Introduction
Рак яичников является самым смертоносным гинекологических злокачественных опухолей у Соединенных Штатов с основной причиной заболеваемости и смертности является высоко повторяющиеся, химиорезистентных особенности этого заболевания. Первичная обработка обычно включает максимальную циторедуктивной операцию и последующее лечение на основе платины, хотя есть некоторые основания предполагать, неоадъювантную терапии может быть полезным в некоторых случаях 1. Большинство пациентов положительно реагировать на первичной обработке, но, к сожалению, половина будет рецидив в течение 18 месяцев 2.
Большинство яичников злокачественные эпителиальные карциномы и может происходить в поверхностном эпителии яичника или маточной 3,4 трубки. Несколько исследований, подтверждающих существование соматических стволовых клеток в женской репродуктивной системе, которая, вероятно, оказывать помощь в восстановлении тканей, что необходимо после овуляции 5,6. Высокая пролиферативная активность как на яичниках и фаллопиевых труб во время ovulция может быть важным фактором в развитии рака яичников (Gharwan, и др. рукопись представлена). Вывод опухолевых клеток, образующих неясен, но они могут возникать из нормальных стволовых клеток, клеток-предшественников, или дифференцированных клеток посредством мутации, которые делают их не в состоянии регулировать деление или судьбу. Эти клетки также называют "раковые стволовые клетки", или "рак инициирования клетки," и может расти в онкогенных многоклеточных сфероидов в условиях низких крепления. Хотя иерархическая модель развития ЛПК могут быть динамическими, тики у разделяют многие из тех же функций, что и обычные стволовые клетки, включая покоя, устойчивости к химиотерапии, долгосрочное самообновлению и способностью дифференцироваться в различных клеточных линиях 7,8.
Несколько исследований, подтверждающих существование тиков при раке яичников и настоящее время предпринимаются усилия для выяснения механизма (ов), в которой эти клетки поддерживают канцерогенез 9-11, Несколько маркеров были предложены для определения яичников тиков с повышенной туморогенности включая CD133, CD117, ALDH1A1, CD44 и MyD88, хотя точное вклад каждого маркера является неясным и может быть типом клеток конкретных 11-16. В то время как универсальный маркер или набор маркеров не было однозначно установлено, яичников тики, различные группы выделили яичников Тики чаще, выбрав для CD44 +, CD133 + и / или клеток с высоким альдегид дегидрогеназы (ALDH) деятельности 13,17-21. CD44 представляет собой трансмембранный гликопротеин, который действует как рецептор гиалуроновой кислоты и регулирует несколько процессов, важных для опухолевой прогрессии, в том числе адгезии, пролиферации, миграции, ангиогенеза и дифференциации 22. CD133 представляет собой трансмембранный гликопротеин, функция которого до сих пор неясно, но исследования показывают, организует плазматической мембраны топологию 23. ALDH, внутриклеточный фермент, который катализирует окисление альдегидов, может быть наиболее Universаль маркером ТЭП как высокая активность была обнаружена в стволовых клетках, выделенных из различных тканей и нескольких ролей, были отнесены к ALDH в поддержке нормальные стволовые клетки и оводы 24. В настоящее время, CD133 и ALDH1 оказаться наиболее воспроизводимые маркеры яичников ТЭП 13,21.
В дополнение к пониманию особенностей ТЭП, есть также большая работа, чтобы определить препараты, которые специально направлены этот субпопуляции. Высокая частота рецидивов, связанных с раком яичников может быть из-за отказа от текущих химиотерапии успешно искоренить Тики. Хотя большая часть опухоли восприимчивы к существующим терапии, тики, как полагают, чтобы быть устойчивым и при плотности не обнаруживается стандартными методами. С разъяснением механизмов сопротивления терапии и рецидива опухоли являются жизненно важными для улучшения реакции и общей выживаемости пациентов с раком яичников.
Здесь методы культуры описаны йна обогащение тиков от установленных и первичных рака яичников клеточных линий. Условия культивирования, описанные здесь, были использованы несколько групп, чтобы побудить распространение тиков или сфероид клеток с помощью стволовых клеток качеств 11,12,14,16,20. Хотя есть несколько стволовых клеток культуры Medias и добавки, обычно используемые для обогащения Тики / сфероидов мы использовали сыворотки среде формулу с EGF и FGF, но без добавления B27 или N-2 добавки. Эти добавки, обычно используемые для нейронов культуры и обогащает стволовых клеток клетки, как было показано, способствовать мезенхимальных фенотипа 25,26 и остается некоторая неопределенность в области, является ли более онкогенными ТЭП, имеющие мезенхимальные или эпителиальные фенотип 27-29 , Чтобы свести к минимуму неопределенности и переменные, которые мы решили использовать наиболее распространенные формулы, так как мы имеем дело с эпителиальных клеток рака яичников.
Поддержание клеток в бессывороточной СМИ в низком колбу крепленияоблегчает сфероид образования и поддерживает распространение клеток с экспрессией CD133 и высокой ALDH деятельности. Наша работа в дальнейшем показали, что клетки, плавающие в нормальных прикрепленных условиях также может представлять собой более онкогенного население TIC. Введение клеток, выращенных в этих условиях в бестимусных голых мышей приводит к более онкогенными потенциал по сравнению с клетками, выращенными в прилагаемых условиях в присутствии сыворотки. Много информации о роли тиков в яичников инициации рака, прогрессии, терапевтический ответ, и рецидива заболевания может быть получена за счет использования этих методов.
Protocol
1. Традиционная культура яичников раковых клеток линий (Прикрепленные условия)
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся обработка клеток и СМИ должны проводиться в стерильных капот культуры ткани
- Готовят традиционный среды для культивирования клеток. Использование 1: 1 DMEM: F12 (+ L-глютамин, + 15 мМ HEPES) и дополнить 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина / стрептомицина. Фильтр решение с использованием 0,45 мкм вакуумный фильтр.
- Подготовка традиционный полистирол 75см 2 культуре ткани колбы с надписью с именем, даты и номера Прохождение клеточной линии interest.Remove флакона клеток из сверхнизким морозильнике или жидким азотом. Размораживание, поместив в 37 ° С на водяной бане в течение 5 мин.
- Передача отстранение от флакона в 15 мл центрифужную пробирку, содержащую 3 мл традиционный среды для культивирования клеток (полученный ранее). Центрифуга суспензии при 4 ° С в течение 5 мин при 400 х г. Между тем, добавить 16 мл традиционные среды для культивирования клеток в колбу.
- Отберите супернатант. Использование 2 мл традиционные среды для культивирования клеток пипеткой клетки вверх и вниз, чтобы ослабить гранул и передача подвеска в колбу. Осторожно рок колбу, чтобы равномерно распределить cells.Place колбу в увлажненной инкубаторе для клеточных культур, установленной на 37 ° С и 5% СО 2. Монитор клетки ежедневно до 80% слияния не будет достигнута.
- После того, как клетки 80% сливной разделить культуру 1: 2 в капот культуре клеток. Аспирируйте супернатант и промывают теплой фосфатным буферным раствором (без кальция и магния) (PBS). Добавить 1,5 мл трипсин 0,25% -ЭДТА и инкубировать 3-5 мин при комнатной температуре.
- Подготовка 2 новых полистирола 75см 2 колбы и добавить 16 мл традиционный среды для культивирования клеток в каждую колбу. Ресуспендируют клетки обрабатывали трипсином в 4 мл традиционные клеточной культуральной среде и аликвоту равные объемы каждой из новых колбах.
- Место колбы в увлажненной инкубаторе для клеточных культур установлен в 37 ° С и 5% СО 2. Монитор клетки ежедневно до 80% слияния не будет достигнута. Продолжить, чтобы разделить клетки икультуры или замораживание и хранить при -80 или в жидком азоте.
2. Формирование многоклеточных сфероидов из яичников раковых клеток линий с использованием плавающей или прилипшие клетки
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся обработка клеток и СМИ должны проводиться в стерильных капот культуры ткани. После культивирования клеток линии под традиционными методами культивирования в течение 2 - 3 проходов (раздел 1) приступить к следующим шагам.
- Подготовка СМИ стволовых клеток. Использование 1: 1 DMEM: F12 (+ L-глютамин, + 15 мМ HEPES) и дополнить с 1% пенициллина / стрептомицина (до конечной концентрации 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина), 1% сывороточного замены нокаутом , 0,4% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% инсулина-трансферрина-селен. Фильтр решение с использованием 0,45 мкм вакуумный фильтр.
- Дополнение стволовых клеток носители с рекомбинантным человеческим фактором роста эпидермиса (EGF) и рекомбинантный фактор роста фибробластов Основной человек (FGF) для конечной концентрации 20 нг / мл и 10 нг / мл, соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: факторы роста должны быть добавлены в свежем виде стволовых клеток массовой информации непосредственно перед использованием. - Создать поплавок TIC культуры. Удалить колбу 80% сливной клетки, выращенные в традиционных прикрепленных условиях культивирования. Сбор средств массовой информации и все плавающих клеток (одно- и агрегаты), оставляя липкого население позади, и передать 50 мл полипропиленовую центрифужную пробирку. Центрифуга суспензии при 4 ° С в течение 5 мин при 400 х г.
Примечание: Плавающие элементы и агрегаты являются очевидными 24 - 72 ч после адгезивные клетки прикреплены к колбе в традиционной культуре. С 80% извлечения сливная пластина примерно 1,0 - 5,0 х 10 5 жизнеспособных клеток с плавающей можно ожидать, в зависимости от клеточной линии. В этом исследовании среднее количество плавающих клеток, собранных из 80% сливной прикрепленной культуре был: 5,0 × 10 5 для ACI-23, 4,8 х 10 5 для OVCAR5, 3,5 × 10 5 для CAOV3 и 1,0 × 10 5 для TGS- 3. В случае передачи многоячеечногоулар образование сфероидов в традиционном и поплавок TIC культуры происходит в течение нескольких дней, хотя это несколько клеточной линии зависит. Например, ACI-23 клетки образуют агрегаты легче, чем CAOV3 клетки. - Между тем, подготовить ультра низким привязанность поверхность полистирола 75 см 2 культуре ткани колбы с надписью с именем, дата и число пассажей клеток линии. Добавить 10 мл стволовых клеток, дополненной факторами роста в колбу.
- После центрифугирования является полным, аспирации средства массовой информации и передача гранул в низкой колбу крепления, добавив 6 мл стволовых клеток массовой информации и пипетки вверх и вниз, чтобы ослабить гранул. Место колбы в увлажненной инкубаторе для клеточных культур установлен в 37 ° С и 5% СО 2. Монитор клетки каждые 2 - 3 дня, чтобы наблюдать сфероид образование.
- Создать традиционной TIC культуры. Удалить колбу 80% сливной клетки, выращенные в традиционных прикрепленных условиях культивирования. Вытяжку СМИ и смойте теплой PBS. Добавить 1,5 мл трипсина 0,25% ЭДТА и инкубировать 3 - 5мин при комнатной температуре.
- Подготовка сверхнизким привязанность поверхность полистирола 75 см 2 культуре ткани колбы с надписью с именем, дата и число пассажей клеток линии. Добавить 10 мл стволовых клеток носители, с добавкой EGF и FGF, как описано, в колбу.
- Добавить 6 мл стволовых клеток массовой информации в колбу с трипсином. Раствор пипеткой клеток вверх и вниз и попытаться ослабить клетки с поверхности колбы. Перевести весь объем клеток сверхнизким колбу привязанность, содержащий клеточную среду, 10 мл стволовых клеток. Место колбу в увлажненной инкубаторе для клеточных культур установлен в 37 ° С и 5% СО 2.
- Дополнение Tic культурам каждые 48 - 72 ч с дополнительным 2 мл стволовых клеток сред и свежий EGF и FGF для конечных концентраций 20 нг / мл и 10 нг / мл, соответственно.
- Монитор клеток до 60 - 80% слияния не будет достигнута. Сплит культуры путем размещения на равные объемы в 2 новых ультра колб с низким крепления и добавление свежих стволовых клеток средств массовой информации для достижения конечного объема 18 мл. Альтернативалы, центрифуги Всю суспензию при температуре 4 ° С в течение 5 мин при 400 х г. Ресуспендируют клеток в стволовые клетки среде с добавлением EGF и FGF и распространять в равной степени в новые флаконы ультра-низким крепления. Клетки не должны быть отделены до одноклеточных суспензий для пассирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе культуры могут продолжать быть разделены и культивировали, замороженные, или экспериментально манипулировать для анализа. В 60 - 80% слияния следующие концентрации клеток были получены для ACI-23: 8,0 × 10 6 для традиционного прилипшие, 4,0 × 10 6 для традиционного TIC и 5,0 × 10 6 для Поплавок ТЭП культур. Хотя это может быть клеточной линии зависит, мы обнаружили, что 5 - 10 дней в культуре является оптимальным для TIC обогащения как процент CD133 + ALDH + клеток является низким в течение первых 3 дней, пики при 5 - 10 дней, и уменьшается снова 14 дней.
3. Генерация Первичная раком яичников клеточных линий и многоклеточных сфероидовот химиорезистентных асцита пациента
ПРИМЕЧАНИЕ: утверждение Экспертный совет был получен для этого протокола. Вся обработка клеток и СМИ должны проводиться в стерильных капот культуры ткани.
- Пластинчатые асцитной жидкости 1: 1 с традиционным клеточной культуральной среде. Подготовка СМИ, как описано в разделе 1 и добавить 10 мл до нескольких традиционных полистирола 75 см 2 колбах для культуры ткани.
- Асцит жидкость, как правило, предоставляется в 1 л стерильной вакуумной бутылок; Отсоедините вакуумный колпачок. Осторожно добавить 10 мл асцитной жидкости в колбу, содержащую 10 мл традиционные средства массовой информации и место в увлажненной клеточной культуры инкубатор до 37 ° С и 5% СО 2. Оставить в покое на 72 - 96 часов, прежде чем делать полную смену носителей. Изменить среды каждые 2 - 3 дня, пока клетки достигают 60 - 80% слияния
- После того, как клетки достигают 60 - 80% слияния, разделить 1: 2, как описано в разделе 1. Запустите ТИЦ культур, как описано в разделе 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: эритроциты, присутствующие в ascitES будут удалены после первой смены носителей, которые не являются приверженцем. Любые фибробласты, присутствующие в основном будут удалены после обработки трипсином, поскольку они более чувствительны и поднимет с минимальным воздействием трипсина. Чистота клеток рака яичников была определена с использованием антитела к CA-125 (MUC16) путем проточной цитометрии.
4. Окрашивание клеток для проточной цитометрии Подтверждение ТИЦ маркеров
- Сбор TIC культур. Передача содержимого колбы в 50-мл полипропиленовую центрифужную пробирку. Центрифуга суспензии в течение 5 мин при 400 х г. Вытяжку СМИ и смойте теплой PBS. Добавить 2 мл неферментативного раствора для диссоциации клеток, инкубировать 3 - 5 минут при 37 ° С, и пипетки вверх и вниз, чтобы разбить комки и диссоциируют на отдельные клетки. Добавить 4 мл стволовых клеток массовой информации.
- Сбор прилипшие культур. Вытяжку СМИ и смойте теплой PBS. Добавить 3 мл неферментативного раствора для диссоциации клеток и инкубируют 3 - 5 мин при 37 ° С. Добавить 3 мл традиционный сотовыймедиакультуры и пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы отделить клетки от колбу и собирать в центрифужную пробирку.
- Центрифуга как ТИЦ и прилипшие суспензии в течение 5 мин при 400 х г. Удалите супернатант и ресуспендируют каждый шарик в 1 мл PBS, содержащего 3% фетальной бычьей сыворотки. Инкубируют при комнатной температуре 30 мин. Между тем, рассчитывать количество жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего. Заметим, клетки под микроскопом, чтобы подтвердить сфероиды диссоциируют на отдельные клетки.
- Этикетка 5 х 1,5 мл Eppendorf трубки для каждого из следующих условий культивирования: 1) неокрашенные (неокрашенных контроля за вознаграждение), 2) ALDH (один пятно положительного контроля для компенсации), 3) CD133 (один пятно положительного контроля для компенсации), 4 ) ALDH + CD133 (экспериментальный образец тест), и 5) DEAB + ALDH (отрицательный контроль для фоновой флуоресценции в FL-1 и FL-4 каналов, соответственно).
- Распределить примерно 5 х 10 5 элементов, каждый из к трубкам # 1 - 4. Центрифуга суспензии в течение 5 мин при 400 х г. Отберите supernataNT и ресуспендирования гранулы в 500 мкл Aldefluor буфера для анализа. Добавить 10 мкл DEAB (ингибитор ALDH) к трубе # 5 для экспериментального отрицательного контроля.
- Добавить 5 мкл активированных Aldefluor реагента трубки # 2 для компенсации положительного контроля и движением перемешать. Добавить 5 мкл активированных Aldefluor реагента трубки # 4 для экспериментального анализа. Щелчок трубки для смешивания и немедленно передать половину объема клеток из трубки # 4 в трубки # 5 (250 мкл), который содержит DEAB.
- Флик трубы, чтобы хорошо перемешать. Инкубируйте все пробирки в течение 30 - 45 мин при 37 ° С в защищенном от света месте. Флик трубки на полпути через инкубационного периода, как клетки оседают на дно. Центрифуга все пробирки в течение 5 мин при 400 х г. Вытяжку супернатант и ресуспендирования клеток в 500 мкл Aldefluor буфера для анализа.
- Для труб с окраской CD133 (# 3 и # 4), добавить CD133 АПК 1:11 непосредственно в Aldefluor буфере для анализа. Выдержите 15 минут на защищенном от света льду. Центрифуга CD133 трубы для 5 мин при 400 х г. Промывают один раз500 мкл Aldefluor буфере для анализа. Ресуспендируют клеток в 500 мкл буфера Aldefluor анализа, соответственно.
- Фильтровать суспензии на отдельные полистирола круглым дном пробирки с ячейки фильтра крышкой. Убедитесь, что весь объем фильтруется через крышку.
- Использование проточного цитометра для анализа клеточной популяции. Используйте трубок # 1-3 для установки контроля компенсации. Использование вперед и параметры бокового рассеяния, ворота клетки, будучи уверенным, чтобы исключить продукты распада клеток. Создание ALDH + и CD133 + двойной клетки, используя FL-1 и FL-4 каналов, соответственно.
- Использование цитометрический программу анализа, подтверждают условия культивирования повысили процент ТИЦ клеток, как ТИЦ богатых культур, должны иметь высшее окрашивание на этих двух маркеров.
Примечание: В дополнение к CD133 и ALDH, другие markersof яичников ТЭП рака могут быть проанализированы с числом маркеров, используемых в какой-либо одной выборке в зависимости от возможностей проточной цитометрии.
5. В естественных условиях
ПРИМЕЧАНИЕ: утверждение Экспертный совет был получен для этого протокола. Распределить Бестимусным Обнаженная мышам 6 - 8-недельного возраста в экспериментальных группах в клетках 3 и позволяют акклиматизироваться в течение нескольких дней до инъекции. Следуйте мышей в гуманных экспериментальных руководящих принципов в соответствии с NIH уходу и использованию животных комитета; контролировать массу тела, физический облик, включая потери веса или получить больше, чем 20%, изможденного внешний вид, диареи или дерматит и усыпить мышей принадлежность этих критериев, по CO 2 асфиксией.
- Сбор культур, как описано в разделе 2. Ресуспендируют каждая клетка населения в 1 мл PBS. Граф жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего.
- Подготовка 15 мл центрифужные пробирки. Для трех экземплярах меры добавить 1,5 × 10 6 жизнеспособных клеток разводили в 2 мл PBS в каждую пробирку (5 × 10 5 клеток в объеме 0,5 мл будет подкожно в правый Fхудой каждой мыши). Подготовка 0,5 мл PBS только для контрольных мышей.
- Использование 27 г иглы, subcutaneouslyinject 0,5 мл суспензии клеток от традиционных культур единомышленником, традиционных культур тик, поплавок TIC культур, или PBS в правый бок каждой из 3 мышей в каждой группе. Вернуться мышей в первоначальные клетки после инъекции.
- Взвешивание мышей и измерить любые пальпируемых опухолей в двух измерениях дважды weeklyby штангенциркуль, создание длину и ширину.
Примечание: Время задержки опухоли, как правило, 20 - 50 дней, в зависимости от клеточной линии. - Рассчитать объем опухоли мокрой стандартными методами (V = (ширина) 2 х длина / 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это исследование по сравнению онкогенность тиков по сравнению с прилипшие клетки для первого поколения только в естественных условиях серийного пассирования тиков, выращенных в аналогичных условиях был завершен других 11,20.
Representative Results
Основанная рака яичников клеточных линий и основную линию асцит клеток, выращенных в традиционных прикрепленных условиях культивирования в присутствии сыворотки шоу прилагается, булыжник морфологии, в то время как те же самые клетки, выращенные в ЛПК условиях культивирования дисплей с плавающей сфероид морфологию, общий тика населения. Светлое изображения, представленные на рисунке 1 четко показывают, морфологические различия в условиях культивирования. Рисунок 1B показывает дифференцированные морфологии, достигнутые после replating ТЭП культуры ACI-23 и TGS-3 в традиционных условиях прикрепленных. Просто 24 ч после посева обратно в прикрепленных условиях, большинство многоклеточных сфероидов отделить и присоединить к поверхности, напоминающие типичные прилипшие клетки.
Чтобы убедиться, что TIC условия обогащения клеток с маркеров стволовых клеток проточной цитометрии анализ проводили с использованием двух общих маркеров рака яичников ТЭП - CD133 expressioп и ALDH деятельность. Точечные участки, показанные на рисунке 2 выделите увеличение доли CD133 + клеток в условиях низкой привязанности, свободной от сыворотки условиях. Кроме того, активность фермента ALDH выше в этих условиях по сравнению с традиционными адгезивных условиях культивирования. Хотя традиционные культуры прилипшие содержать CD133 + клеток, процент увеличивается в условиях, которые повышают образование сфероид. Анализ плюрипотентности маркера, TRA-1-60, придает дополнительную поддержку, что TIC условия обогащения тики, рис 2 б. Количественное на рисунке 2 C показывает, что двойной положительные (CD133 + ALDH +) ACI-23 клетки в значительной степени ограничен культур, выращенных в ЛПК условиях, повышающих. Изменения в уровнях белков различных транскрипционных факторов, которые происходят в ACI-23 клеток после пяти дней культуры в ТЭП условиях были также рассмотрены. Постепенное увеличение в каждом из маркерас видно из традиционных до поплавка TIC условия по сравнению с относительно низкими уровнями, которые наблюдаются в прикрепленной культуре, рисунок 2 D. Интересно человеком линия асцит клеток выращивается в различных условиях показывает высокий маркер фенотип по традиционной условиях ТЭП с немного ни к окрашивания настоящее время в поплавка ТИЦ условиях, на рисунке 2 E.
Туморогенности условиях ТЭП культуры была подтверждена с помощью подкожных инъекций из равного числа жизнеспособных клеток, полученных от всех условий в когортах бестимусных голых мышей. Рисунок 3 показывает, что ACI-23 (А, В) и OVCAR-5 (С) Клетки традиционные прилипшие культуры были менее онкогенными, чем те, из ТЭП культур. Следует отметить, что поплавок TIC культуры получают большие опухоли за более короткий период времени, чем традиционные адгезивных или традиционных культур TIC. Эти dата показывают, что даже со скромным ростом яичников маркеров ТЭП, есть драматические фенотипические изменения. Однако при других клеточных линий (не показаны) традиционные культуры TIC были более онкогенными, чем традиционные адгезивных и поплавок ТЭП культуры клеток.
Рисунок 1. Сфероид развития в различных условиях культивирования. (А) Основанная рака яичников клеточных линий (МСА-23, OVCAR-5 и CAOV3) и первичные пациента полученных клеток асцитной (TGS-3), полученных в низких колбах крепления с бессывороточной стволовых клеток массовой информации легко образуют многоклеточные сфероидов. Изображения показывают традиционные прилипшие условия культивирования поддерживать эпителия булыжником морфологии в МСА-23, OVCAR-5, CAOV3 и TGS-3 клетки, в то время как те же ячейки, образованные сфероидов в 96 часов в ЛПК условиях. Шкала бар 100 мкм. (В) При воздействии 24 чс традиционными прикрепленных условиях культивирования, тик культуры морфологии отображения дифференцированный фенотип, напоминающий оригинальный клейкий морфологию. Масштабная линейка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Низкое-крепления, сыворотки, свободной от условий обогащения клеток с TIC маркеров. (А) проточной цитометрии анализа ACI-23 клеток с использованием APC, конъюгированный CD133 антитела демонстрирует увеличение доли CD133 + клеток в колбах с низким крепления с бессывороточной ствола Сотовые массовой информации. Анализ проточной цитометрией с использованием Aldefluor опробования показывает увеличена ALDH активность в клетках, культивируемых в низких колбах с крепежными сыворотки среде стволовых клеток. CD133 отрицательный контроль не содержит антитела и ALDH негативное конTROL является активированный субстрат в присутствии ингибитора (ALDH DEAB). (В) Анализ с использованием FITC конъюгированной TRA-1-60 антитела демонстрирует высокий процент TRA-1-60 + клеток в поплавка ТЭП условий в МСА-23 клеток. Отрицательный контроль не содержит антител. (C) CD133 + ALDH + клетки являются самыми высокими в традиционном ТИЦ и поплавок TIC условия в клеточной линии ACI-23. Ошибка бары: SEM, N = 6, * р <0,05. (D), Вестерн-блот-анализ показывает увеличение уровня белка транскрипции маркеров стволовых клеток в ACI-23 клеток, культивируемых в условиях ТЭП в течение 5 дней. Всего клеточные лизаты (50 мкг) анализировали с GAPDH в качестве контроля нагрузки. (E) Характерные точечные участки TGS-3 первичных клеток асцитной анализировали, как в. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. низкого крепления, сыворотки, свободной от условий обогащения клеток с повышенной туморогенности. (А) 5 × 10 5 жизнеспособных ACI-23 клетки инъецировали подкожно в бестимусных голых мышей в трех экземплярах. Мыши были взвешены и опухоли измеряли штангенциркулем дважды в неделю. = Традиционный приверженец культура, F = Поплавок TIC культура, S = Традиционные TIC культура. * Р <0,05. (Б) Типичные изображения опухолей, образованных из ACI-23 после 25 дней с использованием клеток, выращенных в различных условиях культивирования. (C) 5 х 10 5 жизнеспособных OVCAR-5 клетки вводили подкожно в бестимусных голых мышей в трех экземплярах и контролироваться, в с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Discussion
Протокол, описанный здесь, представляет собой эффективный и последовательный способ обогащения культур для клеток с особенностями стволовых клеток из установленных яичников линий раковых клеток и применимо к образцов первичных пациентов. Этот метод успешно обогащает по ТЭП по всей различных клеточных линий. Это позволяет своевременно выявлять условия, которые обогащают для ТЭП и / или онкогенного фенотипа, не нашли время, чтобы физически отсортировать Тики от не ТЭП среди населения. Таким образом, относительные уровни различных сигнальных путей могут быть оценены за их вклад в фенотип ТИЦ путем сравнения традиционных культур прикрепленных к TIC культуры, используя разнообразные функциональные анализы. Если чистый населения TIC желательно, выделение может быть легко достигнуто путем введения флуоресценции при содействии или магнитно сортировки шаг в проточной цитометрии протокола.
Важно иметь в виду, однако, что выражение TIC маркерас, например, CD133, CD44, или ALDH, может меняться в зависимости от клеточных линий и клинических образцов, даже одного и того же типа опухоли. Например, мы обнаружили, что OVCAR-5-клетки имеют более высокую экспрессию CD44 по сравнению с CD133, тогда как обратное верно для ACI-23. Поэтому уместно полагаться на инициации опухоли у мышей и проточной цитометрии анализа как окончательный ТИЦ присутствия. После этого протокола, высокая активность ALDH последовательно наблюдается при клеток рака яичников, выращивали в условиях стволовых клеток. Интересно, что экспрессия CD133 всегда выше в ACI-23 клеток, выращенных в традиционных ТИЦ условиях культивирования, в то время как ALDH является самым высоким в поплавка ТИЦ условиях. В отличие от TGS-3 первичные клетки асцита отображения небольшое увеличение CD133 положительности под Поплавок ТИЦ условиях, но значительного увеличения ALDH деятельности на традиционных условиях ТЭП. Эти данные подчеркивают неоднородность клеток рака яичников и пластичность, обычно связанных с ТЭП. Для дальнейшей поддержки CLAим, что эти методы повышения тики, также наблюдалось обогащение TRA-1-60 положительных клеток. TRA-1-60 является плюрипотентности маркер и была использована для определения эмбриональные карциномы яичников и яичек, а также раком простаты TICS 30-32. Хотя наши методы были успешными с многочисленных клеточных линий, не исключено, что стандартные условия TIC может быть лучше подходит для некоторых клеток рака яичников, в то время как модифицированные условия Floater лучше обогащения ТЭП в других популяциях клеток рака яичников. Это еще раз подчеркивает ожидаемое неоднородность как в обоих клеточных линиях рака пациентов, полученных из и установленных яичников.
В дополнение к маркеров клеточной поверхности имеется несколько транскрипционных факторов, которые, как было показано, чтобы охарактеризовать яичников Тики рака, включая Nanog, Sox2, октябрь-4 11, хотя эти маркеры не являются специфичными для яичников ТЭП рака и довольно представляют факторов, важных для эмбрионального плюрипотентности стволовых клеток и DIFференциации 33,34. Мы рассмотрели изменения в уровнях белков этих факторов и обнаружили, что уровни Nanog увеличивают в ЛПК условиях культивирования, в согласии с другими 13,35, а также CD133, TRA-1-60 и CD117. Массив кДНК стволовых клеток маркера человек дополнительно показали увеличение CD133, Nanog, Мельк и PODXL генов в условиях ТЭП по сравнению с традиционными адгезивных условиях. Важно отметить, что следует отметить, что, как и маркеров клеточной поверхности, транскрипционные факторы, связанные с яичников ТЭП может меняться в зависимости от клеточных линий и образцов.
Мы обнаружили, что клетки могут быть более онкогенными и экспрессируют более высокие уровни маркеров стволовых клеток, если они по своей природе не соблюдают в пробирке (т.е. с плавающей клетки, которые не могут легко прикрепляться к клейкой пластине). В культуре, клеточные линии, такие как ACI-23, как правило, имеют много жизнеспособных плавающие клетки и / или клетки, которые растут вертикально в стеке образом в соответствии с традиционной культуральной Conditионы. Хотя успешный обогащение ТЭП с плавающей клеток и агрегатов могут быть применимы в относительно небольшом числе клеточные линии в том числе в настоящем исследовании и OVCAR-3 12, наши результаты предполагают, что это может представлять более онкогенного населения. Таким образом, заготовки на "плавающий" популяцию клеток, выращенных в стандартных культуральных планшетах ткани и средств массовой информации может служить в качестве альтернативного способа обогащения TIC, для клеток, которые адаптируют слабо коммерческой сред стволовых клеток.
Использование различных методов культивирования, представленных в этой рукописи позволит быстрого обогащения ТИЦ населения и лучшего понимания, какие факторы поддерживают эту фенотип в различных клетках. Текущие применения этого метода являются, характеризующих которые сигнальных путей важно, чтобы поддержать распространение этой уникальной популяции клеток. Результаты этих исследований поможет уточнить механизмы опухолевой прогрессии и рецидива.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask | Corning | 3814 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask | Sarstedt | 83.1813.002 | |
| Aldefluor Kit | Stemcell Technologies | 1700 | |
| CD133-APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-090-826 | |
| Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant | Sigma-Aldrich | F0291 | Prepared according to manufacturer's instructions |
| Epidermal Growth Factor - human recombinant | Sigma-Aldrich | E9644 | Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS |
| DMEM:F12 (+L-glutamine, +5 mM HEPES) | Gibco | 11330-032 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | |
| Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution | Corning Cellgro | 25-056-CI | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 51500-056 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum (heat inactivated) | Gemini | 100-106 | |
| Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 μm) | Nalgene | 450-0045 | |
| 15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430052 | |
| 50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E |
References
- Coleman, R. L., Monk, B. J., Sood, A. K., Herzog, T. J. Latest research and treatment of advanced-stage epithelial ovarian cancer. Nat Rev Clin Oncol. 10, 211-224 (2013).
- Ushijima, K. Treatment for recurrent ovarian cancer-at first relapse. J Oncol. 2010, 497429 (2010).
- Erickson, B. K., Conner, M. G., Landen, C. N. The role of the fallopian tube in the origin of ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol. 209, 409-414 (2013).
- King, S. M., et al. The impact of ovulation on fallopian tube epithelial cells: evaluating three hypotheses connecting ovulation and serous ovarian cancer. Endocr Relat Cancer. 18, 627-642 (2011).
- Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495, 241-245 (2013).
- Paik, D. Y., et al. Stem-like epithelial cells are concentrated in the distal end of the fallopian tube: a site for injury and serous cancer initiation. Stem Cells. 30, 2487-2497 (2012).
- Connor, M. L., et al. Cancer stem cells: A contentious hypothesis now moving forward. Cancer Lett. 344, 180-187 (2014).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5, 275-284 (2005).
- Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 65, 3025-3029 (2005).
- Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11154-11159 (2006).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
- Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line. Mol Cell Biochem. 363, 257-268 (2012).
- Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130, 29-39 (2012).
- Meng, E., et al. CD44+/CD24- ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival. Clin Exp Metastasis. 29, 939-948 (2012).
- Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
- Chen, J., et al. Evaluation of characteristics of CD44+CD117+ ovarian cancer stem cells in three dimensional basement membrane extract scaffold versus two dimensional monocultures. BMC Cell Biol. 14, 7 (2013).
- Guo, R., Wu, Q., Liu, F., Wang, Y. Description of the CD133+ subpopulation of the human ovarian cancer cell line OVCAR3. Oncol Rep. 25, 141-146 (2011).
- Curley, M. D., et al. CD133 expression defines a tumor initiating cell population in primary human ovarian cancer. Stem Cells. 27, 2875-2883 (2009).
- Baba, T., et al. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133+ ovarian cancer cells. Oncogene. 28, 209-218 (2009).
- Liao, J., et al. Ovarian cancer spheroid cells with stem cell-like properties contribute to tumor generation, metastasis and chemotherapy resistance through hypoxia-resistant metabolism. PLoS One. 9, e84941 (2014).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71, 3991-4001 (2011).
- Jaggupilli, A., Elkord, E. Significance of CD44 and CD24 as cancer stem cell markers: an enduring ambiguity. Clin Dev Immunol. 2012, 708036 (2012).
- Irollo, E., Pirozzi, G. CD133: to be or not to be, is this the real question. Am J Transl Res. 5, 563-581 (2013).
- Ma, I., Allan, A. L. The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells. Stem Cell Rev. 7, 292-306 (2011).
- McLean, K., et al. Human ovarian carcinoma–associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production. J Clin Invest. 121, 3206-3219 (2011).
- Amara, I., Touati, W., Beaune, P., de Waziers, I. Mesenchymal stem cells as cellular vehicles for prodrug gene therapy against tumors. Biochimie. , (2014).
- Brabletz, T. EMT and MET in metastasis: where are the cancer stem cells. Cancer Cell. 22, 699-701 (2012).
- Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, e46858 (2012).
- Liu, S., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem Cell Reports. 2, 78-91 (2014).
- Malecki, M., et al. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), Oct4A(+), Nanog(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Ovaries. J Stem Cell Res Ther. 2, (2012).
- Malecki, M., Tombokan, X., Anderson, M., Malecki, R., Beauchaine, M. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), POU5F1(+), SOX2(+), NANOG(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Testes. J Stem Cell Res Ther. 3, 10-4172 (2013).
- Rajasekhar, V. K., Studer, L., Gerald, W., Socci, N. D., Scher, H. I. Tumour-initiating stem-like cells in human prostate cancer exhibit increased NF-κB signalling. Nat Commun. 2, 162 (2011).
- Loh, Y. H., et al. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nat Genet. 38, 431-440 (2006).
- Tay, Y., Zhang, J., Thomson, A. M., Lim, B., Rigoutsos, I. MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation. Nature. 455, 1124-1128 (2008).
- Lee, M., et al. Prognostic impact of the cancer stem cell-related marker NANOG in ovarian serous carcinoma. Int J Gynecol Cancer. 22, 1489-1496 (2012).
