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Méthodes de comparaison des éléments nutritifs dans gelée royale faites par africanisées et Honey Bees européenne et les effets sur hémolymphe Les titres de protéines

Published: March 17, 2015 doi: 10.3791/52448
Automatic Translation
1, 2, 3
1Carl Hayden Bee Research Center, USDA-ARS, 2Coupeville, WA, USA, 3Ecotoxicology Division, Eurofins Agroscience Services, Inc.

Abstract

Les abeilles obtiennent les nutriments de pollen qu'ils recueillent et stockent dans la ruche comme gelée royale. Nous avons développé des méthodes pour contrôler la source de pollen que les abeilles recueillent et se convertissent à gelée royale en plaçant colonies dans une zone de vol clos spécialement construit. Des méthodes ont été mises au point pour analyser la composition du pollen et gelée royale et de protéine acide aminé. Nous décrivons également comment la consommation de la gelée royale a été mesurée et les méthodes utilisées pour déterminer ouvrières adultes titres de protéines hémolymphe des abeilles après le repas sur gelée royale pour les 4, 7 et 11 jours après la levée. Méthodes ont été appliquées pour déterminer si le génotype affecte la conversion de pollen gelée royale et le taux que les abeilles consomment et acquièrent protéines de lui. Deux sous-espèces (des abeilles européennes et africanisées miel; EHB et AHB respectivement) ont été fournis avec la même source de pollen. Basé sur les méthodes développées, gelée royale fait par les deux sous-espèces avaient des concentrations de protéines plus faibles et les valeurs de pH que le pollen. En général, l'acide aminé concentrations en gelée royale prises soit par EHB ou AHB étaient similaires et se sont produits à des niveaux plus élevés en gelée royale que dans le pollen. Les deux AHB et EHB consommaient significativement plus de la gelée royale faite par AHB que par EHB. Bien EHB et AHB consommé des quantités similaires de chaque type de gelée royale, les concentrations de protéines dans l'hémolymphe AHB étaient plus élevés que dans EHB. Les différences dans l'acquisition de protéines entre AHB et EHB pourraient refléter adaptations environnementaux liés à la région géographique où chaque sous-espèce a évolué. Ces différences pourraient contribuer à la mise en place réussie des populations AHB dans le Nouveau Monde en raison des effets sur l'élevage du couvain et la croissance de la colonie.

Introduction

La nutrition joue un rôle fondamental dans la santé et la vigueur des colonies d'abeilles mellifères et dans leur mise en place que les populations. Nutriments des aliments fournissent de l'énergie et les composants biochimiques nécessaires à l'élevage du couvain, la thermorégulation, la recherche de nourriture et la réponse immunitaire. Pour colonies d'abeilles mellifères, les nutriments nécessaires à la croissance des populations de la colonie et de maintenir leur santé proviennent de nectar et de pollen. Nectar fournit glucides et de pollen fournit les besoins alimentaires restantes comme les protéines, lipides, vitamines et minéraux 1.

Sous-espèces d'abeilles peuvent différer en fonction de paramètres nutritionnel au niveau de la colonie comme la longévité des travailleurs, l'élevage du couvain, et les mécanismes de l'immunité sociale 2-6. Ces différences pourraient être liés à la façon dont l'alimentation, en particulier le pollen est générée par la colonie et digéré chez les individus. Le pollen est stocké dans les cellules de peigne et par microbienne médiation fermentation de l'acide lactique est modifié chimiquement 11-14.

Nous décrivons ici les méthodes utilisées pour comparer la composition et la consommation de gelée royale faite par différentes sous-espèces d'abeilles mellifères. Méthodes pour mesurer l'hémolymphe des titres de protéines résultant dans ouvrières sont également décrites. Des études antérieures sur la composition nutritionnelle de gelée royale ont été faites avec des abeilles mellifères européennes (EHB) 10,15,16. Cependant, il peut y avoir des différences de gelée royale fabriquée par les abeilles d'espèces différentes, même quand ils se nourrissent sur le même pollen. EHB et AHB ont été comparés, car ces sous-marinspecies ont des différences comportementales et physiologiques distincts qui pourraient être liés à la transformation des aliments et des nutriments acquisition 17. Certaines des différences les plus notables sont que AHB recueillir et consomment plus de pollen que EHB et semblent pour le convertir plus facilement dans le couvain 18. AHB colonies ont des taux plus élevés que d'essaimage EHB et enfuient lorsque les ressources alimentaires deviennent limitées 19-23. La désertion est rare dans EHB. AHB ont également des taux métaboliques plus élevés que EHB 24. La base nutritionnelle pour les différences de niveau de la colonie entre EHB et AHB pourrait être liée à la vitesse de la collecte de pollen et aussi à sa teneur en éléments nutritifs (par exemple, des acides aminés et de protéines) après qu'il est converti en gelée royale. La consommation gelée royale et l'acquisition de protéines résultant pourraient également jouer un rôle dans les différences de niveau de la colonie entre EHB et AHB. En utilisant les méthodes développées, EHB et AHB faites gelée royale de la même source de pollen. La gelée royale a ensuite été renvoyé aux abeilles de each sous-espèces et peut déterminer si les abeilles acquièrent protéine de gelée royale de façon distinctive à leurs sous-espèce ou à la source de la gelée royale.

Protocol

1. Obtenir gelée royale de AHB et EHB Colonies

  1. Placez des pièges à pollen sur les colonies d'abeilles mellifères et de recueillir le pollen. Broyer le pollen en une poudre fine (similaire à partir de libération du pollen des anthères) en utilisant un moulin à café.
  2. Établir cinq colonies chacun AHB et EHB dans une zone de vol clos (EPT), de sorte que les abeilles butinent le pollen seulement fourni. Pour empêcher les travailleurs de la dérive entre EHB et colonies AHB, diviser l'EPT en sections distinctes afin que les abeilles ne peuvent pas traverser entre eux. Placez EHB individu ou colonies AHB avec 3.500-4.000 abeilles ouvrières, peigne de la cire de nectar, de miel, nichée immature et rayons vides dans chaque section de l'EPT.
    NOTE: Les colonies ne ont pas stocké pollen une fois établi. Le taux que le pollen est stocké peut être augmentée en ne incluant pas une reine pondeuse dans les colonies.
  3. Nourrir sol pollen colonies en plaçant un plateau avec le pollen dans chaque section de l'EFA. Répandre environ 60 g de pollen sur chaque plateau de sorte que foraging abeilles peuvent recueillir des charges que corbicular et stocker le pollen dans leurs colonies comme gelée royale. Continuer à fournir pollen frais sur chaque plateau par jour pendant trois semaines.
  4. Reportez-vous à gelée royale des colonies européennes, gelée royale européenne (EBB) et de colonies africanisées que africanisé gelée royale (ABB).

2. Les abeilles d'alimentation dans des cages

  1. La place de cadres scellée couvain d'ouvrières des colonies AHB et EHB dans des cages d'émergence distincts dans une salle de l'environnement fixés à 32-34 ° C et 40% d'humidité relative ..
  2. Lorsque les travailleurs émergent et sont âgés d'environ 24 h, 12 établir plexiglas essais biologiques cages (dimensions 11,5 x 7,5 = x 16,5 cm 3) et ajouter soit 100 EHB nouvellement apparues ou 100 nouvellement écloses AHB travailleurs abeilles à chaque cage. Placez une section de peigne avec un nombre connu de cellules soit EBB ou ABB (24-30 cellules par cage) dans chaque cage pour générer les combinaisons de traitement suivants: AHB Fed ABB, ABB EHB Fed, AHB Fed EBB et EHB Fed EBB. (4 traitements; 6cages par traitement; 24 cages au total).
  3. Ajouter flacons d'eau et un miel de 50% et une solution d'eau formulées par volume pour chaque cage. Remplir les flacons de miel et d'eau par jour pendant la période d'étude de 11 jours.

3. Abeilles échantillonnage travailleurs et gelée royale et en estimant la consommation

  1. Échantillon de 10 travailleurs nouvellement émergé EHB et AHB avant de les placer dans les cages. Reportez-vous à ceux-ci comme jour 0 abeilles et de les faire servir de base pour les concentrations de protéines de l'hémolymphe.
  2. Retirer 10 abeilles de chaque cage après ils se nourrissaient de EBB ou ABB pour 4, 7 et 11 jours.
  3. Placez les abeilles vivantes dans des microtubes individuels et mettre sur les paquets de glace. Sélectionnez un sous-échantillon de quatre abeilles pour l'analyse de la concentration de la protéine de l'hémolymphe.
  4. Après le prélèvement, les abeilles lors de la Journée-11, compter le nombre de cellules en forme de peigne qui contiennent encore gelée royale. Ce est une mesure relative de la consommation gelée royale.
  5. Retirer la gelée royale restante des cellules dans chaque cage et stocker dans separmangé tubes centrifuger selon cage. Conserver les échantillons de gelée royale à -80 ° C jusqu'à l'analyse pour le pH, la concentration de la protéine soluble et la teneur en acides aminés.

4. Estimation pH de pollen et gelée royale

  1. Prenez six aléatoires 0,3 g échantillons de pollen pour les abeilles nourris dans le CFC et le dissoudre dans 300 pi d'eau distillée. Mesurer le pH en utilisant une double lance jonction pH étanche avec une précision de 0,01.
  2. Prendre 0,3 g de gelée royale échantillon qui reste après la période d'alimentation de 11 jours dans chaque cage. Dissoudre la gelée royale dans 300 ul d'eau distillée et la mesure du pH comme décrit pour le pollen (4,1).

5. Analyse des protéines

  1. Prenez six échantillons de pollen et un échantillon de EBB et ABB de chaque cage. Conserver les échantillons à -20 ° C jusqu'à l'analyse de la concentration de protéine soluble.
  2. Mélanger 20 mg de gelée royale ou pollen soit avec 1000 ul de solution tampon de phosphate 0,1 M (PBS).
  3. VoRTEX le mélange pendant 10 secondes et centrifuger à 571,2 g pendant 1 min.
  4. Suppression d'un échantillon de 10 pi du surnageant et le placer dans puits d'une plaque à fond plat de 96 polystyrène EIA / RIA. Répliquer chaque échantillon dans trois puits.
  5. Dessinez hémolymphe des abeilles recueillis auprès de chaque cage en insérant un tube capillaire de 20 pi (qui avait été chauffé et tiré à un point de l'aiguille-forte) dans la partie latérale droite du thorax près du point d'attache des ailes. Recueillir hémolymphe supplémentaires, si nécessaire, en insérant le même tube dans la membrane entre les tergites abdominaux.
  6. Ajouter 1 pi de l'hémolymphe de 9 pi de 0,1 M de PBS. Conserver la solution de l'hémolymphe à -20 ° C jusqu'à l'analyse de la protéine soluble.
  7. Déterminer les concentrations totales de protéine soluble dans le pollen, gelée royale, et des échantillons de hémolymphe en utilisant un kit de dosage de protéine commerciale Bradford. Suivez les instructions du fabricant.
  8. Établir une courbe standard pour estimer protéine soluble concentration dans les échantillons en mesurant l'absorbance de protéines avec des concentrations protéiques connus dans l'albumine de sérum bovin (BSA). Mesurer protéines absorbance à 595 nm en utilisant un spectrophotomètre.

6. Analyse des acides aminés

  1. Piscine échantillons individuels à partir de cellules de peigne de chaque colonie de créer un échantillon représentatif de EBB et ABB pour analyse.
  2. Prenez 50 mg de pollen ou de l'échantillon gelée royale pesé dans des flacons pour échantillonneur automatique, et ajouter 1 ml d'eau distillée dans le flacon, avec 100 pi d'un / ul solution étalon interne de 50 ng constitué de 4 d alanine, acide 23 d -lauric, 13 C 6 et D-glucose 39 -arachidiac acide.
  3. Boucher le échantillon et de traitement par ultrasons pendant 5 min.
  4. Conditionner un HLB cartouche en ajoutant 1 ml de methanol, équilibrée par addition de 1 ml d'eau distillée suivie de l'addition de 1 ml de la gelée royale ou pollen échantillon. Laver la cartouche avec 1 ml de 5,0% de MeOH / H 2 O et elute avec 1 ml de 80% de MeOH / H 2 O.
  5. Evaporer l'extrait à siccité sous un courant d'azote. Reconstituer l'échantillon avec 50 ul de pyridine et 100 ul de N, O-bis (triméthylsilyl) trifluoroacétamide + triméthylchlorosilane (TMCS BSTFA +).
  6. Cap et incuber l'échantillon à 70 ° C pendant 30 min.
  7. Laisser refroidir l'échantillon et de le transférer dans un flacon d'auto-échantillonneur propre.
  8. Cap et placer l'échantillon dans un détecteur sélectif de masse interfacés à un chromatographe en phase gazeuse pour analyser les échantillons à la fois pour les composés volatils et les acides organiques. Séparer les sucres et les acides organiques suivants TMS dérivatisation avec BSTFA + TMCS en utilisant une colonne (30 x 0,25 mm de diamètre) d'une épaisseur de 1,0 um de film.
  9. Régler le four à colonne à 50 ° C pendant 2 min, puis augmenter la température de façon linéaire jusqu'à 290 ° C à 5 ° C / min. et maintenez pendant 7 min. Réglez l'injecteur de GC et GC / interface MS à 250 ° C et 290 ° C, respectivement.
    1. Utilisez l'hélium comme un transporteur en un flow taux de 1,0 ml / min. Réglez la température de la source MS à 230 ° C.
  10. Tune et calibrer le spectromètre de masse quotidien avec perfluorotributylamine (PFTBA). Utilisez une injection de 1 ul de PFTBA dans l'analyse complète (de 35 à 700 amu) en mode d'ions positifs d'obtenir des données sur la présence et les concentrations d'acides aminés.

Representative Results

Gelée royale a été stocké à -80 ° C en moins d'un mois avant d'être analysés pour le pH et la concentration de protéine, et pendant environ 4 mois avant l'analyse d'acides aminés. Diffère de la gelée royale pollen du pH et de la concentration de protéine (Figure 1). Le pH de gelée royale est inférieur au pollen de même que la concentration en protéines. Les deux EHB et AHB consommé plus que ABB EBB (Figure 2).

Les niveaux de protéine soluble dans l'hémolymphe de AHB étaient significativement plus élevé que EHB quel que soit le type de gelée royale qu'ils consomment (Figure 3). Ces différences dans les niveaux de protéines de hémolymphe eu lieu même si EHB et AHB consommé des quantités similaires de chaque type de gelée royale. L'âge des abeilles au moment de l'échantillonnage affecté significativement les concentrations de protéines solubles dans l'hémolymphe. Les concentrations de protéines ont été significativement plus faible dans 4 jours-abeilles comparativement à jour 7 ou 11, qui ne diffère pas.

_content "> Parmi les 10 acides aminés qui sont essentiels pour les abeilles, tous sauf histidine ont été détectés dans le pollen. Dans la plupart des cas, les concentrations d'acides aminés mesurées en gelée royale étaient plus élevés que dans le pollen (figure 4). Par exemple, les concentrations de leucine et thréonine étaient environ 60% plus élevé en gelée royale rapport avec le pollen, et les concentrations de valine étaient environ 25% plus élevé. Alanine, les niveaux d'acide, glutamine, et la méthionine aspartique étaient aussi plus élevés dans gelée royale que dans le pollen. concentrations d'acides aminés ne diffèrent pas considérablement entre niveaux de phénylalanine ABB et EBB à l'exception de la phénylalanine et la cystéine. étaient environ deux fois plus élevé dans ABB rapport avec soit EBB ou le pollen. concentrations cystéine étaient plus faibles dans EBB par rapport à ABB ou le pollen. tryptophane était le seul acide aminé présent dans des concentrations plus élevées dans pollen que dans EBB ou ABB. Les concentrations de proline dans le pollen et ABB étaient plus élevés que dans EBB.


Figure 1: Comparaisons de pH (A) et les concentrations de protéines solubles (B) dans le pollen et gelée royale faite par l'européenne (EHB) ou africanisée (AHB) les abeilles. Le pH de pollen a été significativement plus élevée que la gelée royale comme déterminé par analyse de variance (F 2,12 = 3,725, p <0,0001) suivi d'un test de comparaison multiple Tukeys W-. La concentration en protéines dans le pollen a été significativement plus élevée que dans gelée royale faite par EHB (EBB) ou AHB (ABB) (F 2,27 = 16,49; p <0,0001). Moyens suivies par la même lettre ne sont pas significativement différente au niveau de 0,05.

Figure 2
Figure 2: Le pourcentage moyen de cells contenant gelée royale qui ont été complètement consommé sur un intervalle de 11 jours par les abeilles en cage. La gelée royale a été faite soit par les abeilles européenne (EHB) ou africanisée (AHB) en utilisant la même source de pollen. Les moyennes ont été estimées à partir des cinq cages de chaque traitement; ceux qui ont la même lettre ne sont pas significativement différente au niveau de 0,05 tel que déterminé par une analyse unidirectionnelle de variance (F 3,16 = 7,3, p = 0,003) et W le test de Tukey. Cette figure a été modifié depuis 25.

Figure 3
Figure 3: La concentration moyenne de protéine dans l'hémolymphe de l'Europe (EHB) ou africanisée (AHB) abeilles gelée royale nourris faite par africanisées (ABB) abeilles européenne (EBB) ou pour 4, 7 et 11 jours Une analyse des mesures répétées de. variance révèlent des différences importantes entre les quatre treagroupes TEMENT (F 3,20 = 19,7, p <0,001). Les niveaux de protéine soluble dans AHB Fed ABB étaient significativement plus élevé que EHB Fed ABB (p = 0,008) ou EBB (p = 0,018). L'âge des abeilles au moment de l'échantillonnage affecté significativement les concentrations de protéines solubles dans l'hémolymphe. Les concentrations étaient significativement plus faibles chez les abeilles jour-4 par rapport à jour 7 (p <0,0001) ou 11 (p = 0,001). Jour 7 et J11 abeilles ne diffèrent pas (p = 0,149). Ce chiffre a été modifié depuis 25.

Figure 4
Figure 4:. Les concentrations d'acides aminés (pg par gramme de gelée royale ou pollen) dans le pollen ou la gelée royale fabriqué à partir de ce EBB gelée royale est faite par les abeilles et européens ABB a été faite par les abeilles africanisées. Tryptophane, la cystéine, la phénylalanine et la proline ont été tracées séparément pour plus de clarté en présentant leurs montants. Ce chiffre a été modifié depuis 25.

Discussion

En utilisant les procédés décrits ci-dessus, nous avons constaté que la gelée royale faite par AHB a été consommé en plus grande quantité à la fois par AHB et EHB. Bien EHB et AHB consommé des quantités similaires de chaque type de gelée royale, AHB avait plus élevés des titres de protéines hémolymphe. Résultats basés sur nos méthodes étaient similaires aux rapports précédents où les niveaux de protéines de l'hémolymphe dans AHB étaient plus élevés que dans EHB si les deux ont reçu la même alimentation 26. En mesurant la consommation d'EBB et ABB, qui ont été consommés à des taux différents à la fois par EHB et AHB, il a été déterminé que la concentration de la protéine de l'hémolymphe dans chaque sous-espèce ne pouvait être soulevée en augmentant la consommation de nourriture. Il semble y avoir un plateau pour hémolymphe concentration de protéines chez les travailleurs d'âge infirmière d'abeille et que le point de départ pour le plateau de jeu est plus élevé dans AHB que EHB.

Il ya plusieurs conditions importantes pour établir des colonies pour la production gelée royale qui permettront d'optimiser le taux de stockage de pollen. Tout d'abord, la colonies besoin cadres de couvain ouvert. Sans couvain ouvert pour nourrir, les travailleurs ne seront pas recueillir beaucoup de pollen. Deuxièmement, la colonie doit être orpheline donc pas de couvain supplémentaire est produite. Brood élevage nécessite de grandes quantités de pollen, et seulement le pollen excédentaire est stockée. Dans les petites colonies établies dans l'EPT, il y aurait peu de pollen pour être stocké sous forme de gelée royale si les zones de ponte ont été en expansion afin colonies doivent être orpheline. Enfin, pour gelée royale à effectuer, le pollen doit être perçue comme charges corbicular et stocké dans des cellules en forme de peigne. Si le pollen est recueilli dans les pièges à pollen, il doit être broyé en une poudre fine avant de le présenter aux abeilles afin qu'ils puissent recueillir que les charges corbicular.

Les méthodes de mesure de la consommation de gelée royale produite qualitative plutôt que des estimations absolues. La seule consommation qui a été compté était lorsque les cellules ont été complètement vidés de pain d'abeille. Une estimation plus précise de la consommation totale de pain d'abeille peut être obtenu en enlevant le BR d'abeilleEAD à partir des cellules et en faire une galette qui pourraient être pesé avant et après la période d'étude. Cependant, nous voulions garder le pain d'abeille dans les cellules afin que les abeilles pouvaient nourrir sur elle comme ils le feraient dans une colonie et peut-être poursuivre le traitement pendant la période d'étude. La différence de poids des sections de peigne avant et après l'étude n'a pas été utilisé comme une estimation de la consommation parce que le poids peut avoir augmenté parce que les abeilles mettent le miel dilué nourris à eux dans certaines cellules.

Les travailleurs peuvent aussi ont ajouté une partie de la miel dilué au pain d'abeille. Pour ces raisons, les cellules contenant des quantités approximativement égales de pain d'abeille avant et après la période d'alimentation ont été comptées et générer une mesure qualitative. Pourtant, il y avait une différence frappante entre les deux types de gelée royale dans le nombre de cellules vides ABB comptés rapport à EBB après 11 jours.

Déterminer quand le pollen stocké devient gelée royale peut être difficult parce que les abeilles ajoutent continuellement pollen cellules. Les colonies dans lesquelles les producteurs gelée royale ont été établis avec cadres de couvain ouvert pour les abeilles seraient rassembler le pollen. Cependant, les colonies étaient orpheline donc il y avait des larves pour nourrir que pendant environ neuf jours après la colonie a été établie. Pour le reste de la période de trois semaines lorsque les colonies étaient dans le CFC, le pollen que les abeilles recueillies ont été stockés et convertis en gelée royale. Garder le pollen stocké dans les cellules de peigne pour 11 autres jours où l'alimentent pour les abeilles dans des cages peuvent également ont continué le traitement de pollen gelée royale. La conversion de pollen à pain d'abeille prend environ 7 jours 8. La gelée royale amené à EHB et AHB avait un pH faible et des concentrations de protéines réduites par rapport à la Fed de pollen. Des résultats similaires de changements dans le pollen après la conversion gelée royale ont été rapportés par d'autres 7,10,27. Nos résultats diffèrent des précédents rapports cependant, qu'il y avait des différences de concentrations of certains acides aminés entre gelée royale et le pollen. Les changements dans les concentrations d'acide protéines et d'acides pourraient être dus à l'activité des enzymes protéolytiques, la source de ce qui pourrait être les abeilles elles-mêmes ou les communautés microbiennes établies dans la gelée royale 7,8,28,29.

Les méthodes utilisées pour mesurer la concentration de protéine étaient similaires à celles décrites précédemment pour déterminer les effets de protéines alimentaires sur africanisée et les abeilles européennes 26. Dans le prolongement des méthodes, nous avons pu estimer protéine soluble dans le pollen et gelée royale. Ces méthodes ont généré des résultats similaires aux précédents rapports 7,10,27. Nos résultats fournissent une preuve supplémentaire que AHB assimiler plus efficacement les protéines alimentaires que EHB, et que cela pourrait être un facteur clé dans la domination écologique de AHB dans la plupart des régions où elle a immigré et se établir 30-32.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
waterproof double junction pH spear  Thermo Fisher
Coffee Grinder Mr. Coffee  model 1DS77
Dulbecco's phosphate buffer solution Emd-millipore BSS-1005-B
EIA/RIA polystyrene plate Sigma-Aldrich-Corning CLS3590-100EA
microcapillary pipets Kimble Glass Inc.
Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2  Bio-Rad #500-0202
Spectrophotometer Biotek Synergy HT 
Mass Selective Detector  Agilent 5973N
HLB cartridge
gas chromatograph  Agilent 6930
 gas chromatography column  A J&W Scientific  DB-1701
d4-alanine  Sigma-Aldrich 488917
d23-lauric acid Sigma-Aldrich 451401
13C6-glucose Sigma-Aldrich 389374
Pyridine  Sigma-Aldrich 270970
N,O-Bis (trimethylsilyl)trifluoroacetamide +  
Trimethylchlorosilane (BSTFA + TMCS) Sigma-Aldrich 33148
Perfluorotributylamine (PFTBA) Sigma-Aldrich 442747-U
d39-arachidiac acid Cambridge Isotope 

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References

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Degrandi-Hoffman, G., Eckholm, B., Huang, M. Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers. J. Vis. Exp. (97), e52448, doi:10.3791/52448 (2015).

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