Abstract
हमारे वातावरण में मौजूद रसायनों के हजारों की प्रजनन विषाक्तता की पहचान करना पर्यावरणीय स्वास्थ्य के क्षेत्र में सबसे tantalizing चुनौतियों में से एक रहा है। यह हड्डीवाला जानवरों के एक उच्च संख्या के लिए आवश्यकता के बिना (1) सही (2) उच्च throughput फैशन के लिए एक मध्यम में ऐसा प्रजनन प्रक्रियाओं की चाबी सुविधाओं पुनरावृत्ति कर सकते हैं और मॉडल प्रणाली की कमी के कारण भाग में है।
हम निमेटोड सी में यहां एक परख का वर्णन aneuploid भ्रूण की प्रेरण की निगरानी के द्वारा germline विषैले पदार्थ की तेजी से पहचान की अनुमति देता है कि एलिगेंस। एक GFP संवाददाता लाइन का उपयोग करने से, germline विघटन से उत्पन्न गुणसूत्र अलगाव में त्रुटियों को आसानी से कल्पना कर रहे हैं और स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मात्रा। इस प्रकार अपने विषाक्तता के लिए यौगिकों के एक विशेष सेट की स्क्रीनिंग दिन के एक मामले में एक 96- को 384 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में प्रदर्शन किया जा सकता है। सकारात्मक ज के माध्यमिक विश्लेषणइसके गुणसूत्र असामान्यताओं meiotic विघटन से या जल्दी भ्रूण गुणसूत्र अलगाव त्रुटियों से उत्पन्न निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। कुल मिलाकर, इस परख रासायनिक प्रदर्शन के बाद germline शिथिलता के तेजी से मूल्यांकन के लिए एक तेजी से पहली पास रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है।
Introduction
संयुक्त राज्य अमेरिका में वाणिज्य के लिए पंजीकृत लगभग 87,000 रसायन, इन संभावित प्रभाव स्वास्थ्य एक के लिए परीक्षण किया गया है की अभी तक केवल एक छोटा सा नंबर रहे हैं। परीक्षण किया गया है कि उन लोगों में से केवल एक हिस्से को विशेष रूप से महिला जनन कोशिका विकास और भेदभाव के दौरान स्तनधारियों में जल्दी प्रजनन घटनाओं के परिवर्तन का निर्धारण करने में कठिनाई के कारण भाग में प्रजनन स्वास्थ्य प्रभाव, के लिए मूल्यांकन किया गया है। दरअसल, पहले meiotic घटनाओं महिला स्तनधारियों में भ्रूण के विकास के प्रारंभिक दौर के दौरान जगह ले सकता है और इसलिए का उपयोग और स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए उपयुक्त संख्या में एकत्र करने के लिए मुश्किल हैं।
germline पीढ़ियों के बीच महत्वपूर्ण कड़ी प्रदान करता है, और इसकी उचित समारोह सेलुलर और गुणसूत्र डिवीजन के जटिल कार्यक्रम की सटीक निष्पादन अर्धसूत्रीविभाजन करार दिया पर निर्भर है। Meiotic प्रक्रिया का अनियंत्रण प्रजनन क्षमता में कमी और उत्पादन में हो सकता हैगुणसूत्रों की एक असामान्य संख्या के साथ युग्मक और भ्रूण, एक की हालत aneuploidy करार दिया। अर्धसूत्रीविभाजन में क्रोमोजोम अलगाव त्रुटियों मानव स्वास्थ्य के लिए बेहद प्रासंगिक हैं। गुणसूत्र असामान्यताओं एक 1 150 में जीवित जन्मों की आवृत्ति, त्रिगुणसूत्रता 21, 18 और 13 के रूप में अच्छी तरह के रूप में सबसे अधिक प्रचलित प्रकार 2,3 जा रहा है एक्स और वाई गुणसूत्र त्रुटियों के साथ, आम हैं। इसके अलावा, गुणसूत्र मूल के उन सहित जन्मजात विकृतियों, अमेरिका चार में पर्यावरणीय प्रभावों गुणसूत्र अलगाव और व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं विचार है कि शिशु मृत्यु के प्रमुख कारण हैं 5 नया नहीं है, लेकिन अभी भी खराब समझा जाता है। यह मानव प्रजनन, प्रारंभिक विकास और समग्र प्रजनन स्वास्थ्य के साथ हस्तक्षेप कर रहे हैं हमारे वातावरण में पेश किया रसायनों की जो जांच करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है।
स्तनधारी मॉडल के इन सीमाओं के प्रकाश में, हम <roundworm में प्रजनन विषाक्तता परीक्षण करने के लिए एक उच्च throughput स्क्रीन परख विकसित किया हैउन्हें> सी। एलिगेंस। हम इस तरह के अपने छोटे आकार, कम लागत, कम प्रजनन चक्र, जर्म कोशिकाओं के उच्च अनुपात और हेरफेर 6 की आसानी के रूप में इस आमतौर पर इस्तेमाल किया आनुवंशिक मॉडल प्रणाली द्वारा की पेशकश की कई महत्वपूर्ण सुविधाओं जुटाए गए हैं। कीड़े 96 अच्छी तरह से प्लेट में या उच्च मात्रा तरल संस्कृतियों में उगाया जा सकता है और क्योंकि उनकी पारदर्शिता के सीधे फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का पता लगाने के लिए प्लेटों पर imaged किया जा सकता है। नीचे वर्णित परख इन विशेषताओं का लाभ लेता है और germline विघटन और भ्रूण aneuploidy के शामिल होने का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट संवाददाता Pxol-1 :: GFP युक्त एक कीड़ा तनाव का लाभ लेता है।
इस संवाददाता तनाव के उपयोग के एक मुख्य रूप से उभयलिंगी कीड़ा आबादी में पुरुषों की आम तौर पर दुर्लभ घटना पर आधारित है। इन पुरुषों (<0.2%) स्वाभाविक रूप से एक्स गुणसूत्र 7 के अलगाव में त्रुटि से उत्पन्न। हालांकि, germline विघटन के रूप में अक्सर autosomes के अलगाव में त्रुटियों की ओर जाता हैऔर heterochromosomes की, यह पुरुषों फेनोटाइप (एक्स missegregation) और साथ ही भ्रूण मारक (autosome missegregation) के एक ऊंचा घटनाओं के साथ दोनों संबद्ध करता है। भ्रूण मारक के मुद्दे circumventing आसानी से जबकि पुरुषों के शामिल होने का पता लगाने के लिए, एक पुरुष विशेष के प्रमोटर (xol -1) अभी भी कीड़ा के गर्भाशय के भीतर निहित जल्दी भ्रूण में GFP की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए प्रयोग किया जाता है। जैसे, GFP- व्यक्त भ्रूण की उपस्थिति aneuploid भ्रूण की उपस्थिति के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में प्रयोग किया जाता है। इस विधि में पहले germline रखरखाव और अर्धसूत्रीविभाजन 8,9 में फंसा जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित, इस तनाव उच्च throughput स्क्रीन करने के लिए एक माध्यम में कार्यरत है। महत्वपूर्ण बात है, तनाव ईमानदारी से रसायनों के aneugenicity रिपोर्ट करता है और स्तनधारी प्रजनन समापन 10 को इसलिए प्रासंगिक है। यहाँ वर्णित परख तलाश में दवा और रसायन उद्योग सेटिंग्स में toxicologists करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो जाएगातेजी से प्रजनन समापन की ओर रसायनों की विषाक्तता का आकलन करने के लिए। इसके अलावा, इस परख पूरी तरह से 21 वीं सदी की रिपोर्ट 11 में विषाक्तता में प्रकाश डाला सरकारी प्राथमिकताओं के साथ aligns।
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Protocol
दूध पिलाने जीवाणुओं की 1. तैयारी
नोट: इस खंड में खिला बैक्टीरिया (ई कोलाई तनाव OP50) की तैयारी का वर्णन है।
- ई की एक भी कॉलोनी को अलग-थलग aseptically एक lysogeny शोरबा (पौंड) अगर प्लेट और से कोलाई तनाव OP50 autoclaved लेग शोरबा के 300 मिलीलीटर में टीका लगाना।
- संतृप्ति तक पहुँच जाता है टीका संस्कृति, 200 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन में रात भर विकसित करने के लिए अनुमति दें।
- 6 बाँझ, पूर्व तौला 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में OP50 स्थानांतरण। 6000 आरपीएम (5000 XG) पर 5 मिनट के लिए centrifuging द्वारा बैक्टीरिया गोली।
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बाँझ M9 के 50 मिलीलीटर के साथ बैक्टीरिया धो लें। दो बार दोहराएँ।
- दूसरे धोने के बाद कोई M9 के ट्यूब में छोड़ दिया है यह सुनिश्चित करना कि शेष M9 हटा दें।
- बैक्टीरिया गोली युक्त ट्यूब वजन द्वारा गोली के वजन का निर्धारण और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के वजन घटाना।
- गोली मैं Resuspendएन M9 के 100 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में।
- यह कीड़ा संस्कृति के लिए प्रयोग किया जाता है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर OP50 समाधान स्टोर।
निमेटोड विकास मध्यम (एन जी एम) पेट्री प्लेट्स के 2. तैयारी
नोट: इस खंड प्लेटें जहां सी हैं जो एन जी एम पेट्री प्लेटों की तैयारी, का वर्णन एलिगेंस कीड़े नियमित प्रयोगशाला में रखा जाता है।
- एन जी एम अगर मध्यम आटोक्लेव।
- बाँझ प्रक्रियाओं का उपयोग करना, एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर 6 सेमी पेट्री प्लेटों में एन जी एम अगर समाधान के 17 मिलीलीटर बांटना।
नोट: प्लेटों में अगर की एक स्थिर राशि दूसरे के लिए एक थाली से स्विच जब माइक्रोस्कोप refocusing के लिए की आवश्यकता कम कर देता है। - अगर जमना और अधिक नमी लुप्त हो जाना करने की अनुमति के लिए उपयोग करने से पहले 2-3 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटें छोड़ दें।
- एक बाँझ तकनीक का उपयोग एन जी एम प्लेटों बीज। OP50 तरल संस्कृति की 1-2 बूँदें लागू करें और एक गिलास छड़ का उपयोग फैल गया। सुनिश्चित करें कि नहींप्लेटों के किनारों को बैक्टीरिया लॉन के लिए सभी तरह से फैला।
- OP50 लॉन कीड़े बढ़ने की प्लेट का उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर 1-2 दिनों के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें।
एक तुल्यकालिक इल्ली जनसंख्या 3. तैयारी
नोट: सी के जीवन चक्र एलिगेंस भ्रूण चरण, चार लार्वा चरणों (एल 1-L4) और वयस्कता के शामिल है। इस अनुभाग में कीड़े की एक उम्र-तुल्यकालिक आबादी की तैयारी का वर्णन है। ब्लीच उपचार के बाद C.elegans के साथ संपर्क में आने वाले सभी सामग्री बाँझ होना चाहिए।
- दिन 1 - gravid कृमि जनसंख्या की तैयारी
- कीड़ा आबादी का बहुमत भूखे एल 1 लार्वा के होते हैं जिसमें एन जी एम प्लेटों का प्रयोग करें।
- एक निष्फल कृमि के साथ एल 1 लार्वा लेने लीजिए और नए सिरे से 6 सेमी एन जी एम प्लेटों के लिए उन्हें स्थानांतरित OP50 के साथ वरीयता प्राप्त। कीड़े के बहुमत gravid वयस्क हैं, जब तक 20 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 65 घंटे के लिए सेते हैं। कोथाली भीड़भाड़ से बचने और हर ताजा एन जी एम थाली करने के लिए एल 1 लार्वा की एक से अधिक या दो समूहों स्थानांतरण नहीं है, कीड़े बैक्टीरिया घट बिना विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं।
- दिन 4 - एक तुल्यकालन एल 1 लार्वा जनसंख्या की स्थापना
- M9 के 1-2 मिलीलीटर के साथ उन्हें धोने से एन जी एम प्लेटों से gravid कीड़े लीजिए और एक शंक्वाकार 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण।
- Gravid कीड़े लगभग 5-10 मिनट के लिए 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के नीचे तलछट करते हैं। कीड़ा गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें।
- 2-4 microcentrifuge ट्यूब को कीड़ा गोली स्थानांतरण और ब्लीच / NaOH समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें। आरटी पर 2-3 मिनट के लिए सेते हैं। सभी कीड़े मर चुके हैं पुष्टि करने के लिए stereomicroscope के तहत प्रतिक्रिया की प्रगति की निगरानी। भ्रूण मर सकता है के रूप में अब से 5 मिनट ब्लीच न करें।
- 3000 आरपीएम (900 XG) में 1 मिनट के लिए centrifuging द्वारा कीड़े लीजिए। सतह पर तैरनेवाला निकालें और बाँझ M9 के 1 मिलीलीटर जोड़नेप्रतिक्रिया बेअसर।
- 3000 आरपीएम (900 XG) में 1 मिनट के लिए centrifuging द्वारा दो बार कीड़े धो लें।
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और अप करने के लिए 100-200 μl के लिए M9 जोड़ें।
- एक गिलास पाश्चर विंदुक कीड़ा की एक बूंद को जोड़ने का प्रयोग / M9 के भ्रूण हैच को अनुमति देने के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 24 घंटे के लिए उन्हें एन जी एम प्लेटों स्पष्ट और सेते मिश्रण।
नोट: खाद्य बिना लार्वा के विकास एल 1 के स्तर पर रोक दिया जाएगा।
- दिन 5 - एक तुल्यकालन L4 लार्वा जनसंख्या की स्थापना
- M9 के 1-2 मिलीलीटर के साथ प्लेटें धोने से स्पष्ट एन जी एम प्लेटों से एल 1 लार्वा लीजिए और एक शंक्वाकार 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण।
- लगभग 5 मिनट के लिए 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के नीचे मृत वयस्क कीड़े तलछट करते हैं।
- एक नए शंक्वाकार 15 मिलीलीटर ट्यूब में एल 1 कीड़े हैं जहां पर तैरनेवाला, ले लीजिए, और 2600 आरपीएम (1000 XG) पर 2 मिनट के लिए centrifuging द्वारा कीड़े वेग।
- सतह पर तैरनेवाला Le निकालेंलगभग 500 μl aving।
- एक stereomicroscope का उपयोग बूँदें 10 μl में कीड़े की संख्या की गणना के द्वारा M9 के समाधान में कीड़े की एकाग्रता का निर्धारण। कम से कम 5 बूंदों गणना।
- 20-25 कीड़े / μl को कीड़े की एकाग्रता को समायोजित करें और OP50 के साथ वरीयता प्राप्त एन जी एम प्लेटों को कीड़ा / M9 के मिश्रण के 50 μl जोड़ें।
- वे L4 मंच तक पहुँचने तक एल 1 सिंक्रनाइज़ जनसंख्या बढ़ने की अनुमति देने के लिए (सप्ताह के अंत के माध्यम से ऊष्मायन के लिए) 15 डिग्री सेल्सियस पर 65 घंटा के लिए सेते हैं।
96 अच्छी तरह से प्लेट्स में रसायन कीड़े 4. एक्सपोजर
नोट: इस खंड Pxol1 के उपयोग का वर्णन :: सी युक्त GFP ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर एलिगेंस तनाव aneuploidy के शामिल होने के लिए स्क्रीन करने के लिए।
- M9 के 1-2 मिलीलीटर के साथ प्लेटें धोने से स्पष्ट एन जी एम प्लेटों से L4 लार्वा लीजिए और एक शंक्वाकार 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण।
- की तह तक L4 के कीड़े तलछट चलो15 मिलीलीटर लगभग 5-10 मिनट के लिए शंक्वाकार ट्यूब। कीड़ा गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें।
- M9 के 3-5 मिलीलीटर जोड़ें और एक stereomicroscope का उपयोग बूँदें 10 μl में कीड़े की संख्या की गणना के द्वारा M9 के समाधान में कीड़े की एकाग्रता का निर्धारण। प्रत्येक नमूने के लिए कम से कम 5 बूंदों गणना।
- M9 में 1000 कीड़े / एमएल की एकाग्रता में कीड़े Resuspend।
- खंड एक से OP50 बैक्टीरिया पतला M9 के साथ 10 गुना। कम तापमान कीड़ा विकास को प्रभावित करता है क्योंकि resuspended बैक्टीरिया कमरे के तापमान तक पहुँच सुनिश्चित करें।
- पहले (कदम 4.4 से) कीड़ा / M9 के मिश्रण के 100 μl जोड़ने और फिर एक 2 मिलीलीटर गहरी दौर नीचे 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए (कदम 4.5 से) पतला OP50 बैक्टीरिया के 400 μl जोड़ने के लिए, एक multichannel विंदुक का उपयोग करना। अंत में, प्रत्येक अच्छी तरह से 500 μl में 100 कीड़े होगा।
- एक सुझाव दिया अंतिम concentr प्राप्त करने के लिए, वांछित वेल्स को परीक्षण रासायनिक या उचित नियंत्रण या तो 0.5 μl जोड़ें100 माइक्रोन से समझना, एक एकाग्रता आमतौर पर सी में रासायनिक स्क्रीन में इस्तेमाल किया एलिगेंस 12। 0.1% की एक अंतिम एकाग्रता में इथेनॉल या DMSO के विलायक नियंत्रण बेनकाब।
नोट: हम सकारात्मक नियंत्रण के रूप में nocodazole (100 माइक्रोन) के उपयोग की सलाह देते हैं। - चिपकने वाली फिल्म का उपयोग कर थाली सील। कुओं के बीच पार संक्रमण को रोकने के लिए अच्छी तरह से थाली सील करने के लिए सुनिश्चित करें।
- एल्यूमीनियम पन्नी के साथ थाली लपेटें।
- समय का उपयुक्त लंबाई (24 या 65 घंटा) के लिए उपयुक्त तापमान के एक प्रकार के बरतन (170-180 आरपीएम) को प्लेट हस्तांतरण। कमरे के तापमान कीड़े के विकास को प्रभावित करता है; 20 डिग्री सेल्सियस के आसपास के तापमान को बनाए रखने।
एक 384 अच्छी तरह से थाली में gravid कीड़े 5. छवि अधिग्रहण
नोट: इस खंड में वयस्क hermaphrodites की गर्भाशय के अंदर भ्रूण में GFP की अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए, छवि उजागर Pxol1 :: GFP कीड़े करने के लिए एक उच्च सामग्री खुर्दबीन के उपयोग का वर्णन है। लिएप्रत्येक 384 अच्छी तरह से थाली की जांच की जा करने के लिए, 4 एक्स 96 अच्छी तरह से प्लेटों से कीड़े का उपयोग करें।
- प्रकार के बरतन में रासायनिक जोखिम के बाद, 10-15 मिनट के लिए 96 अच्छी तरह से थाली बाकी वयस्क कीड़े प्लेट के नीचे तलछट के लिए अनुमति देने के लिए करते हैं।
- एक multichannel विंदुक का प्रयोग, प्लेट के नीचे में कीड़े परेशान करने के लिए बहुत सावधान नहीं किया जा रहा है, M9 के 350 μl को हटा दें।
- M9 के 1 मिलीलीटर और दोहराने कदम 5.1 के साथ कीड़े धो लें।
- एक multichannel विंदुक का प्रयोग, प्लेट के नीचे में कीड़े परेशान करने के लिए नहीं सर्वेक्षण सावधान किया जा रहा M9 के 1 मिलीलीटर हटा दें।
- एक multichannel विंदुक का प्रयोग, शेष M9 में कीड़े resuspend और 96 अच्छी तरह से प्लेटों से कीड़ा / M9 के मिश्रण के 100 μl इकट्ठा करने और एक काले रंग की दीवारों / स्पष्ट नीचे 384 अच्छी तरह से थाली के कुओं में लोड। 384 अच्छी तरह से थाली के सभी कुओं लोड किया गया है, जब तक 4 एक्स 96 अच्छी तरह से प्लेटों से कीड़े का उपयोग कर प्रक्रिया को दोहराएं।
नोट: यह महत्वपूर्ण है को बढ़ाने के लिए सभी कुओं ही मात्रा है करने के लिएछवि अधिग्रहण की प्रक्रिया के दौरान दक्षता और ऑटोफोकस की गति। हर अच्छी तरह से 80 से 100 कीड़े के बीच होनी चाहिए। - प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए levamisole (100 माइक्रोन) की एक μl जोड़ें और कीड़े लगभग 30 मिनट के लिए सेते करते हैं।
नोट: levamisole एक acetylcholine रिसेप्टर agonist के रूप में कार्य करता है और कीड़े immobilizes। - स्वचालित इमेजिंग प्रदान करने में सक्षम एक widefield उच्च सामग्री खुर्दबीन के लिए प्लेट हस्तांतरण।
- छवि अधिग्रहण के लिए, निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार एक उच्च सामग्री छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। अच्छी तरह से प्रति एक छवि प्राप्त करने के लिए 4X उद्देश्य का चयन करें।
- छवि अधिग्रहण शुरू करने से पहले, 2160 X 2160 के लिए जोखिम और छवि संकल्प के 45 मिसे के लिए GFP इमेजिंग मापदंडों को समायोजित।
- कुएं में कीड़े की कुल संख्या से विभाजित GFP सकारात्मक कीड़े की संख्या के रूप में डेटा ले लीजिए, बाद उपाय कुओं के बीच अपेक्षाकृत लगातार की जा रही।
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Representative Results
ऐसे सूक्ष्मनलिका जहर Nocodazole के रूप में रासायनिक एजेंटों के लिए Pxol-1 :: GFP संवाददाता तनाव का एक्सपोजर (चित्रा 1) DMSO के नियंत्रण की तुलना में उजागर वयस्क hermaphrodites की गर्भाशय में GFP व्यक्त भ्रूण की एक उच्च अनुपात के शामिल होने की ओर जाता है। GFP पॉजिटिव भ्रूण अन्य भ्रूण के साथ ही पशुओं के पेट में मनाया ऑटो प्रतिदीप्ति में मनाया कमजोर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की तुलना में काफी चमक रहे हैं। उजागर कीड़े सीधे 384 अच्छी तरह से प्लेटों पर imaged हैं और कम से कम एक GFP पॉजिटिव भ्रूण युक्त कीड़े की संख्या में अच्छी तरह से है कि में कीड़े की कुल संख्या से अच्छी तरह से और सामान्यीकृत प्रत्येक के लिए गिना जाता है। रासायनिक स्क्रीन से एक सकारात्मक हिट एक आवृत्ति 1.7x DMSO के 10 से अधिक पर एक कीड़ा जनसंख्या में GFP पॉजिटिव भ्रूण के अनुपात प्रेरित एक यौगिक का मतलब है। दहलीज अनुकूलन के बाद, उच्च सामग्री छवि विश्लेषण (सामग्री फ़ाइल देखें) स्वचालित Calc की अनुमति देता हैकुएं में कीड़े की कुल संख्या से विभाजित सकारात्मक वस्तुओं (यानी, भ्रूण) की संख्या की आबादी और परख के बड़े पैमाने पर अनुकूलन के लिए पसंद की विधि है।
| एक gravid वयस्क आबादी उत्पन्न करने के लिए भूखे कीड़ा आबादी के साथ शुरू करो |
| ↓ (संस्कृति 3 दिन) |
| Gravid वयस्क आबादी ब्लीच |
| ↓ |
| स्थानांतरण प्रक्षालित कीड़े एन जी एम प्लेटें साफ करने के लिए |
| ↓ (संस्कृति एक दिन) |
| सिंक्रनाइज़ एल 1 जनसंख्या लीजिए और OP50 साथ एन जी एम प्लेटों के लिए स्थानांतरण |
| ↓ (15 डिग्री सेल्सियस पर 65 घंटा सेते हैं) |
| सिंक्रनाइज़ L4 आबादी लीजिए |
| ↓ </ टीडी> |
| M9 / OP50 के 0.5 मिलीलीटर में 96 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 100 L4 के कीड़े बांटना |
| ↓ |
| प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए रसायन (100 माइक्रोन) जोड़ें |
| ↓ (24 या 65 घंटे के लिए सेते हैं) |
| एक 384 अच्छी तरह से थाली करने के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेटों से सिंक्रनाइज़ gravid वयस्क आबादी के 100 μl (80 कीड़े) स्थानांतरण। |
| ↓ |
| प्रत्येक अच्छी तरह से (1 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) को levamisole की एक μl जोड़ें |
| ↓ (30 मिनट से 45 सेते हैं) |
| पर कब्जा है और उच्च सामग्री माइक्रोस्कोप के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक की छवियों का विश्लेषण |
तालिका 1. प्रायोगिक कार्यप्रवाह। दिवस 1, उपयोग भूखे कीड़ा जनसंख्या एक gravid वयस्क आबादी उत्पन्न करने के लिए। 4 दिन, bleaएक तुल्यकालन एल 1 जनसंख्या उत्पन्न करने के लिए gravid वयस्क आबादी Ch। OP50 एक तुल्यकालन L4 आबादी उत्पन्न करने के लिए एन जी एम प्लेटें वरीयता प्राप्त करने के लिए 5 दिन, स्पष्ट एन जी एम प्लेटों से एल 1 जनसंख्या हस्तांतरण। दिवस 8, 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए सिंक्रनाइज़ L4 आबादी हस्तांतरण और विभिन्न रसायनों के लिए उन्हें बेनकाब। दिन 9 और 11 दिन, एक उच्च सामग्री खुर्दबीन के साथ imaged किया जा करने के लिए एक 384 अच्छी तरह से थाली से अवगत कराया gravid वयस्कों के हस्तांतरण।
| M9 बफर - 1 एल | |
| 1. बड़े बीकर में निम्नलिखित सामग्री का मिश्रण या चुंबकीय हलचल पट्टी का उपयोग सिलेंडर स्नातक की उपाधि | |
| 3 जी के.एच. 2 पीओ 4 | |
| 6 ग्राम ना 2 HPO 4 | |
| 5 ग्राम सोडियम क्लोराइड | |
| 1 मिलीलीटर 1M MgSO 4 | |
| एच 2 ओ के लिए एक एल | |
| उचित आकार की बोतलों में 2. विभाज्य (500 मिलीलीटर आकार की बोतलों में 300 मिलीलीटर) | |
| 3. 30-60 मिनट के लिए autoclaving द्वारा जीवाणुरहित | |
| प्लेटों के लिए एन जी एम मीडिया - 4 एल | |
| 1. फिर 4 एल को भरने, एक Erlenmeyer फ्लास्क में निम्नलिखित जोड़ें: | |
| 12 ग्राम सोडियम क्लोराइड | |
| 10 ग्राम Bactopeptone | |
| 80 ग्राम अग्रवाल | |
| 2. जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से: | |
| कोलेस्ट्रॉल के 4 मिलीलीटर (5 मिलीग्राम / एमएल) | |
| 4 मिलीलीटर 2 CaCl (1 एम शेयर समाधान) | |
| 4 मिलीलीटर (1 एम शेयर समाधान) 4 MgSO | |
| 30-60 मिनट के लिए 3. आटोक्लेव | |
| 4. थोड़ा शांत करते हैं और के.एच. 2 पीओ के 100 मिलीलीटर जोड़ने | |
| लेग मीडिया - 1 एल | |
| 1. निम्न के 800 मिलीलीटर एच जोड़ें 2 हे | |
| 10 ग्राम Bacto-tryptone। | |
| 5 ग्राम खमीर निकाल सकते हैं। | |
| 10 ग्राम सोडियम क्लोराइड। | |
| 2. NaOH के साथ 7.5 पीएच को समायोजित करें। | |
| 3. DH 2 हे के साथ एक एल मात्रा समायोजित | |
| 60 मिनट - 4. 30 के लिए autoclaving द्वारा जीवाणुरहित | |
| आबादी सिंक्रनाइज़ करने के लिए ब्लीच समाधान - 50 मिलीलीटर | |
| 7.5 मिलीलीटर 10 एन NaOH | |
| 6 मिलीग्राम ब्लीच (नियमित) | |
| 36.5 मिलीलीटर DH 2 हे |
तालिका 2. समाधान।
चित्रा 1:। DMSO और सकारात्मक नियंत्रण nocodazole नियंत्रित करने के लिए Pxol-1 :: GFP संवाददाता तनाव के जोखिम से प्राप्त छवियों के उदाहरण इस उदाहरण में, कीड़े nocodazole करने के लिए 24 घंटे के लिए खुल गए थे या DMSO के Pxol-1 :: GFP के कीड़े थे। (ए) 0.1% DMSO के (नकारात्मक नियंत्रण) या (बी) 100 माइक्रोन nocodazole (सकारात्मक नियंत्रण) से अवगत कराया और 384 अच्छी तरह से प्लेट में imaged। लाल तीर: एक nocodazole इलाज किया कीड़ा के गर्भाशय के भीतर स्पष्ट रूप से दिखाई GFP सकारात्मक भ्रूण। स्केल बार = 1 मिमी। (सी) और (डी) क्रमश: (ए) और (बी) के कुछ भागों बढ़ाया जाता है। स्केल बार = 0.33 मिमी।
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Discussion
यहाँ वर्णित विधि germline विषैले पदार्थ की पहचान के लिए पहली बार बड़े पैमाने पर रणनीति का गठन किया। यह ईमानदारी से germline में शिथिलता के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में प्रयोग किया जाता है, जो जल्दी भ्रूण में aneuploidy के शामिल होने की रिपोर्ट है कि एक GFP ट्रांसजेनिक Pxol-1 :: GFP युक्त तनाव के उपयोग की आवश्यकता है। विधि एक सी से सावधान तुल्यकालन शामिल एलिगेंस कीड़ा जनसंख्या और स्वचालित उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी द्वारा GFP सकारात्मक कीड़े की इमेजिंग द्वारा पीछा 96 अच्छी तरह प्रारूप में रसायनों के कीड़े 'जोखिम।
इस प्रोटोकॉल के कई कदम परिणामों की स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण हैं। ठीक ढंग से लोगों तक पहुंचाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि L4 लार्वा मंचन के रूप में संख्या को अधिकतम करने के लिए सबसे पहले, कीड़ा आबादी अत्यधिक तुल्यकालिक होना चाहिए। इस कारण से, यहाँ वर्णित कार्यप्रणाली पहले कीड़ा जनसंख्या का विरंजन द्वारा और फिर एल 1 भुखमरी से दो तुल्यकालन कदम, शामिल हैं। दूसरा महत्वपूर्ण पैराइस विधि का मीटर जोखिम की लंबाई है। कीड़े नियमित तौर पर 24 घंटे या 65 घंटे के लिए या तो उजागर कर रहे हैं। अर्धसूत्रीविभाजन के रूप में सी में एक सतत प्रक्रिया है एलिगेंस, इन दोनों लोगों तक पहुंचाने के लिए Windows या तो बदल देर meiotic घटनाओं (24 घंटा) या दोनों जल्दी और देर meiotic घटनाओं (65 घंटा) का कब्जा अनुमति देते हैं। यह अब जोखिम बेहतर स्तनधारी प्रजनन विषाक्तता 10 की भविष्यवाणी करने के लिए लगता है कि हालांकि नोट करना महत्वपूर्ण है।
विधि से एक विशेष रूप से आकर्षक पहलू अपने लचीलापन है। प्रोटोकॉल उच्च throughput प्रदर्शन के लिए बनाया गया है, वहीं परख के नीचे पहुंचा संस्करण 24 अच्छी तरह प्लेटें या 1.5 मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग नमूनों की एक छोटी संख्या की जांच के लिए किया जा सकता है। स्क्रीन के पैमाने कम परख की संवेदनशीलता में वृद्धि कर सकता है, जो नमूना प्रति कीड़े के एक उच्च संख्या के परीक्षण में सक्षम बनाता है। वर्तमान स्वरूप में, quadruplicates में स्क्रीनिंग यौगिकों aneupl में उच्च सांख्यिकीय आत्मविश्वास प्रदान करने के लिए सिफारिश की हैoidy दरों मापा। इस बड़े पैमाने कार्यप्रणाली में एक संभावित बाधा GFP पॉजिटिव भ्रूण की स्वचालित पता लगाने के लिए की जरूरत से आता है। इस कार्य को आसानी से आंख के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है, आदर्श एक इमेजिंग विशेषज्ञ के साथ छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर उपयुक्त मानकों के सावधान स्थापना, प्रक्रिया के स्वचालन के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, GFP पॉजिटिव भ्रूण का पता लगाने के परे, हिट की माध्यमिक सत्यापन गुणसूत्र त्रुटियों meiotic या भ्रूण मूल के हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए। हम पहले इस तरह के माध्यमिक assays के आसानी से सी में प्रदर्शन कर रहे हैं कि पता चला है एलिगेंस और germline नाभिक के DAPI धुंधला के साथ ही apoptosis को 10 की माप के लिए कीड़े के acridine नारंगी धुंधला शामिल हैं। इन दो सरल assays से, असामान्य अर्धसूत्रीविभाजन, असामान्य परमाणु आकृति विज्ञान और विखंडन के माध्यम से प्रगति के रूप में अच्छी तरह से रोगाणु सेल नुकसान सभी का आकलन किया जा सकता है।
साथ में ले ली, हम describ हैमॉडल प्रणाली सी का उपयोग कर germline विषाक्तता के तेजी से मूल्यांकन के लिए आवश्यक एड यहाँ कदम एलिगेंस। यह कूड़े आकार और डिम्बग्रंथि के दोष में 10 की कमी हुई सहित स्तनधारी प्रजनन विषाक्तता समापन के भविष्य कहनेवाला है के रूप में महत्वपूर्ण, germline विषाक्तता के लिए एक मार्कर के रूप में कीड़ा में aneuploidy का उपयोग एक प्रासंगिक परख है। महिला germline पर विषाक्त प्रभाव की जांच के लिए विशेष रूप से कठिन हैं के रूप में इस विशेष महत्व का है। इस प्रकार, इस तेजी से परख एक पहले पारित विषाक्तता स्क्रीन के रूप में बड़े जानवर परीक्षण के लिए एक विकल्प प्रदान करता है और शेड जटिल meiotic कार्यक्रम के विभिन्न पहलुओं पर पर्यावरण रासायनिक जोखिम के प्रभाव पर प्रकाश।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Vented, sharp edge Petri dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon films for biological cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
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