Abstract
Определение репродуктивную токсичность тысяч химических веществ, присутствующих в окружающей среде был одним из самых изысканных проблем в области гигиены окружающей среды. Это связано, в частности к нехватке модельных систем, которые могут (1) точно воспроизводят ключи особенности процессов размножения и (2) сделать это в средней и высокой пропускной образом, без необходимости большого числа позвоночных животных.
Здесь мы опишем метод количественного нематоды C. Элеганс, что позволяет быстро идентифицировать зародышевой линии токсикантов путем мониторинга индукцию анеуплоидных эмбрионов. Благодаря использованию в GFP репортер линии, ошибки в сегрегации хромосом в результате зародышевой линии разрушения легко визуализировать и количественно с помощью автоматизированной флуоресцентной микроскопии. Таким образом, скрининг определенного набора соединений для его токсичности могут быть выполнены в виде пластины с 96- до 384-а в течение нескольких дней. Вторичный анализ положительного чего можно выполнить, чтобы определить, является ли возникла хромосомных аномалий от мейоза нарушения или ранних эмбриональных ошибок хромосом. В целом, этот анализ представляет собой быстрый стратегию первого прохода для быстрой оценки зародышевой линии дисфункции следующей химического воздействия.
Introduction
Есть около 87000 химических веществ, зарегистрированные для торговли в Соединенных Штатах, но только небольшое количество из них были протестированы для потенциальных последствий для здоровья 1. Из тех, что были проверены, только часть была оценена для эффектов репродуктивного здоровья, отчасти из-за трудностей в определении изменения ранних репродуктивных событий у млекопитающих, особенно во время развития женского зародышевых клеток и дифференцировки. В самом деле, первого мейотического события происходят во время ранней стадии эмбрионального развития у самок млекопитающих, и, таким образом, трудно получить доступ и собрать в числах, пригодных для целей скрининга.
Зародышевой линии обеспечивает важную связь между поколениями, и ее соответствующая функция зависит от четкое исполнение сложной программы клеточного и хромосомного деления называется мейоза. Нарушение регуляции мейоза процесса может привести к снижению рождаемости и производствагамет и эмбрионов с аномальной числа хромосом, состояние называется анеуплоидии. Хромосомные ошибки сегрегации в мейозе являются весьма актуальными для здоровья человека. Хромосомные аномалии являются общими, с частотой 1 случай на 150 живорожденных, трисомии 21, 18 и 13, а также X и Y ошибок хромосом, являющихся наиболее распространенных типов 2,3. Кроме того, врожденные пороки развития, в том числе хромосомных происхождения, являются ведущей причиной смерти младенцев в США 4 мысль, что влияние окружающей среды может повлиять на хромосомный сегрегации и поведение не является новой 5, но все еще плохо изучены. Поэтому очень важно исследовать, какие из химических веществ, внесенных в нашей среде мешают человеческого плодородия, раннего развития и общего репродуктивного здоровья.
В свете этих ограничений моделей млекопитающих, мы разработали экраном анализа с высокой пропускной испытать токсическое действие на репродуктивную аскариды <EM> C. Элеганс. Мы мобилизовали несколько важных особенностей, предлагаемых этой широко используется генетическая модель системы, такие как ее небольшой размер, низкая стоимость, короткий цикл воспроизводства, высокой долей половых клеток и легкости манипуляции 6. Черви могут быть выращены в 96-луночных планшетах или в высоких жидких культурах объемом и из-за их прозрачности может быть непосредственно отображается на пластинах для обнаружения флуоресцентных репортеров. Анализ, описанный ниже пользуется этими характеристиками и использует червя штамма, содержащего люминесцентные репортером Pxol-1 :: GFP для определения зародышевой линии нарушения и индукцию эмбрионального анеуплоидии.
Использование этого репортера деформации на основе, как правило редком возникновении мужчин в основном гермафродитов населения червя. Эти мужчины (<0,2%), естественно, происходят от ошибок в сегрегации в Х-хромосоме 7. Однако, как нарушение зародышевой линии часто приводит к ошибкам в сегрегации аутосоми heterochromosomes, коррелируется как с повышенной заболеваемости мужчин фенотипа (X missegregation), а также эмбриональной летальности (аутосомно missegregation). Для легко обнаружить индукцию мужчин в обход проблемы эмбриональной летальности, мужчина-промотор (XOL-1) используется для управления экспрессией GFP у ранних эмбрионов еще, содержащихся в матку червя. Таким образом, появление GFP-экспрессирующих эмбрионов используется в качестве посредника для присутствии анеуплоидных эмбрионов. Этот метод был ранее использован для идентификации генов, участвующих в обеспечении зародышевой линии и мейоза 8,9. Адаптированный к химической скрининга, этот штамм используется в среде с экрана с высокой пропускной способностью. Важно отметить, что штамм верно сообщает aneugenicity химических веществ и, следовательно, отношение к млекопитающих репродуктивных конечных точек 10. Анализ, описанный здесь будет особенно полезно токсикологов в фармацевтической и химической промышленности настроек ищутбыстро оценить токсичности химических веществ в области репродуктивного конечных точек. Кроме того, этот анализ полностью присоединяется с государственными приоритетами, выделенных в токсичности в докладе века 21-го 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Кормление бактерий
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается подготовка кормления бактерий (штамм E.coli OP50).
- Изолировать единственная колония E. Штамм OP50 из лизогении бульона (LB) агаром и асептически инокуляции в 300 мл автоклавного LB бульоне.
- Дайте инокулировали культурой расти в течение ночи в вибраторе при 200 оборотах в минуту и 37 ° C, до насыщения пока не будет достигнута.
- Передача OP50 в 6 стерильных, предварительно взвешенных 50 мл конические пробирки. Гранул бактерий центрифугированием в течение 5 мин при 6000 оборотов в минуту (5000 мкг).
- Удалите супернатант и мыть бактерии с 50 мл стерильного M9. Повторите дважды.
- После второй промывки удаления оставшейся M9, чтобы ни М9 не осталось в трубке.
- Определить вес таблетки с весом трубки, содержащей бактерии гранул и вычесть вес 50 мл коническую трубку.
- Ресуспендируют гранул Iп М9 при концентрации 100 мг / мл.
- Хранить OP50 раствора при 4 ° С, пока не будет использован для червячного культуры.
2. Подготовка нематоды роста средних пластин (NGM) Петри
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается подготовка NGM чашках Петри, которые являются пластины, где С. Элеганс червей обычно поддерживается в лаборатории.
- Автоклав агара среду NGM.
- Используя стерильные процедуры, обойтись 17 мл NGM раствора агара в 6 см чашки Петри с помощью перистальтического насоса.
Примечание: постоянное количество агара в пластинах уменьшает потребность в переориентации микроскоп при переключении с одной пластины на другую. - Оставьте пластин при комнатной температуре в течение 2-3 дней перед использованием, чтобы агар затвердеть и позволяют избыток влаги испаряться.
- Семенной пластин NGM с помощью метода стерилизации. Нанесите 1-2 капли OP50 жидкой культуры и распространяется, используя стеклянную палочку. Убедитесь, что нераспространять газон бактерий всю дорогу к краям пластин.
- Дайте OP50 газон расти в течение 1-2 дней при комнатной температуре перед использованием пластин расти червей.
3. Подготовка синхронного Worm населения
ПРИМЕЧАНИЕ: жизненный цикл C. Элеганс состоит из эмбриональной стадии, четыре личиночные стадии (L1-L4) и в зрелом возрасте. В этом разделе описывается подготовка возрастной синхронного населения червей. Все материалы, контактирующие с C.elegans после лечения отбеливателя должны быть стерильными.
- День 1 - Подготовка беременных Worm населения
- Используйте NGM пластин, в которых большинство населения червя состоит из голодали личинок L1.
- Сбор Личинки L1 стерилизованной червя выбрать и перенести их на свежие 6 см NGM пластин затравку OP50. Инкубируют в течение примерно 65 ч при 20 ° С до тех пор, большинство червей не беременные взрослых. Дляизбежать пластины переполненности тюрем и позволяют черви расти, не истощая бактерий, не передавать более чем один или два скопления L1 личинок каждым новым NGM пластины.
- День 4 - Создание Синхронное L1 личинок населения
- Сбор беременной червей из пластин NGM, вымойте их с 1-2 мл M9 и передавать их в конической трубе 15 мл.
- Пусть беременной черви осадок на дно в 15 мл коническую пробирку в течение примерно 5-10 мин. Удалить супернатант, не нарушая червя гранул.
- Передача червя гранул 2-4 микропробирок и добавить 1 мл отбеливателя / раствора гидроксида натрия. Инкубируют в течение 2-3 мин при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции под стереоскопическим чтобы подтвердить все черви умерли. Не отбеливать больше, чем 5 минут, как эмбрионы могут погибнуть.
- Сбор червей путем центрифугирования в течение 1 мин при 3000 оборотов в минуту (900 мкг). Удалить супернатант и добавить 1 мл стерильной M9 снейтрализовать реакцию.
- Промыть червей в два раза центрифугированием в течение 1 мин при 3000 оборотов в минуту (900 мкг).
- Удалить супернатант и добавить M9, чтобы до 100-200 мкл.
- Использование стекла пипетки Пастера добавить каплю червя / M9 смешать, чтобы очистить NGM пластины и инкубировать их в течение по крайней мере 24 часов при 20 ° С, чтобы эмбрионы в люк.
ПРИМЕЧАНИЕ: Без еды рост личинок будет остановлен на стадии L1.
- День 5 - Создание Синхронное L4 личинок населения
- Сбор личинок L1 от четких NGM пластин путем промывки пластин с 1-2 мл M9 и передавать их в конической трубе 15 мл.
- Пусть мертвые взрослых червей осадок на дне 15 мл коническую трубку в течение примерно 5 мин.
- Сбор супернатант, где черви L1, в новом коническая 15 мл пробирку и осадить червей путем центрифугирования в течение 2 мин при 2600 оборотов в минуту (1000 XG).
- Удалить супернатант леaving примерно 500 мкл.
- Определить концентрацию червей в растворе М9 путем подсчета количества червей в 10 мкл капли использованием стереомикроскопа. Количество по меньшей мере, 5 капель.
- Отрегулируйте концентрацию червей до 20-25 экз / мкл и добавить 50 мкл Worm / M9 смеси, чтобы NGM пластин, посеянных с OP50.
- Выдержите в течение 65 ч при 15 ° С (для инкубации через выходные), чтобы синхронизированной население L1 расти, пока они не достигнут стадии L4.
4. Воздействие червей химических веществ в 96-луночных
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается использование Pxol1 :: GFP транскрипции репортера, содержащий С Штамм Элеганс для выявления индукции анеуплоидии.
- Сбор личинок L4 с ясного NGM пластин путем промывки пластин с 1-2 мл M9 и передавать их в конической трубе 15 мл.
- Пусть L4 червей осадок на дно15 мл коническую трубку в течение примерно 5-10 мин. Удалить супернатант, не нарушая червя гранул.
- Добавить 3-5 мл M9 и определить концентрацию червей в растворе М9 путем подсчета количества червей в 10 мкл капли использованием стереомикроскопа. Количество по меньшей мере, 5 капель для каждого образца.
- Ресуспендируют червей в концентрации 1000 червей / мл в М9.
- Развести OP50 бактерий из раздела 1, в 10 раз с M9. Убедитесь в том, ресуспендированные бактерии до комнатной температуры, потому что низкая температура влияет на развитие червя.
- Используя многоканальную пипетку, сначала добавьте 100 мкл Worm / M9 смеси (со стадии 4.4), а затем добавить 400 мкл разбавленных OP50 бактерий (из шага 4.5) в каждую лунку 2 мл глубокой круглым дном 96-луночного планшета. В конце концов, каждый хорошо будет 100 червей в 500 мкл.
- Добавить 0,5 мкл либо исследуемого вещества или соответствующего управления с желаемыми скважин, чтобы достичь предлагаемый окончательный Концция 100 мкМ, концентрация, обычно используемый в химических экранов в С Элеганс 12. Защиту этанол или ДМСО управления растворителе при конечной концентрации 0,1%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем использовать нокодазолом (100 мкм) в качестве положительного контроля. - Печать пластины с помощью клейкой пленки. Будьте уверены, чтобы запечатать пластины также для предотвращения перекрестного загрязнения между скважинами.
- Оберните пластину с алюминиевой фольгой.
- Трансфер пластину шейкер (170-180 оборотов в минуту) соответствующей температуре в течение подходящего периода времени (24 или 65 ч). Температура в помещении влияет на рост червей; поддерживать температуру около 20 ° С.
Приобретение 5. Изображение беременной червей в 384-луночного планшета
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается использование высокой микроскопом содержимого, чтобы изображение подвергается Pxol1 :: GFP червей, визуализировать выражение GFP в эмбрионах в матке взрослых гермафродитов. Длякаждый 384-луночный планшет для скрининга, использовать червей из 4 х 96-луночных планшетах.
- После химического воздействия в шейкере, пусть пластина Остальные 96-луночный в течение 10-15 мин, чтобы позволить взрослых червей для осаждения на дно тарелки.
- Используя многоканальную пипетку, удалите 350 мкл M9, будучи очень осторожным, чтобы не беспокоить червей в нижней части плиты.
- Вымойте червей с 1 мл M9 и повторите шаг 5,1.
- Используя многоканальную пипетку, удалить 1 мл M9, будучи Вэй осторожность, чтобы не мешать червей в нижней части пластины.
- Используя многоканальную пипетку, ресуспендируйте червей в оставшейся M9 и собирать 100 мкл Worm / M9 смеси из 96-луночных планшетах в и загрузить его в лунки черных стен / прозрачным дном 384-луночного планшета. Повторите процесс с использованием червей из 4 х 96-луночных планшетах, пока все лунки 384-луночного планшета не были загружены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это важно для всех скважин, чтобы иметь тот же объем, чтобы увеличитьэффективность и скорость автофокусировки в процессе захвата изображений. Каждый колодец должен содержать от 80 до 100 червей. - Добавить 1 мкл левамизол (100 мкм) в каждую лунку и пусть черви инкубировать в течение примерно 30 мин.
Примечание: Левамизол действует как агонист рецепторов ацетилхолина и удерживает червей. - Передача пластины к широким полем зрения высокой микроскопом содержимому, способной обеспечить автоматизированное изображений.
- Для получения изображения, используйте высоким содержанием сбора и анализа изображений программное обеспечение в соответствии с руководящими принципами производителя. Выберите цель 4X приобрести 1 изображение на лунку.
- Перед началом захвата изображения, настроить параметры изображения GFP в 45 мс воздействия изображения и разрешение 2160 х 2160.
- Сбор данных как количество GFP позитивных червей, деленное на общее число червей в скважине, последний показатель является относительно постоянной между скважинами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Воздействие на Pxol-1 :: GFP репортер напряжения к воздействию химических веществ, таких как микротрубочки яда нокодазолом (фиг.1) приводит к индукции высокой долей GFP-экспрессирующих эмбрионов в полость матки, подверженных взрослых гермафродитов по сравнению с контролем ДМСО. Эмбрионы GFP-положительных значительно светлее, чем слабой фоновой флуоресценции, наблюдаемой в других эмбрионов, а также автоматического флуоресценции, наблюдаемой в кишечнике животных. Открытые червей непосредственно отображается на 384-луночных планшетах, и количество червей, содержащий по меньшей мере один GFP-положительный зародыш рассчитан на каждую лунку, и нормированной на общее количество червей в том, что а. Положительный удар от химического экране означает соединение, индуцированную долю GFP-положительных эмбрионов в популяции червя на частоте 1.7x выше ДМСО 10. После порога оптимизации, высокая анализ изображений контент (смотри файл материалы) позволяет автоматизированную Calcавляет числа положительных объектов (то есть, эмбрионов), деленное на общее число червей в скважину и является методом выбора для крупномасштабного адаптации анализа.
| Начните с голодали населения червя, чтобы создать беременных взрослого населения |
| ↓ (культура 3 дней) |
| Bleach беременной взрослого населения |
| ↓ |
| Передача беленой червей, чтобы очистить NGM пластин |
| ↓ (культура 1 день) |
| Сбор синхронизированы населения L1 и трансфер в NGM пластин с OP50 |
| ↓ (Выдержите 65 ч при 15 ° С) |
| Соберите синхронизированный население L4 |
| ↓ </ TD> |
| Отказаться от 100 L4 червей в каждую лунку 96-луночных планшетах в в 0,5 мл M9 / OP50 |
| ↓ |
| Добавить химикаты (100 мкМ) в каждую лунку |
| ↓ (Выдержите в течение 24 или 65 часов) |
| Перевести 100 мкл синхронизированного беременной взрослого населения (80 червей) из-луночных планшетах с 96 по 384-луночного планшета. |
| ↓ |
| Добавить 1 мкл левамизол в каждую лунку (1 мкМ конечной концентрации) |
| ↓ (Выдержите 30 до 45 мин) |
| Захват и анализ изображения каждой лунки с высокой микроскопом содержимому |
Таблица 1. Экспериментальные процесса. День 1, использование голода население червь для создания беременных взрослого населения. День 4, bleaСН беременных взрослого населения для получения синхронизированного население L1. День 5, трансфер население L1 от четких NGM пластин OP50 высевают NGM пластин для создания синхронизированных населения L4. День 8, передавать синхронизированный население L4 до 96-луночного планшета и подвергать их различным химическим веществам. День 9 и 11 день, трансфер открытые беременных взрослых 384-луночный планшет для включения в образ с высоким содержанием микроскопом.
| M9 буфера - 1 л | |
| 1. Смешайте следующие ингредиенты в большой химический стакан или мерный цилиндр с помощью магнитной мешалки | |
| 3 г KH 2 PO 4 | |
| 6 г Na 2 HPO 4 | |
| 5 г NaCl | |
| 1 мл 1М MgSO 4 | |
| Н 2 О до 1 Л. | |
| 2. Алиготе в соответствующих размеров бутылок (300 мл в 500 мл размера бутылок) | |
| 3. Стерилизовать автоклавированием в течение 30-60 мин | |
| NGM средств массовой информации для плит - 4 л | |
| 1. Добавьте следующий в колбе Эрленмейера, а затем заполнить в 4 л: | |
| 12 г NaCl | |
| 10 г Bactopeptone | |
| 80 г Агар | |
| 2. Добавьте и хорошо перемешать: | |
| 4 мл холестерин (5 мг / мл) | |
| 4 мл CaCl 2 (1 М раствор) | |
| 4 мл MgSO 4 (1 М раствор) | |
| 3. Автоклав в течение 30-60 мин | |
| 4. Пусть немного остыть и добавить 100 мл KH 2 PO | |
| LB СМИ - 1 л | |
| 1. Добавьте следующий до 800 мл H 2 O | |
| 10 г Bacto-триптон. | |
| 5 г дрожжевого экстракта. | |
| 10 г NaCl. | |
| 2. Отрегулируйте рН до 7,5 с NaOH. | |
| 3. Отрегулируйте громкость на 1 л дН 2 O | |
| 4. Стерилизовать автоклавированием в течение 30 - 60 мин | |
| Bleach решение для синхронизации населения - 50 мл | |
| 7,5 мл 10 N NaOH | |
| 6 мл отбеливателя (обычная) | |
| 36,5 мл дН 2 O |
Таблица 2. Решения.
Рисунок 1:. Примеры изображений, полученных в результате воздействия на Pxol-1 :: GFP репортер напряжения для управления ДМСО и положительного контроля нокодазолом В этом примере червей подвергались в течение 24 ч, чтобы нокодазолом или ДМСО Pxol-1 :: GFP черви. подвергается (А) 0,1% ДМСО (отрицательный контроль) или (б) 100 мкМ нокодазолом (положительный контроль) и отображается в 384-луночных планшетах. Красная стрелка: GFP положительные эмбрионы отчетливо видны в матке одного нокодазол лечение червя. Шкала бар = 1 мм. (С) и (D) увеличиваются части (А) и (В) соответственно. Масштабная линейка = 0,33 мм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, описанный здесь, является первой большой стратегии масштаба для идентификации зародышевой линии токсикантов. Это требует использования в GFP трансгенных Pxol-1 :: GFP, содержащий штамм, который верой и правдой сообщает индукцию анеуплоидии у ранних эмбрионов, который используется в качестве прокси для зародышевой линии дисфункции. Способ включает тщательное синхронизацию С Элеганс население червь и экспозиция червей химических веществ в формате 96-луночного последующим визуализации GFP положительных червей с помощью автоматизированных высокой содержание микроскопии.
Несколько шагов этого протокола имеют решающее значение для согласованности результатов. Во-первых, население червь должен быть очень синхронно как максимально увеличить количество правильно поставлена L4 личинок, которые будут использоваться для воздействия. По этой причине, методологию, описанную здесь, включает в себя два шага синхронизации, сначала отбеливания населения червячного а затем L1 голода. Второй важный пунктСчетчик этого метода является длительность воздействия. Черви обычно подвергаются как для 24 часов или в 65 часов. Как мейоза представляет собой непрерывный процесс, в С. Элеганс, эти два окна экспозиции позволяют захват либо измененных конце мейоза событий (24 ч) или раннего и позднего мейоза событий (65 ч). Важно отметить, однако, что чем дольше воздействие, кажется, лучше прогнозировать млекопитающих репродуктивной токсичности 10.
Одним из наиболее привлекательным аспектом данного метода является его гибкость. В то время как протокол предназначен для высокопроизводительного скрининга, уменьшенной версией анализа может быть выполнена для скрининга меньшего числа проб с использованием 24-луночных планшетах или 1,5 мл пробирки. Снижение масштаб экрана позволяет испытание большим числом червей в образце, которые могут увеличить чувствительность анализа. В нынешнем формате, скрининга соединений в quadruplicates рекомендуется обеспечить более высокую статистическую достоверность в aneuploidy ставки измерить. Потенциальный барьер в этом большом масштабе методологии происходит от необходимости автоматизированного обнаружения GFP-положительных эмбрионов. Хотя эта задача может быть легко выполнена на глаз, осторожно создание соответствующих параметров на программное обеспечение для анализа изображений, в идеале со специалистом изображения, имеет решающее значение для автоматизации процедуры. Кроме того, за обнаружения GFP-положительных эмбрионов, вторичной проверки из ударов должны быть выполнены, чтобы определить, есть ли ошибки являются хромосомные мейотического или эмбрионального происхождения. Ранее мы показали, что такие вторичные анализы легко выполнить в C. Элеганс и включают DAPI-окрашивание зародышевых ядер, а также акридинового оранжевого окрашивания червей для измерения апоптоза 10. Из этих двух простых анализах, ненормальное движение через мейоза, нарушение морфологии ядра и фрагментации, а также потеря половых клеток могут быть оценены.
Взятые вместе, мы describред здесь шаги, необходимые для быстрой оценки зародышевой линии токсичности с использованием модельной системы С Элеганс. Важно отметить, что использование анеуплоидии в червя в качестве маркера для зародышевой линии токсичности является важным для анализа, как это предсказывает млекопитающих концами репродуктивной токсичности, включая уменьшение размеров мусора и яичников дефектов 10. Это особое значение, поскольку токсические эффекты на женщин зародышевой линии особенно трудным для изучения. Таким образом, это быстро анализ представляет собой альтернативу крупных испытаний на животных в качестве первого экрана токсичности пройти и проливает свет на эффект воздействия химических веществ окружающей среды на различных аспектов сложного мейотическому программы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Vented, sharp edge Petri dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon films for biological cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
- Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from: http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T (2009).
- Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
- Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
- Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
- Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
- Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- National Research Council. Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , The National Academies Press. (2007).
- Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).
