Abstract
我々の環境中に存在する化学物質の何千もの生殖毒性を識別することは環境衛生の分野で最も食欲をそそる課題の一つとなっている。これは、（1）正確に生殖過程のキーの機能を再現し、（2）脊椎動物の多数を必要とせず、ハイスループット様式に、中で行うことができ、モデル系の不足に一部起因する。
ここでは、線虫C.でのアッセイを説明異数性胚の誘導を監視することにより、生殖細胞系の毒物の迅速な同定を可能にする虫 。 GFPレポーターラインを利用することにより、生殖細胞の破壊に起因する染色体分離におけるエラーは、容易に自動化蛍光顕微鏡により可視化し、定量化される。したがって、その毒性のための化合物の特定のセットのスクリーニングは、数日のうちに96の384ウェルプレート形式で実施することができる。正hの二次分析その染色体異常が減数分裂の破壊または初期胚染色体分配誤差に由来するかどうかを決定するために行うことができる。要するに、このアッセイは、化学物質曝露後の生殖細胞系の機能障害を迅速に評価するための迅速な初回通過戦略を表す。
Introduction
米国では商業用に登録さ約87000薬品、これらは潜在的な健康への影響1のためにテストされたのまだごく少数があります。テストされたもののうち、一部のみ、特に女性の生殖細胞の発生および分化の間、哺乳動物における早期の生殖イベントの変更を決定する際の困難さに一部起因生殖健康への影響について評価された。確かに、最初の減数分裂事象は、雌の哺乳類における胚発生の初期段階で行われ、スクリーニング目的に適した番号にアクセスして収集することは困難である。
生殖細胞は、世代間の重要なリンクを提供し、その適切な機能は、細胞の染色体分裂の複雑なプログラム減数分裂と呼ばれるの正確な実行に依存している。減数分裂プロセスの調節不全が減少生殖能力との産生をもたらす可能性染色体の異常な数の配偶子および胚は、条件が異数性と呼ばれる。減数分裂における染色体の分離エラーが人間の健康に非常に関連しています。染色体異常は1〜150で出生の頻度、21トリソミー、18と13だけでなく、最も一般的なタイプ2,3であるXとY染色体のエラーで、共通している。さらに、染色体の起源のものを含め先天性奇形は、環境の影響は、染色体分離や行動に影響を与えることができるという考えは5新しいものではないが、それでも十分に理解されていない米国4で乳児死亡の主要な原因である。それは人間の生殖能力、初期の開発および全体的な生殖に関する健康に干渉している私たちの環境に導入された化学物質のどの調査することが重要である。
哺乳動物モデルのこれらの制限に照らして、我々は、回虫生殖毒性を試験するためのハイスループットスクリーニングアッセイを開発した<EM> C。エレガンス。我々は、その小さなサイズ、低コスト、短い再生サイクル、生殖細胞の割合が高いと操作6の容易として一般的に使用される遺伝モデルシステムによって提供されるいくつかの重要な機能を動員している。ワームは、96ウェルプレートに、または大量の液体培養で増殖することができ、それらの透明性を直接蛍光レポーターを検出するためにプレート上に結像することができる。以下に記載のアッセイは、これらの特性を利用して、蛍光レポーターPxol-1を含むウォーム株を活用:: GFPの胚の異数性の生殖細胞を破砕した誘導を検出すること。
このレポーター株の使用は、主に雌雄同体のワームの人口の男性の一般的まれな出来事に基づいています。これらの男性（<0.2％）が自然にX染色体7の分離の誤差に由来する。しかし、生殖細胞系列の中断などの頻繁に常染色体の分離におけるエラーにつながるそしてheterochromosomesのではなく、男性の表現型（Xの分配異常）ならびに胚性致死（常染色体の分配異常）の高められた発生率との両方を相関させる。胚の致死性の問題を回避しながら、容易に雄の誘導を検出するために、雄特異的プロモーター（XOL-1）は、依然としてワームの子宮内に含まれる初期胚におけるGFPの発現を駆動するために使用される。このように、GFPを発現する胚の外観は、異数性胚の存在のためにプロキシとして使用される。この方法は、以前に生殖細胞維持および分裂8,9に関与する遺伝子を同定するために使用されている。化学物質のスクリーニングに適合し、この菌株は、ハイスループットスクリーニングに媒体中で使用される。重要なことは、株は忠実に化学物質のaneugenicityを報告し、そのための哺乳動物の生殖エンドポイント10に関連している。ここに記載のアッセイは、見て、製薬および化学産業の設定で毒物学者に特に有用であろう急速生殖エンドポイントに向かっての化学物質の毒性を評価した。さらに、このアッセイは、完全に21世紀のレポート11に毒性で強調表示政府の優先事項と整合する。
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Protocol
摂食細菌の調製
注：このセクションでは、給紙細菌（ 大腸菌株 OP50）の調製を記載する。
- Eの単一コロニーを分離無菌的にLB培地（LB）寒天プレートとから大腸菌株 OP50は、オートクレーブしたLBブロス300mlに接種する。
- 飽和状態に達するまでに接種培養は、200rpmで、37℃でシェーカーで一晩増殖させる。
- 6無菌、予め秤量した50ミリリットルコニカルチューブにOP50を転送します。 6000 RPM（5000 XG）で5分間遠心分離することによって細菌をペレット化。
- 上清を捨て、滅菌したM9 50mlで細菌を洗う。二回繰り返します。
- 第二回目の洗浄後何M9がチューブ内に残っていないことを確認して、残りのM9を削除します。
- 細菌ペレットを含むチューブを計量することによってペレットの重量を測定し、50ミリリットルコニカルチューブの重量を差し引く。
- ペレットIを再懸濁nはM9に100mg / mlの濃度で。
- それはワーム培養に使用されるまで4℃でOP50ソリューションを保管してください。
線虫成長培地（NGM）ペトリ皿の調製
注：このセクションでは、C.プレートであるNGMペトリ皿、の調製を記載elegansのワームは、日常的に研究室で維持されている。
- NGM寒天培地をオートクレーブ。
- 滅菌手順を使用して、蠕動ポンプを使用して6センチメートルペトリプレートにNGM寒天溶液17mlを分注する。
注：プレート内の寒天の一定量を別のプレートから切り替えるときに顕微鏡を再集束の必要性を低減。 - 寒天が固化してみましょうと余分な水分を蒸発できるようにするため、使用前に2〜3日間室温でプレートにしておきます。
- 無菌技術を用いたNGMプレートをシード。 OP50液体培養の1-2滴を適用し、ガラス棒を用いて拡散。ことを確認していないすべての道のプレートの端に細菌の芝生を広げます。
- OP50の芝生がワームを成長させるのプレートを使用する前に、室温で1〜2日間増殖することを許可する。
同期ワーム人口の調製
注：Cのライフサイクル虫は胚段階、4幼虫期（L1-L4）と成人期から構成されている。このセクションでは、ワームの年齢同期人口の製造を記載している。漂白処理後の線虫と接触する全ての材料は、無菌でなければならない。
- 1日目- 、妊娠ワーム人口の調製
- ワームの人口の大半が飢餓のL1幼虫で構成されているNGMプレートを使用してください。
- 滅菌ワームとのL1幼虫が選ぶ収集し、新鮮に6cm NGMプレートにそれらを転送するには、OP50を播種。ワームの大半は妊娠大人になるまで20℃で約65時間インキュベートする。へプレート過密を回避し、ワームは細菌を破壊することなく成長させる、各新鮮なNGMプレートにL1幼虫の1つまたは2つ以上のクラスタを転送しないでください。
- 4日目-シンクロナイズドL1幼虫人口の確立
- M9 1-2 mlのそれらを洗浄することにより、NGMプレートから妊娠ワームを収集し、円錐形の15ミリリットルチューブに転送。
- 妊娠ワームは約5〜10分間15ミリリットルコニカルチューブの底に沈降してみましょう。ワームペレットを乱すことなく、上清を取り除きます。
- 2-4マイクロ遠心チューブにワームペレットを移し、漂白剤/ NaOH溶液1ミリリットルを追加します。 RTで2〜3分間インキュベートする。死んでいるすべてのワームを確認するために、実体顕微鏡下で反応の進行状況を監視します。胚が死ぬことができるようになりましたが5分を漂白しないでください。
- 3000 RPM（900 XG）で1分間遠心分離することにより、ワームを収集します。上清を除去し、滅菌M9の1ミリリットルを追加反応を中和する。
- 3000 RPM（900 XG）で1分間遠心分離することにより、二回のワームを洗ってください。
- 上清を除去し、最大で100〜200μlにM9を追加。
- ガラスパスツールピペットを使用すると、NGMプレートをクリアして、胚が孵化することを可能にするために20℃で少なくとも24時間のためにそれらをインキュベートするワーム/ M9ミックスのドロップを追加。
注：食べ物がないと幼虫の成長がL1段階で停止されます。
- 5日目-シンクロナイズドL4幼虫人口の確立
- M9 1-2 mlのプレートを洗浄することにより明確なNGMプレートからのL1幼虫を収集し、円錐形の15ミリリットルチューブに転送。
- 約5分間の15ミリリットルコニカルチューブの底に死んだ成虫の堆積物をしましょう。
- 新しい円錐形の15ミリリットルチューブ内のL1虫である上清を、収集し、2600 RPM（1,000 XG）で2分間遠心分離することによりワームを沈殿させる。
- 上清ルを削除約500μlのAVING。
- 実体顕微鏡を使用してドロップ10μlのワームの数をカウントすることによりM9溶液中のワームの濃度を決定する。少なくとも5滴を数える。
- 20-25ワーム/μlにワームの濃度を調整し、NGMプレートにワーム/ M9ミックス50μlのを追加OP50を播種。
- 彼らはL4段階に到達するまでに成長するL1同期化された人口を可能にするために（週末を通してインキュベーションのために）15℃で65時間インキュベートする。
96ウェルプレート中で化学物質へのワームの4暴露
注：このセクションでは、Pxol1の使用が記載されている:: Cを含むGFP転写レポーターエレガンス株は、異数性の誘導のためにスクリーニングする。
- M9 1-2 mlのプレートを洗浄することにより明確なNGMプレートからL4幼虫を収集し、円錐形の15ミリリットルチューブに転送。
- L4ワームの底に沈降してみましょう約5〜10分間15ミリリットルコニカルチューブ。ワームペレットを乱すことなく、上清を取り除きます。
- M9 3〜5 mlを加え実体顕微鏡を用いて10μlの滴でワームの数をカウントすることによりM9溶液中のワームの濃度を決定する。各サンプルについて少なくとも5滴を数える。
- M9 1000ワーム/ mlの濃度でワームを再懸濁する。
- M9でセクション1の10倍からOP50細菌を希釈する。より低い温度では、ワームの開発に影響を与えるために再懸濁させ、細菌が室温に達することを確認してください。
- マルチチャンネルピ ペットを用いて、第一（ステップ8.8）ワーム/ M9ミックス100μlのを追加し、2ミリリットル深い丸底96ウェルプレートの各ウェルに（ ステップ4.5から）で希釈OP50細菌の400μlを添加する。最後に、各ウェルを500μlの100ワームを持つことになります。
- 提案され、最終的なconcentrを達成するために、被験化学物質または所望のウェルに適切な制御のどちらかの0.5μLを追加します。100μMのationが、濃度は一般的にCの化学画面で使用虫 12。 0.1％の最終濃度でエタノールまたはDMSO溶媒対照を公開します。
注：我々は、陽性対照としてノコダゾール（100μM）の使用をお勧めします。 - 接着フィルムを使用してプレートをシール。ウェル間のクロスコンタミネーションを防ぐためにウェルプレートをシールしてください。
- アルミホイルでプレートを包みます。
- 時間の適切な長さのために適切な温度（24または65時間）のシェーカー（170〜180 RPM）にプレートを転送します。部屋の温度は、ワームの成長に影響を与えます。 20℃前後の温度を維持する。
384ウェルプレート中で、妊娠ワームの5.画像取得
注：このセクションでは、大人の雌雄同体の子宮内の胚におけるGFPの発現を可視化するために、画像さらさPxol1 :: GFPワームに高いコンテンツ顕微鏡の使用が記載されている。のためにスクリーニングされる各384ウェルプレートに、4×96ウェルプレートからワームを使用する。
- シェーカー中の化学暴露後に、10〜15分間、96ウェルプレートの残りは成虫がプレートの底に沈降することを可能にすることができます。
- マルチチャンネルピペットを用いて、プレートの底にワームを邪魔しないように非常に気をつけながら、M9の350μlのを削除します。
- M9の1ミリリットルを繰り返しステップ5.1でワームを洗ってください。
- マルチチャンネルピペットを用いて、プレートの底にワームを乱さないVEYように注意しながら、M9の1ミリリットルを削除します。
- マルチチャンネルピペットを使用して、残りのM9にワームを再懸濁し、96ウェルプレートからワーム/ M9ミックス100μlのを収集し、黒壁/透明底384ウェルプレートのウェルにロードします。 384ウェルプレートの全てのウェルがロードされるまで、4×96ウェルプレートからワームを使用してプロセスを繰り返す。
注：すべてのウェルに増加させるために、同じ体積を有することが重要である画像取得プロセス中にオートフォーカスの効率と速度。各ウェルを80から100のワームとの間で含まれている必要があります。 - 各ウェルにレバミゾール（100μM）の1μl加え、ワームは、約30分間インキュベートしましょう。
NOTE：レバミゾールアセチルコリン受容体アゴニストとして作用し、ワームを固定する。 - 自動化されたイメージングを提供することが可能な広視野高含量顕微鏡にプレートに移す。
- 画像取得のために、製造業者のガイドラインに従って高含量画像収集および解析ソフトウェアを使用します。ウェルあたり1画像を取得する4X対物レンズを選択する。
- 画像取得を開始する前に、xは2160 2160への曝露と画像解像度の45ミリ秒にGFPの撮像パラメータを調整する。
- ウェル中のワームの総数で割ったGFP陽性虫の数などのデータを収集し、後者の指標は、ウェル間の比較的一貫している。
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Representative Results
このような微小管毒ノコダゾールなどの化学剤に対するPxol-1 :: GFPレポーター株の曝露（ 図1）は、DMSO対照と比較して露出した成体雌雄同体の子宮におけるGFP発現胚の高い割合の誘導を導く。 GFP陽性胚は、他の胚だけでなく、動物の腸内で観察された自家蛍光で観察弱いバックグラウンド蛍光よりも有意に明るい。露出されたワームは、直接384ウェルプレート上に結像された少なくとも1つのGFP陽性胚を含む虫の数は、各ウェルについてカウントし、そのウェル内のワームの総数によって正規化される。化学画面から正のヒットは、DMSO 10よりも高い周波数1.7倍でワーム集団におけるGFP陽性胚の割合を誘発した化合物を意味する。しきい値の最適化、高含量画像解析（ 材料ファイルを参照してください）に続いて、自動化されたカルクことができます正のオブジェクトの数のulation（ すなわち、胚）ウェル内のワームの総数で割って、アッセイの大規模な適応のための最適な方法である。
| 妊娠成人人口を生成するために、飢えたワームの人口で開始 |
| ↓（文化3日間） |
| 妊娠成人人口ブリーチ |
| ↓ |
| NGMプレートをクリアするために漂白されたワームを転送 |
| ↓（文化1日） |
| 同期化されたL1集団を収集し、OP50でNGMプレートに移す |
| ↓（15ºCで65時間インキュベートし） |
| 同期されたL4集団を収集 |
| ↓</ TD> |
| M9 / OP50の0.5ミリリットルで96ウェルプレートの各ウェルに100 L4ワームを分配 |
| ↓ |
| 各ウェルに化学物質（100μM）を追加 |
| ↓（24または65時間インキュベート） |
| 384ウェルプレートに96ウェルプレートから同期妊娠成人人口の100μL（80ワーム）を転送します。 |
| ↓ |
| 各ウェル（最終濃度1μM）のレバミゾールの1μLを追加 |
| ↓（30〜45分間インキュベート） |
| 高含量顕微鏡で各ウェルの画像をキャプチャして解析する |
表1.実験ワークフロー。1日目は、使用飢餓ワーム集団は妊娠成人集団を生成する。 4日目、blea同期化されたL1集団を生成するために妊娠成人人口はCH。 5日目は、同期されたL4集団を生成するためにOP50シードされたNGMプレートに明確なNGMプレートからL1集団を転送する。 8日目に、96ウェルプレートに同期L4集団を転送し、別の化学物質にそれらをさらす。 9日目と11日目には、高含有量顕微鏡で撮像される384ウェルプレートに露出妊娠成人を転送する。
| M9バッファー- 1 L | |
| 1.大きなビーカーに以下の成分を組み合わせるか、磁気攪拌棒を用いてメスシリンダー | |
| 3グラムのKH 2 PO 4 | |
| 6グラムのNa 2 HPO 4 | |
| 5グラムのNaCl | |
| 1ミリリットルの1M MgSO 4を | |
| H 2 O L. 1 | |
| 適切なサイズのボトルに2.分量（500ミリリットルサイズのペットボトルで300ミリリットル） | |
| 3. 30〜60分間オートクレーブで滅菌する | |
| プレート用NGMメディア- 4 L | |
| 1. 4 Lに記入した後、三角フラスコに以下を追加します。 | |
| 12グラムのNaCl | |
| 10gのバクト | |
| 80gの寒天 | |
| 2.加え、よく混ぜる。 | |
| コレステロール4mlの（5 mg / ml）で | |
| 4ミリリットルのCaCl 2（1Mのストック溶液） | |
| 4ミリリットルをMgSO 4（1 M原液） | |
| 30〜60分間3.オートクレーブ | |
| 4.少し冷ますとKH 2 POの100ミリリットルを追加 | |
| LB培地- 1 L | |
| 1. 800ミリリットルのH 2 Oに以下を追加します。 | |
| 10グラムバクト - トリプトン。 | |
| 5gの酵母エキス。 | |
| 10グラムのNaCl。 | |
| 2. NaOHでpHを7.5に調整します。 | |
| 3.をdH 2 Oで1 Lに音量を調整します | |
| 4. 30オートクレーブで滅菌する - 60分 | |
| 集団を同期させるための漂白剤溶液- 50ミリリットル | |
| 7.5ミリリットル10NのNaOH | |
| 6ミリリットル漂白剤（レギュラー） | |
| 36.5ミリリットルのdH 2 O |
表2.ソリューション。
図1：DMSOおよび陽性対照ノコダゾールを制御するPxol-1 :: GFPレポーター株の曝露から得られる画像の例は、この例では、ワームをノコダゾールで24時間曝露したまたはDMSO Pxol-1 :: GFPワームた。は（A）0.1％DMSO（陰性対照）または（B）100μMノコダゾール（陽性対照）に暴露し、384ウェルプレート中で画像化した。赤矢印：1ノコダゾール扱わワームの子宮内にはっきりと見えるGFP陽性胚。スケールバー= 1ミリメートル。 （C）及び（D）は、それぞれ（A）および（B）の部分を拡大している。スケールバー= 0.33ミリメートル。
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Discussion
ここで説明する方法は、生殖系列の毒物を同定するための最初の大規模な戦略を構成する。それは忠実に生殖細胞機能障害のためのプロキシとして使用されている初期胚で異数性の誘導を報告したGFPトランスジェニックPxol-1 :: GFP含む株を使用する必要があります。この方法は、Cの慎重な同期を伴う虫ワームの人口と自動化ハイコンテンツ顕微鏡によってGFP陽性ワームの撮影に続いて、96ウェルフォーマットでの化学物質へのワーム"暴露。
このプロトコルのいくつかのステップは、結果の一貫性に重要である。適切に露光に使用されるL4幼虫を上演したの数を最大としてまず、ワーム集団はに非常に同期している必要があります。このため、ここで説明する方法論は、L1飢餓によるワームの人口の漂白による最初と、2つの同期ステップを含む。第二の重要なパラこの方法のメーターは露出の長さです。ワームは、日常的に24時間または65時間のどちらかのために露出されている。減数分裂のようにCの継続的なプロセスである虫は 、これら2つの露光窓が変更された後期の減数分裂のイベント（24時間）または初期および後期両方の減数分裂のイベント（65時間）のいずれかのキャプチャを可能にします。それは、より長い曝露がより良い哺乳類生殖毒性10を予測するように見えることが注意することが重要である。
方法の特に魅力的な側面は、その柔軟性である。プロトコルは、ハイスループットスクリーニングのために設計されているが、アッセイのスケールダウンバージョンは、24ウェルプレートまたは1.5 mlチューブを使用してサンプルの少数のスクリーニングを行うことができる。画面のスケールを小さくすると、アッセイの感度を高めることができるサンプルあたりのワームより多数のテストを可能にします。現在の形式では、四連でスクリーニング化合物はaneuplで高い統計的信頼を提供することをお勧めしますoidy率を測定。この大規模な方法論の潜在的なハードルはGFP陽性胚の自動検出のための必要性から来ている。このタスクは簡単に目で行うことができますが、画像解析ソフト上で適切なパラメータを慎重に設立は、理想的にイメージングの専門家と、手順の自動化のために重要である。さらに、GFP陽性胚の検出を超えて、ヒットの二次検証は、染色体エラーが減数または胚起源のものであるかどうかを決定するために行われるべきである。我々は以前にそのような二次アッセイを容易にC.して行われることを示したエレガンスとは、生殖細胞核のDAPI染色と同様にアポトーシス10の測定のためのワームのアクリジンオレンジ染色を含む。これら二つの単純なアッセイから、異常な減数分裂、異常な核形態および断片化を介して進行、ならびに生殖細胞の損失は、全てを評価することができる。
まとめると、我々はdescribを持っているここでエドモデル系Cを使用して生殖細胞毒性の迅速な評価のために必要な手順虫 。それは、哺乳動物の生殖毒性エンドポイントの予測産子数と卵巣の欠陥10を減少させるように重要なのは、生殖細胞毒性のマーカーとしてワームでの異数性の使用は、関連するアッセイである。女性の生殖細胞に対する毒性影響を調査するために特に困難であるので、これは特に重要である。したがって、この高速のアッセイは、最初のパス毒性画面として大型動物実験の代替を提供し、複雑な減数分裂プログラムのさまざまな側面での環境化学物質暴露の影響に光を投げかけて。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Vented, sharp edge Petri dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon films for biological cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
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