Abstract
תאי מולר הם תאי גליה העיקריים של הרשתית. קצה רגליהם יוצרות את הגבולות של הרשתית בקרומים החיצוניים ופנימיים הגבלה (ILM), ובשיתוף עם האסטרוציטים, pericytes ותאי האנדותל הם מקימים את מחסום הדם-רשתית (BRB). BRB מגביל תחבורה מהותית בין זרם הדם והרשתית תוך ILM פועל כקרום במרתף שמגדיר בהיסטולוגיה גבול בין הרשתית וזגוגית החלל. תיוג תאי מולר הוא רלוונטי במיוחד כדי ללמוד את מצבו הפיזי של המחסומים ברשתית, תאים אלה הם חלק בלתי נפרד מBRB וILM. שני BRB וILM לעתים קרובות שינו במחלת רשתית ואחראי לתסמיני מחלה.
ישנן מספר שיטות מבוססות היטב ללמוד על שלמות BRB, כגון assay הכחול אוונס או אנגיוגרפיה והעמסת. עם זאת שיטות אלה אינן מספקים מידע על המידה של t חדירות BRBo מולקולות גדולות יותר, בטווח ננומטר. יתר על כן, הם אינם מספקים מידע על מצבם של חסמים אחרים ברשתית כגון ILM. ללמוד חדירות BRB צד ILM רשתית, השתמשנו בשיטה המבוססת AAV שמספקת מידע על חדירות של BRB למולקולות גדולות יותר תוך ציון המצב של חלבוני ILM ומטריצת חוץ-תאית במצבי מחלה. שתי גרסאות AAV שימושיות למחקר כזה: AAV5 וShH10. יש AAV5 כמיהות טבעיות לקולטני אור, אבל זה לא יכול להעביר לרשתית החיצונית כאשר מנוהל לתוך הזגוגית כאשר ILM הוא שלם (כלומר, ברשתית wild-type). יש ShH10 כמיהות חזקות לתאי גלייה וסלקטיבי תווית גליה מולר בשתי רשתיות בריאים וחולה. ShH10 מספק מסירת גן יעילה יותר ברשתית שבו ILM נפגעת. כלים הנגיפיים אלה בשילוב עם ניתוח אימונוהיסטוכימיה והדם-DNA לשפוך אור על מצבם של חסמי רשתית במחלה.
Introduction
תאי מולר הם המרכיב העיקרי גליה של הרשתית. מורפולוגית, הם משתרעים על פני רשתית רדיאלית וendfeet, במגע עם הזגוגית, להתמודד ILM ורכיבים סודיים של זה האחרון. ILM הוא קרום במרתף מורכב מעשרה חלבונים שונים תאיים מטריצה (laminin, Agrin, perlecan, nidogen, קולגן וכמה proteoglycans סולפט הפרין). במהלך פיתוח, הנוכחות שלה היא הכרחית עבור histogenesis רשתית, ניווט של אקסונים האופטיים, והישרדות של תאי הגנגליון 1-3. עם זאת, ILM הוא בלתי חיוני ברשתית מבוגרת וניתן להסיר בניתוח בפתולוגיות מסוימות מבלי לגרום לניזק לרשתית 4. בריפוי גנטי, קרום זה הופך להיות מכשול פיזי לתמרה יעילה של הרשתית באמצעות AAVs על ידי הזרקת תוך 5.
דרך arborization הנרחב של התהליכים שלהם, תאי מולר לספק suppo התזונתי והרגולציהrt לשני נוירונים ברשתית ותאי כלי דם. תאי מולר מעורבים גם בוויסות של הומאוסטזיס ברשתית, בהקמה והתחזוקה של BRB 6. צמתים הדוקים בין תאי האנדותל נימי רשתית, תאי מולר, האסטרוציטים וpericytes יוצרים BRB. BRB מונע מחומרים מסוימים מלהיכנס למחלות רבות כמו retina.In רטינופתיה סוכרתית, חסימת וריד רשתית ומחלות בדרכי הנשימה, חוסר חמצן של הרשתית גורם לדליפה באמצעות 7-9 BRB. קרע זה קשור לעלייה בחדירות כלי דם שמובילה לבצקת vasogenic, היפרדות רשתית ופגיעה ברשתית.
תאי מולר קשורים באופן הדוק עם כלי דם והקרום במרתף, ששיחקו תפקיד חשוב בשתי יושרת BRB וILM. כתוצאה מכך, תיוג תאי גליה מולר הוא רלוונטי במיוחד למחקר של המצב הפיזי של מחסומי רשתית אלה.
קלאסיברית, חדירות BRB נמדדות באמצעות assay הכחול אוונס המורכב מהזרקה המערכתית של צבע הכחול אוונס, אשר נקשר אינה קוולנטית לאלבומין פלזמה. assay זה מודד את דליפת אלבומין (חלבון בגודל ביניים, ~ 66 KDA) מכלי דם לתוך הרשתית (ראה פרוטוקולי סעיף 5) 10. לחלופין, הדליפה של כלי הדם ניתן דמיינה ידי אנגיוגרפיה הקרינה רשתית המעידה על דליפה של העמסה (מולקולה קטנה, ~ 359 Da; ראה סעיף פרוטוקולים 6) 11. עם זאת, בשתי השיטות מאפשרות הערכה של חדירות BRB למולקולות קטנות וחלבונים אבל הם לא מספקים מידע על יושר ILM.
לפיכך, ללמוד חדירות BRB, השתמשנו בשיטה המבוססת AAV שנותנת מידע על חדירות BRB למולקולות גדולות יותר (חלקיקי AAV למשל,, 25 בקוטר ננומטר). ואכן, השיטה שלנו יכולה לזהות נוכחות של transgene AAV בדם, שהייתי מציעה ש~ חלקיקי 25 ננומטר קוטר הייתתוכל לחדור לזרם הדם. שיטה זו גם מספקת מידע על המבנה של ILM וחלבוני מטריצה תאיים במצבים פתולוגיים. שתי גרסאות AAV שימושיות למחקר כזה: AAV5 וShH10. הזריק Subretinally, יש AAV5 כמיהות טבעיות לקולטניים אור ואפיתל הפיגמנט ברשתית 12 אבל זה לא יכול להעביר לרשתית החיצונית כאשר מנוהלים לתוך הזגוגית ברשתית wild-type עם ILM שלם 5,13. ShH10 היא גרסת AAV שתוכנן במיוחד כדי למקד את תאי גלייה על נוירונים 14,15. ShH10 סלקטיבי תוויות בתאי מולר בשתי רשתיות בריאים וחולה עם התייעלות ברשתית עם מחסומים נפרצו 16. כלים הנגיפיים אלה בשילוב עם immuhistochemistry ובדיקות הדם-DNA לספק מידע על מצבם של חסמי רשתית ומעורבותם במחלה (איור 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל בעלי החיים ששמשו במחקר זה טופלו ויטופלו בהתאם להצהרת Arvo לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזון.
1. הפקת רקומביננטי AAV (rAAV) על ידי חלוף Transfection של HEK-293 תאים 17,18
הערה: ראה מקלור C, יופיטר (2011) 19.
- לטהר הכנת פלסמיד בקנה מידה גדולה (מ"ג לפחות 1 / מיליליטר) של פלסמידים וקטור AAV. השתמש 3 פלסמידים. פלסמיד עוזר AAV נושא את הגנים השכפול וקפסיד ללא המסוף ההפוך AAV חוזר ITRS, קלטת ביטוי transgene ביצוע ITR AAV מכונה פלסמיד ההעברה, ופלסמיד אספקת גני עוזר אדנווירוס E2, E4, וגני VA RNA מצוינים כלpHELPER.
- Transfect 293 תאים עם 3 פלסמידים אלה באמצעות polyethyleneimine (או מגיב transfection אחר). מעל 80% מיעילות transfection הוא הכרחי לvi הטובתשואות RAL.
- לטהר AAV רקומביננטי מ293 lysates תא בשיפוע iodixanol. 15%, 25%, 40%, וiodixanol 60% משמש להשגת השיפוע. לאסוף 40% חלק iodixanol המכיל חלקיקי AAV, לרכז את החלק לאחר ultracentrifugation ב500,000 XG במשך שעה וחיץ תמורת 1 נגד PBS (נאגר מלוח פוספט) עם 0.001% pluronic.
- כדי לקבוע כייל הגנומי נגיפי 20, לבצע ProteinaseK לעכל DNAse אחרי QPCR. פריימרים קדימה הפוך להגביר את אזור 62 נ"ב ממוקם בITR AAV2. לסטנדרטי פלסמיד, החללית שכותרתו עם FAM ויש לו חור שחור מרווה (BHQ).
- לבצע qPCR (תגובת השרשרת של פולימראז כמותי) בנפח סופי של 25 μl באמצעות 340 ננומטר לאחור תחל ITR, פריימר ITR קדימה 100 ננומטר, 100 ננומטר בדיקה AAV2 ITR, 0.4 מ"מ dNTPs, 2 מ"מ MgCl2, 1x פלטינום תקי מאגר, 1U פלטינום תבנית תקי ו -5 μl (סטנדרטי, מדגם ואין שליטת תבנית).
- להסטנדרטי, השתמש בפלסמיד לtransfection ב7 x 10-לקפל דילולים סדרתי (5 μl כל אחד מ2 x 10 x 9 עד 2 10 3 הגנום מיליליטר / וכתוצאה מכך ריכוז סופי מאוקטובר 10-אפריל 10 הגנום מיליליטר /).
- להתחיל את התכנית על ידי צעד denaturation ראשוני ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ואחריו 40 מחזורים של denaturation בב 95 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות וחישול / סיומת ב 60 ° C 1 דקות. חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך אחסון לטווח קצר או ב -20 ° C לתקופות ארוכות אחסון.
2. הזרקת תוך של AAV
- הרדימי עכברי C57BL6J עם קטמין (50 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם) ולאמת את אובדן ליישר רפלקס, תגובת רפלקס הנסיגה וקמצוץ הזנב מצביעה הרדמה מתאימה. להתרחב תלמידים על ידי יישום של קרנית של 5% neosynephrine וmydriaticum 0.5% בטיפי עיניים. השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
- לעבור disposab G ultrafine 30מחט le דרך הקו המשווה ובסמוך לימבוס, לתוך חלל הזגוגית (ראה צ'יו K, יופיטר (2007) 21). הזרק מניות μl 1 מכילות 1 עד 4 x 10 11 סמנכ"ל ShH10-GFP או AAV5-GFP עם תצפית ישירה של המחט במרכז חלל הזגוגית (איור 1). השתמש בעין אחת כביקורת על ניסויי ILM. להזריק את שני העיניים לניסויי BRB. החל טיפול מקומי נוגד דלקת ואנטי-בקטריאלי על עיניים מוזרקות.
- להתרחב תלמידים עם neosynephrine וטיפות עיני mydriaticum להדמיה. לבצע בדיקות קרקעית עין עם מצלמה קרקעית העין לעקוב GFP (חלבון פלואורסצנטי הירוק) ביטוי שבוע 1, 2 שבועות, 1 חודש, ו -2 חודשים לאחר הזרקת תוך (איור 1). להקריב את עכברי משאיפת CO 2 1-2 חודשים לאחר הזרקה.
3. אימונוהיסטוכימיה
- לcryosections רשתית (איור 1), לנתח את עיני enucleated להסיר lתיקון ENS וקרנית, והטבילה בparaformaldehyde 4% עבור שעה 1.
- Cryoprotect עיניים קבועות בעבר בסוכרוז 10% עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, סוכרוז 20% עבור שעות נוספות בטמפרטורת חדר. Cryoprotect בתמיסת סוכרוז 30%, הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. להקפיא ולהטביע eyecups בהטבעת שרף כגון קריו מטריצה. הפוך 10 מיקרומטר cryosections והר בשקופיות טיפול מיוחד לקטעי רקמה קפוא ושתשפר את דבקות רקמות במהלך צביעה.
- Permeabilize חלקים עם 0.1% X100 טריטון בPBS pH 7.4 למשך 5 דקות. לשטוף 2x בPBS ולחסום עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר בPBS עם BSA 1%, 0.1% Tween 20.
- לflatmounts רשתית (איור 1), לתקן את עיני enucleated בparaformaldehyde 4% במשך 15 דקות כדי להקל על הנתיחה.
- ב15-30 דקות, לנתח את העיניים כדי להסיר את הקרנית ועדשה. הפרד את הרשתית מאפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) ולובן העין על ידי חיתוך סביב serrata אורה ועצב הראייה. לטבול בparaformaldehyde 4% למשך 30 דקות נוספות כדי לתקן את הרשתית וחלבון פלואורסצנטי בתאי רשתית transduced (קיבעון לא יעלה על 24 שעות). לשטוף 5 דקות בPBS סטרילי, pH 7.4.
- לשנות את PBS לחיץ חסימה (PBS עם BSA 1%, 2% עזים נורמלי או חמור בדם, 0.5% Triton X-100), ודגירה בחסימת מאגר לאו 4 שעות בטמפרטורת חדר או 4 ° C למשך הלילה.
- דגירה רקמות עם נוגדנים עיקריים בחסימת מאגר לאו 4 שעות בטמפרטורת חדר או 4 ° C למשך הלילה. 3x לשטוף עם PBS.
הערה: הנוגדנים המשמשים הם כדלקמן: אנטי laminin (1/1000), 4D2 (1/500) מוטות תיוג, שיבוט synthetase אנטי-גלוטמין GS-6 (1/1500) תאי תיוג ILM שיבוט אנטי-רודופסין תיוג Müller , PNA קטינים (1/40) תיוג קונוסים. - דגירה רקמות עם 1: 500 דילול של נוגדנים משני מצומדות פלואוריד Alexa חסימת חיץ במשך שעה 1 (cryosections) או 2 שעות (flatmounts) בטמפה החדרrature ומוגן מפני אור. 3x לשטוף עם PBS.
- לבצע חתכים להקלה לרשתית וflatmount זה על גבי זכוכית עם שני קולטי האור או צד תא הגנגליון ברשתית (RGC) יפנו כלפי מעלה. להוסיף mountingmedium המימי, להחיל coverslip ולאחסן ב 4 ° C.
- בצע מיקרוסקופיה confocal על מיקרוסקופ confocal לייזר סריקה. לרכוש ברצף תמונות, שורה אחרת שורה, כדי להפחית את העירור והפליטה crosstalk. להגדיר את גודל צעד על פי תורת הדגימה. השתמש בהגדרות חשיפה שלמזער פיקסלים oversaturated בתמונות הסופיות. תמונות תהליך 12-bit עם פיג'י, Z-סעיפי פרויקט על מטוס בודד באמצעות עוצמה מקסימלית תחת Z-פרויקט פונקציה ולבסוף להמיר 8 סיביות מצב צבע RGB.
4. ניתוח PCR של דגימות דם עכבר
- להזריק 100 מניות μl המכילות 1 עד 4 x 10 11 חלקיקים של AAV-GFP לוריד הפין של עכברים מורדמים C57BL6J (5% מisofluraneלזירוז בתא קרוב ו -2.5% מisoflurane באמצעות חרטומו במהלך ניתוח) באמצעות מזרק אינסולין עם מחט 6 מ"מ עדין במיוחד. בעלי חיים זה ישמשו כביקורת חיובית של מחזורי חלקיקי AAV.
- דם מדגם מזנב עכבר לפני ההזרקה ו -3 שעות, 24 שעות, 2 ימים, ו -3 ימים לאחר הזרקת תוך ShH10 או לאחר הזרקת intrapenile (איור 1). על 10-20 μl נאסף בצינורות הפרין. להקריב את עכברי משאיפת CO 2 לאחר השלמת ההליך.
- לחלץ הדנ"א הגנומי מדגימות דם באמצעות ערכת החילוץ על פי בחירתך.
- לבצע הגברה PCR של DNA גנומי. לפרוטוקול זה משתמש בזוג פריימר הבא: GFP, לחוש 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ", antisense 5'-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3". תכנית ה- PCR הבאה בוצעה: 95 ° C 2 דקות (מחזור 1); 95 ° C 45 שניות, 1 דקות 55 ° C, 72 ° C שניות 45 (30 מחזורים); 72 ° C 5 דקות (מחזור 1);4 ° C אחיזה.
5. אופציונאלי אוונס הכחול שיטה
הערה: לכמת חדירות כלי דם על ידי מדידת דליפת אלבומין מכלי דם לרשתית בשיטה הכחולה אוונס 10.
- הכן צבע הכחול אוונס על ידי פירוק בפתרון נורמלי מלוח (6 מ"ג / מיליליטר), sonication במשך 5 דקות בשואב קולי, וסינון באמצעות מסנן 5 מיקרומטר.
- הרדימי עכברי C57BL6J (שאיפת isoflurane, ראה שלב 4.1), לבדוק את אובדן ליישר רפלקס, רפלקס הנסיגה ותגובת קמצוץ הזנב מצביעה הרדמה מתאימה, ולהזריק אוונס כחול (45 מ"ג / קילוגרם) דרך וריד הפין (איור 1). בדוק שכפות, לוע, ואוזניים של העכברים להיות ברור כחולות לאחר הזרקה כחולה אוונס, המאשרים את הספיגה והפצה של הצבע.
- הרדימי עכברי C57BL6J 3 שעות לאחר ההזרקה של הצבע עם קטמין (50 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם) ולאמת את אובדן righting רפלקס המצביע על הרדמה מתאימה. לדוגמא intracardially כ -500 μl דם בצינורות הפרין ותנקב עכברים למשך 2 דקות באמצעות החדר השמאלי עם חיץ ציטרט (0.05 M, pH 3.5; לפזר 7.8 גרם של חומצת לימון ו -3.8 גרם של נתרן ציטרט בL 1 של מים מזוקקים) טרום חימם עד 37 ° C כדי למנוע התכווצות כלי דם. עכברים הקריבו באמצעות זלוף.
- לאחר זלוף, enucleate ובזהירות לנתח את שני העיניים תחת מיקרוסקופ הפעלה כדי לאסוף את הרשתית (ראה סעיף 3.2). רשתית יבש במאייד צנטריפוגלי הלילה, לשקול, ולחלץ את הצבע הכחול אוונס ידי דוגרים רשתית עם של פוראמיד 100 μl במשך 18 שעות על 65 מעלות צלזיוס עם הרועד (100 XG). דגימות רשתית צנטריפוגה ב30K צינורות מסנן אומגה ב20,798.5 XG לשעה 2 ב 4 ° C ודגימות דם צנטריפוגות ב20,798.5 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- להשתמש בשתי supernatants למדוד הספיגה. לקבוע הספיגה של כל דגימה על ידי הפחתת הספיגה המקסימלי for אוונס הכחול ב620 nm למינימום הספיגה ב 740 ננומטר. חישוב ריכוז הכחול אוונס בפלזמה ורשתית מעקומה סטנדרטית של אוונס הכחול בפוראמיד. הגעה חדירות BRB בmicroliter של אוונס כחול לגרם של רשתית יבשה לשעה (μl hr / פלזמה / g רשתית wt היבש).
6. אופציונאלי ההעמסה אנגיוגרפיה
הערה: דליפה מכלי דם ברשתית בעכברים ניתן דמיינה ידי הזרקת intraperitoneal של והעמסת נתרן.
- הרדימי עכברי C57BL6J (שאיפת isoflurane, ראה שלב 4.1) ולהתרחב תלמידים עם טיפות עיניים (neosynephrine וmydriaticum). השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
- הזרק intraperitoneally .01-0.02 מיליליטר של 10% והעמסת נתרן בתמיסת מלח סטרילית 0.1 מיליליטר לאנגיוגרפיה והעמסת.
- לאסוף תמונות של שני העיניים לאחר הזרקה באמצעות מצלמה קרקעית העין. להקריב את עכברי משאיפת CO 2 לאחר פרוcedure.
הערה: 20 שניות נחוצות לכלי הרשתית להיות גלויים על אנגיוגרפיה. תמונות צריכים להיות בשבי בין 3-10 דקות לכל היותר לאחר הזרקה והעמסת. כתמי הדליפה (אם קיימים) ניתנים לצפייה לאחר 2.5 דקות. בנקודות זמן מאוחר יותר את איכות התמונה הולכת לאיבוד בשל העמסת נתרן לשדר לתמונות זגוגית, ובכך רק זמן קצר לאחר שהושגו משמשים לניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מצפים לתמרת רשתית של תאי גליה מולר באמצעות ShH10 אם מודל החיה מראה הפרעות במבנה של ILM (איור 2 א - ב). לדוגמא, הראינו כי בהעדר Dp71, מטרות ShH10 במיוחד אבל בצורה יעילה יותר Müller תאי גלייה ידי הזרקת תוך, המצביעים על חדירות מוגברות של ILM בקו העכבר הזה בהשוואה לעכברי wild-type 16 (איור 2C - F).
גם AAV5 יכול לשמש כמדד לחדירות ILM. AAV5, לא יעיל על ידי הזרקת תוך בעכברי wild-type, הופך חזק יעיל במסירת גן לקולטני אור בעכברים עם חסמי רשתית נפגעים כגון עכברי Dp71-null 16 או במחלות רשתית אחרות 22 (איור 2G - H). זה מאשר את חוסר ארגון ILM וincreas חדירות פוטנציאלי נוסףדואר במטריצת חוץ-התאית המקיפה את תאי העצב ברשתית.
מצאנו כי, התמוטטות BRB של עכברי Dp71-null נותרת סלקטיבי לחלקיקי AAV מאז ללא שמץ של AAV נמצאו בדגימות דם של הזריק intravitreally Dp71-null עכברי 16 (איור 3).
איור 1:. ייצוג סכמטי של הפרוטוקול הכללי לאחר ייצור AAV, חלקיקים מוזרקים לתוך הזגוגית או לוריד הפין לעכברים בוגרים בהרדמה. תמונות קרקעית עין עם המצלמה מיקרון III מבוצעות לעקוב ביטוי GFP. דפוס ביטוי GFP מנותח על cryosections הרשתית וflatmounted הודות רשתיות לאימונוהיסטוכימיה ותמונות confocal. מעבר AAV באמצעות BRB נבחנים על ידי ניתוח PCR על דגימות דם המגיעות מעכברי intravitreally או intrapenially מוזרקים, in כדי לזהות הנוכחות של רצף ה- GFP, מחוון של AAV חלקיקי נוכחות לתוך זרם הדם.
איור 2: חדירות ILM תמרת AAV תמונות Confocal של flatmounted wild-type ורשתיות Dp71-null שכותרתו עם נוגדן פאן-laminin (A, B). (סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר). תמונות קרקעית עין מראה ביטוי של GFP (C, D). Flatmounted רשתית חודש לאחר הזרקת תוך ShH10-GFP (E, F). שלושה הכינון מחדש ממדי (* E) באזור המסומן בכוכבית במראה E transduced תאי גליה מולר בירוק והאסטרוציטים ב( נוגדני GFAP אנטי) אדומים. Flatmounted רשתית חודש לאחר הזרקת תוך של AAV5-GFP (G, H) (סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר). תמונת Confocal של האזור המסומן בכוכבית בH מראה קולטני אור transduced במגזרים חיצוניים ירוקים וחרוט ב( צביעה לקטינים PNA) אדומה (* H). העמודה השמאלית מראה תוצאות מרשתית עכבר wild-type והעמודה האמצעית מציגה תוצאות מרשתית עכבר Dp71-null. הסכימה (I) מייצגת התמרה AAV של רשתית עם מחסומים נפרץ כרשתית Dp71-null, דרך הזגוגית. קיצורים: קורות חיים, כלי choroidal; הרשתית, אפיתל הפיגמנט ברשתית; רופאים לזכויות אדם, תאי קולטי אור (מוטות קונוסים); תאי גליה MGC, מולר; HC, תאים אופקיים; BC, תאים דו קוטביים; AC, תאי amacrine; M, מיקרוגליה; EC, תאי האנדותל; P, pericytes; GC, תאי הגנגליון; , האסטרוציטים; ILM, קרום הגבלה פנימי; V, זגוגית; AAV, וירוס adeno הקשורים. (Re-הדפסה באישור ואקה et al., גליה (2013) 16, # 3483740951391).
tp_upload / 52,451 / 52451fig3.jpg "/>
איור 3: חדירות BRB לחלקיקי AAV הגברה PCR של transgene GFP שחולץ מן דגימות דם עכבר.. עכברים או מוזרקים intravitreally (IVT) עם ShH10-GFP או intrapenially (IP) עם AAV-GFP בזמנים שונים לאחר הזרקה. ליין 5-18, מספרים מוזרים לעכברי wild-type ואפילו מספרים לעכברי Dp71-null; מסלול 2, 1 ננוגרם של פלסמיד AAV, PTR-SB-smCBA-hGFP; מסלול 3, מים; נתיבי 5-6, DNA דם לפני ההזרקה; נתיבים 7-8, 3 שעות שלאחר IVT; נתיבים 9-10, 24 שעות לאחר IVT; נתיבים 11-12, 24 שעות לאחר IP; נתיבים 13-14, 48 שעות לאחר IVT; נתיבים 15-16, 48 שעות לאחר IP; נתיבים 17-18, 72 שעות לאחר IVT; נתיבי 19-20, 72 שעות לאחר IP. נתיבים 1 ו -4, סולם Invitrogen קנה מידה (100 נ"ב): 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1,000, 1,500, 2,000, 3,000 נ"ב. (Re-להדפיס באישור ואקה et al., גליה (2013) 16, # 3483740951391).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BRB מסדיר את חילופי מולקולות בין הדם לרשתית. התמוטטותה קשורה למחלות שונות כגון רטינופתיה סוכרתית או ניוון מקולרים הקשור לגיל (AMD). לאחרונה הראו כי בעכבר דיסטרופין נוק-אאוט, אשר מציג BRB החדיר, הרשתית הופכת להיות יותר מתירנית למסירת הגן בתיווכו של וקטורי adeno הקשורים ויראלי (AAV). עם זאת, למרות חלקיקי AAV חדירות BRB הוחדר intraocularly להישאר מרותק לתא העיני במודל זה. התוצאות שלנו מצביעות על כך שהריפוי גנטי למחלות המציגות BRB החדיר אינו מייצג סיכונים נוספים של תופעות לוואי מערכתיים. יתר על כן, הם תומכים בעובדה שמחסומים אחרים כגון ILM הופכים נפגעו במהלך מחלת רשתית המאפשרת גישה טובה יותר לחלקיקים נגיפיים. הממצאים שלנו יובילו אותנו לחשוב שגנים כתב קידוד AAV הוא כלי מצוין ללמוד חדירות BRB ויושרה ILM במודלים של בעלי חיים במחלות רשתית. Particularly, ShH10 גרסת AAV, שבמיוחד תוויות גליה מולר יכול לשמש ככלי לתווית גליה רשתית ולדווח על מצב הרשתית בתגובה למחלה. ShH10 יהיה סלקטיבי תווית גליה מולר בשתי רשתיות בריאים וחולה. עם זאת, שני ShH10 וAAVs האחר יספק מסירת גן יעילה יותר ברשתית עם מחסומים נפרץ.
כמה שלבים קריטיים ביישום הפרוטוקולים-שתואר לעיל (1) פיתוח מיומנות ידנית לבצע הזרקת התוך הבטוחה ביותר, ו- (2) תיקון הרקמות כראוי לפני ואחרי הניתוח. בלימוד מחסומי רשתית, הזרקת התוך צריכה להיות מוצאת להורג גם כי הוא - בלי לגעת בעדשה או הרשתית. נזק לעדשה או ניתוק הרשתית משפיע 23,24 חדירות BRB. בנוסף לנזק עדשה פוגע הדמיה קרקעית עין. לגעת ברשתית יכול להיקרע ILM ולפגוע במבנה הרשתית. כדי להימנע מלגעת ברשתית, ההתנסותmenter צריך לבחון את קצה מזרק המילטון באמצע חלל הזגוגית, מול הרשתית. צבע שאינו רעיל יכול להיכלל (כגון פנול אדום או העמסה) בפתרון הנגיפי כדי לסייע בהתבוננות בהזרקת הנוזל לתוך הזגוגית. נזק לרשתית ניתן להבחין בקלות במהלך ההדמיה הקרקעית הבאה הליך ההזרקה. עוד צעד קריטי הוא הקיבוע של הרקמה לאחר רמות ביטוי מספיק הם הגיעו. לאחר enucleation, חייבים להיות שקועים עיניים מייד במאגר מקבע ולפני permeabilization רקמת קיבעון שני הוא הכרחי על מנת למנוע דליפת GFP. זה יכול להיות מועיל כדי לחתוך את הקרנית לפני הטבילה כל עין במקבעת - זה ייתן לי מקבע סיכוי לחלחל לתוך הזגוגית. צעד זה עלול להגביר את יציבות הרקמה הכוללת.
לבסוף, חשוב גם להזריק מספיק חלקיקי AAV לtransduce יעילות הרשתית ולהתבונן לשעבר GFPpression על תמונות קרקעית העין. הכמות האופטימלית של חלקיקי AAV היא כ -10 10 -10 11 VG לכל עין, מתחת ל- 10 10 חלקיקי ביטוי GFP לא נצפה תמיד על ידי הדמיה קרקעית עין.
טכניקה זו לא תיתן את האפשרות לקיים את ILM או כלי הדם מתחת לBRB ישירות. עם זאת, מספק דרך לבחון חסמי רשתית ושינוים במצבי מחלה, באופן שהיה בעבר לא ניתן באמצעות assay הכחול אוונס ואנגיוגרפיה והעמסת. באמצעות AAVs עם מאפייני התמרה רשתית ספציפיים, אפשר לקבל תובנות טובות יותר את מצב הרשתית ביחס לתאי גליה, מטריצת החוץ תאית שלהם וILM. לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבחון את היעילות של אסטרטגיות טיפוליות וההשפעה שלהם על BRB וחדירות רשתית וללכת לכיוון הבנה טובה יותר של התקדמות מחלה והאפשרות לשחזר תנאים נורמלים אחרי שהטיפולמודל עכבר na של מחלה ברשתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0.5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight - 8.5 cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| curved Vanna scissor | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
