Abstract
Identifisere reproduksjonstoksiske effekter av de tusenvis av kjemikalier i vårt miljø har vært en av de mest fristende utfordringer innen miljørettet helsevern. Dette er delvis på grunn av det sparsommelige modellsystemer som kan (1) nøyaktig rekapitulere nøkler funksjoner i reproduktive prosesser og (2) gjøre det i en middels til høy gjennomstrømming mote, uten behov for et høyt antall virveldyr.
Vi beskriver her en analyse i nematode C. elegans som tillater hurtig identifisering av germline giftstoffer ved å overvåke induksjon av aneuploide embryoer. Ved å gjøre bruk av et GFP reporter linje, blir feil i kromosom segregering som følge av kimlinje avbrudd lett visualisert og kvantifisert ved automatisert fluorescens mikroskopi. Således screening av et bestemt sett av forbindelser for dets toksisitet kan utføres i et 96- til 384-brønn plate-format i løpet av noen dager. Sekundær analyse av positive hsin kan utføres for å fastslå om kromosomfeil stammer fra meiotisk avbrudd eller fra tidlig fosterdød kromosom segregering feil. Til sammen representerer denne analysen en rask førstepassasje strategi for rask vurdering av kimlinje dysfunksjon etter kjemisk eksponering.
Introduction
Det er ca 87 000 kjemikalier registrert for handel i USA, men bare et fåtall av disse har blitt testet for potensielle helseeffekter 1. Av de som har blitt testet, har bare en del er vurdert for reproduktive helseeffekter på grunn av delvis til vanskelighetene med å bestemme endring av de tidlige reproduktive hendelser i pattedyr, spesielt under kvinnelig bakterie celle utvikling og differensiering. Faktisk, den første meiotisk arrangementer finner sted i løpet av de tidlige stadier av fosterutvikling hos kvinnelige pattedyr, og er derfor vanskelig å få tilgang til og samle inn tall som passer for screening-formål.
Kimlinje gir den viktige sammenheng mellom generasjoner, og dens riktige funksjon er avhengig av den nøyaktige utførelse av den intrikate program av cellulær og kromosomal divisjon betegnet meiose. Dysregulering av meiotisk fremgangsmåte kan resultere i redusert fertilitet og produksjon avkjønnsceller og embryo med et unormalt antall kromosomer, kalles en tilstand Aneuploidy. Kromosom segregering feil i meiose er svært relevant for menneskers helse. Kromosomfeil er vanlige, med en frekvens på 1 i 150 levendefødte, Trisomi 21, 18 og 13 samt X og Y-kromosomfeil blir de mest utbredte typer 2,3. Videre medfødte misdannelser, inkludert de av kromosom opprinnelse, er den ledende årsaken til spedbarnsdød i USA 4 Ideen om at miljømessige påvirkninger kan påvirke kromosomsegregering og atferd er ikke ny 5, men er fortsatt dårlig forstått. Det er derfor viktig å undersøke hvilke av kjemikalier introdusert i vårt miljø er i konflikt med menneskelig fruktbarhet, tidlig utvikling og generell reproduktiv helse.
I lys av disse begrensningene av pattedyr modeller, har vi utviklet en high-throughput skjerm analyse for å teste reproduksjonstoksisitet i rundorm <em> C. elegans. Vi har mobilisert flere viktige funksjoner som tilbys av denne brukte genetiske modellsystem som sin lille størrelse, lave kostnader, kort gjengivelse syklus, høy andel av kjønnsceller og enkel manipulasjon 6. Ormer kan dyrkes i 96-brønners plater eller i høye volum flytende kulturer, og på grunn av sin gjennomsiktighet kan avbildes direkte på platene for deteksjon av fluorescerende pressen. Analysen beskrevet nedenfor tar nytte av disse egenskapene og tar nytte av en orm belastning som inneholder fluorescerende reporter Pxol-1 :: GFP å oppdage kimlinje avbrudd og induksjon av embryonale Aneuploidy.
Bruken av denne reporter-stammen er basert på den generelt sjeldne forekomst av hanner i en hovedsakelig hermaphroditic orm befolkningen. Disse menn (<0,2%) naturlig stamme fra feil i segregering av X-kromosomet 7. Men som kimlinje avbrudd ofte fører til feil i segregering av autosomerog av heterochromosomes, det korrelerer både med en forhøyet forekomst av hanner fenotype (X missegregation) samt embryonale letalitet (autosome missegregation). For enkelt å oppdage induksjon av hanner mens omgå spørsmålet om embryonale dødelighet, er en hann-promoter (xol-1) som brukes til å drive uttrykk for GFP i tidlige embryoer fortsatt finnes i ormen livmor. Som sådan, er fremkomsten av GFP-uttrykk embryoer brukt som en proxy for tilstedeværelse av aneuploide embryoer. Denne fremgangsmåte er tidligere blitt brukt for å identifisere gener involvert i kimlinje vedlikehold og meiose 8,9. Innrettet til kjemisk screening, er denne stammen som anvendes i et medium til høy gjennomstrøming. Viktigere, rapporterer belastningen trofast aneugenicity av kjemikalier og er derfor relevant for pattedyr reproduktive endepunkter 10. Analysen beskrevet her vil være spesielt nyttig for toksikologer i farmasøytisk og kjemisk industri innstillinger jaktfor å vurdere hurtig toksisitet av kjemikalier mot forplantnings endepunkter. Videre denne analysen justert fullt med de statlige prioriteringene fremhevet i Toxicity i det 21. århundre rapport 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Feeding Bakterier
MERK: Denne delen beskriver fremstillingen av fôring bakterier (E. coli stamme OP50).
- Isolere en enkelt koloni av E. coli-stamme OP50 fra en lysogeni buljong (LB) agar plate og aseptisk inokulere i 300 ml autoklavert LB-næringsløsning.
- Tillat den inokulerte kultur til å vokse over natten i et risteapparat ved 200 rpm og 37 ° C, inntil metning er nådd.
- Overfør OP50 i 6 sterile, pre-veide 50 ml koniske rør. Pelletere bakteriene ved sentrifugering i 5 minutter ved 6000 rpm (5000 x g).
- Kast supernatanten og vask bakterier med 50 ml sterilt M9. Gjenta to ganger.
- Etter den andre vask fjerne gjenværende M9, som sikrer at ingen M9 er igjen i tuben.
- Bestemme vekten av pelleten ved å veie rør inneholdende bakterie pellet og trekke vekten av 50 ml konisk rør.
- Resuspender pelleten in M9 ved en konsentrasjon på 100 mg / ml.
- Oppbevar OP50 løsning ved 4 ° C inntil den brukes til snekke kultur.
2. Utarbeidelse av Nematode vekstmedium (NGM) Petri Plates
MERK: Denne delen beskriver fremstillingen av NGM Petri plater, som er de platene der C. elegans ormer blir rutinemessig opprettholdt i laboratoriet.
- Autoklaveres NGM agar medium.
- Ved hjelp av sterile prosedyrer, dispensere 17 ml NGM agaroppløsning i 6 cm petriplater ved hjelp av en peristaltisk pumpe.
MERK: En konstant mengde agar i platene reduserer behovet for refokusering mikroskopet ved veksling fra en plate til en annen. - La platene ved romtemperatur i 2-3 dager før bruk for å la agar størkne og tillate overskytende fuktighet å fordampe.
- Seed NGM plater ved hjelp av en steril teknikk. Påfør 1-2 dråper OP50 flytende kultur og spres ved hjelp av en glasstav. Sørg for at ikkeå spre bakterier plenen hele veien til kantene av platene.
- La OP50 plenen å vokse i 1-2 dager ved romtemperatur før bruk platene til å vokse ormer.
3. Utarbeidelse av en Synkron Worm Befolkning
MERK: livssyklus C. elegans består av fosterstadiet, fire larvestadier (L1-L4) og voksenlivet. Denne delen beskriver fremstillingen av en alders synkron befolkning av ormer. Alle materialer som kommer i kontakt med C.elegans etter blekebehandling må være sterile.
- Dag 1 - Utarbeidelse av Gravid Worm Befolkning
- Bruk NGM plater der de fleste av ormen befolkning består av utsultede L1 larver.
- Samle L1 larver med en sterilisert orm plukke og overføre dem til friske 6 cm NGM plater seeded med OP50. Inkuberes i ca. 65 timer ved 20 ° C inntil mesteparten av ormer er gravid voksne. Tilunngå plate befolkning og tillate ormer til å vokse uten å tappe bakterier, ikke overføre mer enn en eller to grupper av L1 larver for hver frisk NGM plate.
- Dag 4 - Etablering av en synkronisert L1 Larver Befolkning
- Samle gravid ormer fra NGM plater ved å vaske dem med 1-2 ml av M9 og overføre dem til en konisk 15 ml tube.
- La gravid ormer sedimentere til bunnen av 15 ml konisk rør i omtrent 5-10 min. Fjern supernatanten uten å forstyrre ormen pellet.
- Overfør ormen pellet til 2-4 mikrosentrifugerør og tilsett 1 ml av blekemiddel / NaOH løsning. Inkuber i 2-3 minutter ved romtemperatur. Overvåke fremdriften av reaksjonen under stereomikroskop for å bekrefte alle ormene er døde. Ikke bleke lenger enn 5 min som embryoene kunne dø.
- Samle ormene ved sentrifugering i 1 minutt ved 3000 rpm (900 x g). Fjern supernatanten og tilsett 1 ml sterilt M9 tilnøytralisere reaksjonen.
- Vask ormer to ganger ved sentrifugering i 1 minutt ved 3000 rpm (900 x g).
- Fjern supernatanten og legge M9 til opp til 100-200 mL.
- Ved hjelp av et glass Pasteur pipette legge en dråpe av ormen / M9 blande å fjerne NGM plater og ruge dem i minst 24 timer ved 20 ° C for å tillate embryoene å klekkes.
MERK: Uten mat larvene vekst vil bli stanset ved L1 scenen.
- Dag 5 - Etablering av en synkronisert L4 Larver Befolkning
- Samle L1 larver fra de klare NGM plater ved å vaske platene med 1-2 ml av M9 og overføre dem til en konisk 15 ml tube.
- La de døde voksne ormer sediment på bunnen av 15 ml konisk rør i ca. 5 min.
- Samle supernatanten, hvor L1 ormer er, i en ny 15 ml konisk rør og utfelle ormer ved sentrifugering i 2 minutter ved 2600 rpm (1000 x g).
- Fjern supernatanten leaving ca 500 mL.
- Bestemme konsentrasjonen av ormer i M9-løsning ved å telle antallet ormer i 10 pl dråper ved hjelp av et stereomikroskop. Tell minst 5 dråper.
- Justere konsentrasjonen av ormer til 20-25 ormer / mikroliter og tilsett 50 mL av orm / M9 mix til NGM plater seeded med OP50.
- Inkuber i 65 timer ved 15 ° C (for inkubasjon gjennom week-end) for å la L1 synkronisert befolkningen å vokse til de når L4 scenen.
4. Eksponering av Worms til Kjemikalier i 96-brønners plater
MERK: Denne delen beskriver bruk av Pxol1 :: GFP transcriptional reporter som inneholder C. elegans belastning å screene for induksjon av Aneuploidy.
- Samle L4 larver fra de klare NGM plater ved å vaske platene med 1-2 ml av M9 og overføre dem til en konisk 15 ml tube.
- La L4 ormer sediment på bunnen av15 ml konisk tube for ca 5-10 min. Fjern supernatanten uten å forstyrre ormen pellet.
- Legg 3-5 ml M9 og bestemme konsentrasjonen av ormer i M9-løsning ved å telle antallet ormer i 10 pl dråper ved hjelp av et stereomikroskop. Tell minst 5 dråper for hver prøve.
- Resuspender ormene ved en konsentrasjon på 1,000 orm / ml i M9.
- Fortynne OP50 bakterier fra § 1 10 ganger med M9. Pass på at resuspendert bakterier nå romtemperatur fordi lavere temperatur påvirker orm utvikling.
- Ved hjelp av en multikanal pipette, først tilsett 100 ul av snekke / M9 blanding (fra trinn 4.4) og deretter legge til 400 pl av de fortynnede OP50 bakterier (fra trinn 4.5) til hver brønn av en 2 ml dyp rundbunnet 96-brønns plate. På slutten, vil hver brønn ha 100 ormer i 500 mL.
- Tilsett 0,5 mL av enten test kjemisk eller på passende kontroll til de ønskede brønner, for å oppnå en foreslått endelige konsentrasjonerasjon av 100 pM, en konsentrasjon som vanligvis anvendes i kjemiske skjermer i C. elegans 12. Eksponere etanol eller DMSO løsemiddel kontroller ved en sluttkonsentrasjon på 0,1%.
MERK: Vi anbefaler bruk av nocodazol (100 mm) som positiv kontroll. - Tett plate ved hjelp av selvklebende film. Sørg for å forsegle platen godt for å hindre kryssforurensning mellom brønnene.
- Pakk plate med aluminiumsfolie.
- Overføre platen til en rister (170-180 rpm) av den passende temperatur i en passende lang tid (24 eller 65 timer). Temperaturen i rommet påvirker veksten av ormer; holde temperaturen rundt 20 ° C.
5. Image Acquisition of Gravid Worms i en 384-brønners plate
MERK: Denne delen beskriver bruk av et høyt innhold mikroskop for å avbilde utsatt Pxol1 :: GFP ormer, for å visualisere uttrykket av GFP i embryoene i livmoren av voksne hermafroditter. Forhver 384-brønners plate som skal siktes, bruk ormer fra 4 x 96-brønners plater.
- Etter kjemisk eksponering i shaker, la 96-brønns plate hvile i 10-15 minutter for å tillate at de voksne ormer for å sedimentere til bunnen av platen.
- Ved hjelp av en flerkanals pipette, fjerne 350 mL av M9, blir svært forsiktig for ikke å forstyrre ormer i bunnen av tallerkenen.
- Vask ormer med 1 ml M9 og gjenta trinn 5.1.
- Ved hjelp av en flerkanals pipette, fjerne en ml av M9, er vey forsiktig for ikke å forstyrre ormer i bunnen av tallerkenen.
- Ved hjelp av en flerkanals pipette, resuspender ormer i de resterende M9 og samle 100 mL av orm / M9 blanding fra 96-brønners plater og legger det inn i brønnene på en svart vegg / klar bunn 384-brønners plate. Gjenta prosessen ved hjelp av ormer fra 4 x 96-brønners plater, før alle brønnene i 384-brønns plate er lastet.
MERK: Det er viktig for alle brønnene har samme volum for å økeeffektivitet og hastigheten på autofokus under bildet anskaffelsesprosessen. Hver brønn bør inneholde mellom 80 til 100 ormer. - Tilsett 1 mL av levamisol (100 uM) til hver brønn og la ormer inkuberes i ca. 30 min.
MERK: Levamisole fungerer som en acetylkolin reseptor agonist og immobilizes ormer. - Overføre platen til en widefield høyt innhold mikroskopet kan gi automatisert avbildning.
- For image oppkjøpet, bruke et høyt innhold bilde innsamling og analyse programvare i henhold til produsentens retningslinjer. Velg 4X mål å skaffe seg en image per brønn.
- Før du starter image oppkjøpet, justere GFP bildeparameterne til 45 msek av eksponering og bildeoppløsning på 2160 x 2160.
- Samle inn data etter hvert som antall GFP positive ormer dividert med det totale antallet ormer i brønnen, idet sistnevnte mål er relativt konsistent mellom brønnene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksponering av Pxol-1 :: GFP reporter-stammen av kjemiske midler slik som mikrotubul giften nocodazol (figur 1) som fører til induksjon av en høy andel av GFP-uttrykk embryo i uterus hos utsatte voksne hermaphrodites i forhold til DMSO-kontroll. GFP-positive embryoer er betydelig lysere enn den svake bakgrunnsfluorescens ble observert i andre embryoer samt auto-fluorescens observert i tarmen av dyrene. Eksponerte ormer er direkte avbildet på 384-brønners plater og antall ormer inneholdende minst en GFP-positive embryo, telles for hver brønn og normalisert med det totale antallet ormer i at brønnen. En positiv hit fra kjemisk skjermen en forbindelse indusert en andel av GFP-positive embryoene i en orm befolkning med en frekvens 1,7x høyere enn DMSO 10. Etter terskel optimalisering, det høye innhold bildeanalyse (se Materialer fil) tillater at automatisert calcbefolkningen av antallet positive objekter (dvs. embryo) dividert med det totale antallet ormer i brønnen, og er den foretrukne metode for storskala tilpasning av analysen.
| Start med sultet orm befolkningen til å generere en gravid voksne befolkningen |
| ↓ (Kultur 3 dager) |
| Bleke gravid voksne befolkningen |
| ↓ |
| Overfør bleket ormer å fjerne NGM plater |
| ↓ (Kultur 1 dag) |
| Samle synkronisert L1 befolkning og overføre til NGM plater med OP50 |
| ↓ (Inkuber 65 timer ved 15 ºC) |
| Samle synkronisert L4 befolkningen |
| ↓ </ Td> |
| Dispensere 100 L4 ormer til hver brønn av de 96-brønners plater i 0,5 ml av M9 / OP50 |
| ↓ |
| Tilsette kjemikalier (100 uM) til hver brønn |
| ↓ (Inkuber i 24 eller 65 timer) |
| Overfør 100 ul av den synkroniserte gravid voksne befolkningen (80 ormer) fra 96-brønners plater i en 384-brønners plate. |
| ↓ |
| Tilsett 1 mL av levamisol til hver brønn (1 mM endelig konsentrasjon) |
| ↓ (Inkuber 30-45 min) |
| Fange opp og analysere bilder av hver brønn med høyt innhold mikroskop |
Tabell 1. Experimental arbeidsflyt. Dag 1, til bruk sultet orm befolkningen generere en gravid voksne befolkningen. Dag 4, BleaCH gravid voksne befolkningen til å generere en synkronisert L1 befolkning. Dag 5, overføre L1 befolkningen fra klare NGM plater til OP50 seeded NGM plater for å generere en synkronisert L4 befolkning. Dag 8, overføre synkronisert L4 befolkningen til 96-brønns plate og utsette dem for ulike kjemikalier. Dag 9 og dag 11, overfører de eksponerte gravid voksne i en 384-brønners plate som skal avbildes med et høyt innhold mikroskop.
| M9 Buffer - 1 L | |
| 1. Bland følgende ingredienser i store beger eller målesylinder bruker magnetrører | |
| 3 g KH 2 PO 4 | |
| 6 g Na 2 HPO 4 | |
| 5 g NaCl | |
| 1 ml 1M MgSO4 | |
| H 2 O til 1 L. | |
| 2. Aliquot til passende størrelse flasker (300 ml i 500 ml størrelse flasker) | |
| 3. Steriliser ved autoklavering i 30-60 min | |
| NGM media for plater - 4 L | |
| 1. Legg følgende i en Erlenmeyerkolbe, så fyll opp til 4 L: | |
| 12 g NaCl | |
| 10 g Bactopeptone | |
| 80 g Agar | |
| 2. Tilsett og bland godt: | |
| 4 ml av kolesterol (5 mg / ml) | |
| 4 ml CaCl2 (1 M stamløsning) | |
| 4 ml MgSO4 (1 M stamløsning) | |
| 3. Autoklav i 30-60 min | |
| 4. La den avkjøles litt og tilsett 100 ml KH 2 PO | |
| LB media - 1 L | |
| 1. Legg til følgende til 800 ml H 2 O | |
| 10 g Bacto-trypton. | |
| 5 g gjærekstrakt. | |
| 10 g NaCl. | |
| 2. Juster pH til 7,5 med NaOH. | |
| 3. Juster volumet til en L med dH 2 O | |
| 4. Steriliser ved autoklave i 30 - 60 min | |
| Blekemiddel løsning for synkronisering av populasjoner - 50 ml | |
| 7.5 ml 10 N NaOH | |
| 6 ml blekemiddel (vanlig) | |
| 36.5 ml dH 2 O |
Tabell 2. Solutions.
Fig. 1: Eksempler på bildene innhentet fra eksponering av Pxol-1 :: GFP reporter-stammen for å styre DMSO og positiv kontroll nocodazol I dette eksempel ble ormer eksponert i 24 timer for å nocodazol eller DMSO Pxol-1 :: GFP ormer var. utsatt for (A) 0,1% DMSO (negativ kontroll) eller (B) 100 pM nocodazol (positiv kontroll) og avbildes i 384-brønns plater. Rød pil: GFP positive embryoer godt synlig innen ett nocodazol behandlet orm livmor. Skala bar = 1 mm. (C) og (D) er forstørrede deler av (A) og (B) respektivt. Skala bar = 0,33 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremgangsmåten beskrevet her utgjør det første storskala strategi for identifisering av germline giftstoffer. Det krever bruk av en GFP transgene Pxol-1 :: GFP inneholder stamme som trofast rapporterer induksjon av Aneuploidy i tidlige embryoer som brukes som en proxy for kimlinje dysfunksjon. Fremgangsmåten innebærer imidlertid synkroniseringen av en C. elegans orm befolkning og ormer eksponering for kjemikalier i 96-brønners format fulgt av avbildning av GFP positive ormer og automatisert høy-innhold mikroskopi.
Flere trinn av denne protokollen er avgjørende for konsistensen av resultatene. Først bør ormen populasjoner være svært synkron til som maksimere antall ordentlig iscenesatt L4 larver som vil bli brukt for eksponeringen. Av denne grunn er den metodikk som er beskrevet her innbefatter to synkroniserings trinn, først ved bleking av snekke befolkningen og da hos L1 sult. Den andre viktige parameter av denne metoden er lengden på eksponeringen. Ormene blir rutinemessig utsatt for enten 24 timer eller 65 timer. Som meiose er en kontinuerlig prosess i C. elegans, disse to eksponerings vinduer tillate fangst av enten endret sene meiotisk hendelser (24 t) eller både tidlige og sene meiotisk hendelser (65 hr). Det er viktig å merke seg imidlertid at jo lenger eksponeringen ser ut til å bedre forutsi pattedyr reproduksjonstoksiske 10.
Et spesielt attraktivt trekk ved fremgangsmåten er dens fleksibilitet. Mens protokollen er konstruert for høy throughput screening, kan en nedskalert versjon av analysen utføres for screening av et mindre antall prøver ved anvendelse av 24-brønners plater eller 1,5 ml rør. Senking av omfanget av skjermen gjør at test av et høyere antall ormer per prøve som kan øke følsomheten til analysen. I dagens format, screening forbindelser i quadruplicates anbefales å gi høyere statistisk tillit til aneuploidy priser målt. En potensiell hinder i denne storskala metodikk kommer fra behovet for automatisk deteksjon av GFP-positive embryoer. Selv om denne oppgaven kan enkelt utføres ved øyet, den forsiktig etablering av hensiktsmessige parametere på bildeanalyse programvare, gjerne med en avbildning spesialist, er avgjørende for automatisering av prosedyren. Videre utover påvisning av GFP-positive embryoer, sekundær validering av treff skal utføres for å bestemme om kromosom feilene er av meiotisk eller embryonal opprinnelse. Vi har tidligere vist at slike sekundære analysene kan lett utføres i C. elegans og omfatter DAPI-fargingen av germline kjerner samt akridin orange farging av ormer for måling av apoptose 10. Fra disse to enkle analyser, kan unormal progresjon gjennom meiose, unormal kjernefysisk morfologi og fragmentering samt bakterie celle tap alle bli vurdert.
Til sammen har vi described her trinnene som kreves for rask vurdering av kimlinje toksisitet ved bruk av modellsystemet C. elegans. Viktigere, er bruken av Aneuploidy i ormen som en markør for kimlinje toksisitet en relevant analyse som det er prediktive for pattedyr reproduktive toksisitets endepunkter inkludert redusert kullstørrelse og eggstokkene defekter 10. Dette er av særlig betydning som toksiske effekter på kvinnelig kimlinje er spesielt vanskelige å etterforske. Dermed gir denne raske analysen et alternativ til store dyreforsøk som et første pass toksisitet skjerm og belyser effekten av miljø kjemisk eksponering på ulike aspekter av den komplekse meiotisk program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Vented, sharp edge Petri dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon films for biological cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
- Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from: http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T (2009).
- Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
- Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
- Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
- Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
- Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- National Research Council. Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , The National Academies Press. (2007).
- Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).
