Abstract
Müller细胞是视网膜的主要神经胶质细胞。其最终的脚形成的视网膜在外侧和内界膜（ILM）的范围内，并在与星形胶质细胞，周细胞和内皮细胞结合它们建立血 - 视网膜屏障（BRB）。 BRB限制了血液和视网膜之间的物质运输而在ILM充当基底膜限定组织学视网膜和玻璃体腔之间的边界。标记Müller细胞是特别相关，研究视网膜屏障的物理状态，因为这些细胞是BRB和ILM的一个组成部分。既BRB和ILM经常改变视网膜病和负责疾病症状。
有几种公认的方法来研究的BRB的完整性，如Evans蓝测定法或荧光血管造影。然而，这些方法不提供关于BRB渗透性吨的范围内的信息Ø较大的分子，在纳米范围内。而且，它们不提供对其他视网膜屏障如在ILM的状态信息。研究BRB渗透性沿着视网膜ILM，我们使用的AAV基础的方法，可提供对渗透性BRB对较大分子虽然表示在疾病状态在ILM和胞外基质蛋白的状态的信息。两个变种AAV对于这样的研究有用：AAV5和ShH10。 AAV5具有天然趋光感受器，但它不能得到跨越到外视网膜给药时进入玻璃体时在ILM是完整的（ 即，在野生型视网膜）。 ShH10具有朝向胶质细胞强烈的取向和在健康和患病的视网膜将选择性标记米勒胶质细胞。 ShH10提供视网膜更高效的基因传递，其中ILM受到损害。再加上免疫和血液DNA分析这些病毒工具揭示到的视网膜疾病障碍的状态。
Introduction
Müller细胞是视网膜的主要神经胶质成分。形态，它们跨越视网膜径向和它们endfeet，与玻璃体接触，面对在ILM和后者的秘密分量。在ILM是一种基底膜约十个不同的细胞外基质蛋白（层粘连蛋白，聚集蛋白，串珠素，巢蛋白，胶原蛋白和一些硫酸肝素蛋白聚糖）组成。在开发过程中，它的存在是不可或缺的视网膜组织发生神经节细胞1-3，视神经轴突的导航和生存。但是，ILM是非本质的成人视网膜，可以在某些病理手术切除，而不会造成视网膜损伤4。在基因治疗中，此膜变成为使用自动增值服务的视网膜高效转导通过玻璃体内注射5的物理屏障。
通过他们的流程的广泛树枝状，Müller细胞提供营养和监管suppoRT既视网膜神经细胞和血管细胞。 Müller细胞也参与视网膜动态平衡的调节，在BRB 6的形成和维持。紧密连接视网膜毛细血管内皮细胞之间，Müller细胞，星形胶质细胞和周形成BRB。 BRB防止某些物质进入retina.In许多疾病，如糖 尿病性视网膜病变，视网膜静脉阻塞和呼吸系统疾病，视网膜缺氧会导致通过BRB 7-9泄漏。这种断裂是与增加血管通透性，导致血管性水肿，视网膜脱离和视网膜损伤相关联。
Müller细胞被紧密地与血管和基底膜相关联，打在两BRB和ILM完整性中起重要作用。因此，标记缪勒胶质细胞是特别相关的这些视网膜屏障的物理状态的研究。
经典同盟，BRB渗透性是用伊文思蓝测定法，包括全身性注射Evans蓝染料，其结合非共价地与血浆白蛋白的测定。此法测量从血管进入视网膜（见协议第5条）10白蛋白漏出（蛋白质中等大小，〜66 kDa的）。另外，血管渗漏可以通过荧光血管造影视网膜的证明荧光素渗漏进行可视化（小分子〜359达;见协议第6条）11。然而，这两种方法允许BRB渗透性小分子和蛋白质的评估，但它们不提供关于在ILM的完整性信息。
因此，为了研究BRB渗透性，我们使用的AAV基础的方法，让上BRB渗透性至较大的分子（ 例如，AAV颗粒，25纳米的直径）的信息。事实上，我们的方法可以检测出的AAV转基因的存在于血液中，这将表明，〜25 nm的直径的颗粒会能够渗透到血液中。这种方法还提供了在病理条件下在ILM和细胞外基质蛋白质的结构信息。两个变种AAV对于这样的研究有用：AAV5和ShH10。视网膜下注射，AAV5具有天然向性为感光细胞和视网膜色素上皮细胞12，但是它不能获得跨越到外视网膜给药时进入玻璃体在野生型视网膜中有完整的ILM 5,13。 ShH10是已工程化以特异性靶向神经胶质细胞在神经元14,15的AAV变种。 ShH10选择性标记在健康和患病的视网膜与视网膜增加的效率受损障碍16Müller细胞。再加immuhistochemistry和血液DNA分析这些病毒的工具提供的视网膜屏障的状态和它们在疾病的参与（ 图1）的信息。
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Protocol
在这项研究中使用的所有动物根据ARVO声明动物在眼科和视觉研究中使用的照顾和处理。
1.生产重组腺相关病毒（腺相关病毒）由HEK-293细胞17,18的瞬时转染的
注：请参阅麦克卢尔C，朱庇特（2011）19。
- 纯化大规模质粒制备的AAV载体质粒（至少1毫克/毫升）。使用3质粒。所述AAV辅助质粒携带复制和衣壳基因 未经AAV反向末端重复的ITR，所述转基因表达盒携带AAV ITR称为转移质粒，并且该质粒供给腺病毒辅助基因的E2，E4和VA RNA基因所指为pHELPER。
- 转染293细胞使用聚乙烯亚胺（或其他转染试剂）这3个质粒。高于80％的转染效率是必要的良好的六RAL产量。
- 净化从293细胞裂解液重组AAV上的碘克沙醇梯度。 15％，25％，40％，和60％的碘克沙醇被用于获得梯度。收集含AAV颗粒的40％的碘克沙醇馏分，浓缩超速离心后的级分在500000×g离心对PBS与0.001％的Pluronic 1小时，缓冲液交换（磷酸盐缓冲盐水）。
- 要确定病毒基因组滴度20，进行DNA酶蛋白酶K消化后QPCR。正向和反向引物扩增位于AAV2 ITR的62 bp的区域。对于质粒的标准，该探针用FAM和具有黑孔猝灭剂（BHQ）。
- 进行定量PCR（定量聚合酶链式反应）中的25微升用340纳米的终体积反向ITR底漆，100nM的正向引物的ITR，100nM的AAV2 ITR探针，0.4毫的dNTPs，2mM的氯化镁，1个白金Taq缓冲液，1U白金Taq和5微升模板（标准，样品和无模板对照）。
- 为的标准中，使用的质粒转染在7×10倍连续稀释液（每2×10 9个至2×10 3产生的最终浓度从10月10日至4月 10日的基因组/毫升的基因组/毫升5微升）。
- 由初始变性步骤在95℃下进行15分钟，随后变性的40个循环的开始的程序，在95℃，1分钟退火/延伸60℃，1分钟。储存在4℃下短期储存，或在-20℃下长期储存。
2.玻璃体内注射AAV的
- 麻醉C57BL6J小鼠用氯胺酮（50毫克/千克）和赛拉嗪（10毫克/公斤），并验证翻正反射时，撤回反射和尾部夹送响应指示一个适当的麻醉的损失。由neosynephrine 5％的角膜应用扩张的学生和mydriaticum 0.5％眼药水。使用上的眼睛兽医药膏，以防止干燥，而在麻醉下。
- 通过超细地下30 disposab乐针穿过赤道旁缘，入玻璃体腔（见邱K，朱庇特（2007）21）。注入1微升原料含有1至4×10 11 VP ShH10-GFP或AAV5-GFP与直接观察在玻璃体腔的中心针（ 图1）。用一只眼睛作为ILM实验对照。注入两只眼睛的BRB实验。对注入的眼睛敷上消炎和抗菌局部治疗。
- 扩张与学生和neosynephrine mydriaticum眼药水成像。执行眼底检查与眼底照相机跟随的GFP（绿色荧光蛋白）的表达1周，2周，1个月，和玻璃体内注射后的2个月（ 图1）。用CO 2吸入1〜2个月后喷射牺牲小鼠。
3.免疫组化
- 视网膜的冷冻切片（ 图1），解剖剜出眼睛去除升在4％多聚甲醛1小时ENS和角膜，并浸泡修复。
- Cryoprotect先前固定的眼睛在10％蔗糖1小时，在室温下，20％的蔗糖为另一小时，在室温下进行。 Cryoprotect在30％蔗糖溶液，过夜，在4℃。冻结和嵌入树脂如低温矩阵嵌入眼罩。使10微米的冰冻切片和安装在滑轨经过特殊处理的冷冻组织切片染色以及在改善组织粘连。
- 透用0.1％的Triton X100的部分在PBS pH 7.4的5分钟。洗涤2次在PBS中，块1小时，在室温下在PBS中以1％BSA，0.1％吐温20。
- 视网膜flatmounts（ 图1），固定摘除眼睛用4％多聚甲醛中15分钟，以方便清扫。
- 在15-30分钟，解剖眼睛去除角膜和晶状体。通过切割周围锯齿缘分离的视网膜色素上皮细胞（RPE）和巩膜视网膜和视神经。沉浸在4％多聚甲醛另外30分钟来固定视网膜和在转导视网膜细胞的荧光蛋白（固定必须不超过24小时）。在无菌PBS，pH 7.4中洗涤5分钟。
- 改变的PBS以封闭缓冲液（PBS中的1％BSA，2％正常山羊或驴血清，0.5％的Triton X-100），并孵育在封闭缓冲液为任一4小时，在室温下或4℃过夜。
- 孵育组织与初级抗体在封闭缓冲液为任一4小时，在室温下，或在4℃下过夜。洗涤3次，用PBS。
注意：是使用的抗体如下：抗层粘连蛋白（1 / 1,000）标记在ILM，抗视紫红质克隆4D2（1/500）标签棒，防谷氨酰胺合成克隆GS-6（1/1500）标签Müller细胞，PNA凝集素（1/40）标签锥。 - 孵育组织用1：500稀释的Alexa Fluor缀合的第二抗体在封闭缓冲液中进行1小时（冷冻切片）或2小时（flatmounts），在室温坦佩叉涂抹并避光。洗涤3次，用PBS。
- 使减轻削减视网膜和flatmount它与上无论是感光或视网膜神经节细胞（RGC）侧朝上载玻片。添加水mountingmedium，应用盖玻片并储存在4℃。
- 执行激光扫描共聚焦显微镜共聚焦显微镜。由线获取图像顺序地，线，以减少激发和发射串扰。根据采样定理确定步长大小。使用曝光设置，最大限度地减少过饱和像素的最终图像。处理的12位图像斐济，项目的Z部分上使用下的Z-项目函数的最大强度并最终转换为8位的RGB色彩模式的单一平面。
小鼠血液样本4. PCR分析
- 注入100μl的原料含有的AAV-GFP的1至4×10 11颗粒进入麻醉C57BL6J小鼠的阴茎静脉（异氟醚的5％用于使用胰岛素注射器用超细6毫米针诱导密切室，并通过在手术过程中一鼻锥异氟烷2.5％）。这种动物将作为循环的AAV颗粒的阳性对照。
- 从鼠尾注射和3小时，24小时，2天，以及之后ShH10玻璃体内注射或intrapenile喷射（ 图1）后第3天前样品的血液。约10-20微升被收集在肝素管。在手术完成之后，牺牲小鼠通过CO 2吸入。
- 提取使用你选择的提取试剂盒血液样本的基因组DNA。
- 执行的基因组DNA的PCR扩增。此协议使用下列引物对：绿色荧光蛋白，有义：5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3'，反义5'-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3'。以下PCR程序进行：95℃2分钟（1个循环）; 95℃45秒，55℃1分钟，72℃45秒（30个循环）; 72°C 5分钟（1周期）;4℃保持。
5.可选埃文斯蓝方法
注：通过测量血管白蛋白漏入使用伊文思蓝法10视网膜量化血管通透性。
- 通过溶解在通过5μm过滤器的生理盐水溶液（6毫克/毫升），超声处理5分钟，在超声波洗涤机，并过滤制备伊文思蓝染料。
- 麻醉C57BL6J小鼠（异氟烷吸入，见步骤4.1），检查翻正反射，撤退反射和尾掐响应，表示适当的麻醉的损失，并通过阴茎静脉（ 图1），注入伊文思蓝（45毫克/千克）。检查爪子，枪口，耳朵小鼠变得清楚蓝色以下注射Evans蓝染料，证实了染料的吸收和分布。
- 注射用氯胺酮（50毫克/千克）和赛拉嗪（10毫克/千克）的染料后麻醉C57BL6J小鼠3小时，并验证rightin的损失克反射表明适当麻醉。样品心内约500微升的血液在肝素管，并通过左心室用柠檬酸盐缓冲液灌注小鼠，持续2分钟（0.05M，pH为3.5;溶解7.8克柠檬酸和3.8克柠檬酸钠在1升的蒸馏水中）预热至37℃，以防止血管收缩。小鼠经由灌注处死。
- 后灌注，剜除，仔细解剖手术显微镜，收集视网膜下两只眼睛（见第3.2节）。在离心蒸发器中干燥视网膜过夜，称重，并通过培养视网膜用100μl甲酰胺中18小时，在65℃振荡（100 XG）提取伊文思蓝染料。在30K的ω过滤管在20,798.5 xg离心2小时，在4℃离心机视网膜样品离心血样在20,798.5 xg离心15分钟，在4℃。
- 使用这两种上清测量吸光度。减去最大吸光度FO测定各样品的吸光度řEvans蓝在620nm到最小吸光度在740纳米。从伊文思蓝中甲酰胺的标准曲线计算出的伊文思蓝浓度在血浆和视网膜。表达BRB渗透性在每小时每克干视网膜（微升血浆/克视网膜干重/小时）的伊文思蓝的微升。
6.可选荧光血管造影
注：泄漏从视网膜血管小鼠可通过腹膜内注射荧光素钠被可视化。
- 麻醉C57BL6J小鼠（异氟烷吸入，见步骤4.1）和瞳孔扩张与眼药水（neosynephrine和mydriaticum）。使用上的眼睛兽医药膏，以防止干燥，而在麻醉下。
- 注入腹膜内0.01-0.02毫升10％荧光素钠在0.1ml无菌盐水进行荧光血管造影。
- 收集双眼用眼底照相机注射后的图像。后亲的CO牺牲小鼠吸入2cedure。
注：20秒所必需的视网膜血管，以成为对造影可见。图片必须要3-10分钟最大荧光素注射后抓获。漏点（如果存在）2.5分钟后可观察到。在稍后的时间点的图像质量由于荧光素钠扩散到用于分析之后不久得到的玻璃体，因此仅图像丢失。
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Representative Results
我们预计增加的使用ShH10缪勒胶质细胞的视网膜转导，如果该动物模型显示扰动在ILM（ 图2A - B）的结构。例如，我们已经表明，在不存在的Dp71，ShH10靶特异性而更有效地缪勒胶质细胞通过玻璃体内注射，这表明在ILM的通透性增加在该鼠标线相比野生型小鼠16（ 图2C - F）。
AAV5也可以用作ILM渗透性的指标。 AAV5，无效通过玻璃体内注射的野生型小鼠，变得强烈有效的基因递送到感光体在小鼠中受损的视网膜屏障诸如Dp71无效小鼠16或在其它视网膜变性22（ 图2G - H）。这进一步印证了ILM混乱和潜在的通透性increasË周围视网膜神经细胞的细胞外基质中。
我们发现，Dp71无效小鼠的BRB击穿保持选择性的AAV颗粒，因为没有找到相关的微量的AAV的血液样本中的玻璃体内注射的Dp71无效小鼠16（ 图3）。
图1：一般的协议的示意图的AAV生产后，颗粒被注入玻璃体或阴茎静脉麻醉成年小鼠。眼底图像与美光III相机执行跟随GFP表达。绿色荧光蛋白的表达模式的视网膜冰冻切片分析，flatmounted视网膜感谢免疫组化和共聚焦图像。通过BRB的AAV通道通过PCR分析血液样本从玻璃体内或intrapenially注入小鼠来评估，我n阶来检测GFP序列的存在，所述AAV的指示器粒子存在进入血液。
图2：ILM渗透性的AAV转导 flatmounted野生型和Dp71空视网膜标记有泛层粘连蛋白抗体（A，B）的共焦图象。（比例尺为50μm）。眼底图像显示GFP表达（C，D）。 ShH10-GFP玻璃体内注射（E，F）后Flatmounted视网膜一个月。三维由于E表示星号表示的区域的重建（E *）转导的穆勒胶质细胞中的绿色和星形胶质细胞中的红色（抗GFAP抗体）。 （500微米比例尺）玻璃体内注射AAV5-GFP（G，H）后Flatmounted视网膜一个月。通过H中星号显示为红色（PNA凝集素染色）在绿色和锥外段转光感受器（H *）表示该地区的共聚焦图像。左栏显示了从野生型小鼠的视网膜的结果和中间列表示从Dp71空小鼠视网膜的结果。模式（Ⅰ）代表的视网膜的AAV转导受损障碍，Dp71空视网膜，通过玻璃体。缩写：CV，脉络膜血管; RPE，视网膜色素上皮细胞;份，感光细胞（视杆和视锥细胞）; MGC，穆勒胶质细胞;的HC，水平细胞; BC，双极细胞; AC，无长突细胞;男，小胶质细胞; EC，内皮细胞; P，周细胞; GC，神经节细胞; A，星形胶质细胞; ILM，内界膜; V，玻璃体; AAV，腺相关病毒（从Vacca 等，神经胶质（2013年）16，＃3483740951391重新打印许可）。
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图3：BRB渗透性的AAV颗粒的GFP转基因的小鼠的血液样品中提取的PCR扩增。小鼠或者注入玻璃体内（IVT）配ShH10-GFP或intrapenially（IP）的使用的AAV-GFP在不同时间注射后。泳道5-18，奇数对于野生型小鼠和偶数对Dp71无效小鼠;第2泳道，1纳克的AAV载体，PTR-SB-smCBA-HGFP的;泳道3，水;小巷5-6，注射前血液DNA; 7-8车道，3小时后IVT; 9-10车道，24小时后IVT; 11-12车道，24小时后IP; 13-14车道，48小时后IVT;泳道15-16，48小时后的IP; 17-18车道，72小时后IVT;小巷19-20，72小时后IP。泳道1和4，Invitrogen公司规模梯（100碱基对）：100，200，300，400，500，600，700，800，1000，1500，2000，3000 bp的。 （许可由Vacca 等，神经胶质（2013年）16，＃3483740951391重新打印）。
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Discussion
该BRB调节血液和视网膜之间的分子交换。其击穿与各种疾病，如糖尿病性视网膜病或年龄相关性黄斑变性（AMD）相关联。我们最近发现，在一个肌营养不良蛋白敲除小鼠，其中显示可渗透BRB，视网膜变得更宽容的由腺相关病毒载体（AAV）介导的基因传递。然而，尽管BRB渗透性的AAV颗粒喷入眼内保持局限于此模型中的眼隔室。我们的研究结果表明，基因治疗中显示渗透BRB并不代表全身副作用附加险的疾病。此外，他们支持的事实，其他障碍，如ILM视网膜疾病允许病毒颗粒更好的访问期间受到危及。我们的研究结果使我们认为AAV编码报告基因是研究BRB渗透性和ILM完整性视网膜疾病的动物模型的优秀工具。 Particularly，所述AAV变种ShH10，其特异性标签米勒胶质细胞，可以用来作为一种工具来标记视网膜神经胶质细胞和视网膜上的状态响应于疾病报告。 ShH10将选择性地在健康和患病的视网膜标记米勒胶质细胞。然而，无论ShH10和其他自动增值服务将提供在视网膜受损障碍更有效的基因递送。
在应用上述的协议的一些关键的步骤是：（1）显影手巧执行最安全玻璃体内注射，和（2）正确地固定在组织之前和解剖后。在研究视网膜屏障，玻璃体内注射，应很好执行的是 - 不接触透镜或视网膜。损坏镜头或拆卸视网膜影响BRB通透性23,24。另外镜头的损坏妨碍眼底成像。在谈到视网膜破裂可以在ILM和破坏视网膜结构。避免接触视网膜，experiM输入应观察Hamilton注射器的前端在玻璃体腔的中部，在视网膜的前面。无毒的染料可以包括（例如酚红或荧光素）中的病毒溶液中的观测流体注射入玻璃体中提供帮助。损坏视网膜可容易地在眼底成象以下注射过程观察。另一个关键步骤是对组织的固定足够表达水平达到后。眼球摘除后，眼睛必须立即浸泡在固定液缓冲液和组织透之前的第二固定是必要的，以防止泄漏的GFP。它可以是有帮助的浸入整个眼睛中的固定剂前狭缝角膜 - 这会给固定液有机会渗入玻璃体。这个步骤可以增加整体组织稳定性。
最后，同样重要的是注入足够的AAV颗粒有效地转导视网膜和观察GFP前PRESSION在眼底图像。 AAV颗粒的最佳量是每眼大约10 10 -10 11 VG，低于10 10个粒子的GFP表达并不总是由眼底摄像观察。
这种技术不会给直接观察ILM或BRB下的血管的可能性。然而，它提供了一种方法来检查视网膜屏障和它们在疾病状态变形例中，在一个方式使用伊文思蓝测定法和荧光素血管造影术，这在以前是不可能的。使用自动增值服务与特定的视网膜传导性，所以能够获得更好的洞察视网膜的状态相对于该神经胶质细胞，其细胞外基质和ILM。掌握该技术后，可以测试的治疗策略的有效性和它们对BRB影响和视网膜渗透性和去往更好地理解疾病进展和可能性的恢复治疗我后在正常条件视网膜病呐小鼠模型。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0.5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight - 8.5 cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| curved Vanna scissor | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
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