Abstract
Müller cellen zijn de belangrijkste gliale cellen van de retina. Hun end feet vormen de grenzen van het netvlies aan de buitenste en binnenste beperkende membranen (ILM), en in samenhang met astrocyten, pericyten en endotheliale cellen daarin voor de bloed-retina barrière (BRB). BRB beperkt materiaaltransport tussen de bloedstroom en het netvlies tijdens de ILM fungeert als een basaalmembraan die histologisch definieert de grens tussen het netvlies en het glasachtige holte. Labelen Müller cellen is bijzonder relevant voor de fysieke toestand van het netvlies barrières te bestuderen, omdat deze cellen zijn een integraal onderdeel van de BRB en ILM. Zowel BRB en ILM worden vaak veranderd bij ziekte van het netvlies en zijn verantwoordelijk voor de symptomen van de ziekte.
Er zijn verschillende goed gevestigde werkwijzen om de integriteit van de BRB bestuderen, zoals Evans blue assay of fluoresceïne angiografie. Maar deze methoden geven geen informatie over de mate van BRB permeabiliteit to grotere moleculen, in het nanometer bereik. Bovendien hoeven zij geen informatie over de toestand van andere retinale barrières zoals de ILM. Om BRB permeabiliteit te bestuderen naast retinale ILM, gebruikten we een AAV gebaseerde methode met informatie over doorlaatbaarheid van BRB tot grotere moleculen terwijl die de status van de ILM en extracellulaire matrixeiwitten ziektetoestanden. Twee AAV varianten zijn nuttig voor een dergelijke studie: AAV5 en ShH10. AAV5 een natuurlijk tropisme voor fotoreceptoren, maar het kan niet over naar de buitenste retina bij toediening in het glaslichaam bij de ILM intact (dwz in wildtype retina). ShH10 heeft een sterke tropism richting gliacellen en zal selectief Müller glia labelen bij zowel gezonde als zieke netvliezen. ShH10 biedt efficiëntere genaflevering in netvlies waar ILM in het gedrang komt. Deze virale gereedschap in combinatie met immunohistochemie en bloed-DNA-analyse licht werpen op de toestand van het netvlies barrières bij de ziekte.
Introduction
Müller cellen zijn de belangrijkste gliale component van het netvlies. Morfologisch weerszijden van de retina radiaal en hun eindvoetjes van astrocyten in contact met het glasachtige lichaam, het gezicht van de ILM en geheime componenten van de laatstgenoemde. De ILM is een basaal membraan samengesteld uit een tiental verschillende extracellulaire matrix eiwitten (laminin, agrine, perlecan, nidogen, collageen en verscheidene heparinesulfaat proteoglycanen). Tijdens de ontwikkeling, haar aanwezigheid is onmisbaar voor het netvlies histogenese, navigatie van optische axonen, en overleving van ganglioncellen 1-3. Echter, ILM is onwezenlijke bij volwassen netvlies en kan operatief verwijderd worden in bepaalde pathologieën zonder dat er schade aan het netvlies 4. Bij gentherapie, dit membraan wordt een fysieke barrière voor efficiënte transductie van het netvlies met AAV door intravitreale injectie 5.
Door de uitgebreide arborization van hun processen, Müller cellen voedings- en regelgeving Support zowel retinale neuronen en vasculaire cellen. Müllercellen zijn ook betrokken bij de regulatie van de retinale homeostase, bij de vorming en instandhouding van de BRB 6. Krappe kruispunten tussen retinale capillaire endotheelcellen, Müller cellen, astrocyten en pericyten vormen de BRB. BRB voorkomt dat bepaalde stoffen uit het invoeren van de retina.In vele ziekten zoals diabetische retinopathie, retinale veneuze occlusie en aandoeningen van de luchtwegen, hypoxie van het netvlies veroorzaakt lekkage door de BRB 7-9. Deze breuk wordt geassocieerd met een verhoogde vasculaire permeabiliteit leidt tot vasogeen oedeem, retinale loslating en schade aan het netvlies.
Müllercellen zijn sterk geassocieerd met bloedvaten en de basale membraan, speelt een belangrijke rol in zowel BRB en ILM integriteit. Bijgevolg labelen Müller gliacellen is bijzonder relevant voor de studie van de fysische toestand van deze retina barrières.
Klassiekbondgenoot, wordt BRB doorlatendheid gemeten met de Evans blauw test bestaat uit systemische injectie van Evans blauwe kleurstof, die niet-covalent bindt aan plasma-albumine. Deze test meet de albumine lekkage (eiwit van tussenmaat, ~ 66 kDa) van de bloedvaten in het netvlies (zie protocollen hoofdstuk 5) 10. Als alternatief kan de vasculaire lekkage worden gevisualiseerd door fluorescentie retinale angiografie procedures voor de lekkage van fluoresceïne (kleine molecule, ~ 359 Da; zie Protocollen hoofdstuk 6) 11. Toch beide methoden is het mogelijk de evaluatie van de BRB permeabiliteit voor kleine moleculen en eiwitten, maar ze hebben geen informatie over de ILM integriteit.
Vandaar dat BRB permeabiliteit onderzoeken gebruikten we een AAV gebaseerde methode die informatie over de BRB permeabiliteit voor grotere moleculen (bijvoorbeeld AAV deeltjes 25 nm diameter) geeft. Inderdaad, kan onze methode aanwezigheid van AAV transgen op te sporen in het bloed, wat zou suggereren dat ~ deeltjes 25 nm diameter zoukunnen infiltreren in de bloedbaan. Deze werkwijze geeft ook informatie over de structuur van de ILM en extracellulaire matrixeiwitten in pathologische omstandigheden. Twee AAV varianten zijn nuttig voor een dergelijke studie: AAV5 en ShH10. Subretinally geïnjecteerd, AAV5 een natuurlijk tropisme voor fotoreceptoren en retinale pigmentepitheel 12 maar het kan niet over naar de buitenste retina bij toediening in het glaslichaam in wildtype retina's met intacte ILM 5,13. ShH10 een AAV variant die is ontworpen om specifiek te richten gliale cellen over neuronen 14,15. ShH10 etiketten selectief Müller cellen bij zowel gezonde als zieke netvliezen met een verhoogde efficiëntie in het netvlies met een gecompromitteerde barrières 16. Deze virale gereedschap in combinatie met immuhistochemistry en bloed-DNA-analyse geven informatie over de toestand van het netvlies barrières en hun betrokkenheid bij de ziekte (figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren die in deze studie werden verzorgd en behandeld volgens de ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research.
1. Productie van recombinant AAV (rAAV) van kortstondige transfectie van HEK-293 cellen 17,18
OPMERKING: Zie McClure C, Jupiter (2011) 19.
- Zuiver een grootschalige plasmidebereiding (tenminste 1 mg / ml) van de AAV vector plasmiden. Gebruik 3 plasmiden. De AAV helper plasmide dat de replicatie en capside genen zonder AAV omgekeerde terminale herhalingen ITR's, de transgene expressiecassette die de AAV ITR aangeduid als de overdracht plasmide en het plasmide levert het adenovirus helper genen E2, E4 en VA RNA genen bedoelde als pHELPER.
- Transfecteren 293-cellen met deze 3 plasmiden met polyethyleenimine (of andere transfectie reagens). Boven 80% transfectie efficiëntie noodzakelijk voor een goede viral opbrengsten.
- Zuiver recombinant AAV 293 cellysaten op iodixanol gradiënt. 15%, 25%, 40% en 60% iodixanol wordt gebruikt om de helling te verkrijgen. Verzamel 40% iodixanol fractie die AAV deeltjes, concentreren de fractie na ultracentrifugeren bij 500.000 xg gedurende 1 uur en uitwisseling van buffer tegen PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) met 0,001% Pluronic.
- Virale genomische titer 20 te bepalen, het uitvoeren van een DNAse ProteinaseK digest gevolgd door QPCR. De forward en reverse primers versterken de 62 bp regio gelegen in het AAV2 ITR. Voor het plasmide norm, wordt de sonde gelabeld met FAM en heeft een zwart gat quencher (BHQ).
- Het uitvoeren van qPCR (kwantitatieve polymerase chain reaction) in een eindvolume van 25 pi met behulp van 340 nm te keren ITR primer, 100 nM vooruit ITR primer, 100 nM AAV2 ITR sonde, 0,4 mM dNTP, 2 mM MgCl2, 1x Platinum Taq Buffer, 1U Platinum Taq en 5 ul sjabloon (standaard, monster en geen template controle).
- Voorde standaard, gebruikt het plasmide voor transfectie in 7 x 10-voudige seriële verdunningen (5 pi elk van 2 x 09-02 oktober x 10 3 genomen / ml resulteerde in een eindconcentratie van 10 oktober-10 april genomen / ml).
- Begin het programma een initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 15 min gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 1 min en annealing / uitbreiding bij 60 ° C gedurende 1 min. Bewaar bij 4 ° C voor korte opslag of bij -20 ° C voor langere opslagperioden.
2. intravitreale injectie van AAV
- Verdoven C57BL6J muizen met ketamine (50 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) en controleer de meer verlies van evenwicht, de terugtrekking reflex en de staart knijpen reactie wijst op een goede verdoving. Verwijden de pupillen van de cornea toepassing van neosynephrine 5% en mydriaticum 0,5% oogdruppels. Gebruik vet zalf op ogen droog voorkomen terwijl onder verdoving.
- Slagen voor een ultrafijne 30 G disposable naald door de evenaar en naast de limbus, in het glasvocht holte (zie Chiu K, Jupiter (2007) 21). Injecteer 1 pl voorraad met 1-4 x 10 11 VP ShH10-GFP of AAV5-GFP met directe observatie van de naald in het midden van het glasachtige holte (figuur 1). Gebruik één oog als controle voor ILM experimenten. Injecteren beide ogen voor BRB experimenten. Breng een anti-inflammatoire en antibacteriële topische behandeling geïnjecteerde ogen.
- Verwijden leerlingen met neosynephrine en mydriaticum oogdruppels voor de beeldvorming. Voer fundus onderzoek met het oog fundus camera GFP (Green Fluorescent Protein) expressie 1 week, 2 weken, 1 maand en 2 maanden na intravitreale injectie (Figuur 1) volgen. Offer muizen met CO2 inhalatie 1 tot 2 maanden na injectie.
3. Immunohistochemistry
- Voor retinale cryosecties (figuur 1), ontleden verwijderde ogen om l te verwijderenens en het hoornvlies, en onderdompeling fix in 4% paraformaldehyde gedurende 1 uur.
- Cryoprotect de eerder vastgestelde ogen in 10% sucrose gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, 20% sucrose gedurende een uur bij kamertemperatuur geroerd. Cryoprotect in 30% sucrose oplossing overnacht bij 4 ° C. Bevriezen en insluiten oogschelpen in het inbedden van hars zoals Cryo-matrix. Maak 10 micrometer cryocoupes en monteren op dia's, speciaal behandeld voor ingevroren weefsel secties en dat te verbeteren weefsel volgen ervan tijdens de kleuring.
- Permeabilize secties met 0,1% Triton X100 in PBS pH 7,4 gedurende 5 minuten. Was 2x in PBS en blok 1 uur bij kamertemperatuur in PBS met 1% BSA, 0,1% Tween 20.
- Voor retinale flatmounts (figuur 1), vast ontkernde ogen in 4% paraformaldehyde gedurende 15 min bij de dissectie te bevorderen.
- In 15-30 min, ontleden de ogen aan het hoornvlies en de lens te verwijderen. Scheid het netvlies van de netvliespigmentepitheel (RPE) en sclera door te snijden rond de ora serrata ende oogzenuw. Dompel in 4% paraformaldehyde gedurende nog eens 30 min naar het netvlies en het fluorescerende eiwit in getransduceerde retinale cellen (fixatie niet meer dan 24 uur) vast. Was 5 minuten in steriel PBS, pH 7.4.
- Verander de PBS blokkerende buffer (PBS met 1% BSA, 2% normaal geit of ezel serum, 0,5% Triton X-100) en incubeer in blokkerende buffer voor of 4 uur bij kamertemperatuur of 4 ° C overnacht.
- Incubeer weefsels met primaire antilichamen in blokkeerbuffer voor of 4 uur bij kamertemperatuur of bij 4 ° C overnacht. Was 3x met PBS.
OPMERKING: De antilichamen die zijn: anti-laminine (1 / 1.000) labelen van de ILM, anti-rhodopsine kloon 4D2 (1/500) etikettering staven, anti-glutamine synthetase kloon GS-6 (1 / 1.500) labeling Müllercellen , PNA Lectine (1/40) etikettering kegels. - Incubeer weefsels met 1: 500 verdunning van Alexa Fluor geconjugeerde secundaire antilichamen in het blokkeren van buffer gedurende 1 uur (cryocoupes) of 2 uur (flatmounts) bij kamertemperatuur tempetuur en beschermd tegen licht. Was 3x met PBS.
- Maak verlichten bezuinigingen op de retina en flatmount het op een glasplaatje met ofwel de fotoreceptor of retinale ganglioncellen (RGC) naar boven gericht. Voeg waterige mountingmedium, gelden dekglaasje en bewaar bij 4 ° C.
- Voeren confocale microscopie op laser scanning confocale microscoop. Acquire beelden sequentieel, regel voor regel, om excitatie en emissie overspraak te verminderen. Definieer stap grootte volgens de Nyquist-Shannon sampling theorema. Gebruik belichtingsinstellingen die oververzadigd pixels in de uiteindelijke beelden te minimaliseren. Proces 12-bits afbeeldingen met Fiji, project Z-profielen op een enkel vlak met behulp van maximale intensiteit onder Z-project functie en uiteindelijk om te zetten naar 8-bits RGB-kleurenmodus.
4. PCR analyse van muis bloedmonsters
- Injecteer 100 ui voorraad met 1-4 x 10 11 deeltjes van een AAV-GFP in de penis ader van verdoofde muizen C57BL6J (5% isofluraanvoor inductie in een nauwe ruimte en 2,5% van isofluraan via een neuskegel tijdens de operatie) met behulp van een insuline spuit met een ultra-fijne 6 mm naald. Dit dier zal dienen als een positieve controle van circulerende AAV deeltjes.
- Monster bloed van de muis staart vóór de injectie en 3 uur, 24 uur, 2 dagen en 3 dagen na ShH10 intravitreale injectie of na intrapenile injectie (figuur 1). Ongeveer 10-20 pl verzameld in héparine buizen. Offeren muizen door CO 2 inhalatie na afronding van de procedure.
- Uittreksel genoom DNA van bloedmonsters met behulp van de extractie kit van uw keuze.
- Voer PCR amplificatie van genomisch DNA. Voor dit protocol gebruikt u de volgende primerpaar: GFP, voelen 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', antisense 5'-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3'. De volgende PCR-programma werd uitgevoerd: 95 ° C 2 min (1 cyclus); 95 ° C 45 sec, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 seconden (30 cycli); 72 ° C 5 min (1 cyclus);4 ° C te houden.
5. Optioneel Evans Blue Methode
OPMERKING: Kwantificeren vasculaire permeabiliteit door het meten van albumine lekkage van bloedvaten in het netvlies met behulp van de Evans blauwe methode 10.
- Bereid Evans Blue kleurstof door oplossing in een fysiologische zoutoplossing (6 mg / ml), sonicatie gedurende 5 minuten in een ultrasoon reiniger en filtratie door een 5 urn filter.
- Verdoven C57BL6J muizen (isofluraan inademing, zie stap 4.1), controleer dan de meer verlies van evenwicht, de terugtrekking reflex en de staart knijpen reactie wijst op een goede verdoving, en injecteer Evans blauw (45 mg / kg) door de penis ader (figuur 1). Controleer of de poten, snuit en oren van muizen worden duidelijk blauwe volgende Evans blauw injectie, ter bevestiging van de opname en verdeling van de kleurstof.
- Verdoven C57BL6J muizen 3 uur na injectie van de kleurstof met ketamine (50 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) en controleer het verlies van righting reflex wijst op een goede verdoving. Voorbeeld intracardiaal 500 gl bloed in heparine buizen en perfuseren muizen gedurende 2 min via de linker ventrikel met een citraatbuffer (0,05 M, pH 3,5, opgelost 7,8 g citroenzuur en 3,8 g natriumcitraat in 1 liter gedestilleerd water) voorverwarmd tot 37 ° C vasoconstrictie voorkomen. Muizen worden opgeofferd via de perfusie.
- Na perfusie, ophelderen en zorgvuldig ontleden beide ogen onder een operationele microscoop om het netvlies te verzamelen (zie paragraaf 3.2). Droge retina in een centrifugale verdamper nachts, wegen en extraheer de Evans blauwe kleurstof door incubatie netvlies met 100 pl formamide gedurende 18 uur bij 65 ° C onder schudden (100 xg). Centrifuge retina monsters 30K omega filter buizen bij 20,798.5 xg gedurende 2 uur bij 4 ° C en centrifugeer bloedmonsters 20,798.5 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Gebruik beide bovenstaande vloeistoffen om absorptie te meten. Bepaal absorptie van elk monster door het aftrekken van de maximale extinctie for Evans blauw bij 620 nm om de absorptie minimum bij 740 nm. Bereken Evans blauw-concentratie in het plasma en het netvlies van een standaard curve van Evans blauw in formamide. Express BRB permeabiliteit in microliter Evans blue per gram droge retina per uur (gl plasma / g retinale drooggewicht / uur).
6. Optioneel fluorescentie-angiografie
OPMERKING: Lekkage van retinale bloedvaten in muizen kan worden gevisualiseerd door intraperitoneale injectie van natriumfluoresceïne.
- Verdoven C57BL6J muizen (isofluraan inademing, zie stap 4.1) en verwijden de pupillen met oogdruppels (neosynephrine en mydriaticum). Gebruik vet zalf op ogen droog voorkomen terwijl onder verdoving.
- Intraperitoneaal injecteren 0,01-0,02 ml 10% natrium fluoresceïne in 0,1 ml steriele zoutoplossing fluoresceïne angiografie.
- Verzamel beelden van beide ogen na injectie met behulp van een oogfundus camera. Offeren muizen door CO 2 inhalatie na de proprocedure.
OPMERKING: 20 sec zijn nodig voor de retinale vaten zichtbaar op angiografie geworden. Beelden moeten worden vastgelegd tussen 3-10 min maximale na fluoresceïne injectie. De lekkage vlekken (indien aanwezig) zijn waarneembaar na 2,5 min. Op latere tijdstippen de beeldkwaliteit verloren gaat door natriumfluoresceïne diffunderen in het glasvocht, dus slechts kort beelden verkregen na gebruikt voor analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We verwachten verhoogde retinale transductie van Müller gliacellen met ShH10 als het diermodel toont verstoringen in de structuur van het VLM (Figuur 2A - B). Zo hebben we aangetoond dat in afwezigheid van Dp71, ShH10 targets specifiek maar efficiënter Müller gliacellen door intravitreale injectie aangeeft verhoogde permeabiliteit van de ILM in deze muis lijn vergeleken met wild-type muizen 16 (figuur 2C - F).
AAV5 kan ook worden gebruikt als een indicator van ILM permeabiliteit. AAV5, ineffectief door intravitreale injectie in wild-type muizen, wordt sterk effectief in het gen levering aan fotoreceptoren in muizen met een gecompromitteerde retinale barrières zoals de Dp71-null muizen 16 of in andere retinale degeneratie 22 (figuur 2G - H). Dit bevestigt verder de ILM desorganisatie en potentiële permeabiliteit increase in de extracellulaire matrix rond de retinale neuronen.
We vonden dat de verdeling BRB van Dp71-null muizen blijft selectief om AAV deeltjes omdat er geen spoor van AAV werden gevonden in bloedmonsters van intravitreaal geïnjecteerd Dp71-null muizen 16 (figuur 3).
Figuur 1:. Schematische weergave van het algemene protocol na AAV productie deeltjes worden geïnjecteerd in het glasachtige lichaam of in de penis ader verdoofde volwassen muizen. Fundus beelden met Micron III camera worden uitgevoerd om de GFP expressie volgen. De GFP expressie patroon wordt geanalyseerd op het netvlies cryocoupes en flatmounted netvliezen dankzij immunohistochemie en confocale beelden. De AAV passage door de BRB wordt beoordeeld door PCR-analyse op bloedmonsters afkomstig van intravitreaal of intrapenially geïnjecteerde muizen, iMet het doel de aanwezigheid van GFP sequentie detecteren indicator van de AAV deeltjes aanwezig in de bloedbaan.
Figuur 2: ILM permeabiliteit voor AAV transductie confocale beelden van flatmounted wildtype en Dp71 null netvlies gelabeld met een pan-laminine-antilichaam (A, B). (Schaalbalk: 50 pm). Fundus beelden die GFP-expressie (C, D). Flatmounted netvliezen een maand na ShH10-GFP intravitreale injectie (E, F). Driedimensionale reconstitutie (E *) van de met een sterretje in E showing gebied getransduceerde Müller gliacellen in groen en astrocyten in rood (anti-GFAP-antilichaam). Flatmounted netvliezen een maand na de intravitreale injectie van AAV5-GFP (G, H) (schaal bar: 500 pm). Confocale beeld van de met een sterretje in H tonen getransduceerd fotoreceptoren in groen en kegel buitensegmenten in rood (PNA lectine kleuring) (H *) oppervlak. De linker kolom toont de resultaten van wild-type muis netvliezen en de middelste kolom geeft de resultaten van Dp71-null muis netvliezen. Het schema (I) staat voor AAV transductie van het netvlies met een gecompromitteerd barrières als Dp71-null netvlies, door middel van het glasvocht. Afkortingen: CV, choroidal vaartuigen; RPE, retinale pigment epitheel; PHR, fotoreceptorcellen (staafjes en kegeltjes); MGC, Müller gliacellen; HC, horizontale cellen; BC, bipolaire cellen; AC, amacrine cellen; M, microglia; EG endotheelcellen; P, pericyten; GC, ganglioncellen; A, astrocyten; ILM, binnenste beperkende membraan; V, glasachtig; AAV, adeno-geassocieerd virus. (Re-print met toestemming van Vacca et al., Glia (2013) 16, # 3483740951391).
tp_upload / 52451 / 52451fig3.jpg "/>
Figuur 3: BRB permeabiliteit voor AAV deeltjes PCR amplificatie van GFP transgen geëxtraheerd uit muis bloedmonsters.. Muizen ofwel intravitreaal (IVT) met ShH10-GFP of intrapenially (IP) met AAV-GFP geïnjecteerd op verschillende tijdstippen na de injectie. Lane 5-18, oneven nummers voor wild-type muizen en zelfs nummers voor Dp71-null muizen; laan 2, 1 ng van de AAV plasmide, pTR-SB-smCBA-hGFP; laan 3, water; lanen 5-6, bloed DNA vóór de injectie; lanen 7-8, 3 uur na IVT; lanen 9-10, 24 uur na IVT; lanen 11-12, 24 uur na het OT; lanen 13-14, 48 uur na IVT; lanen 15-16, 48 uur na het OT; lanen 17-18, 72 uur na IVT; lanen 19-20, 72 uur na het OT. Lanen 1 en 4, Invitrogen schaal ladder (100 bp): 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1500, 2000, 3000 bp. (Re-print met toestemming van Vacca et al., Glia (2013) 16, # 3483740951391).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De BRB regelt de uitwisseling van moleculen tussen bloed en retina. De verdeling wordt geassocieerd met verschillende ziekten zoals diabetische retinopathie of leeftijd gerelateerde maculaire degeneratie (AMD). We hebben onlangs aangetoond dat in een dystrofine knock-out muis, die permeabel BRB weergeeft, het netvlies toleranter voor genoverdracht gemedieerd door adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV). Ondanks BRB permeabiliteit AAV deeltjes geïnjecteerd intraoculair beperkt blijven tot de oculaire compartimenten in dit model. Onze resultaten geven aan dat gentherapie voor ziekten die doorlaatbaar BRB geen bijkomende risico van systemische neveneffecten vertegenwoordigen weergegeven. Bovendien ondersteunen ze het feit dat andere barrières zoals de ILM in gevaar komen tijdens de ziekte van het netvlies waardoor een betere toegang tot de virale deeltjes. Onze bevindingen leiden ons om te denken dat AAV-codering reporter genen is een uitstekend hulpmiddel om BRB permeabiliteit en ILM integriteit te bestuderen in diermodellen van de ziekte van het netvlies. Bijzonmatig, de AAV variant ShH10, dat specifiek labels Müller glia kan worden gebruikt als een instrument om retinale glia label en rapporteren over de toestand van het netvlies ingeval van ziekte. ShH10 zal selectief Müller glia labelen bij zowel gezonde als zieke netvliezen. Echter, zullen zowel ShH10 en andere AAVs efficiënter genaflevering in netvliezen met een gecompromitteerd barrières bieden.
Enkele kritische stappen bij het toepassen van de hierboven beschreven protocollen (1) ontwikkeling handigheid de veiligste intravitreale injectie voeren, en (2) op de juiste vaststelling van het weefsel voor en na dissectie. Bij het bestuderen van retinale belemmeringen moet de intravitreale injectie goed uitgevoerd dat - zonder het objectief of de retina. Beschadiging van de lens of het losmaken van het netvlies heeft invloed op de BRB permeabiliteit 23,24. Daarnaast lens schade belemmert fundus beeldvorming. Het aanraken van het netvlies kan de ILM scheuren en schade aan het netvlies structuur. Om te voorkomen dat het aanraken van het netvlies, de experimenteleMVoer moet de punt van de Hamilton spuit waarnemen in het midden van het glasachtige holte voor het netvlies. Een niet-toxische kleurstof kunnen (zoals fenol rood of fluoresceïne) in de virale oplossing te helpen bij de waarneming van de vloeistof injectie in het glaslichaam. Schade aan het netvlies kan gemakkelijk worden waargenomen tijdens fundus beeldvorming na de injectieprocedure. Een kritische stap is de fixatie van het weefsel na voldoende expressieniveaus bereikt. Na enucleatie moet ogen meteen ondergedompeld in fixeermiddel buffer en voor weefsel permeabilisatie een tweede fixatie noodzakelijk om GFP lekkage te voorkomen. Het kan nuttig zijn om het hoornvlies spleet voor het onderdompelen van het gehele oog in het fixeermiddel zijn - dit zal het fixeermiddel een kans doordringen in het glaslichaam geven. Deze stap kan de algehele stabiliteit weefsel te verhogen.
Tenslotte is het ook belangrijk om voldoende AAV partikels injecteren efficiënt transduceren het netvlies en GFP ex observerenpression op oogfundus beelden. De optimale hoeveelheid van AAV deeltjes ongeveer 10 10 -10 11 vg per oog, onder 10 10 deeltjes de GFP expressie wordt niet altijd nageleefd door fundus beeldvorming.
Deze techniek zal de mogelijkheid om direct te observeren de ILM of het vaatstelsel onder de BRB niet geven. Het biedt echter een manier om retinale barrières en voor wijziging ziektetoestanden, op een wijze die voorheen niet mogelijk met de Evans blue assay en fluoresceïne angiografie onderzoeken. Gebruik AAV specifieke retinale transductie eigenschappen, is het mogelijk om meer inzicht te krijgen in de toestand van het netvlies ten opzichte van de gliacellen, hun extracellulaire matrix en ILM. Na het beheersen van deze techniek kan men de effectiviteit van therapeutische strategieën en hun invloed op BRB en retinale permeabiliteit testen en te gaan naar een beter begrip van de progressie van de ziekte en de mogelijkheid om normale omstandigheden na de behandeling i herstellenna muismodel van ziekte van het netvlies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0.5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight - 8.5 cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| curved Vanna scissor | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
