السماح للسكان متزامنة L1 لتنمو حتى تصل إلى مرحلة L4.
4. التعرض للديدان للمواد الكيميائية في لوحات 96-جيدا
ملاحظة: يصف هذا القسم استخدام Pxol1 :: مراسل النسخي GFP تحتوي على C. سلالة ايليجانس للكشف عن تحريض عدم توازن الصبغيات.
- جمع اليرقات L4 من لوحات NGM واضحة من قبل غسل لوحات مع 1-2 مل من M9 ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- السماح للL4 الديدان الرواسب إلى أسفل15 مل أنبوب مخروطي لحوالي 5-10 دقيقة. إزالة طاف دون الإخلال بيليه دودة.
- إضافة 3-5 مل من M9 وتحديد تركيز الديدان في حل M9 عن طريق حساب عدد من الديدان في 10 ميكرولتر قطرات باستخدام stereomicroscope. عدد لا يقل عن 5 قطرات لكل عينة.
- Resuspend والديدان بتركيز 1،000 الديدان / مل في M9.
- تمييع البكتيريا OP50 من الباب 1 10 أضعاف مع M9. تأكد من أن البكتيريا معلق تصل درجة حرارة الغرفة لانخفاض درجة الحرارة تؤثر تطوير دودة.
- باستخدام ماصة الأقنية، أولا إضافة 100 ميكرولتر من دودة / M9 مزيج (من الخطوة 4.4) ثم قم بإضافة 400 ميكرولتر من البكتيريا OP50 المخفف (من الخطوة 4.5) إلى كل بئر من 2 مل جولة عميقة أسفل لوحة 96-جيدا. في النهاية، سوف يكون كل بئر 100 الديدان في 500 ميكرولتر.
- إضافة 0.5 ميكرولتر من إما الكيميائية الاختبار أو عنصر التحكم المناسب إلى آبار المطلوب، لتحقيق concentr النهائي المقترحأوجه من 100 ميكرومتر، وتركيز تستخدم عادة في شاشات الكيميائية في C. ايليجانس 12. كشف الإيثانول أو DMSO الضوابط المذيبات في تركيز النهائي من 0.1٪.
ملاحظة: نوصي استخدام نوكودازول (100 ميكرومتر)، ومراقبة إيجابية. - ختم لوحة باستخدام فيلم لاصقة. تأكد من ختم لوحة جيدا لمنع التلوث المتبادل بين الآبار.
- التفاف لوحة مع رقائق الألومنيوم.
- نقل لوحة لشاكر (170-180 دورة في الدقيقة) من درجة حرارة مناسبة لطول مناسب من الزمن (24 أو 65 ساعة). درجة حرارة الغرفة يؤثر على نمو الديدان. الحفاظ على درجة الحرارة نحو 20 درجة مئوية.
5. اكتساب صورة حامل الديدان في لوحة 384 جيدا
ملاحظة: يصف هذا القسم استخدام المجهر نسبة عالية لصورة Pxol1 يتعرض :: الديدان GFP، لتصور التعبير عن GFP في الأجنة داخل الرحم من المنحرفين الكبار. إلىكل لوحة 384 جيدا ليتم عرضه، واستخدام الديدان من لوحات 4 × 96-جيدا.
- بعد التعرض للمواد الكيميائية في شاكر، والسماح للوحة 96-جيدا بقية لمدة 10-15 دقيقة للسماح للالديدان البالغة من رسوبيات إلى الجزء السفلي من لوحة.
- باستخدام ماصة متعدد القنوات، وإزالة 350 ميكرولتر من M9، والحرص جدا على عدم تعكير صفو الديدان في الجزء السفلي من لوحة.
- غسل الديدان مع 1 مل من M9 وكرر الخطوة 5.1.
- باستخدام ماصة متعدد القنوات، وإزالة 1 مل من M9، والحرص على VEY عدم تعكير صفو الديدان في الجزء السفلي من لوحة.
- باستخدام ماصة الأقنية، resuspend والديدان في M9 المتبقية وجمع 100 ميكرولتر من دودة / M9 مزيج من لوحات 96-جيدا وتحميله في الآبار من الجدران السوداء / واضحة أسفل لوحة 384 جيدا. كرر العملية باستخدام الديدان من لوحات 4 × 96-جيدا، حتى يتم تحميل جميع الآبار من لوحة 384 جيدا.
ملاحظة: من المهم لجميع الآبار لديهم نفس حجم من أجل زيادةكفاءة وسرعة ضبط تلقائي للصورة أثناء عملية الحصول على الصور. وينبغي أن تتضمن كل بئر بين 80 و 100 الديدان. - إضافة 1 ميكرولتر من الليفاميزول (100 ميكرومتر) إلى كل بئر والسماح للديدان احتضان لحوالي 30 دقيقة.
ملاحظة: الليفاميزول بمثابة مستقبلات ناهض أستيل ويشل الديدان. - نقل لوحة إلى أعلى مستوى المجهر المحتوى widefield قادرة على توفير التصوير الآلي.
- لاقتناء الصور، واستخدام عالية المحتوى الحصول على الصور وتحليل البرامج وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة. حدد الهدف 4X لاكتساب 1 صورة لكل بئر.
- قبل البدء في الحصول على الصور، وضبط المعلمات التصوير GFP إلى 45 ميللي ثانية من التعرض ودقة وضوح الصورة إلى 2،160 X 2،160.
- جمع البيانات مثل عدد الديدان إيجابية GFP مقسوما على إجمالي عدد الديدان في البئر، هذا الاجراء الأخير هو ثابت نسبيا بين الآبار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التعرض للPxol-1 :: GFP مراسل سلالة لعوامل كيميائية مثل أنيبيب السم نوكودازول (الشكل 1) يؤدي إلى تحريض على نسبة عالية من الأجنة، معربا عن GFP في الرحم من المنحرفين الكبار يتعرض مقارنة السيطرة DMSO. الأجنة GFP إيجابية هي أكثر إشراقا بكثير من ضعف مضان الخلفية التي لوحظت في الأجنة الأخرى، وكذلك لصناعة السيارات في مضان لوحظ في أمعاء الحيوانات. يتم تصوير الديدان يتعرض مباشرة على لوحات 384 جيدا ويتم حساب عدد من الديدان التي تحتوي على جنين واحد على الأقل GFP إيجابية لكل بئر وتطبيع على العدد الكلي من الديدان في ذلك أيضا. وضرب إيجابي من الشاشة الكيميائية يعني مركب يسببها نسبة الأجنة GFP إيجابية في عدد السكان دودة على تردد 1.7x أعلى من DMSO 10. وبعد عتبة التحسين، وتحليل المحتوى المرتفع صورة (انظر ملف المواد) يسمح للأحسب الآليulation من عدد الكائنات إيجابية (أي الأجنة) مقسوما على إجمالي عدد الديدان في البئر وهو الأسلوب المفضل للتكيف على نطاق واسع من الفحص.
| تبدأ مع السكان دودة المتعطشة لتوليد السكان البالغين حامل |
| ↓ (الثقافة 3 أيام) |
| تبييض السكان البالغين حامل |
| ↓ |
| نقل ابيض الديدان واضحة لوحات NGM |
| ↓ (1 ثقافة اليوم) |
| جمع متزامنة السكان L1 ونقل إلى لوحات NGM مع OP50 |
| ↓ (احتضان 65 ساعة على 15 درجة مئوية) |
| جمع السكان L4 متزامنة |
| ↓ </ td> |
| الاستغناء 100 L4 الديدان إلى كل بئر من لوحات 96-جيدا في 0.5 مل من M9 / OP50 |
| ↓ |
| إضافة المواد الكيميائية (100 ميكرومتر) إلى كل بئر |
| ↓ (احتضان لمدة 24 أو 65 ساعة) |
| نقل 100 ميكرولتر من السكان البالغين حامل متزامنة (80 الديدان) من لوحات جيدا 96 لوحة 384 جيدا. |
| ↓ |
| إضافة 1 ميكرولتر من الليفاميزول إلى كل بئر (1 ميكرومتر تركيز النهائي) |
| ↓ (احتضان 30 إلى 45 دقيقة) |
| التقاط وتحليل الصور من كل بئر مع المجهر المحتوى العالي |
الجدول 1. سير العمل التجريبي. يوم 1، استخدام تجويع السكان دودة لتوليد السكان البالغين حامل. اليوم 4، bleaCH يقع السكان البالغين حامل لتوليد السكان L1 متزامنة. يوم 5، ونقل السكان L1 من لوحات NGM واضحة لOP50 المصنف لوحات NGM لتوليد السكان L4 متزامنة. يوم 8، ونقل السكان L4 متزامنة لوحة 96 جيدا ويعرضهم للمواد الكيميائية المختلفة. يوم 9 ويوم 11، ونقل البالغين حامل تتعرض لوحة 384 بشكل جيد ليتم تصويرها مع المجهر عالية المحتوى.
| M9 العازلة - 1 L | |
| 1. الجمع بين المكونات التالية في كوب كبير أو تخرج اسطوانة باستخدام شريط مغناطيسي | |
| 3 ز KH 2 PO 4 | |
| 6 ز نا 2 هبو 4 | |
| 5 ز كلوريد الصوديوم | |
| 1 مل 1M MgSO 4 | |
| H 2 O إلى 1 L. | |
| 2. قسامة في زجاجات الحجم المناسب (300 مل في زجاجة 500 مل الحجم) | |
| 3. تعقيم بواسطة التعقيم لمدة 30-60 دقيقة | |
| وسائل الإعلام NGM لوحات - 4 L | |
| 1. إضافة ما يلي في دورق مخروطي، ثم ملء إلى 4 L: | |
| 12 جم كلوريد الصوديوم | |
| 10 غرام Bactopeptone | |
| 80 جم آجار | |
| 2. إضافة وتخلط جيدا: | |
| 4 مل من الكولسترول (5 ملغ / مل) | |
| 4 مل CaCl 2 (1 M حل الأوراق المالية) | |
| 4 مل MgSO 4 (1 M حل الأوراق المالية) | |
| 3. الأوتوكلاف لمدة 30-60 دقيقة | |
| 4. السماح لتبرد قليلا وإضافة 100 مل من KH 2 PO | |
| LB الإعلام - 1 L | |
| 1. إضافة إلى 800 مل التالية H 2 O | |
| 10 غرام Bacto-تريبتون. | |
| 5 ز خلاصة الخميرة. | |
| 10 غرام كلوريد الصوديوم. | |
| 2. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.5 مع هيدروكسيد الصوديوم. | |
| 3. ضبط مستوى الصوت إلى 1 L مع DH 2 O | |
| 4. تعقيم بواسطة التعقيم ل30 - 60 دقيقة | |
| محلول التبييض لمزامنة السكان - 50 مل | |
| 7.5 مل 10 N هيدروكسيد الصوديوم | |
| 6 مل التبييض (العادية) | |
| 36.5 مل درهم 2 O |
معشوقة = "jove_content"> الجدول 2. حلول.
الشكل 1: أمثلة من الصور التي تم الحصول عليها من التعرض للPxol-1 :: GFP مراسل سلالة للسيطرة DMSO ونوكودازول السيطرة إيجابي في هذا المثال، تعرض الديدان لمدة 24 ساعة إلى نوكودازول أو كان DMSO Pxol-1 :: الديدان GFP. تتعرض ل(A) 0.1٪ DMSO (مراقبة سلبية) أو (B) 100 ميكرومتر نوكودازول (مراقبة إيجابية) وتصويرها في لوحات 384 جيدا. السهم الأحمر: GFP الأجنة إيجابية واضحة للعيان داخل الرحم واحد نوكودازول تعامل الدودة. شريط مقياس = 1 مم. (C) و (D) يمكن تكبيرها أجزاء من (A) و (B) على التوالي. شريط مقياس = 0.33 ملم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الموصوفة هنا يشكل أول استراتيجية واسعة النطاق لتحديد المواد السامة الجرثومية. ويتطلب ذلك استخدام المعدلة وراثيا GFP Pxol-1 :: GFP تحتوي على السلالة التي تقارير بأمانة تحريض عدم توازن الصبغيات في الأجنة المبكرة والذي يستخدم كبديل لضعف الجرثومية. ينطوي على طريقة التزامن الدقيق لC. ايليجانس السكان دودة والتعرض الديدان للمواد الكيميائية في شكل 96-جيدا تليها التصوير من الديدان إيجابية GFP بواسطة المجهر الآلي عالية المحتوى.
عدة خطوات من هذا البروتوكول هي الحاسمة لاتساق النتائج. أولا، يجب أن يكون السكان دودة متزامن للغاية لتحقيق أقصى قدر من حيث عدد نظموا بشكل صحيح L4 اليرقات التي سيتم استخدامها لالتعرض. لهذا السبب، فإن المنهجية المبينة هنا تتضمن خطوتين التزامن، لأول مرة تبيض من السكان دودة ومن ثم عن طريق L1 المجاعة. في الفقرة الثانية المهمةمتر من هذه الطريقة هو طول التعرض. تتعرض الديدان بشكل روتيني إما 24 ساعة أو 65 ساعة. كما الانقسام الاختزالي هو عملية مستمرة في C. ايليجانس، هذه النوافذ التعرض اثنين تسمح للأسر إما غيرت أحداث أواخر الانتصافي (24 ساعة) أو كلا الحدثين الانتصافي المبكرة والمتأخرة (65 ساعة). ومن المهم أن نلاحظ مع ذلك أن التعرض الطويل يبدو أن التنبؤ بشكل أفضل سمية الإنجابية الثدييات 10.
وأحد الجوانب جاذبية خاصة من الأسلوب هو مرونته. في حين تم تصميم بروتوكول للفحص إنتاجية عالية، وهو نسخة مصغرة من أسفل الفحص يمكن أن يؤديها لفحص عدد أصغر من العينات باستخدام 24 لوحات جيدا أو 1.5 مل أنابيب. تخفيض حجم الشاشة تمكن من اختبار على عدد أكبر من الديدان في العينة التي يمكن أن تزيد من حساسية الفحص. في الشكل الحالي، يوصى مركبات الفحص في quadruplicates لتوفير الثقة الإحصائية أعلى في aneuplمعدلات oidy قياسها. وهناك عقبة محتملة في هذه المنهجية على نطاق واسع تأتي من الحاجة للكشف الآلي الأجنة GFP إيجابية. على الرغم من أن هذه المهمة يمكن بسهولة أن يقوم بها العين، وإنشاء حذرا من المعلمات المناسبة على برنامج تحليل الصور، من الناحية المثالية مع أخصائي التصوير، أمر بالغ الأهمية لأتمتة هذا الإجراء. وعلاوة على ذلك، ما وراء الكشف عن الأجنة GFP إيجابية، يجب أن يتم تنفيذ التحقق من صحة الثانوي من الضربات لتحديد ما إذا أخطاء الكروموسومات هي من الانتصافي أو الأصل الجنينية. لقد أظهرنا سابقا أن مثل هذه المقايسات الثانوية يتم تنفيذ بسهولة في C. ايليجانس وتشمل دابي تلطيخ نوى الجرثومية وكذلك تلطيخ أكريدين البرتقال من الديدان لقياس موت الخلايا المبرمج 10. من هذه المقايسات اثنين بسيطة، تطور غير طبيعي من خلال الانقسام المنصف، مورفولوجيا النووية غير طبيعي والتفتت فضلا عن فقدان الخلية الجرثومية يمكن أن يكون كل تقدير.
أخذت معا، قمنا describإد هنا الخطوات اللازمة لإجراء تقييم سريع للسمية الجرثومية باستخدام C. نظام نموذجي ايليجانس. الأهم من ذلك، استخدام عدم توازن الصبغيات في دودة كعلامة للسمية الجرثومية هو مقايسة ذات الصلة كما هو التنبؤي من الثدييات النقاط النهائية للسمية الإنجابية بما في ذلك انخفاض حجم القمامة وعيوب المبيض 10. هذا له أهمية خاصة حيث آثار سامة على سلالة الجرثومية الإناث هي شاقة وخاصة للتحقيق. وهكذا، ويوفر هذا الاختبار السريع بديلا لاختبارات الحيوانات الكبيرة باعتبارها أول تمريرة الشاشة سمية ويلقي الضوء على تأثير التعرض للمواد الكيميائية البيئية على مختلف جوانب برنامج الانتصافي تعقيدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Vented, sharp edge Petri dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon films for biological cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
- Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from: http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T (2009).
- Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
- Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
- Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
- Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
- Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- National Research Council. Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , The National Academies Press. (2007).
- Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).
