Abstract
识别数以千计的出现在我们的环境中的化学物质的生殖毒性已经在环境健康领域中最诱人的挑战之一。这部分对模型系统，可以（1）准确地概括生殖过程的键的功能和（2）这样做的一个中高通量方式的缺乏是由于，而不需要大量的脊椎动物的。
我们在这里描述的线虫C.化验线虫 ，它允许快速鉴定生殖系毒物通过监测非整倍体胚胎的诱导。通过利用GFP报告线，在染色体分离从种系的破坏而导致的错误很容易可视化并用自动荧光显微镜定量。由此一组特定于它的毒性化合物的筛选可以在96至384孔板格式在几天之内进行。积极H第二分析其可以被执行以确定是否染色体异常起源于减数分裂中断或从早期胚胎染色体分离错误。总之，此法代表了一个快速第一遍战略的生殖功能障碍的化学品接触的快速评估。
Introduction
有在美国注册的商业约87000化学品，但只有一小部分，这些已经过测试，潜在的健康影响1。那些已被测试过的，仅一部分被评定为生殖健康的影响，部分原因是在确定改变哺乳动物早期生殖活动的困难，特别是在雌性生殖细胞发育和分化。事实上，第一减数分裂事件发生期间，在雌性哺乳动物胚胎发育的早期阶段，因此难以进入并收集在适于筛选目的号码。
生殖细胞提供了两代人之间的关键环节，其相应的功能是依赖于细胞和染色体分裂的复杂程序的精确执行称为减数分裂。减数分裂过程的失调可导致减少的生育力和生产配子和胚胎染色体数目异常，这种情况被称为非整倍体。减数分裂中染色体分离错误是高度相关的人体健康。染色体异常是常见的，具有一个频率的1在150个活产，21三体，18和13以及X和Y染色体的误差是最普遍的类型2,3。此外，先天性畸形，包括那些染色体来源的，是婴儿死亡的首要原因，在美国4中的环境影响可以影响染色体分离和行为的概念并不是新的5，但仍知之甚少。因此，关键是要考察其引入到我们的环境中的化学物质会干扰人的生育能力，早期的发展和整体生殖健康。
在光的哺乳动物模型的这些限制，我们开发了一种高通量筛选测定法中的蛔虫，以测试生殖毒性<EM>温度。线虫。我们已动员本常用的遗传模型系统提供了几个重要的功能，例如它的尺寸小，成本低，短的再现周期，生殖细胞的比例高，并易于操作6。蠕虫可以生长在96孔板或在高容量液体培养物并由于其透明性，可直接上成像板检测荧光报道的。下面所描述的实验利用了这些特点优势，以含荧光记者Pxol-1 :: GFP检测生殖干扰和诱导胚胎非整倍体的虫株的优势。
使用该报告菌株的是基于通常罕见的男性在一个主要雌雄同体蠕虫人口。这些男性（<0.2％），自然地从错误中X染色体7的隔离起源。然而，由于种系破坏经常导致错误的常染色体的偏析heterochromosomes的和，它与雄性表型（Ⅹmissegregation）以及胚胎致死（常染色体missegregation）升高的发病率相关两者。容易地检测男性的感应而绕过胚胎致死的问题，一个雄性特异性启动子（XOL-1）用于驱动的GFP表达在早期胚胎仍含有蠕虫的子宫内。因此，表达GFP的胚胎的外观被用作用于非整倍体胚胎的存在的代理。此方法已被以前用于确定基因牵连种系维护和减数分裂8,9。适用于化学筛选，这株被采用在中高通量筛选。重要的是，应变忠实报告的化学品的aneugenicity，因此相关的哺乳动物的生殖端点10。这里描述的检测将是特别有用的毒理学家医药和化工等行业的设置看迅速评估朝生殖端点的化学品的毒性。此外，此法完全对准了毒性，在21 世纪11报告强调了政府的优先事项。
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Protocol
1.准备喂食细菌
注意：本节介绍喂食细菌（ 大肠杆菌菌株OP50）的准备。
- 隔离大肠杆菌的单个菌落从LB培养基（LB）琼脂平板上，并在无菌条件下大肠杆菌菌株OP50接种入300ml高压灭菌的LB肉汤。
- 允许接种培养过夜在摇床在200rpm和37℃下生长，直到达到饱和。
- 转移OP50成6无菌，预先称重的50ml锥形管中。通过在6000转（5000 XG）离心5分钟沉淀细菌。
- 弃去上清液，并用50ml无菌的M9洗细菌。重复两次。
- 第二次洗涤后除去残留的M9，确保没有M9被留在管中。
- 通过称量含有细菌沉淀管确定粒料的重量，并减去在50ml锥形管中的重量。
- 悬浮颗粒我ÑM9以100mg / ml的浓度。
- 储存在4℃的OP50溶液，直到它被用于蠕虫培养。
2.制备线虫生长培养基（NGM）培养皿
注意：这部分描述NGM培养皿的制备，这是所述板，其中所述C。线虫蠕虫例行维持在实验室。
- 高压灭菌的NGM琼脂培养基。
- 使用无菌的程序，免除17毫升的NGM琼脂溶液倒入用蠕动泵6厘米培养皿。
注：琼脂中平板恒定量减少了需要从一个板切换到另一个时再聚焦显微镜。 - 离开所述板在室温下放置2-3天使用前，让琼脂固化，允许多余的水分蒸发。
- 种子用无菌技术的NGM板。应用1-2滴OP50液体培养物并扩散用玻璃棒。确保不一路蔓延细菌草坪到板的边缘。
- 允许OP50草坪在室温下用板成长蠕虫之前生长1-2天。
3.准备一个同步蠕虫人口
注：C。的生命周期线虫是由萌芽阶段，四幼虫阶段（L1-L4）和成年。本节描述了蠕虫的时代同步人口的制备。所有的材料来在漂白处理后与线虫接触必须是无菌的。
- 第1天-妊娠蠕虫人口的制备
- 使用NGM板中的大多数蠕虫人口由饿死L1幼虫。
- 收集L1幼虫用消毒虫挑，并将它们转移到新鲜6厘米NGM板接种OP50。孵育约65小时，在20℃，直到大部分的蠕虫是妊娠成人。到避免板拥挤并允许蠕虫未耗尽的细菌生长，不L1幼虫多于一个或两个簇转移到每个新鲜NGM板。
- 4日-建立同步L1幼虫人口
- 通过与M9 1-2毫升冲洗它们收集来自NGM板的妊娠蠕虫和它们转移到一个锥形15ml试管。
- 让妊娠蠕虫沉淀到15毫升锥形管的底部为约5-10分钟。去除上清，而不会干扰病毒颗粒。
- 该蠕虫病毒颗粒转移到2-4离心管，并添加了漂白剂/氢氧化钠溶液1ml。孵育在室温2-3分钟。监视立体显微镜下的反应的进行，以确认所有的蠕虫都死了。不要漂白超过5分钟，因为胚胎会死亡。
- 通过在3000转（900 XG）离心1分钟收集蠕虫。除去上清液，并添加无菌的M9 1ml至中和反应。
- 通过在3000转（900 XG）离心1分钟洗两次的蠕虫。
- 除去上清液，并添加M9与高达100-200微升。
- 使用玻璃巴斯德吸管加一滴蠕虫/ M9混合以清除NGM板孵育它们至少24小时，在20℃，以允许胚胎孵化。
注：没有食物的幼虫的生长将在L1阶段停止。
- 5日-建立同步L4幼虫人口
- 通过洗涤该板用1-2的M9毫升收集来自明确NGM板在L1幼虫，并将它们传送到一圆锥形15ml试管。
- 让死成虫沉淀到15毫升锥形管的底部为约5分钟。
- 收集上清液，其中所述L1蠕虫，在一个新的锥形15ml试管，并通过在2600转（1000 XG）离心2分钟沉淀出蠕虫。
- 除去上清液乐AVING约500微升。
- 通过滴用立体显微镜计数在10微升的蠕虫数目确定在M9溶液蠕虫的浓度。计数至少5滴。
- 调整蠕虫的浓度为20-25蠕虫/微升，添加50微升的蠕虫/ M9混合物来接种OP50 NGM板。
- 孵育65小时，在15℃（用于通过周末孵育），以允许在L1同步的人口增长，直到它们到达L4阶段。
4.暴露蠕虫在化学物质在96孔板
注：本节介绍了使用Pxol1的含:: C.绿色荧光蛋白的转录记者线虫菌株筛选非整倍体的诱导。
- 通过洗涤该板用1-2的M9毫升收集来自明确NGM板的L4幼虫，并将它们传送到一圆锥形15ml试管。
- 让L4蠕虫沉积物的底部的15毫升锥形管中大约5-10分钟。去除上清，而不会干扰病毒颗粒。
- 加3-5的M9毫升，并确定由滴用立体显微镜计数在10微升的蠕虫数目，在M9溶液蠕虫的浓度。计数至少5滴每个样品。
- 重悬在蠕虫中的M9 1000蠕虫/ ml的浓度。
- 从稀释第1 OP50细菌10倍与M9。确保悬浮的细菌达到室温，因为较低的温度会影响蠕虫的发展。
- 使用多道移液器，先添加100微升蜗杆/ M9混合物（来自步骤4.4）中，然后添加400微升的稀释OP50菌（来自步骤4.5），以对一个2毫升深圆底96孔板各孔中。在结束时，每个孔将具有在500μl100蠕虫。
- 加入0.5微升的任一测试的化学品或适当的控制，以所期望的孔，以实现一个建议的最终精矿100μMATION，浓度一般在C.化学屏幕中使用线虫 12。暴露乙醇或DMSO溶剂对照为0.1％的最终浓度。
注意：我们建议使用诺考达唑（100μM）作为阳性对照。 - 封用粘接膜的板。一定要密封板以及防止井之间的交叉污染。
- 包装板用铝箔。
- 板转移到适当的温度的摇床（170-180转）为适当长度的时间（24或65小时）。室内的温度影响的蠕虫的生长;维持20℃左右的温度下进行。
在384孔板5.图像采集妊娠蠕虫
注意：这部分描述了使用具有高含量的显微镜图像的露出Pxol1 :: GFP蠕虫，可视化在成人雌雄同体的子宫内的胚胎的GFP的表达。为每384孔板进行筛选，用从4×96孔板蠕虫。
- 在摇床化学暴露后，让96孔板休息10-15分钟，以允许成虫沉降到板的底部。
- 使用多道移液器，去除350微升的M9的，是非常小心，不要打扰蠕虫在板的底部。
- 1毫升M9和重复步骤5.1洗蠕虫。
- 使用多道移液器，去除1毫升了M9的，是合租小心，不要打扰蠕虫在板的底部。
- 使用多道移液器，悬浮蠕虫在剩余M9和收集100微升的蠕虫/ M9混合物从96孔板中，并将其加载到一个黑色壁/透明底384孔板的孔中。重复使用蠕虫从4×96孔板的过程中，直到已加载该384孔板的所有孔中。
注意：这是重要的，所有的孔中，以具有相同的体积，以便增加效率和自动聚焦的速度在图像采集过程中。每口井应该包含在80到100蠕虫。 - 加入1μl左旋咪唑（100μM）的每个孔中，让蠕虫孵育大约30分钟。
注：左旋咪唑充当乙酰胆碱受体激动剂和固定不变的蠕虫。 - 板块转移到能够提供自动成像的广角含量高的显微镜。
- 进行图像采集，使用根据制造商的指导方针的高含量的图像采集和分析软件。选择4X目标收购每孔1的图像。
- 启动图像采集前，调整GFP成像参数到45毫秒的曝光和图像分辨率为2,160 X 2,160的。
- 收集数据作为GFP阳性蠕虫蠕虫的总数在井分割数，后者被测量井之间相对一致。
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Representative Results
曝光Pxol-1 :: GFP报告菌株的化学试剂，如微管毒物诺考达唑（ 图1）导致了表达GFP的胚胎中相比DMSO对照露出成年雌雄同体的子宫高比例的诱导。 GFP阳性胚胎是比在其他胚胎以及自发荧光，在动物的肠道观察中观察到的弱的背景荧光显著亮。暴露蠕虫被直接成像在384孔板和蠕虫的含有至少一个GFP阳性胚胎的数量以及计算每个井和归由该蠕虫的总数。从化学屏幕正击中意味着诱导蠕虫人口GFP阳性胚胎的比例在1.7倍的频率比DMSO 10以上的化合物。以下阈值的优化，高内涵图像分析（见材料文件）允许所述自动计算正的对象（ 即，胚）通过在井蠕虫的总数除以数的不愿意将是选择用于该测定的大规模适配的方法。
| 开始饿死蠕虫人口产生妊娠成年人群 |
| ↓（培养3天） |
| 漂白妊娠成人 |
| ↓ |
| 转移漂白蠕虫清除NGM板 |
| ↓（文化1天） |
| 收集同步L1人口转移到NGM板的OP50 |
| ↓（孵育65小时，在15°C） |
| 收集同步L4人口 |
| ↓</ TD> |
| 分配100 L4蠕虫到96孔板的每个孔在0.5ml M9 / OP50的 |
| ↓ |
| 添加化学品（100μM）到各孔 |
| ↓（孵育24或65小时） |
| 从96孔板转移100μl的该同步妊娠成年人口（80蠕虫）至384孔板中。 |
| ↓ |
| 加入1μl左旋咪唑至每孔（1μM终浓度） |
| ↓（孵育30至45分钟） |
| 捕捉和高含量的显微镜分析每个图像以及 |
表1.实验的工作流程。每日1剂，使用饿死蠕虫人口产生妊娠成年人群。 4日，bleaCH的妊娠成年人口，以产生一个同步的L1人口。 5日，由清晰NGM板转移L1人口OP50种子NGM板产生同步L4人口。第8天，在同步L4人口转移到96孔板中，并将它们暴露于不同的化学物质。 9日和11日，转让的露出妊娠大人到384孔板向具有高含量的显微镜成像。
| M9缓冲- 1升 | |
| 1.结合在大烧杯中下列成分或用磁搅拌棒量筒 | |
| 3克KH 2 PO 4 | |
| 6克的Na 2 HPO 4 | |
| 5克氯化钠 | |
| 1毫升1M 硫酸镁 | |
| H 2 O来1 L. | |
| 2.分装到合适的大小瓶（300毫升500毫升大小的瓶） | |
| 3.高压灭菌30-60分钟 | |
| NGM媒体板块- 4升 | |
| 1.添加以下的锥形瓶中，然后填充到4 L： | |
| 12克氯化钠 | |
| 10克细菌蛋白胨 | |
| 80克琼脂 | |
| 2.加入拌匀： | |
| 4毫升胆固醇（5毫克/毫升） | |
| 4毫升氯化钙2（1μM原液） | |
| 4毫升硫酸镁 （1μM原液） | |
| 3.高压灭菌30-60分钟 | |
| 4.稍晾凉，并加入100毫升KH 2 PO | |
| LB培养基- 1升 | |
| 1.添加以下到800毫升水2 O | |
| 10克细菌蛋白胨。 | |
| 5g酵母提取物。 | |
| 10克氯化钠。 | |
| 2.调节pH至7.5，用NaOH。 | |
| 3.调整音量，以1升与卫生署2 O | |
| 60分钟 - 4.高压灭菌消毒30 | |
| 同步人群的漂白粉溶液- 50毫升 | |
| 7.5毫升10 N氢氧化钠 | |
| 6毫升漂白剂（常规） | |
| 36.5毫升的dh 2 O |
表2.解决方案。
图1：从Pxol-1 :: GFP报告菌株，以控制的DMSO和阳性对照诺考达唑的曝光获得的图像的实例 。在这个例子中，蠕虫暴露24小时，诺考达唑或DMSO Pxol-1 :: GFP的蠕虫者。暴露于（A）的 0.1％的DMSO（阴性对照）或（B）的 100μM诺考达唑（ 阳性对照）和成像在384孔板中。红色箭头：GFP阳性胚胎在一个诺考达唑治疗蠕虫的子宫清晰可见。比例尺= 1毫米。 （C）和（D）中分别被放大的（A）和（B）的部分。比例尺= 0.33毫米。
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Discussion
此处所描述的方法构成第一大规模策略种系毒物的鉴定。它需要使用一个GFP转基因Pxol-1含有应变:: GFP的忠实报告非整倍体的诱导，其中用作种系功能障碍的代理早期胚胎。该方法涉及一个C的仔细同步线虫蠕虫人口和蠕虫暴露于化学品中的96孔格式接着GFP阳性蠕虫通过自动化高含量显微镜成像。
几个步骤这个协议是至关重要的结果的一致性。首先，蠕虫种群应高度同步为最大数量的适当分级L4幼虫将用于曝光。由于这个原因，这里描述的方法包括两个同步步骤，首先由蠕虫人口的漂白，然后通过L1的饥饿。第二个重要的第计这种方法是暴露的长度。该蠕虫经常暴露无论是24小时或65小时。作为减数分裂是一个连续的过程中C.线虫 ，这两种曝光窗户让任何改变后期减数分裂事件（24小时）或早期和晚期减数分裂事件（65小时）的捕获。然而值得注意的是，更长的曝光似乎更好地预测哺乳动物生殖毒性10是很重要的。
该方法的一个特别有吸引力的方面是它的灵活性。而该协议被设计用于高通量筛选，可以对样品的数量较少使用24孔板或1.5 ml微量离心管中筛选来进行测定的按比例缩小的版本。降低屏幕的规模使若干每个样品蠕虫这可能增加了测定的灵敏度更高的检测。另外，在本格式中，在一式四份筛选化合物，建议，以提供更高的统计置信在aneuploidy率来衡量。在这种大规模的方法的一个潜在的障碍来自于需要GFP阳性胚胎的自动检测。虽然这个任务可以容易地通过眼来进行，仔细建立在图像分析软件的适宜参数，理想地与成像专家，是用于该过程的自动化是至关重要的。此外，除了GFP阳性胚胎的检测中，命中的二次验证应当被执行以确定是否染色体错误是减数分裂或胚胎来源的。我们以前曾表明，这样的次级测定法在C容易地进行线虫和包括DAPI染色种系核以及蠕虫凋亡10的测定吖啶橙染色。从这两个简单的实验，经过减数分裂，异常核形态和分裂异常的进展，以及生殖细胞的损失都可以进行评估。
综上所述，我们describ编辑在这里需要的生殖毒性，使用模型系统C.快速评估的步骤线虫 。重要的是，在蜗杆作为标记为种系毒性使用非整倍性是一个相关检测，因为它是预测性的哺乳动物的生殖毒性端点包括减少产仔数和卵巢的缺陷10。这是特别重要的是在雌性生殖毒性效应是特别艰巨进行调查。因此，这种快速检测提供了一种替代大型动物试验的第一阶段毒性屏和棚灯上的复杂减数分裂方案各方面环境的化学品暴露的效果。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Vented, sharp edge Petri dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon films for biological cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
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