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Developmental Biology

Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode Published: February 22, 2015 doi: 10.3791/52445

Abstract

Identificare la tossicità riproduttiva delle migliaia di sostanze chimiche presenti nel nostro ambiente è stata una delle sfide più allettanti nel campo della salute ambientale. Ciò è dovuto in parte alla scarsità di sistemi modello che può (1) ricapitolare accuratamente chiavi caratteristiche dei processi riproduttivi e (2) lo fanno in un medio di moda high-throughput, senza la necessità di un elevato numero di animali vertebrati.

Descriviamo qui un test nel nematode C. elegans che permette la rapida identificazione delle sostanze tossiche linea germinale monitorando l'induzione di embrioni aneuploidi. Facendo uso di una linea di GFP giornalista, errori nella segregazione dei cromosomi derivanti da interruzioni germinale sono facilmente visualizzati e quantificati al microscopio a fluorescenza automatizzata. Così la proiezione di un particolare insieme di composti per la sua tossicità può essere eseguita in un formato di piastra da 96 a 384 pozzetti in pochi giorni. Analisi secondaria di h positivola sua può essere eseguita per stabilire se le anomalie cromosomiche originati da interruzioni meiotic o dai primi errori segregazione dei cromosomi embrionali. Complessivamente, questo test rappresenta una veloce strategia di primo passaggio per la rapida valutazione della disfunzione linea germinale dopo l'esposizione chimica.

Introduction

Ci sono circa 87.000 sostanze chimiche registrate per il commercio negli Stati Uniti, ma solo un piccolo numero di questi sono stati testati per i potenziali effetti sulla salute 1. Di quelli che sono stati testati, solo una parte è stata esaminata per effetti sulla salute riproduttiva dovuti in parte alla difficoltà di determinare alterazioni degli eventi riproduttivi primi nei mammiferi, in particolare durante lo sviluppo delle cellule germinali femminile e differenziazione. In effetti, i primi eventi meiotici hanno luogo durante le prime fasi dello sviluppo embrionale dei mammiferi di sesso femminile e sono quindi di difficile accesso e raccogliere in numero adeguato a fini di screening.

La linea germinale fornisce il collegamento cruciale tra le generazioni, e la sua funzione appropriata dipende dalla precisa esecuzione del programma intricata di divisione cellulare e cromosomico chiamato meiosi. Disregolazione del processo meiotica può causare ridotta fertilità e la produzione digameti ed embrioni con un numero anormale di cromosomi, una condizione nota come aneuploidie. Errori segregazione cromosomiche in meiosi sono molto importanti per la salute umana. Anomalie cromosomiche sono comuni, con una frequenza di 1 a 150 nati vivi, Trisomia 21, 18 e 13, nonché X e Y errori cromosomiche che sono i tipi più diffusi 2,3. Inoltre, malformazioni congenite, incluse quelle di origini cromosomiche, sono la principale causa di morte infantile negli Stati Uniti 4 L'idea che le influenze ambientali possono influenzare la segregazione e il comportamento cromosomico non è nuovo 5, ma è ancora poco conosciuta. E 'quindi fondamentale indagare quali delle sostanze chimiche introdotte nel nostro ambiente stanno interferendo con la fertilità umana, lo sviluppo della prima e della salute riproduttiva generale.

Alla luce di queste limitazioni dei modelli mammiferi, abbiamo sviluppato un saggio schermo high-throughput per testare la tossicità riproduttiva nel verme <em> C. elegans. Abbiamo mobilitato diverse importanti caratteristiche offerte da questo sistema modello genetico di uso comune come le sue piccole dimensioni, a basso costo, ciclo di riproduzione breve, alta percentuale di cellule germinali e la facilità di manipolazione 6. Worms possono essere coltivate in piastre da 96 pozzetti o in volume di culture alte e liquidi a causa della loro trasparenza possono essere esposte direttamente su piastre per la rilevazione di giornalisti fluorescenti. Il test descritto di seguito sfrutta queste caratteristiche e si avvale di un ceppo verme contenente il reporter fluorescente Pxol-1 :: GFP per rilevare interruzioni germinale e induzione di aneuploidie embrionale.

L'uso di questo ceppo giornalista si basa sul generalmente scarsa incidenza maschi in una popolazione verme principalmente ermafrodita. Questi maschi (<0,2%) naturalmente provengono da errore nella segregazione del cromosoma X 7. Tuttavia, come interruzione linea germinale porta spesso ad errori in segregazione di autosomie di eterocromosomi, si correla sia con una elevata incidenza di maschi fenotipo (X missegregation) e letalità embrionale (autosoma missegregation). Per rilevare facilmente l'induzione dei maschi, mentre eludere la questione della letalità embrionale, un promotore maschio-specifica (Xol-1) è usato per guidare l'espressione di GFP in embrioni precoci ancora contenuti all'interno dell'utero del worm. Come tale, la comparsa di embrioni-GFP esprimere viene utilizzato come proxy per la presenza di embrioni aneuploidi. Questo metodo è stato precedentemente utilizzato per identificare i geni implicati nella linea germinale manutenzione e meiosi 8,9. Adattato per lo screening chimico, questo ceppo è impiegato in un mezzo di schermo ad alta produttività. È importante sottolineare che il ceppo riporta fedelmente la aneugenicity di sostanze chimiche ed è quindi rilevante per endpoint riproduttivi dei mammiferi 10. Il test qui descritto sarà particolarmente utile per i tossicologi in ambienti dell'industria chimica farmaceutica e ricercadi valutare rapidamente la tossicità delle sostanze chimiche verso endpoint riproduttivi. Inoltre, questo test allinea pienamente con le priorità governative evidenziati nella tossicità nel 21 ° rapporto secolo 11.

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Protocol

1. Preparazione di batteri alimentazione

NOTA: Questa sezione descrive la preparazione di batteri alimentazione (ceppo di E. coli OP50).

  1. Isolare una singola colonia di E. coli ceppo OP50 da un brodo lisogenia (LB) piastra di agar e asetticamente inoculare in 300 ml di brodo LB autoclavato.
  2. Lasciare la coltura inoculata a crescere durante la notte in un agitatore a 200 rpm e 37 ° C, fino a saturazione.
  3. Trasferire il OP50 in 6 50 ml provette coniche sterili, pre-pesati. Pellet i batteri per centrifugazione per 5 min a 6.000 giri (5.000 xg).
  4. Eliminare il surnatante e lavare i batteri con 50 ml di sterile M9. Ripetere due volte.
  5. Dopo il secondo lavaggio rimuovere il rimanente M9, assicurando che nessun M9 è lasciato nel tubo.
  6. Determinare il peso del pellet pesando il tubo contenente il pellet batteri e sottrarre il peso del tubo conico 50 ml.
  7. Risospendere il pellet in M9 ad una concentrazione di 100 mg / ml.
  8. Conservare la soluzione OP50 a 4 ° C fino al suo utilizzo per la cultura verme.

2. Preparazione del nematode crescita a medio Piastre (NGM) Petri

NOTA: Questa sezione descrive la preparazione di piatti NGM Petri, che sono i piatti in cui il C. vermi elegans sono normalmente mantenute in laboratorio.

  1. Sterilizzare l'agar NGM.
  2. Utilizzando procedure sterili, erogare 17 ml di soluzione di agar NGM in sei centimetri piastre Petri utilizzando una pompa peristaltica.
    NOTA: una quantità costante di agar-agar in piastre riduce la necessità di rifocalizzare il microscopio quando si passa da un piatto all'altro.
  3. Lasciare le piastre a temperatura ambiente per 2-3 giorni prima dell'uso per consentire l'agar solidificare e permettere l'umidità in eccesso di evaporare.
  4. Seed le piastre NGM utilizzando una tecnica sterile. Applicare 1-2 gocce di liquido OP50 cultura e diffondere con una bacchetta di vetro. Assicurarsi di nonper diffondere il prato batteri fino ai bordi delle piastre.
  5. Lasciare che il prato OP50 a crescere per 1-2 giorni a temperatura ambiente prima di usare le piastre per crescere vermi.

3. Preparazione di un sincrono Worm Popolazione

NOTA: Il ciclo di vita di C. elegans comprende la fase embrionale, quattro stadi larvali (L1-L4) e l'età adulta. Questa sezione descrive la preparazione di una popolazione in età-sincrona di vermi. Tutti i materiali che entrano in contatto con C.elegans dopo il trattamento candeggiante devono essere sterili.

  1. 1 ° giorno - Preparazione di Gravid Worm Popolazione
    1. Utilizzare piastre NGM in cui la maggioranza della popolazione è costituito da verme affamato L1 larve.
    2. Raccogliere le larve L1 con un verme sterilizzato raccogliere e trasferirli freschi 6 piatti cm NGM seminato con OP50. Incubare per circa 65 ore a 20 ° C fino a quando la maggior parte dei vermi sono adulti gravide. Aevitare la piastra di sovraffollamento e permettere ai vermi di crescere senza esaurire i batteri, non trasferire più di uno o due gruppi di L1 larve di ogni piatto NGM fresco.
  2. Giorno 4 - Istituzione di un Synchronized L1 Larve Popolazione
    1. Raccogliere i vermi gravide dalle piastre NGM lavandoli con 1-2 ml di M9 e trasferirli in un tubo conico da 15 ml.
    2. Che i vermi gravide sedimentare sul fondo della provetta conica da 15 ml per circa 5-10 minuti. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet verme.
    3. Trasferire il pellet verme di 2-4 tubi microcentrifuga e aggiungere 1 ml di candeggina / NaOH. Incubare per 2-3 minuti a temperatura ambiente. Monitorare l'avanzamento della reazione allo stereomicroscopio per confermare tutti i vermi sono morti. Non candeggiare più di 5 minuti come gli embrioni potrebbero morire.
    4. Raccogliere i vermi per centrifugazione per 1 min a 3000 rpm (900 xg). Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di sterile M9 aneutralizzare la reazione.
    5. Lavare i vermi due volte mediante centrifugazione per 1 min a 3000 rpm (900 xg).
    6. Rimuovere il surnatante e aggiungere M9 fino a 100-200 ml.
    7. Usando una pipetta Pasteur di vetro aggiungere una goccia del verme / M9 miscela per cancellare piastre NGM e incubate per almeno 24 ore a 20 ° C per consentire gli embrioni alla schiusa.
      NOTA: Senza cibo crescita del larve sarà interrotta nella fase L1.
  3. Giorno 5 - Istituzione di un Synchronized L4 Popolazione
    1. Raccogliere le larve L1 dalle piastre NGM chiare lavando i piatti con 1-2 ml di M9 e trasferirli in un tubo conico da 15 ml.
    2. Lasciare morti vermi adulti sedimenti sul fondo del tubo da 15 ml per circa 5 min.
    3. Raccogliere il surnatante, in cui i vermi sono L1, in un nuovo tubo da 15 ml, e precipitare i vermi per centrifugazione per 2 min a 2600 rpm (1000 xg).
    4. Rimuovere il surnatante leaving circa 500 ml.
    5. Determinare la concentrazione di vermi nella soluzione M9 contando il numero di vermi in 10 microlitri gocce utilizzando uno stereomicroscopio. Contare almeno 5 gocce.
    6. Regolare la concentrazione dei vermi per 20-25 vermi / ml e aggiungere 50 ml di worm / mix M9 a piastre NGM seminato con OP50.
    7. Incubare per 65 ore a 15 ° C (per l'incubazione con il week-end), per consentire alla popolazione sincronizzato L1 a crescere fino a raggiungere lo stadio L4.

4. L'esposizione di Worms per sostanze chimiche in piastre con 96 pozzetti

NOTA: Questa sezione descrive l'uso di Pxol1 :: giornalista trascrizionale GFP contenenti C. ceppo elegans allo schermo per l'induzione di aneuploidie.

  1. Raccogliere le larve L4 dalle piastre NGM chiare lavando i piatti con 1-2 ml di M9 e trasferirli in un tubo conico da 15 ml.
  2. Lasciare L4 vermi sedimenti sul fondo dellaTubo da 15 ml per circa 5-10 minuti. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet verme.
  3. Aggiungere 3-5 ml di M9 e determinare la concentrazione di vermi nella soluzione M9 contando il numero di vermi in 10 microlitri gocce utilizzando uno stereomicroscopio. Contare almeno 5 gocce per ogni campione.
  4. Risospendere i vermi ad una concentrazione di 1.000 vermi / ml in M9.
  5. Diluire i batteri OP50 dalla sezione 1 10 volte con M9. Assicurarsi che i batteri risospeso temperatura ambiente a causa della temperatura più bassa influisce sviluppo verme.
  6. Utilizzando una pipetta multicanale, prima aggiungere 100 ml di worm mix / M9 (dal punto 4.4) e poi aggiungere 400 ml di batteri OP50 diluito (dal punto 4.5) in ciascun pozzetto di una profonda rotonda 2 ml bottom piastra da 96 pozzetti. Alla fine, ogni pozzetto avrà 100 vermi in 500 microlitri.
  7. Aggiungere 0,5 ml di ciascuna sostanza chimica di prova o il controllo appropriato ai pozzetti desiderati, per ottenere un Conc finale suggeritozione di 100 micron, una concentrazione comunemente usato in schermi chimici in C. elegans 12. Esporre etanolo o DMSO controlli con solvente ad una concentrazione finale di 0,1%.
    NOTA: Si consiglia l'uso di nocodazole (100 micron) come controllo positivo.
  8. Sigillare la piastra con pellicola adesiva. Accertarsi di sigillare la piastra bene per evitare la contaminazione incrociata tra i pozzetti.
  9. Avvolgere la piastra con un foglio di alluminio.
  10. Trasferire la piastra ad un agitatore (170-180 rpm) della temperatura appropriata per la lunghezza adeguata di tempo (24 o 65 ore). La temperatura della camera colpisce la crescita dei vermi; mantenere la temperatura intorno ai 20 ° C.

5. Acquisizione di immagini di gravide Worms in un piatto da 384 pozzetti

NOTA: Questa sezione descrive l'uso di un microscopio ad alto contenuto di all'immagine Pxol1 esposta :: vermi GFP, di visualizzare l'espressione di GFP in embrioni all'interno dell'utero di ermafroditi adulti. Perogni piatto 384-bene proiettato, utilizzare i vermi da lastre 4 x 96 pozzetti.

  1. Dopo esposizione chimica nello shaker, lasciare che la piastra a 96 pozzetti riposo per 10-15 minuti per consentire i vermi adulti per sedimentare sul fondo della piastra.
  2. Usando una pipetta multicanale, rimuovere 350 microlitri della M9, ​​facendo molta attenzione a non disturbare i vermi sul fondo della piastra.
  3. Lavare i vermi con 1 ml di M9 e ripetere il punto 5.1.
  4. Usando una pipetta multicanale, rimuovere 1 ml di M9, essendo vey attenzione a non disturbare i vermi sul fondo della piastra.
  5. Utilizzando una pipetta multicanale, risospendere i vermi nel restante M9 e raccogliere 100 ml di worm / mix M9 dalle piastre a 96 pozzetti e caricarlo nei pozzetti di una parete nera / chiara fondo piatto 384-bene. Ripetere il processo con i vermi da lastre 4 x 96 pozzetti, finché non sono stati caricati tutti i pozzetti della piastra a 384 pozzetti.
    NOTA: È importante per tutti i pozzetti di avere lo stesso volume per aumentare laefficienza e velocità del autofocus durante il processo di acquisizione dell'immagine. Ogni pozzetto dovrebbe contenere da 80 a 100 vermi.
  6. Aggiungere 1 ml di levamisolo (100 micron) in ogni pozzetto e lasciare che i vermi incubare per circa 30 min.
    NOTA: Levamisole agisce come un agonista del recettore dell'acetilcolina e immobilizza i vermi.
  7. Trasferire la piastra per un widefield elevato contenuto di microscopio in grado di fornire immagini automatizzata.
  8. Per l'acquisizione delle immagini, utilizzare un alto contenuto di software di acquisizione e analisi delle immagini secondo le linee guida del produttore. Selezionare l'obiettivo 4X per acquisire 1 immagine al bene.
  9. Prima di avviare l'acquisizione delle immagini, regolare i parametri di imaging GFP a 45 msec di esposizione e risoluzione di 2.160 x 2.160.
  10. Raccogliere i dati come il numero di GFP vermi positivi divisa per il numero totale di vermi nel pozzo, quest'ultima misura essendo relativamente costante tra i pozzetti.

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Representative Results

L'esposizione della Pxol-1 :: GFP giornalista ceppo ad agenti chimici quali microtubulo veleno nocodazole (Figura 1) porta alla induzione di una elevata percentuale di embrioni-GFP esprimere nell'utero di ermafroditi adulti esposti rispetto al controllo DMSO. Gli embrioni GFP-positive sono significativamente più luminoso sfondo debole fluorescenza osservato in altri embrioni nonché l'auto-fluorescenza osservato nell'intestino degli animali. Vermi sono direttamente esposte ripreso su piastre 384 pozzetti e il numero di vermi contenente dell'embrione almeno un GFP-positive viene contato per ciascun pozzetto e normalizzati per il numero totale di vermi in bene. Un colpo positiva dallo schermo chimica significa un composto indotto una percentuale di embrioni GFP-positive in una popolazione verme ad una frequenza superiore a 1,7x DMSO 10. A seguito di ottimizzazione soglia, l'alto contenuto di analisi di immagine (vedi file di Materiali) permette al calc automatizzatolamento del numero di oggetti positivi (cioè, embrioni) diviso per il numero totale di vermi nel pozzo ed è il metodo di scelta per la grande scala adeguamento del dosaggio.

Inizia con popolazione verme affamato di generare una popolazione adulta gravido
↓ (Culture 3 giorni)
Bleach popolazione adulta gravida
Trasferimento sbiancato vermi per cancellare piastre NGM
↓ (Cultura 1 ° giorno)
Raccogliere popolazione L1 sincronizzato e trasferimento a piastre NGM con OP50
↓ (Incubare 65 ore a 15 ° C)
Raccogliere la popolazione L4 sincronizzato
↓ </ Td>
Erogare 100 L4 vermi a ciascun pozzetto di piastre a 96 pozzetti in 0,5 ml di M9 / OP50
Aggiungere le sostanze chimiche (100 micron) per ciascun bene
↓ (Incubare per 24 o 65 ore)
Trasferire 100 microlitri della popolazione adulta gravida sincronizzato (80 vermi) dalle 96 pozzetti di una piastra a 384 pozzetti.
Aggiungere 1 ml di levamisolo ad ogni pozzetto (concentrazione finale 1 mM)
↓ (Incubare 30 a 45 min)
Cattura e analizzare le immagini di ogni bene ad alto contenuto di microscopio

Tabella 1. workflow sperimentale. Day 1, uso affamata popolazione verme per generare una popolazione adulta gravida. Giorno 4, bleach popolazione adulta gravida per generare una popolazione L1 sincronizzato. Giorno 5, trasferire la popolazione L1 da piastre NGM chiare OP50 seminato piastre NGM per generare una popolazione L4 sincronizzato. Giorno 8, trasferire la popolazione L4 sincronizzato a 96 pozzetti e li espongono alle diverse sostanze chimiche. Giorno 9 e il giorno 11, il trasferimento adulti gravide esposte ad una piastra a 384 pozzetti per essere ripreso con un microscopio ad alto contenuto.

M9 Buffer - 1 L
1. Unire i seguenti ingredienti in grande bicchiere o cilindro graduato con ancoretta magnetica
3 g KH 2 PO 4
6 g Na 2 HPO 4
5 g NaCl
1 ml 1M MgSO 4
H 2 O a 1 L.
2. Aliquotare in bottiglie appropriate dimensioni (300 ml in bottiglie da 500 ml di dimensioni)
3. Sterilizzare in autoclave per 30-60 min
NGM supporti per piatti - 4 L
1. Aggiungere la seguente in una beuta, quindi riempire di 4 L:
12 g NaCl
10 g Bactopeptone
80 g Agar
2. Aggiungere e mescolare bene:
4 ml di colesterolo (5 mg / ml)
4 ml CaCl 2 (1 M soluzione madre)
4 ml MgSO 4 (1 M soluzione madre)
3. Autoclave per 30-60 min
4. Lasciate raffreddare leggermente e aggiungere 100 ml di KH 2 PO
LB media - 1 L
1. Aggiungere il seguente 800 ml H 2 O
10 g Bacto-triptone.
5 g di estratto di lievito.
10 g di NaCl.
2. Regolare il pH a 7,5 con NaOH.
3. Regolare il volume a 1 L con dH 2 O
4. Sterilizzare in autoclave 30 - 60 min
Soluzione di candeggina per la sincronizzazione popolazioni - 50 ml
7,5 ml 10 N NaOH
6 ml candeggina (regolare)
36.5 ml dH 2 O

Tabella 2. Le soluzioni.

Figura 1
Figura 1:. Esempi di immagini ottenute da esposizione del Pxol-1 :: GFP giornalista sforzo per controllare DMSO e nocodazole controllo positivo In questo esempio, i vermi sono stati esposti per 24 ore a nocodazole o DMSO Pxol-1 :: GFP erano vermi. esposto a (A) 0,1% DMSO (controllo negativo) o (B) 100 pM nocodazole (controllo positivo) e ripreso in 384 pozzetti. Freccia rossa: GFP embrioni positive chiaramente visibili all'interno dell'utero uno nocodazole trattato del worm. Bar Scala = 1 mm. (C) e (D) sono ingrandite porzioni di (A) e (B), rispettivamente. Barra di scala = 0,33 millimetri.

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Discussion

Il metodo qui descritto costituisce la prima strategia larga scala per l'identificazione di sostanze tossiche germinali. Si richiede l'uso di un transgenico GFP Pxol-1 :: GFP contenente ceppo che riporta fedelmente l'induzione di aneuploidie in embrioni precoci che viene utilizzato come proxy per la disfunzione linea germinale. Il metodo prevede l'accurata sincronizzazione di un C. popolazione verme elegans e l'esposizione a sostanze chimiche worm 'in formato a 96 pozzetti seguito da immagini dei GFP vermi positivi mediante microscopia ad alta contenuto di automazione.

Diversi passaggi di questo protocollo sono cruciali per la coerenza dei risultati. Innanzitutto, le popolazioni verme devono essere altamente sincrona come massimizzare il numero di scena correttamente L4 che verrà utilizzato per l'esposizione. Per questo motivo, il metodo qui descritto comprende due fasi di sincronizzazione, prima di sbiancamento della popolazione vite senza fine e poi da L1 fame. Il secondo importante parametro di questo metodo è la durata dell'esposizione. I vermi sono regolarmente esposti sia per 24 ore o 65 ore. Come meiosi è un processo continuo in C. elegans, queste due finestre di esposizione consente la cattura di eventi sia alterati fine meiotiche (24 ore) e due eventi meiotici precoce e tardiva (65 hr). È importante notare, tuttavia, che l'esposizione sembra più meglio prevedere tossicità riproduttiva mammiferi 10.

Un aspetto particolarmente interessante del metodo è la sua flessibilità. Mentre il protocollo è progettato per lo screening ad alto rendimento, una versione ridotta del dosaggio può essere eseguita per la proiezione di un numero inferiore di campioni utilizzando piastre da 24 pozzetti o provette da 1,5 ml. Abbassando la scala dello schermo consente la prova di un maggior numero di vermi per campione che potrebbero aumentare la sensibilità del saggio. Nella forma attuale, composti di screening in quadruplicates si raccomanda di fornire confidenza statistica più alta nel aneupltassi oidy misurati. Un potenziale ostacolo in questa metodologia larga scala deriva dalla necessità di rilevamento automatico di embrioni GFP-positive. Sebbene questo compito può essere facilmente eseguita a occhio, l'accurata definizione di parametri appropriati sul software di analisi delle immagini, idealmente con uno specialista di imaging, è cruciale per l'automazione della procedura. Inoltre, oltre il rilevamento di embrioni GFP-positive, convalida secondaria dei risultati deve essere eseguita per determinare se gli errori cromosomiche sono meiotica o origine embrionale. Abbiamo precedentemente dimostrato che tali dosaggi secondari sono facilmente eseguite in C. elegans e comprendono il DAPI-colorazione dei nuclei germinali e arancio di acridina colorazione dei vermi per la misura dell'apoptosi 10. Da questi due test semplici, progressione anomala attraverso la meiosi, morfologia nucleare anormale e la frammentazione e perdita di cellule germinali possono essere valutati.

Nel loro insieme, abbiamo describED qui i passi necessari per la rapida valutazione della tossicità germinale utilizzando il sistema modello C. elegans. È importante sottolineare che l'uso di aneuploidie nella worm come marker per la tossicità germinale è un test rilevante in quanto è predittivo di mammiferi endpoint di tossicità riproduttiva, tra cui una diminuzione delle dimensioni dei cuccioli e difetti ovariche 10. Questo è di particolare importanza in quanto gli effetti tossici sulla linea germinale femminile sono particolarmente arduo per indagare. Pertanto, questo test veloce fornisce un'alternativa ai grandi esperimenti sugli animali come una prima schermata di tossicità passaggio e mette in luce l'effetto di esposizioni chimiche ambientali su vari aspetti del programma meiotica complesso.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm Vented, sharp edge Petri dishes Tritech T3315
Agar Apex 20-274
Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate Corning P-DW-20-C-S
Bactopeptone Apex 20-261
Bacto-tryptone Fisher Scientific BP1421-2
Bleach Clorox
Calcium chloride (CaCl2) VWR AA12316-A1
Cholesterol Fisher Scientific ICN10138225
DMSO VWR IC19018680
E. coli (OP50) Caenorhabditis Genetics Center http://www.cbs.umn.edu/cgc
Ethanol 200 proof VWR EM-4455S
Greiner CELLSTAR 384 well plates Sigma-Aldrich M1937-32EA
ImageXpress Micro XLS System Molecular Devices
Levamisole hydrochloride Fluka 31742
Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4) VWR 97061-438
MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software Molecular Devices
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655
Rayon films for biological cultures VWR 60941-086
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) VWR BDH0316
Stereomicroscope Nikon SMZ 745 This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work.
TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain Caenorhabditis Genetics Center http://www.cbs.umn.edu/cgc
Yeast extract Becton Dickinson 212750

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References

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Biologia dello Sviluppo , Schermata chimica alto rendimento aneuploidie tossicità riproduttiva GFP
Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em
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Parodi, D. A., Damoiseaux, R.,More

Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445, doi:10.3791/52445 (2015).

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