Abstract
خلايا مولر هي الخلايا الدبقية الرئيسية للشبكية العين. من نهاية أقدام تشكل حدود شبكية العين في الأغشية الحد الخارجي والداخلي (ILM)، وبالتزامن مع الخلايا النجمية، pericytes والخلايا البطانية التي وضع حاجز الدم في شبكية العين (BRB). BRB يحد من نقل المواد بين الدم وشبكية العين في حين يتصرف ILM باعتباره الغشاء القاعدي الذي يحدد تشريحيا الحدود بين شبكية العين وتجويف الجسم الزجاجي. وصفها خلايا مولر غير ذات أهمية خاصة لدراسة الحالة المادية للحواجز شبكية العين، وهذه الخلايا هي جزء لا يتجزأ من BRB وILM. وكثيرا ما غيرت كل من BRB وILM في مرض شبكية العين، وهي المسؤولة عن أعراض المرض.
هناك عدة طرق راسخة لدراسة سلامة BRB، مثل فحص الأزرق ايفانز أو تصوير الأوعية فلوريسئين. لكن هذه الأساليب لا تقدم معلومات على مدى BRB نفاذية رس جزيئات أكبر، في نطاق نانومتر. وعلاوة على ذلك، فإنها لا تقدم معلومات عن حالة الحواجز الشبكية الأخرى مثل ILM. لدراسة BRB نفاذية جنبا إلى جنب مع شبكية العين ILM، استخدمنا طريقة مقرها AAV أن يقدم معلومات عن نفاذية BRB إلى الجزيئات الكبيرة في حين تشير إلى حالة ILM والمصفوفة خارج الخلية البروتينات في الحالات المرضية. الخيارين AAV مفيدة لهذه الدراسة: AAV5 وShH10. AAV5 لديه انتحاء الطبيعي لخلايا مستقبلة للضوء ولكن لا يمكن أن يحصل عبر لشبكية العين الخارجية عندما تدار في الجسم الزجاجي عندما ILM غير سليمة (أي في البرية من نوع شبكية العين). ShH10 لديه انتحاء قوي نحو الخلايا الدبقية، وسوف تسمية انتقائي الدبقية مولر في كل من شبكية العين السليمة والمريضة. ShH10 يوفر توصيل الجينات أكثر كفاءة في شبكية العين حيث تم اختراق ILM. تسلط هذه الأدوات الفيروسية إلى جانب المناعية و-DNA الدم تحليل الضوء على حالة الحواجز الشبكية في المرض.
Introduction
خلايا مولر هي العنصر الدبقية الرئيسي للشبكية العين. شكليا، فإنها تمتد شبكية العين شعاعيا وendfeet بهم، في اتصال مع الجسم الزجاجي، مواجهة ILM والمكونات السرية لهذه الأخيرة. وILM هو الغشاء القاعدي تتكون من حوالي عشرة مختلفة البروتينات المصفوفة خارج الخلية (laminin، أجرين AGRIN، perlecan، nidogen، والكولاجين والعديد من البروتيوغليكان كبريتات الهيبارين). خلال التنمية، وجودها لا غنى عنه لتكون الأنسجة الشبكية، والملاحة من المحاور البصرية، وبقاء خلايا العقدة 1-3. ومع ذلك، ILM هو غير اساسي في شبكية العين الكبار، ويمكن إزالتها جراحيا في بعض الأمراض دون التسبب في اضرار في شبكية العين 4. في العلاج الجيني، ويصبح هذا الغشاء حاجز مادي لالتنبيغ كفاءة شبكية العين باستخدام AAVs عن طريق الحقن intravitreal 5.
من خلال تشجر واسعة من العمليات، وخلايا مولر توفر سوبو الغذائية والتنظيميRT إلى كل من الخلايا العصبية للشبكية وخلايا الأوعية الدموية. وتشارك خلايا مولر أيضا في تنظيم التوازن في شبكية العين، في تشكيل وصيانة BRB 6. منعطفات ضيقة بين الخلايا البطانية الشعرية الشبكية، مولر الخلايا، الخلايا النجمية وpericytes تشكل BRB. BRB يمنع بعض المواد من دخول retina.In أمراض كثيرة مثل اعتلال الشبكية السكري، وانسداد الوريد الشبكي وأمراض الجهاز التنفسي، ونقص الأكسجين لشبكية العين يسبب تسرب من خلال BRB 7-9. ويرتبط هذا التمزق مع زيادة في نفاذية الأوعية الدموية مما يؤدي إلى وذمة وعائية المنشأ، انفصال الشبكية وتلف شبكية العين.
وترتبط خلايا مولر بإحكام مع الأوعية الدموية والغشاء القاعدي، ولعب دورا هاما في كل من BRB وILM النزاهة. ونتيجة لذلك، واصفة الخلايا الدبقية مولر غير ذات أهمية خاصة لدراسة الحالة المادية لهذه الحواجز الشبكية.
كلاسيكيحليف، ويقاس BRB النفاذية باستخدام الفحص الأزرق ايفانز تتكون من حقن النظامية ايفانز صبغة زرقاء، الذي يربط غير تساهميا لألبومين البلازما. ويقيس هذا الاختبار تسرب الزلال (البروتين من حجم متوسط، ~ 66 كيلو دالتون) من الأوعية الدموية في شبكية العين (انظر بروتوكولات القسم 5) 10. بدلا من ذلك، تسرب الأوعية الدموية يمكن تصور من قبل تصوير الأوعية مضان شبكية العين مما يدل على تسرب فلوريسئين (جزيء صغير، ~ 359 دا؛ انظر بروتوكولات القسم 6) 11. ومع ذلك، على حد سواء أساليب تسمح تقييم نفاذية BRB إلى جزيئات صغيرة والبروتينات لكنها لا توفر المعلومات حول سلامة ILM.
وبالتالي، لدراسة BRB النفاذية، واستخدمنا طريقة مقرها AAV أن يعطي معلومات عن نفاذية BRB لجزيئات أكبر (على سبيل المثال، والجسيمات AAV، 25 قطرها نانومتر). في الواقع، يمكن أن أسلوبنا كشف عن وجود AAV التحوير في الدم، الأمر الذي من شأنه أن يوحي بأن ~ الجسيمات 25 نانومتر قطر من شأنهتكون قادرة على التسلل إلى مجرى الدم. يوفر هذا الأسلوب أيضا معلومات عن هيكل ILM والبروتينات المصفوفة خارج الخلية في الحالات المرضية. الخيارين AAV مفيدة لهذه الدراسة: AAV5 وShH10. حقن Subretinally، AAV5 لديه انتحاء الطبيعي لخلايا مستقبلة للضوء في شبكية العين والظهارة الصبغية 12 ولكن لا يمكن أن يحصل عبر لشبكية العين الخارجية عندما تدار في الجسم الزجاجي في البرية من نوع شبكية العين مع ILM سليمة 5،13. ShH10 هو البديل AAV التي تم تصميمها خصيصا لاستهداف الخلايا الدبقية على الخلايا العصبية 14،15. ShH10 التسميات بشكل انتقائي خلايا مولر في كل من شبكية العين السليمة والمريضة مع زيادة الكفاءة في شبكية العين مع الحواجز المعرضة للخطر (16). هذه الأدوات الفيروسية إلى جانب immuhistochemistry وتحليل DNA الدم توفر معلومات عن حالة الحواجز الشبكية ومشاركتها في مرض (الشكل 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويهتم جميع الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة لوالتعامل معها وفقا لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية.
1. إنتاج المؤتلف AAV (rAAV) بواسطة عابر ترنسفكأيشن من كلوة-293 خلايا 17،18
ملاحظة: انظر مكلور C، إن الرب (2011) 19.
- تنقية مستحضر على نطاق واسع بلازميد (على الأقل 1 ملغ / مل) من البلازميدات ناقلات AAV. استخدام 3 البلازميدات. البلازميد AAV المساعد تحمل تكرار وقفيصة الجينات دون AAV مقلوب محطة يكرر وائح الاتصالات الدولية، والكاسيت التعبير التحوير تحمل أحالت AAV ITR باسم البلازميد نقل، والبلازميد توريد الجينات اتش المساعد E2، E4، والجينات VA RNA المشار باسم pHELPER.
- 293 بالنقل الخلايا مع هذه البلازميدات 3 باستخدام polyethyleneimine (أو غيرها من كاشف ترنسفكأيشن). فوق 80٪ من كفاءة ترنسفكأيشن هو ضروري لالسادس جيدعائدات راؤول.
- تنقية AAV المؤتلف من 293 لست] خلية على التدرج iodixanol. ويستخدم 15٪، 25٪، 40٪، و 60٪ iodixanol للحصول على التدرج. جمع 40٪ iodixanol جزء التي تحتوي على جزيئات AAV، والتركيز على جزء بعد تنبيذ فائق ب 500،000 x ج لمدة 1 ساعة وعازلة الصرف مقابل PBS (الفوسفات مخزنة المالحة) مع 0.001٪ Pluronic.
- لتحديد الفيروسي عيار 20 الجيني، إجراء الدناز ProteinaseK هضم تليها QPCR. الاشعال إلى الأمام وعكس تضخيم المنطقة 62 بي بي تقع في AAV2 ITR. لمعيار البلازميد، هو المسمى التحقيق مع FAM، ولها ثقب أسود فاكهه تقضي (BHQ).
- تنفيذ QPCR (الكمي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل) في الحجم النهائي من 25 ميكرولتر باستخدام 340 نانومتر عكس ITR التمهيدي، 100 نانومتر ITR إلى الأمام التمهيدي، 100 نانومتر AAV2 ITR التحقيق، 0.4 ملي dNTPs، 2 مم MgCl2، 1X البلاتين طق العازلة، 1U البلاتين طق و 5 قالب ميكرولتر (قياسي، عينة وأي سيطرة قالب).
- إلىالمعيار، واستخدام البلازميد لترنسفكأيشن في 7 × 10 أضعاف التخفيفات المتسلسلة (5 ميكرولتر من كل 2 × 09-02 أكتوبر × 10 3 الجينوم / مل مما أدى إلى تركيز النهائي من 10 أكتوبر - 10 أبريل الجينوم / مل).
- بدء البرنامج خطوة تمسخ الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تليها 40 دورة من تمسخ في في 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة والصلب / تمديد في 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير أو في -20 ° C لفترات التخزين الطويلة.
2. Intravitreal حقن AAV
- تخدير الفئران C57BL6J مع الكيتامين (50 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) والتحقق من فقدان المنعكس التقويمي، منعكس الانسحاب وذيل قرصة استجابة مما يدل على أن التخدير المناسب. تمدد التلاميذ من خلال تطبيق القرنية من neosynephrine 5٪ و 0.5٪ mydriaticum قطرات العين. استخدام مرهم التعليم والتدريب المهني على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
- تمرير G disposab متناهية الصغر 30لو الإبرة من خلال خط الاستواء وبجانب حوف، في تجويف الجسم الزجاجي (انظر تشيو K، إن الرب (2007) 21). حقن 1 ميكرولتر الأسهم التي تحتوي على 1-4 × 10 11 نائب الرئيس للShH10-GFP أو AAV5-GFP مع الملاحظة المباشرة من الإبرة في وسط تجويف الجسم الزجاجي (الشكل 1). استخدام عين واحدة كعنصر تحكم للتجارب ILM. حقن كلتا العينين للتجارب BRB. تطبيق العلاج الموضعي المضادة للالتهابات ومضادة للجراثيم في عيون حقن.
- تمدد التلاميذ مع neosynephrine وقطرات العين mydriaticum للتصوير. أداء الامتحانات قاع مع كاميرا قاع العين لمتابعة GFP (البروتين الأخضر نيون) التعبير 1 أسبوع، 2 أسابيع، 1 شهر، و2 أشهر بعد الحقن intravitreal (الشكل 1). التضحية الفئران عن طريق الاستنشاق CO 2 1-2 أشهر بعد الحقن.
3. المناعية
- لcryosections شبكية العين (الشكل 1)، تشريح عيون منزوعة النواة لإزالة لENS والقرنية، والغمر الإصلاح في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 1 ساعة.
- Cryoprotect عيون ثابتة سابقا في 10٪ سكروز لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، و 20٪ السكروز لساعة أخرى في درجة حرارة الغرفة. Cryoprotect في 30٪ من محلول السكروز، بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تجميد وتضمين eyecups في تضمين الراتنج مثل البرد المصفوفة. جعل 10 ميكرون cryosections وجبل على الشرائح معاملة خاصة لأقسام الأنسجة المجمدة والتي تعمل على تحسين الالتزام الأنسجة خلال تلطيخ.
- Permeabilize أقسام مع 0.1٪ تريتون X100 في برنامج تلفزيوني 7.4 درجة الحموضة لمدة 5 دقائق. غسل 2X في برنامج تلفزيوني وكتلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني مع 1٪ BSA، 0.1٪ توين 20.
- لflatmounts الشبكية (الشكل 1)، وتحديد العيون منزوعة النواة في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 15 دقيقة لتسهيل تشريح.
- في 15-30 دقيقة، وتشريح العين لإزالة القرنية والعدسة. فصل الشبكية من الظهارة الصبغية الشبكية (RPE) والصلبة عن طريق خفض حول مشرشر أورا والعصب البصري. تزج في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 30 دقيقة أخرى لإصلاح الشبكية وبروتين فلوري في خلايا الشبكية transduced (يجب ألا يتجاوز تثبيت 24 ساعة). يغسل 5 دقائق في برنامج تلفزيوني العقيمة، ودرجة الحموضة 7.4.
- تغيير PBS إلى عرقلة العازلة (PBS مع 1٪ BSA، 2٪ الماعز العادي أو مصل حمار، 0.5٪ تريتون X-100)، واحتضان في عرقلة العازلة إما 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية خلال الليل.
- احتضان الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية في عرقلة العازلة إما 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية خلال الليل. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: الأجسام المضادة المستخدمة هي كما يلي: مكافحة laminin (1 / 1،000) وصفها ILM، استنساخ مكافحة رودوبسين 4D2 (1/500) قضبان وضع العلامات، ومكافحة الجلوتامين مخلقة استنساخ GS-6 (1 / 1،500) وضع العلامات الخلايا مولر ، السلطة الوطنية الفلسطينية كتين (1/40) المخاريط وضع العلامات. - احتضان الأنسجة مع 1: 500 التخفيف من الأجسام المضادة الثانوية مترافق فلور اليكسا في عرقلة العازلة لمدة 1 ساعة (cryosections) أو 2 ساعة (flatmounts) في غرفة تيمبيrature ومحمية من الضوء. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني.
- جعل تخفيف تخفيضات لشبكية العين وflatmount وضعها على شريحة زجاجية مع إما مستقبلة للضوء في شبكية العين أو الخلايا العقدية (RGC) الجانب متجهة لأعلى. إضافة mountingmedium مائي، وتطبيق ساترة وتخزينها في 4 ° C.
- أداء المجهري متحد البؤر على الليزر المسح المجهر متحد البؤر. الحصول على صور بالتتابع، سطرا سطرا، للحد من الإثارة والحديث المتبادل الانبعاثات. تحديد حجم الخطوة وفقا لنظرية أخذ العينات نيكويست-شانون. استخدام الإعدادات التي تقلل من التعرض بكسل مشبعة في الصور النهائية. عملية صور 12 بت مع فيجي، ومشروع Z-أقسام على متن طائرة واحدة باستخدام الحد الأقصى لكثافة تحت وظيفة Z-المشروع وأخيرا تحويل إلى 8 بت وضع الألوان RGB.
4. تحليل PCR من ماوس عينات الدم
- ضخ 100 ميكرولتر الأسهم التي تحتوي على 1-4 × 10 11 الجسيمات من AAV-GFP في الوريد القضيب من الفئران C57BL6J تخدير (5٪ من الأيزوفلورينلتحريض في غرفة وثيقة و 2.5٪ من الأيزوفلورين من خلال مخروط الأنف أثناء الجراحة) باستخدام حقنة الأنسولين مع غاية في الدقة 6 مم إبرة. وهذا الحيوان بمثابة مراقبة إيجابية تعميم جزيئات AAV.
- الدم عينة من ذيل فأر قبل الحقن و3 ساعة و 24 ساعة، 2 أيام، و 3 أيام بعد ShH10 حقن intravitreal أو بعد حقن intrapenile (الشكل 1). ويتم جمع حوالي 10-20 ميكرولتر في أنابيب الهيبارين. التضحية الفئران عن طريق الاستنشاق CO 2 بعد الانتهاء من هذا الإجراء.
- استخراج الحمض النووي الجيني من عينات الدم باستخدام عدة استخراج اختيارك.
- أداء PCR التضخيم من الحمض النووي الجيني. لهذا البروتوكول استخدام الزوج التمهيدي التالية: GFP، بمعنى 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 "، العقاقير 5'-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3". تم تنفيذ برنامج PCR التالية: 95 ° C 2 دقيقة (1 دورة)؛ 95 ° C و 45 ثانية، 55 ° C 1 دقيقة، 72 ° C و 45 ثانية (30 دورات)؛ 72 ° C 5 دقائق (1 دورة)؛4 ° C الانتظار.
5. اختياري ايفانز الطريقة الأزرق
ملاحظة: تحديد نفاذية الأوعية الدموية عن طريق قياس تسرب الزلال من الأوعية الدموية في شبكية العين باستخدام طريقة ايفانز الأزرق 10.
- إعداد ايفانز الأزرق صبغ خلال انحلال في حل العادي المالحة (6 ملغ / مل)، صوتنة لمدة 5 دقائق في نظافة بالموجات فوق الصوتية، والترشيح من خلال 5 ميكرون التصفية.
- تخدير الفئران C57BL6J (الأيزوفلورين استنشاق، راجع الخطوة 4.1)، والتحقق من فقدان المنعكس التقويمي، منعكس الانسحاب واستجابة ذيل قرصة يشير إلى التخدير السليم، وحقن ايفانز الأزرق (45 ملغ / كلغ) عن طريق الوريد القضيب (الشكل 1). تأكد من أن الكفوف، كمامة، وآذان الفئران تصبح زرقاء بوضوح التالية ايفانز حقن الأزرق، مؤكدا امتصاص وتوزيع الصبغة.
- تخدير الفئران C57BL6J 3 ساعة بعد حقن الصبغة مع الكيتامين (50 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) والتحقق من فقدان rightinز منعكس يشير إلى التخدير المناسب. عينة intracardially حوالي 500 ميكرولتر من الدم في أنابيب الهيبارين ويروي الفئران لمدة 2 دقيقة عبر البطين الأيسر مع العازلة سيترات (0.05 M، ودرجة الحموضة 3.5؛ حل 7.8 غرام من حمض الستريك و 3.8 غرام من سيترات الصوديوم في 1 لتر من الماء المقطر) قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية لمنع تضيق الأوعية. وضحى الفئران عن طريق نضح.
- بعد نضح، استأصل وبعناية تشريح كلتا العينين تحت مجهر التشغيل لجمع شبكية العين (انظر القسم 3.2). شبكية العين الجافة في المبخر الطرد المركزي ليلة وضحاها، تزن، واستخراج صبغة زرقاء ايفانز التي يحتضنها شبكية العين مع 100 ميكرولتر من الفورماميد لمدة 18 ساعة على 65 درجة مئوية مع اهتزاز (100 x ج). عينات الطرد المركزي شبكية العين في 30K أنابيب مرشح أوميغا في 20،798.5 x ج لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية، وعينات الدم أجهزة الطرد المركزي في 20،798.5 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- استخدام كل supernatants لقياس الامتصاصية. تحديد الامتصاصية من كل عينة عن طريق طرح أقصى الامتصاصية FOص ايفانز الأزرق في 620 نانومتر إلى الحد الأدنى الامتصاصية في 740 نانومتر. حساب ايفانز تركيز الأزرق في البلازما وشبكية العين من منحنى مستوى ايفانز الأزرق في الفورماميد. التعبير عن نفاذية BRB في ميكروليتر من ايفانز الأزرق في كل غرام من شبكية العين الجافة في الساعة (ميكرولتر بلازما / ز الشبكية بالوزن الجاف / ساعة).
6. اختياري فلوريسئين تصوير الأوعية الدموية
ملاحظة: التسرب من الأوعية الدموية في شبكية العين في الفئران يمكن تصور عن طريق الحقن داخل الصفاق من فلوريسئين الصوديوم.
- تخدير الفئران C57BL6J (الأيزوفلورين استنشاق، راجع الخطوة 4.1) وتمدد التلاميذ مع قطرات العين (neosynephrine وmydriaticum). استخدام مرهم التعليم والتدريب المهني على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
- حقن داخل الصفاق 0.01-0.02 مل من 10٪ فلوريسئين الصوديوم في 0.1 مل ملحي معقم لتصوير الأوعية فلوريسئين.
- جمع الصور من كلتا العينين بعد الحقن باستخدام كاميرا قاع العين. التضحية الفئران عن طريق الاستنشاق CO 2 بعد المواليالتعريف الشخصي إجراءات.
ملاحظة: 20 ثانية ضرورية للسفن الشبكية لتصبح مرئية على الأوعية. الصور يجب أن يتم القبض بين 3-10 دقيقة كحد أقصى بعد حقن فلوريسئين. بقع التسرب (إذا كان موجودا) يمكن ملاحظتها بعد 2.5 دقيقة. في نقطة زمنية لاحقة يتم فقدان جودة الصورة بسبب فلوريسئين الصوديوم نزع فتيله في الصور زجاجي، وبالتالي الوحيدة التي تم الحصول عليها بعد فترة قصيرة تستخدم للتحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ونحن نتوقع زيادة التنبيغ شبكية العين من مولر الخلايا الدبقية باستخدام ShH10 إذا يظهر نموذج حيواني الاضطرابات في هيكل ILM (الشكل 2A - B). على سبيل المثال، لقد أظهرنا أنه في غياب Dp71 والأهداف ShH10 وجه التحديد ولكن بشكل أكثر كفاءة الخلايا الدبقية مولر عن طريق الحقن intravitreal، مشيرا إلى زيادة نفاذية ILM في هذا الخط الماوس مقارنة البرية من نوع الفئران 16 (الشكل 2C - F).
ويمكن أيضا أن تستخدم AAV5 كمؤشر على ILM النفاذية. AAV5، غير فعالة عن طريق الحقن intravitreal في البرية من نوع الفئران، ويصبح فعالا بقوة في إيصال الجينات إلى خلايا مستقبلة للضوء في شبكية العين الفئران مع الحواجز المعرضة للخطر مثل الفئران Dp71 فارغة 16 أو في الإنحطاط الشبكية الأخرى 22 (الشكل 2G - H). وهذا يؤكد أيضا على الفوضى ILM والزياده نفاذية المحتملةه في المصفوفة خارج الخلوية المحيطة الخلايا العصبية للشبكية.
وجدنا أن، وانهيار BRB من الفئران Dp71 فارغة لا يزال انتقائي لجزيئات AAV منذ تم العثور على أي أثر لAAV في عينات دم حقن intravitreally Dp71-اغية الفئران 16 (الشكل 3).
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للبروتوكول العام بعد إنتاج AAV، يتم حقن جزيئات في الجسم الزجاجي أو في الوريد القضيب لتخدير الفئران البالغة. يتم تنفيذ قاع الصور مع الكاميرا ميكرون الثالث لمتابعة التعبير GFP. ويتم تحليل نمط GFP التعبير على cryosections شبكية العين وflatmounted شبكية العين وذلك بفضل المناعية والصور مبائر. ويتم تقييم مرور AAV من خلال BRB عن طريق تحليل PCR على عينات الدم يسيل من الفئران المحقونة intravitreally أو intrapenially، طن أجل كشف عن وجود تسلسل GFP، مؤشر على وجود الجسيمات AAV إلى مجرى الدم.
الشكل 2: ILM نفاذية لAAV تنبيغ الصور متحد البؤر من flatmounted من النوع البري وشبكية العين Dp71 الصفرية المسمى مع الأجسام المضادة لعموم laminin (A، B). (شريط نطاق و: 50 ميكرون). الصور قاع العين تبين GFP التعبير (C، D). Flatmounted شبكية العين بعد شهر واحد ShH10-GFP حقن intravitreal (E، F). ثلاثة إعادة الأبعاد (E *) من المنطقة المشار إليها بعلامة النجمة في E الاداء transduced مولر الخلايا الدبقية باللون الأخضر والأحمر الخلايا النجمية في (مكافحة GFAP الضد). Flatmounted شبكية العين بعد شهر واحد حقن intravitreal من AAV5-GFP (G، H) (شريط مقياس: 500 ميكرون). صورة مبائر من المنطقة المشار إليها بعلامة النجمة في H تظهر مبصرات transduced في الخضراء ومخروط شرائح الخارجية في الحمراء (PNA كتين تلطيخ) (H *). العمود الأيسر يبين النتائج من النوع البري شبكية العين الماوس ويظهر العمود الأوسط من شبكية العين الماوس النتائج Dp71 الصفرية. مخطط (I) يمثل AAV تنبيغ الشبكية مع الحواجز للخطر كما الشبكية Dp71 الصفرية، من خلال زجاجي. الاختصارات: السيرة الذاتية والأوعية المشيمية. RPE، الظهارة الصبغية الشبكية. أطباء لحقوق الإنسان، خلايا مستقبلة للضوء (قضبان ومخاريط)؛ MGC، مولر الخلايا الدبقية. HC، والخلايا الأفقية. قبل الميلاد، وخلايا القطبين. AC، وخلايا عديم الاستطالات. M، الخلايا الدبقية الصغيرة. EC، والخلايا البطانية. P، pericytes. GC، خلايا العقدة. A، الخلايا النجمية. ILM، داخل الغشاء المحدد. V، زجاجي. AAV، فيروس الغدة المرتبطة. (إعادة طباعة بإذن من فاكا وآخرون، الدبقية (2013) 16، # 3483740951391).
tp_upload / 52451 / 52451fig3.jpg "/>
الشكل 3: نفاذية BRB إلى جزيئات AAV PCR التضخيم من GFP التحوير المستخرج من عينات الدم الماوس. الفئران إما حقن intravitreally (IVT) مع ShH10-GFP أو intrapenially (IP) مع AAV-GFP في أوقات مختلفة بعد الحقن. حارة 5-18، الأعداد الفردية لالبرية من نوع الفئران وحتى الأرقام بالنسبة للفئران Dp71 الصفرية. حارة 2، 1 نانوغرام من البلازميد AAV، PTR-SB-smCBA-hGFP. حارة 3، المياه، الممرات 5-6، DNA الدم قبل الحقن. الممرات 7-8، 3 ساعة بعد IVT. الممرات 9-10، 24 ساعة بعد IVT. الممرات 11-12، 24 ساعة بعد IP. الممرات 13-14، 48 ساعة بعد IVT. الممرات 15-16، 48 ساعة بعد IP. الممرات 17-18، 72 ساعة بعد IVT. الممرات 19-20، 72 ساعة بعد IP. الممرات 1 و 4، إينفيتروجن على نطاق وسلم (100 بي بي): 100، 200، 300، 400، 500، 600، 700، 800، 1،000، 1،500، 2،000، 3،000 سنة مضت. (إعادة طباعة بإذن من فاكا وآخرون، الدبقية (2013) 16، # 3483740951391).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وBRB ينظم تبادل الجزيئات بين الدم وشبكية العين. ويرتبط انهيارها يعانون من أمراض مختلفة مثل اعتلال الشبكية السكري أو الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD). أظهرنا مؤخرا أنه في الدستروفين خروج المغلوب الماوس، والذي يعرض نفاذية BRB، تصبح الشبكية أكثر تساهلا لتوصيل الجينات بوساطة ناقلات فيروسية الغدة المرتبطة (AAV). ومع ذلك، على الرغم من BRB الجسيمات نفاذية AAV حقن intraocularly البقاء محصورة في حجرة العين في هذا النموذج. نتائجنا تشير إلى أن العلاج الجيني للأمراض التي تعرض BRB نفاذية لا تمثل مخاطر إضافية من الآثار الجانبية الجهازية. وعلاوة على ذلك، فإنها تدعم حقيقة أن الحواجز الأخرى مثل ILM تصبح خطر أثناء المرض في شبكية العين مما يتيح الوصول بشكل أفضل إلى الجسيمات الفيروسية. النتائج التي توصلنا إليها تقودنا إلى الاعتقاد بأن الجينات مراسل ترميز AAV هو أداة ممتازة لدراسة نفاذية BRB وسلامة ILM في النماذج الحيوانية للمرض في شبكية العين. Particularly، وShH10 AAV البديل، التي تصف على وجه التحديد مولر الدبقية يمكن أن تستخدم كأداة لتسمية الدبقية الشبكية وتقديم تقرير عن حالة الشبكية ردا على المرض. سوف ShH10 تسمية انتقائي الدبقية مولر في كل من شبكية العين السليمة والمريضة. ومع ذلك، فإن كلا ShH10 وAAVs أخرى توفر توصيل الجينات أكثر كفاءة في شبكية العين مع حواجز للخطر.
بعض الخطوات الهامة في تطبيق البروتوكولات المذكورة أعلاه هي (1) تطوير البراعة اليدوية لأداء أسلم حقن intravitreal، و (2) إصلاح الأنسجة بشكل صحيح قبل وبعد تشريح. في دراسة حواجز شبكية العين، وحقن intravitreal يجب تنفيذها بشكل جيد وهذا هو - دون لمس العدسة أو الشبكية. إتلاف عدسة أو فصل شبكية العين يؤثر على نفاذية 23،24 BRB. بالإضافة إلى ذلك الضرر عدسة يعوق التصوير قاع. يمكن لمس شبكية العين تمزق ILM وتلف بنية شبكية العين. لتجنب لمس شبكية العين، وجتربةmenter يجب مراقبة غيض من حقنة هاملتون في منتصف تجويف الجسم الزجاجي، أمام الشبكية. يمكن تضمين صبغة غير سامة (مثل الفينول الأحمر أو فلوريسئين) في الحل الفيروسية للمساعدة في مراقبة حقن السوائل في الجسم الزجاجي. تلف شبكية العين ويمكن ملاحظة بسهولة أثناء التصوير قاع بعد إجراء الحقن. خطوة حاسمة أخرى هي تثبيت للأنسجة بعد التوصل إلى مستويات التعبير كافية. بعد استئصال، والعيون يجب أن تكون مغمورة على الفور في المخزن تثبيتي وقبل permeabilization الأنسجة لتثبيت الثاني هو ضروري من أجل منع تسرب GFP. ويمكن أن يكون من المفيد شق القرنية قبل غمر العين بأكملها في تثبيتي - وهذا سيعطي تثبيتي فرصة لتتخلل في الجسم الزجاجي. هذه الخطوة يمكن أن تزيد من استقرار النسيج الكلي.
وأخيرا، من المهم أيضا لحقن ما يكفي من جزيئات AAV لتنبيغ كفاءة شبكية العين ومراقبة GFP السابقPRESSION على الصور قاع العين. مبلغ الأمثل للجزيئات AAV حوالي 10 10 -10 11 VG لكل عين، أقل من 10 10 الجسيمات ولم يلاحظ التعبير GFP دائما تصوير قاع العين.
هذه التقنية سوف لا يعطي إمكانية لمراقبة مباشرة ILM أو الأوعية الدموية تحت BRB. ومع ذلك فإنه يوفر وسيلة لدراسة حواجز شبكية العين والتعديل في الحالات المرضية، في الطريقة التي كانت في السابق غير ممكن باستخدام الفحص الأزرق ايفانز وتصوير الأوعية فلوريسئين. باستخدام AAVs مع خصائص محددة التنبيغ الشبكية، فمن الممكن الحصول على فهم أفضل للحالة الشبكية فيما يتعلق الخلايا الدبقية، مصفوفة من خارج الخلية وILM. بعد إتقان هذه التقنية، يمكن للمرء اختبار فعالية الاستراتيجيات العلاجية وتأثيرها على BRB والنفاذية في شبكية العين ويذهب نحو فهم أفضل لتطور المرض وإمكانية لاستعادة الأوضاع الطبيعية بعد ط العلاجغ نموذج الفأر من مرض شبكية العين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0.5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight - 8.5 cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| curved Vanna scissor | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
