Abstract
Identifikation af reproduktionstoksicitet af de tusindvis af kemikalier i vores miljø har været en af de mest forjættende udfordringer inden for miljø og sundhed. Dette skyldes til dels, at de sparsomme model systemer, der kan (1) præcist rekapitule- nøgler funktioner i reproduktive processer og (2) gøre det i en mellem- til high-throughput fashion, uden behov for et stort antal hvirveldyr.
Vi beskriver her et assay i nematode C. elegans, der tillader hurtig identifikation af germline giftstoffer ved at overvåge induktion af aneuploide embryoner. Ved at gøre brug af et GFP reporter linje, er fejl i kromosom adskillelse resulterende fra kimcellelinje forstyrrelser let visualiseres og kvantificeres ved automatiseret fluorescensmikroskopi. Således screening af et bestemt sæt af forbindelser til dets toksicitet kan udføres i en 96- til 384-brønds plade-format i løbet af få dage. Sekundær analyse af positive hdens kan udføres for at afgøre, om kromosomfejl stammede fra meiotisk afbrydelse eller fra tidlige embryonale kromosom adskillelse fejl. Tilsammen dette assay er en hurtig first-pass strategi for hurtig vurdering af germline dysfunktion efter kemisk eksponering.
Introduction
Der er ca. 87.000 kemikalier, der er registreret for handel i USA, men kun et lille antal af disse er blevet testet for potentielle sundhedsmæssige virkninger 1. Af dem, der er blevet testet, har kun en del blevet vurderet for reproduktiv sundhed effekter skyldes til dels, at det er vanskeligt at bestemme ændring af de tidlige reproduktive begivenheder i pattedyr, især under kvindelig udvikling kønsceller og differentiering. Faktisk den første meiotiske begivenheder finder sted i de tidlige stadier af fosterudviklingen hos kvindelige pattedyr og er derfor svære at få adgang til og samle i antal egnede til screening.
Kimcellelinjen giver den afgørende forbindelse mellem generationerne, og dets relevante funktion er afhængig af den præcise gennemførelse af den indviklede program for Cellulær og kromosomal division kaldes meiose. Dysregulering af den meiotiske proces kan resultere i reduceret fertilitet og produktion afkønsceller og embryoner med en unormal antallet af kromosomer, en tilstand kaldet aneuploidi. Kromosom adskillelse fejl i meiose er yderst relevante for menneskers sundhed. Kromosomfejl er fælles, med en frekvens på 1 i 150 levendefødte, trisomi 21, 18 og 13 samt X og Y-kromosom fejl er de mest udbredte former 2,3. Desuden medfødte misdannelser, herunder kromosomale oprindelse, er den førende årsag til spædbarnsdød i USA 4 Tanken om, at miljømæssige påvirkninger kan påvirke kromosomal segregering og adfærd er ikke ny 5, men stadig dårligt forstået. Det er derfor afgørende at undersøge, hvilke af de kemikalier, der blev indført i vores miljø forstyrrer menneskers forplantningsevne, tidlig udvikling og generelle reproduktive sundhed.
I lyset af disse begrænsninger i de pattedyr modeller, har vi udviklet et high-throughput screen assay til at teste reproduktionstoksicitet i rundorm <em> C. elegans. Vi har mobiliseret flere vigtige funktioner, der tilbydes af denne almindeligt anvendte genetiske model system som sin lille størrelse, lave omkostninger, kort gengivelse cyklus, høj andel af kønsceller og nem manipulation 6. Orme kan dyrkes i 96-brønds plader eller i høje volumen flydende kulturer og på grund af deres gennemsigtighed kan direkte afbildes på plader til detektering af fluorescerende reportere. Den nedenfor beskrevne assay drager fordel af disse egenskaber og drager fordel af en orm stamme indeholdende fluorescerende reporter Pxol-1 :: GFP at detektere kimcellelinje forstyrrelser og induktion af embryonale aneuploidi.
Anvendelsen af denne reporter stamme er baseret på den generelt sjældne forekomst af hanner i en hovedsagelig hermafroditisk orm befolkning. Disse mænd (<0,2%) naturligt stammer fra fejl i adskillelse af X-kromosomet 7. Men som germlinie forstyrrelser ofte fører til fejl i adskillelse af autosomerog heterochromosomes det korrelerer med både en forhøjet forekomst af hanner fænotype (X missegregation) samt embryonisk letalitet (Autosom missegregation). For nemt at detektere induktion af hanner mens omgå problemet med embryoniske dødelighed er en han-specifik promotor (xol-1) anvendes til at drive ekspression af GFP i tidlige embryoner stadig indeholdt i ormen livmoder. Som sådan er fremkomsten af GFP-udtrykkende embryoner anvendes som proxy for tilstedeværelsen af aneuploide embryoner. Denne fremgangsmåde er tidligere blevet anvendt til at identificere gener, der er impliceret i kimcellelinje vedligeholdelse og meiose 8,9. Tilpasset til kemisk screening, er denne stamme anvendes i en medium til high-throughput skærm. Vigtigt er det, stammen trofast rapporterer aneugenicity af kemikalier og er derfor relevant for pattedyr reproduktive endpoints 10. Den her beskrevne assay vil være særlig nyttig for toksikologer i farmaceutiske og kemiske industri indstillinger søgertil hurtigt at vurdere toksiciteten af kemikalier i retning reproduktive endpoints. Desuden er denne analyse fuldt ud på linje med de statslige prioriteringer fremhævet i Toksicitet i st rapporten 21 århundrede 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Feeding Bakterier
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver fremstillingen af fodring bakterier (E. coli stamme OP50).
- Isolere en enkelt koloni af E. coli-stamme OP50 fra en lysogeni bouillon (LB) agar plade og aseptisk at inokulere i 300 ml autoklaveret LB bouillon.
- Lad den podede kultur til at vokse natten over i en omryster ved 200 rpm og 37 ° C, indtil mætning er nået.
- Overfør OP50 i 6 sterile, forvejet 50 ml koniske rør. Pelletere bakterierne ved centrifugering i 5 minutter ved 6.000 rpm (5.000 x g).
- Supernatanten fjernes, og vaske bakterierne med 50 ml sterilt M9. Gentag to gange.
- Efter den anden vask fjerner den resterende M9, sikre, at ingen M9 er tilbage i røret.
- Bestemme vægten af pelleten ved vejning røret indeholdende bakterier pellet og trække vægten af 50 ml konisk rør.
- Pellet resuspenderes in M9 i en koncentration på 100 mg / ml.
- Opbevar OP50 opløsning ved 4 ° C, indtil det anvendes til ormen kultur.
2. Fremstilling af Nematode vækstmedium (NGM) petriskåle
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver fremstillingen af NGM petriskåle, som er pladerne, hvor C. elegans orme rutinemæssigt opretholdt i laboratoriet.
- Autoklaver NGM agarmedium.
- Ved hjælp af sterile procedurer, dispensere 17 ml NGM agaropløsning i 6 cm petriskåle under anvendelse af en peristaltisk pumpe.
BEMÆRK: En konstant mængde agar i pladerne reducerer behovet for omlægningen af mikroskopet, når der skiftes fra den ene plade til den anden. - Lad pladerne ved stuetemperatur i 2-3 dage før brug for at lade agar størkne og lad overskydende fugt at fordampe.
- Seed NGM plader under anvendelse af en steril teknik. Påfør 1-2 dråber OP50 flydende kultur og sprede med en glasstav. Sørg ikkeat sprede bakterierne græsplæne hele vejen til kanterne af pladerne.
- Lad OP50 plænen til at vokse i 1-2 dage ved stuetemperatur før anvendelse af pladerne for at vokse orme.
3. Udarbejdelse af en synkron Worm Befolkning
BEMÆRK: livscyklus C. elegans består af fosterstadiet, fire larvestadier (L1-L4) og voksenlivet. Dette afsnit beskriver fremstilling af en aldersbetinget synkron population af orme. Alle materialer, der kommer i kontakt med C.elegans efter blegemiddel behandling skal være sterile.
- Dag 1 - Fremstilling af Gravid Worm Befolkning
- Brug NGM plader, hvor de fleste af ormen befolkning består af udsultet L1 larver.
- Saml L1 larver med en steriliseret orm vælge og overføre dem til friske 6 cm NGM plader podet med OP50. Inkuber i ca. 65 timer ved 20 ° C, indtil de fleste af orme er drægtige voksne. Tilundgå plade overbelægning og lade ormene til at vokse uden at reducere bakterier, ikke overføre mere end en eller to klynger af L1 larver til hver frisk NGM plade.
- Dag 4 - Etablering af en synkroniseret L1 Larver Befolkning
- Saml af den gravide orme fra NGM plader ved at vaske dem med 1-2 ml M9 og overføre dem til en konisk 15 ml rør.
- Lad drægtige orme sedimenterer til bunden af 15 ml konisk rør i ca. 5-10 min. Fjern supernatanten uden at forstyrre ormen pellet.
- Overfør ormen pillen til 2-4 mikrocentrifugerør og tilsættes 1 ml af blegemiddel / NaOH-opløsning. Inkuber i 2-3 minutter ved stuetemperatur. Overvåge udviklingen af reaktionen under stereomikroskop at bekræfte alle orme er døde. Må ikke bleges længere end 5 min, da embryonerne kunne dø.
- Saml ormene ved centrifugering i 1 min ved 3000 rpm (900 x g). Fjern supernatanten og tilsættes 1 ml sterilt M9 tilneutralisere reaktionen.
- Vask orme to gange ved centrifugering i 1 min ved 3000 rpm (900 x g).
- Fjern supernatanten og tilsæt M9 op til 100-200 ml.
- Ved hjælp af en glas Pasteur-pipette en dråbe ormen / M9 mix at rydde NGM plader og inkubere dem i mindst 24 timer ved 20 ° C for at tillade embryoner at udklække.
BEMÆRK: Uden mad larverne vækst vil blive standset på L1 fase.
- Dag 5 - Etablering af en synkroniseret L4 larver Befolkning
- Saml L1 larver fra de klare NGM plader ved at vaske pladerne med 1-2 ml M9 og overføre dem til et konisk 15 ml rør.
- Lad de døde voksne orme sediment på bunden af 15 ml konisk rør i ca. 5 min.
- Opsaml supernatanten, hvor L1 orme er i en ny konisk 15 ml rør og udfælde ormene ved centrifugering i 2 minutter ved 2.600 rpm (1.000 x g).
- Fjern supernatanten lender ca. 500 pi.
- Bestemme koncentrationen af orme i M9 opløsning ved at tælle antallet af orme i 10 pi falder anvendelse af et stereomikroskop. Tæl mindst 5 dråber.
- Justér koncentrationen af orme til 20-25 orme / pl og tilsættes 50 pi af ormen / M9 mix til NGM plader podet med OP50.
- Der inkuberes i 65 timer ved 15 ° C (for inkubation gennem week-enden) for at tillade L1 Synchronized befolkning at vokse, indtil de når L4 fase.
4. Udsættelse af Worms til kemikalier i plader med 96 brønde
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver brugen af Pxol1 :: GFP transkriptionel reporter indeholdende C. elegans stamme til at screene for induktion af aneuploidi.
- Saml L4 larver fra de klare NGM plader ved at vaske pladerne med 1-2 ml M9 og overføre dem til et konisk 15 ml rør.
- Lad L4 orme sediment på bunden af15 ml konisk rør i ca. 5-10 min. Fjern supernatanten uden at forstyrre ormen pellet.
- Tilføj 3-5 ml M9 og bestemme koncentrationen af orme i M9 opløsning ved at tælle antallet af orme i 10 pi dråber ved hjælp af et stereomikroskop. Tæl mindst 5 dråber for hver prøve.
- Resuspender orme i en koncentration på 1.000 orme / ml i M9.
- Fortynd de OP50 bakterier fra § 1 10 gange med M9. Sørg for, at resuspenderede bakterierne nå stuetemperatur, fordi lavere temperatur påvirker orm udvikling.
- Ved hjælp af en multikanalpipette, først tilsættes 100 pi af orm / M9 mix (fra trin 4.4) og derefter tilsættes 400 pi af de fortyndede OP50 bakterier (fra trin 4.5) til hver brønd i en 2 ml dyb rundbundet 96-brønds plade. Ved afslutningen, vil hver brønd have 100 orme i 500 pi.
- Tilsæt 0,5 pi enten teststoffet eller hensigtsmæssig kontrol til de ønskede brønde, for at opnå en foreslået endelig concentration af 100 pM, en koncentration der almindeligvis anvendes i kemiske skærme i C. elegans 12. Bring ethanol eller DMSO opløsningsmiddel kontrol ved en slutkoncentration på 0,1%.
BEMÆRK: Vi anbefaler brugen af nocodazol (100 uM) som positiv kontrol. - Forsegle skiltet med selvklæbende film. Sørg for at forsegle skiltet godt at undgå krydskontaminering mellem brønde.
- Wrap pladen med alufolie.
- Overfør pladen til en ryster (170-180 rpm) af den passende temperatur for passende tidsrum (24 eller 65 timer). Temperaturen i rummet påvirker væksten af orme; holde temperaturen omkring 20 ° C.
5. Image Acquisition af GRAVID Worms i en 384-brønds plade
Bemærk: Dette afsnit beskriver anvendelsen af et højt indhold mikroskop at afbilde udsat Pxol1 :: GFP orme, at visualisere ekspressionen af GFP i embryoner i livmoderen af voksne hermafroditter. Forhver 384-brønds plade, der skal screenes, bruge orme fra 4 x 96-brønds plader.
- Efter kemisk eksponering i rysteapparatet, lad 96-brønds plade hvile i 10-15 minutter for at tillade de voksne orme at sedimentere til bunden af pladen.
- Ved hjælp af en multikanal pipette til at fjerne 350 pi af M9, er meget omhyggelig med ikke at forstyrre orme i bunden af pladen.
- Vask ormene med 1 ml M9 og gentag trin 5.1.
- Ved hjælp af en multikanalpipette, fjerne 1 ml M9, være vey omhyggelig med ikke at forstyrre orme i bunden af pladen.
- Ved hjælp af en multikanal pipette resuspendere orme i de resterende M9 og indsamle 100 pi af ormen / M9 mix fra de 96 brønde og indlæse den i brøndene i en sorte vægge / klar bund 384 brønde. Gentag processen ved hjælp af orme fra 4 x 96-brønds plader, indtil alle brønde i 384 brønde er blevet indlæst.
BEMÆRK: Det er vigtigt for alle brønde at have samme volumen for at øge deneffektivitet og hastighed autofokus under billedet tilegnelsesproces. Hver brønd bør indeholde mellem 80 til 100 orme. - Tilsæt 1 pi levamisol (100 uM) til hver brønd og lod orme inkuberes i ca. 30 min.
BEMÆRK: Levamisol fungerer som en acetylcholin-receptor agonist og immobiliserer orme. - Overfør pladen til en Vidvinklet højt indhold mikroskop stand til at tilvejebringe automatiseret billeddannelse.
- For billedoptagelse, bruge et højt indhold indsamling og analyse billedsoftware overensstemmelse med producentens retningslinjer. Vælg 4X mål at erhverve 1 billede pr godt.
- Før du starter erhvervelse billedet, justere GFP imaging parametre til 45 ms for eksponering og billedopløsning til 2.160 x 2.160.
- Indsamler data som antallet af GFP-positive orme divideret med det samlede antal af orme i brønden, den sidstnævnte foranstaltning er relativt konsistent mellem brønde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksponering af Pxol-1 :: GFP reporter stamme med kemiske midler, såsom den mikrotubulus gift nocodazol (figur 1) fører til induktion af en stor del af GFP-udtrykkende embryoner i livmoderen af udsatte voksne hermafroditter sammenlignet med DMSO-kontrol. GFP-positive embryoner er væsentligt lysere end den svage baggrundsfluorescens observeret i andre embryoer samt auto-fluorescens observeret i tarmen af dyrene. Synlige orme direkte afbildes på 384-brønds plader, og antallet af orm, der indeholder mindst et GFP-positive embryo tælles for hver brønd og normaliseret af det samlede antal orme i det godt. En positiv hit fra den kemiske skærm betyder en forbindelse, inducerede en andel af GFP-positive embryoner i en orm befolkning ved en frekvens 1.7x højere end DMSO 10. Efter tærskel optimering, det høje indhold billedanalyse (se Materialer fil) tillader automatiseret calcfolkning af antallet af positive objekter (dvs. embryoner) divideret med det samlede antal orme i brønden og er den foretrukne metode til storstilet tilpasning af assayet.
| Start med udsultet orm befolkning til at generere en gravid voksne befolkning |
| ↓ (kultur 3 dage) |
| Blege gravide voksne befolkning |
| ↓ |
| Overfør bleget orme at rydde NGM plader |
| ↓ (kultur 1 dag) |
| Saml synkroniseret L1 befolkning og overføre til NGM plader med OP50 |
| ↓ (inkuberes 65 timer ved 15 ºC) |
| Saml den synkroniserede L4 befolkning |
| ↓ </ Td> |
| Dispenser 100 L4 orme til hver brønd af 96-brønds plader i 0,5 ml M9 / OP50 |
| ↓ |
| Tilføj kemikalier (100 uM) til hver brønd |
| ↓ (inkuberes i 24 eller 65 timer) |
| Overfør 100 ul af synkroniserede gravide voksne befolkning (80 orme) fra 96-brønds plader til en 384-brønds plade. |
| ↓ |
| Tilsæt 1 pi levamisol til hver brønd (1 uM slutkoncentration) |
| ↓ (Inkuber 30 til 45 min) |
| Capture og analysere billeder af hver brønd med højt indhold mikroskop |
Tabel 1. Eksperimentel workflow. Dag 1, til brug sultede orm befolkning generere en gravid voksne befolkning. Dag 4, bleaCH gravide voksne befolkning til at generere en synkroniseret L1 befolkning. Dag 5, overføre L1 befolkning fra klare NGM plader til OP50 podet NGM plader for at generere en synkroniseret L4 befolkning. Dag 8, overføre synkroniseret L4 befolkning til 96-brønds plade og udsætte dem for de forskellige kemikalier. Dag 9 og dag 11, overfører de udsatte drægtige voksne til en plade med 384 brønde, der skal afbildes med et højt indhold af mikroskop.
| M9 Buffer - 1 L | |
| 1. Kombiner de følgende bestanddele i stort bægerglas eller en gradueret cylinder under anvendelse af magnetisk omrørerstav | |
| 3 g KH 2 PO 4 | |
| 6 g Na 2 HPO 4 | |
| 5 g NaCl | |
| 1 ml 1M MgSO4 | |
| H 2 O til 1 L. | |
| 2. Alikvot i passende størrelse flasker (300 ml i 500 ml størrelse flasker) | |
| 3. Der steriliseres i autoklave i 30-60 min | |
| NGM medier for plader - 4 L | |
| 1. Tilsæt følgende i en Erlenmeyerkolbe, derefter udfylde til 4 L: | |
| 12 g NaCl | |
| 10 g bactopepton | |
| 80 g Agar | |
| 2. Tilsæt og bland godt: | |
| 4 ml af kolesterol (5 mg / ml) | |
| 4 ml CaCl2 (1 M stamopløsning) | |
| 4 ml MgSO4 (1 M stamopløsning) | |
| 3. Autoklave for 30-60 min | |
| 4. Lad afkøle lidt og tilsæt 100 ml KH 2 PO | |
| LB medier - 1 L | |
| 1. Tilføj følgende til 800 ml H 2 O | |
| 10 g Bacto-trypton. | |
| 5 g gærekstrakt. | |
| 10 g NaCl. | |
| 2. Indstil pH til 7,5 med NaOH. | |
| 3. Juster volumen til 1 L med dH2O | |
| 4. steriliseres ved autoklavering i 30 til 60 min | |
| Bleach løsning til synkronisering befolkninger - 50 ml | |
| 7,5 ml 10 N NaOH | |
| 6 ml blegemiddel (regelmæssig) | |
| 36,5 ml dH2O |
Tabel 2. Solutions.
Figur 1:. Eksempler på billeder opnået fra eksponering af Pxol-1 :: GFP reporter stamme til at styre DMSO og positiv kontrol nocodazol I dette eksempel blev orme eksponeret i 24 timer for at nocodazol eller DMSO Pxol-1 :: GFP orme var. udsat for (A) 0,1% DMSO (negativ kontrol) eller (B) 100 uM nocodazol (positiv kontrol) og afbildes i 384-brønds plader. Rød pil: GFP-positive embryoner klart synlige inden for en nocodazol behandlet orm livmoder. Scale bar = 1 mm. (C) og (D) er forstørret dele af (A) og (B) hhv. Scale bar = 0,33 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne fremgangsmåde er den første store strategi til identifikation af germline giftstoffer skala. Det kræver brug af et GFP transgen Pxol-1 :: GFP indeholdende stamme, der trofast rapporterer induktion af aneuploidi i tidlige embryoner, der anvendes som en proxy for germlinie dysfunktion. Fremgangsmåden involverer omhyggelig synkronisering af en C. elegans orm befolkning og orme eksponering for kemikalier i 96-brønds format efterfulgt af billeddannelse af GFP-positive orme ved automatiseret højt indhold mikroskopi.
Flere trin i denne protokol er afgørende for sammenhængen i resultaterne. For det første bør ormen populationer være meget synkron som maksimere antallet af korrekt trinvis L4 larver, der vil blive anvendt til eksponeringen. Af denne grund, den metode, der er beskrevet her omfatter to synkronisering trin, først ved blegning af ormen befolkning og derefter ved L1 sult. Det andet vigtige parameter af denne fremgangsmåde er længden af eksponeringen. Ormene rutinemæssigt udsat for enten 24 timer eller 65 timer. Som meiose er en kontinuerlig proces i C. elegans, disse to eksponering vinduer tillader indfangning af enten ændret sene meiotiske begivenheder (24 timer) eller både tidlige og sene meiotiske begivenheder (65 h). Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at jo længere eksponering synes at bedre forudsige pattedyr reproduktionstoksicitet 10.
Et særligt attraktivt aspekt af fremgangsmåden er dens fleksibilitet. Mens protokollen er beregnet til screening med højt gennemløb, kan en nedskaleret version af assayet udføres til screening af et mindre antal af prøver ved anvendelse af plader med 24 brønde eller 1,5 ml rør. Sænkning omfanget af skærmen muliggør test af et større antal orme pr prøve, som kan øge assayets følsomhed. I det nuværende format, er screening af forbindelser i firdobbelte anbefales at give en højere statistisk tillid til aneuploidy satser målt. En potentiel forhindring i denne store skala metode kommer fra behovet for automatiseret påvisning af GFP-positive embryoner. Selv om denne opgave let kan udføres af øjet, omhyggelig etablering af passende parametre i billedanalyse software, ideelt set med et billeddannende specialist, er afgørende for automatisering af proceduren. Endvidere, ud over påvisning af GFP-positive embryoner sekundær validering af hits bør udføres for at bestemme, om kromosomale fejl af meiotisk eller embryonale stamceller. Vi har tidligere vist, at sådanne sekundære assays let udføres i C. elegans og omfatter DAPI-farvning af kimcellelinje kerner samt acridinorange-farvning af orme til måling af apoptose 10. Ud fra disse to enkle analyser, kan unormal progression gennem meiose, unormal nukleare morfologi og fragmentering samt kønsceller tab alle vurderes.
Tilsammen har vi described her de nødvendige skridt for en hurtig vurdering af germline toksicitet ved hjælp af modellen systemet C. elegans. Det er vigtigt, at anvendelsen af aneuploidi i ormen som en markør for kimcellelinje toksicitet er et relevant assay som det er prædiktiv for pattedyr reproduktiv toksicitet slutpunkter, herunder reduceret kuldstørrelse og æggestokkene defekter 10. Dette er af særlig betydning, da toksiske effekter på den kvindelige germline er særligt belastende at undersøge. Således er denne hurtige analyse giver et alternativ til store dyreforsøg som et første pass toksicitet skærm og belyser effekten af miljømæssige kemiske eksponeringer om forskellige aspekter af det komplekse meiotiske program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Vented, sharp edge Petri dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon films for biological cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
- Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from: http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T (2009).
- Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
- Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
- Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
- Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
- Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- National Research Council. Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , The National Academies Press. (2007).
- Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).
