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Developmental Biology

Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo Published: February 22, 2015 doi: 10.3791/52445

Abstract

A identificação da toxicidade reprodutiva das milhares de substâncias químicas presentes em nosso ambiente tem sido um dos desafios mais tentadoras no campo da saúde ambiental. Isto é devido em parte à falta de sistemas modelo que podem (1) recapitulam precisão chaves características dos processos reprodutivos e (2) fazê-lo em um meio a high-throughput forma, sem a necessidade de um elevado número de animais vertebrados.

Descrevemos aqui um ensaio no nemátodo C. elegans que permite a rápida identificação de substâncias tóxicas da linha germinal por monitorização da indução de embriões aneuplóidicos. Ao fazer uso de uma linha repórter GFP, erros na segregação cromossoma resultante da interrupção da linha germinativa são facilmente visualizados e quantificados por microscopia de fluorescência automatizada. Assim, o rastreio de um determinado conjunto de compostos para a sua toxicidade pode ser realizada num formato de placa de 96 a 384 poços numa questão de dias. Análise secundária de h positivoseu pode ser realizado para determinar se as anomalias cromossómicas originado meiótica perturbação ou de erros iniciais de segregação cromossoma embrionárias. Ao todo, este ensaio representa uma estratégia de primeira passagem rápida para a rápida avaliação da disfunção germline seguinte exposição a substâncias químicas.

Introduction

Há cerca de 87.000 produtos químicos registrados para o comércio nos Estados Unidos, mas apenas um pequeno número destes foram testados quanto aos efeitos potenciais sobre a saúde 1. Daqueles que foram testados, apenas uma parte foi avaliada para efeitos de saúde reprodutiva, em parte devido à dificuldade em determinar a alteração dos eventos precoces reprodutivas em mamíferos, especialmente durante o desenvolvimento de células germinativas femininas e diferenciação. Na verdade, os primeiros eventos da meiose ocorrem durante os primeiros estágios do desenvolvimento embrionário em mamíferos do sexo feminino e são, portanto, de difícil acesso e coletar em números adequados para fins de rastreio.

A linha germinativa proporciona a ligação crucial entre gerações, e a sua função apropriada depende da execução precisa do programa intrincado da divisão celular e alterações cromossómicas denominado meiose. A desregulação do processo meiótico pode resultar na redução da fertilidade e da produção degametas e embriões com um número anormal de cromossomos, uma condição denominada aneuploidia. Erros de segregação cromossômica na meiose são altamente relevantes para a saúde humana. Anormalidades cromossômicas são comuns, com uma frequência de 1 em cada 150 nascidos vivos, Trissomia 21, 18 e 13, bem como X e Y erros de cromossomos, sendo os tipos mais prevalentes 2,3. Além disso, malformações congênitas, incluindo os de origem cromossômicas, são a principal causa de morte infantil em os EUA 4 A idéia de que as influências ambientais podem afetar a segregação e do comportamento cromossômico não é nova 5, mas ainda é pouco compreendida. Assim, é fundamental investigar qual dos produtos químicos introduzidos no nosso ambiente estão a interferir com a fertilidade humana, o desenvolvimento precoce e saúde reprodutiva em geral.

À luz dessas limitações dos modelos de mamíferos, temos desenvolvido um ensaio de tela de alto rendimento para testar a toxicidade reprodutiva na lombriga <em> C. elegans. Temos mobilizou várias características importantes oferecidos por este sistema modelo genético comumente utilizadas, tais como seu pequeno tamanho, baixo custo, ciclo de reprodução curta, alta proporção de células germinativas e facilidade de manipulação 6. Os vermes podem ser cultivadas em placas de 96 poços ou em culturas líquidas de alto volume e por causa de sua transparência pode ser visualizado directamente em placas para a detecção de repórteres fluorescentes. O ensaio descrito a seguir aproveita estas características e tira vantagem de uma estirpe repórter que contém o sem-fim fluorescente Pxol-1 :: GFP para detectar perturbações da linha germinal e indução de aneuploidia embrionária.

A utilização desta estirpe repórter é baseada na ocorrência rara geralmente de machos na população verme principalmente hermafroditas. Estes homens (<0,2%) originam naturalmente de erro na segregação do cromossomo X 7. No entanto, como a interrupção da linha germinativa frequentemente leva a erros na segregação dos autossomose de heterochromosomes, correlaciona-se ambos com uma incidência elevada de machos do fenótipo (X missegregation), bem como a letalidade embrionária (autosome missegregation). Para detectar facilmente a indução de machos, contornando o problema da letalidade embrionária, um promotor específico do macho (Xol-1) é utilizado para conduzir a expressão da GFP em embriões precoces ainda contidos no interior do útero do sem-fim. Como tal, o aparecimento de embriões que expressam GFP é utilizado como um substituto para a presença de embriões aneuplóidicos. Este método tem sido utilizado anteriormente para identificar genes implicados na manutenção da linha germinal e meiose 8,9. Adaptado para filtragem de produtos químicos, esta estirpe é empregue numa forma de tela de alto rendimento. É importante ressaltar que a cepa relata fielmente a aneugenicity de produtos químicos e é, portanto, relevante para endpoints reprodução de mamíferos 10. O ensaio descrito aqui será particularmente útil para toxicologistas em configurações da indústria química farmacêutica e à procurapara avaliar rapidamente a toxicidade dos produtos químicos para com terminais reprodutivos. Além disso, este ensaio se alinha totalmente com as prioridades governamentais destacadas na toxicidade no st relatório 21 do século 11.

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Protocol

1. Preparação da alimentação Bactérias

NOTA: Esta seção descreve a preparação de bactérias alimentam (E. coli OP50).

  1. Isolar uma única colônia de E. coli estirpe OP50 a partir de um caldo de lisogenia (LB) e agar de placa inocular assepticamente em 300 ml de caldo LB autoclavado.
  2. Permitir que a cultura inoculada a crescer durante a noite num agitador a 200 rpm e 37 ° C, até que é atingida a saturação.
  3. Transfira a OP50 em 6 estéreis, pré-pesado de 50 ml tubos cônicos. Sedimentar as bactérias por centrifugação durante 5 min a 6000 rpm (5000 xg).
  4. Descartar o sobrenadante e lava-se as bactérias com 50 ml de M9 estéril. Repita duas vezes.
  5. Após a segunda lavagem remover o restante M9, assegurando que nenhum M9 é deixado no tubo.
  6. Determinar o peso do sedimento por pesagem do tubo contendo o sedimento de bactérias e subtrair o peso do tubo de 50 ml.
  7. Ressuspender o pellet in M9 a uma concentração de 100 mg / ml.
  8. Guardar a solução OP50 a 4 ° C até ser utilizado para a cultura sem-fim.

2. Preparação de crescimento de nemátodos Médias Plates (NGM) Petri

NOTA: Esta seção descreve a preparação de placas NGM Petri, que são as placas onde o C. elegans vermes são rotineiramente mantidas em laboratório.

  1. Autoclave o meio agar NGM.
  2. Utilizando procedimentos de esterilização, dispensar 17 ml de solução de agar NGM em seis centímetros placas de Petri utilizando uma bomba peristáltica.
    NOTA: uma quantidade constante de agar nas placas reduz a necessidade de reorientar o microscópio quando se muda de uma placa para outra.
  3. Deixar as placas à temperatura ambiente durante 2-3 dias antes da utilização para deixar o agar solidificar e permitir que o excesso de humidade se evapore.
  4. Semente as placas NGM usando uma técnica estéril. Aplicar 1-2 gotas de OP50 cultura líquida e espalhado utilizando uma vareta de vidro. Certifique-se que nãopara espalhar o relvado bactérias todo o caminho para as extremidades das placas.
  5. Permitir que o relvado OP50 a crescer durante 1-2 dias à temperatura ambiente antes de utilizar as placas de crescer vermes.

3. Elaboração de um População Worm Synchronous

NOTA: O ciclo de vida de C. elegans é constituída pela fase embrionária, quatro estádios larvares (L1-L4) e na idade adulta. Esta seção descreve a preparação de uma população síncrono-idade de worms. Todos os materiais que entram em contacto com C.elegans após o tratamento de branqueamento deve ser estéril.

  1. Dia 1 - Preparação de Gravid Worm População
    1. Utilizar placas NGM em que a maioria da população sem-fim consiste de larvas L1 faminto.
    2. Colete as larvas L1 com um verme esterilizado escolher e transferi-los para novas placas de 6 cm NGM semeado com OP50. Incubar durante cerca de 65 horas a 20 ° C até que a maioria dos vermes são adultos grávidos. Paraevitar placa superlotação e permitir que os vermes de crescer sem esgotar as bactérias, não transferir mais do que um ou dois grupos de larvas L1 para cada placa NGM fresco.
  2. Dia 4 - Criação de um Synchronized L1 Larvas População
    1. Recolha os vermes grávidas a partir das placas NGM, lavando-as com 1-2 ml de M9 e transferi-los para um tubo cônico de 15 ml.
    2. Deixe os vermes fêmeas grávidas sedimentar para o fundo do tubo de 15 ml durante aproximadamente 5-10 min. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento verme.
    3. Transfira o pellet worm para 2-4 microtubos e adicionar 1 ml de água sanitária / solução de NaOH. Incubar durante 2-3 minutos à temperatura ambiente. Monitorar o progresso da reação, ao microscópio estereoscópico para confirmar todos os vermes estão mortos. Não lixívia mais de 5 min como os embriões poderiam morrer.
    4. Recolha os vermes por centrifugação por 1 min a 3.000 rpm (900 xg). Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de solução estéril para M9neutralizar a reacção.
    5. Lave os vermes duas vezes por centrifugação durante 1 min a 3000 rpm (900 xg).
    6. Remover o sobrenadante e adicionar a M9 até 100-200 ul.
    7. Usando uma pipeta de pasteur de vidro adicionar uma gota do verme / M9 misturar para limpar placas NGM e incubar durante pelo menos 24 horas a 20 ° C para permitir que os embriões para eclodir.
      NOTA: Sem comida crescimento das larvas será interrompido na fase L1.
  3. Dia 5 - Criação de um Synchronized L4 Larvas População
    1. Recolhe-se o larvas L1 a partir das placas NGM claras por lavagem das placas com 1-2 ml de M9 e transferi-los para um tubo cónico de 15 ml.
    2. Deixe a vermes adultos mortos sedimentos para o fundo do tubo cónico de 15 mL durante aproximadamente 5 min.
    3. Recolhe-se o sobrenadante, em que os vermes são L1, em um novo tubo cónico de 15 ml, e precipitar os vermes por centrifugação durante 2 min a 2600 rpm (1000 xg).
    4. Remover o sobrenadante leendo cerca de 500 ul.
    5. Determinar a concentração de vermes na solução M9 pela contagem do número de vermes em 10 ul de gotas usando um estereomicroscópio. Contagem de, pelo menos, 5 gotas.
    6. Ajustar a concentração dos vermes para vermes 20-25 / ul e adicionar 50 ul de o sem-fim / M9 mistura para placas NGM semeados com OP50.
    7. Incubar durante 65 horas a 15 ° C (por meio de incubação a fim-de-semana) para permitir que a população sincronizada L1 a crescer até atingirem a fase de L4.

4. Exposição de Worms para Chemicals em placas de 96 poços

NOTA: Esta seção descreve o uso de Pxol1 :: repórter transcricional GFP contendo C. elegans estirpe para pesquisar a indução de aneuploidia.

  1. Recolhe-se o larvas L4 das placas NGM claras por lavagem das placas com 1-2 ml de M9 e transferi-los para um tubo cónico de 15 ml.
  2. Deixe a L4 vermes sedimentos para o fundo doTubo de 15 ml por cerca de 5-10 min. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento verme.
  3. Adicionar 3-5 ml de M9 e determinar a concentração de vermes na solução M9 pela contagem do número de vermes em 10 ul de gotas usando um estereomicroscópio. Contagem de, pelo menos, 5 gotas de cada amostra.
  4. Ressuspender os vermes, a uma concentração de 1.000 / ml em vermes M9.
  5. Diluir as bactérias OP50 da seção 1 10 vezes com M9. Certifique-se que as bactérias em ressuspensão atingir a temperatura ambiente, porque temperatura mais baixa afeta o desenvolvimento worm.
  6. Usando uma pipeta de canais múltiplos, primeiro adicionar 100 ul do verme / mistura M9 (a partir do passo 4.4) e, em seguida, adicionar 400 ul das OP50 bactérias diluídas (a partir do passo 4.5) em cada poço de uma 2 ml de fundo redondo profunda placa de 96 poços. No final, cada poço terá 100 vermes em 500 ul.
  7. Adicionar 0,5 uL de quer o produto químico de teste ou de controlo apropriado para os poços desejados, para alcançar uma concentr definitiva sugeriução de 100 pM, uma concentração utilizada em telas químicos em C. elegans 12. Expor etanol ou controlos de solvente de DMSO a uma concentração final de 0,1%.
    NOTA: Recomendamos a utilização de nocodazole (100 M) como controle positivo.
  8. Selar a placa usando película adesiva. Certifique-se de selar a placa bem para evitar a contaminação cruzada entre os poços.
  9. Enrole a placa com papel alumínio.
  10. Transferir a placa para um agitador (170-180 rpm) de uma temperatura adequada para o período de tempo adequado (24 ou 65 horas). A temperatura da sala afecta o crescimento dos vermes; manter a temperatura a cerca de 20 ° C.

Aquisição 5. Imagem de grávidas Worms em 384 poços Placa

NOTA: Esta secção descreve o uso de um elevado teor de microscópio de imagem exposto a Pxol1 :: vermes gfp, para visualizar a expressão da GFP nos embriões no útero de hermafroditas adultos. Paracada placa de 384 poços a serem rastreados, vermes de utilizar placas de 4 x 96 poços.

  1. Após a exposição a substâncias químicas com o agitador, deixar a placa de 96 poços repouso durante 10-15 minutos para permitir que os vermes adultos para sedimentar para o fundo da placa.
  2. Usando uma pipeta de canais múltiplos, remover 350 ul da M9, ​​sendo muito cuidado para não perturbar os vermes na parte inferior da placa.
  3. Lave os vermes com 1 ml de M9 e repita o passo 5.1.
  4. Usando uma pipeta de canais múltiplos, 1 ml de remover o M9, sendo vey cuidado para não perturbar os vermes na parte inferior da placa.
  5. Usando uma pipeta de canais múltiplos, ressuspender os vermes no restante M9 e recolher 100 uL do verme / M9 mistura a partir das placas de 96 poços e carregá-lo nas cavidades de paredes pretas de / fundo transparente placa de 384 poços. Repetir o processo de utilização de vermes das placas 4 x 96 cavidades, até que todos os poços da placa de 384 poços foram carregadas.
    NOTA: É importante que todos os poços, para ter o mesmo volume, a fim de aumentar aeficiência e velocidade do autofoco durante o processo de aquisição de imagem. Cada poço deverá conter entre 80 a 100 vermes.
  6. Adicionar 1 ml de levamisol (100 uM) a cada poço e deixar os vermes incubar durante aproximadamente 30 min.
    NOTA: Levamisol actua como um agonista do receptor de acetilcolina e imobiliza os vermes.
  7. Transferir a placa com um alto teor de microscópio de campo amplo capaz de fornecer imagem automatizado.
  8. Para aquisição de imagem, use uma aquisição e análise de imagem de software alto teor de acordo com as orientações do fabricante. Selecione o objetivo 4X para adquirir uma imagem por poço.
  9. Antes de iniciar a aquisição de imagem, ajustar os parâmetros de imagem GFP para 45 ms de exposição e resolução de imagem de 2160 x 2160.
  10. Recolher os dados como o número de vermes positivas para GFP divididos pelo número total de vermes no poço, sendo a última medida relativamente consistente entre poços.

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Representative Results

Exposição do Pxol-1 :: GFP estirpe repórter de agentes químicos, tais como o veneno de microtúbulos Nocodazole (Figura 1) leva à indução de uma alta proporção de embriões que expressam GFP no útero de hermafroditas adultos expostos em comparação com controlo de DMSO. Os embriões GFP positivas são significativamente mais brilhantes do que a fraca fluorescência de fundo observada em outros embriões, assim como a auto-fluorescência observada no intestino dos animais. Vermes são expostos directamente visualizados em placas de 384 poços e o número de vermes embrião contendo pelo menos um GFP-positiva é contado para cada poço e normalizados pelo número total de vermes em que bem. A resposta positiva a partir da tela química significa um composto induziu uma proporção de embriões GFP positivas em uma população sem-fim com uma frequência maior do que 1,7x DMSO 10. Após otimização limiar, o alto teor de análise de imagem (veja o arquivo de materiais) permite que o calc automatizadoulação do número de objectos positivos (ou seja, embriões) dividido pelo número total de vermes no bem e é o método de escolha para a adaptação, em larga escala do ensaio.

Comece com população verme faminto para gerar uma população adulta grávida
↓ (Cultura 3 dias)
Branquear a população adulta grávida
Transferência branqueada vermes para limpar placas NGM
↓ (Cultura 1 dia)
Recolha população L1 sincronizado e transferir para placas NGM com OP50
↓ (Incubar 65 horas a 15 ° C)
Recolha a população L4 sincronizado
↓ </ Td>
Dispensar 100 vermes L4 para cada poço das placas de 96 poços em 0,5 ml de M9 / OP50
Adicionar produtos químicos (100 uM) a cada poço
↓ (Incubar por 24 ou 65 horas)
Transferir 100 ul da população adulta grávida sincronizados (80 vermes) a partir das placas de 96 poços para uma placa de 384 poços.
Adicionar 1 ml de levamisol a cada poço (concentração final 1 uM)
↓ (Incubar de 30 a 45 min)
Capturar e analisar as imagens de cada poço com elevado teor de microscópio

Tabela 1. fluxo de trabalho Experimental. Dia 1, o uso fome população sem-fim de gerar uma população adulta grávida. Dia 4, bleach da população adulta grávida para gerar uma população de L1 sincronizado. Dia 5, transferir a população L1 de placas NGM claras para OP50 semeadas placas NGM para gerar uma população L4 sincronizado. Dia 8, a transferência da população L4 sincronizado com placa de 96 poços e expô-los aos diferentes produtos químicos. Dia 9 e dia 11, transferir os adultos grávidas expostas a uma placa de 384 poços a ser trabalhada com um microscópio de alta conteúdo.

M9 buffer - 1 L
1. Misture os seguintes ingredientes em grande copo ou cilindro graduado usando uma barra magnética
3 g de KH 2 PO 4
6 g de Na 2 HPO 4
5 g de NaCl
1 ml 1 M MgSO4
H2O até 1 L.
2. Parte alíquota para frascos de tamanho apropriado (300 ml em frascos de 500 ml de tamanho)
3. Esterilizar em autoclave por 30-60 min
Media NGM para placas - 4 L
1. Adicione o seguinte em uma garrafa de Erlenmeyer, em seguida, preencher a 4 L:
12 g de NaCl
10 g Bactopeptona
80 g Agar
2. Adicione e misture bem:
4 ml de Colesterol (5 mg / ml)
4 ml de CaCl2 (1 M de solução de estoque)
4 ml de MgSO 4 (1 M de solução de estoque)
3. Autoclave para 30-60 min
4. Deixe esfriar um pouco e adicione 100 ml de KH 2 PO
LB media - 1 L
1. Adicione o seguinte para 800 ml H 2 O
10 g de Bacto-triptona.
5 g de extracto de levedura.
10 g de NaCl.
2. Ajustar o pH a 7,5 com NaOH.
3. Ajustar o volume de 1 L com dH2O
4. Esterilizar em autoclave por 30 - 60 min
Solução de água sanitária para a sincronização de populações - 50 ml
7,5 ml NaOH 10 N
6 ml de lixívia (regular)
36,5 ml de dH2O

Tabela 2. Solutions.

Figura 1
Figura 1:. Os exemplos de imagens obtidas a partir da exposição Pxol-1 :: GFP estirpe repórter para controlar DMSO e nocodazol controlo positivo Neste exemplo, vermes foram expostas durante 24 horas a Nocodazole ou DMSO Pxol-1 :: GFP foram vermes. exposto a (A) 0,1% de DMSO (controlo negativo) ou (B) 100 uM de nocodazole (controlo positivo) e fotografada em placas de 384 poços. A seta vermelha: GFP embriões positivos claramente visíveis dentro de um útero nocodazole tratado do worm. Escala da barra = 1 mm. (C) e (D) são porções de (A) e (B) ampliada, respectivamente. Barra de escala = 0,33 mm.

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Discussion

O método aqui descrito constitui a primeira estratégia de grande escala para a identificação de substâncias tóxicas da linha germinal. Ele requer o uso de um transgênico GFP Pxol-1 :: GFP contendo tensão que relata fielmente a indução de aneuploidia em embriões, que é usado como um proxy para a disfunção da linha germinativa. O método envolve a sincronização cuidadosa de um C. população sem-fim elegans e exposição dos vermes aos agentes químicos em formato de 96 poços seguido pela imagem dos vermes GFP positivas através de microscopia de alta conteúdo automatizado.

Diversas etapas deste protocolo são cruciais para a consistência dos resultados. Em primeiro lugar, população de vermes deve ser altamente síncrona como a maximizar o número de larvas L4 encenado adequadamente que será usado para a exposição. Por esta razão, a metodologia aqui descrita inclui dois passos de sincronização, primeiro por branqueamento da população sem-fim e, em seguida, por L1 inanição. O segundo parágrafo importantemetro deste método é o tempo de exposição. Os vermes são rotineiramente expostas durante 24 ou 65 h ou hr. Como a meiose é um processo contínuo em C. elegans, estas duas janelas de exposição permitem a captura de ambos eventos alterados final da meiose (24 h) ou ambos os eventos meióticos precoces e tardios (65 h). É importante notar, contudo, que o maior tempo de exposição parece melhor predizer toxicidade reprodutiva dos mamíferos 10.

Um aspecto particularmente interessante do método é a sua flexibilidade. Enquanto que o protocolo é concebido para rastreio de alto rendimento, uma versão reduzida do ensaio pode ser realizado para o rastreio de um menor número de amostras utilizando placas de 24 poços ou tubos de 1,5 ml. Baixando a escala da tela permite o teste de um maior número de vermes por exemplo o que pode aumentar a sensibilidade do ensaio. Neste formato, os compostos de triagem em quadruplicado é recomendado para proporcionar maior confiança estatística no aneupltaxas oidy medido. Um obstáculo potencial em grande escala desta metodologia vem da necessidade de detecção automática de embriões GFP positivas. Embora esta tarefa pode ser realizada facilmente a olho nu, o estabelecimento de parâmetros apropriados cuidadoso sobre o software de análise de imagem, de preferência com um especialista em imagem, é crucial para a automatização do procedimento. Além disso, para além da detecção de embriões GFP positivas, validação secundário dos hits devem ser realizados para determinar se erros cromossômicos são de meiotic ou origem embrionária. Já mostramos anteriormente que tais ensaios secundários são facilmente realizados em C. elegans e incluem o DAPI-coloração de núcleos da linha germinal, bem como coloração com alaranjado de acridina dos vermes para a medição de apoptose 10. A partir destes dois ensaios simples, através da meiose progressão anormal, morfologia anormal e fragmentação nuclear, bem como perda de células germinativas podem ser avaliadas.

Tomados em conjunto, temos described aqui as etapas necessárias para a rápida avaliação da toxicidade germline usando o sistema de modelo C. elegans. É importante notar que o uso de aneuploidia no verme como um marcador para a toxicidade da linha germinativa é um ensaio relevante, uma vez que é preditiva de pontos de extremidade de toxicidade reprodutiva de mamíferos, incluindo diminuição do tamanho da ninhada e defeitos do ovário 10. Isto é de particular importância e efeitos tóxicos sobre a linha germinal feminina são particularmente árdua para investigar. Assim, este ensaio rápido fornece uma alternativa para grandes testes em animais como uma tela de toxicidade primeira passagem e lança luz sobre o efeito da exposição a produtos químicos ambientais em vários aspectos do programa meiotic complexo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm Vented, sharp edge Petri dishes Tritech T3315
Agar Apex 20-274
Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate Corning P-DW-20-C-S
Bactopeptone Apex 20-261
Bacto-tryptone Fisher Scientific BP1421-2
Bleach Clorox
Calcium chloride (CaCl2) VWR AA12316-A1
Cholesterol Fisher Scientific ICN10138225
DMSO VWR IC19018680
E. coli (OP50) Caenorhabditis Genetics Center http://www.cbs.umn.edu/cgc
Ethanol 200 proof VWR EM-4455S
Greiner CELLSTAR 384 well plates Sigma-Aldrich M1937-32EA
ImageXpress Micro XLS System Molecular Devices
Levamisole hydrochloride Fluka 31742
Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4) VWR 97061-438
MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software Molecular Devices
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655
Rayon films for biological cultures VWR 60941-086
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) VWR BDH0316
Stereomicroscope Nikon SMZ 745 This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work.
TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain Caenorhabditis Genetics Center http://www.cbs.umn.edu/cgc
Yeast extract Becton Dickinson 212750

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References

  1. Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from: http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T (2009).
  2. Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
  3. Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
  4. Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
  5. Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  7. Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
  8. Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
  9. Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).
  10. Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
  11. National Research Council. Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , The National Academies Press. (2007).
  12. Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).

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Biologia do Desenvolvimento Edição 96, A tela química alto rendimento aneuploidia toxicidade reprodutiva GFP
Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em
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Parodi, D. A., Damoiseaux, R.,More

Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445, doi:10.3791/52445 (2015).

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