Abstract
Las células de Müller son las principales células gliales de la retina. Sus pies finales forman los límites de la retina en las membranas limitantes exterior e interior (ILM), y en conjunción con los astrocitos, los pericitos y células endoteliales que establecen la barrera sangre-retina (BRB). BRB limita el transporte de material entre el torrente sanguíneo y la retina mientras que la ILM actúa como una membrana basal que define histológicamente la frontera entre la retina y la cavidad vítrea. Etiquetado de las células de Müller es particularmente relevante para estudiar el estado físico de las barreras de la retina, ya que estas células son una parte integral de la BRB y ILM. Tanto BRB y ILM se alteran con frecuencia en enfermedades de la retina y son responsables de síntomas de la enfermedad.
Hay varios métodos bien establecidos para estudiar la integridad de la BRB, tales como el ensayo de azul de Evans o la angiografía con fluoresceína. Sin embargo, estos métodos no proporcionan información sobre el grado de permeabilidad BRB to moléculas más grandes, en el rango nanométrico. Además, no proporcionan información sobre el estado de otras barreras de la retina tales como la ILM. Para estudiar la permeabilidad BRB junto ILM de la retina, se utilizó un método basado en AAV que proporciona información sobre la permeabilidad de BRB a moléculas más grandes, mientras que indica el estado de las proteínas de ILM y de la matriz extracelular en estados de enfermedad. Dos variantes de AAV son útiles para tal estudio: AAV5 y ShH10. AAV5 tiene un tropismo natural para fotorreceptores pero no puede conseguir a través de la retina externa cuando se administra en el vítreo cuando la ILM está intacto (es decir, en las retinas de tipo salvaje). ShH10 tiene un fuerte tropismo hacia las células gliales y etiquetará selectivamente células de Müller en ambas retinas sanas y enfermas. ShH10 proporciona la entrega de genes más eficiente en retinas donde se ve comprometida ILM. Estas herramientas virales, junto con el análisis de inmunohistoquímica y de ADN de sangre arrojan luz sobre el estado de las barreras de la retina en la enfermedad.
Introduction
Las células de Müller son el principal componente glial de la retina. Morfológicamente, que abarcan la retina radial y su endfeet, en contacto con el vítreo, se enfrentan a la ILM y componentes secretos de este último. El ILM es una membrana basal compuesta de unos diez diferentes proteínas de la matriz extracelular (laminina, agrina, perlecan, nidogen, colágeno y varios proteoglicanos de sulfato de heparina). Durante el desarrollo, su presencia es indispensable para la histogénesis de la retina, la navegación de axones ópticos, y la supervivencia de las células ganglionares de 1-3. Sin embargo, ILM no es esencial en la retina de adultos y se puede extirpar quirúrgicamente en ciertas patologías sin causar daño en la retina 4. En la terapia génica, esta membrana se convierte en una barrera física para la transducción eficiente de la retina utilizando AAV mediante inyección intravítrea 5.
A través de la extensa arborización de sus procesos, las células de Müller proporcionan suppo nutricional y regulatoriort a ambas neuronas de la retina y células vasculares. Las células de Müller también están involucrados en la regulación de la homeostasis de la retina, en la formación y mantenimiento de la BRB 6. Las uniones estrechas entre las células endoteliales de los capilares de la retina, las células de Müller, astrocitos y pericitos forman la BRB. BRB evita ciertas sustancias entren en los retina.In muchas enfermedades como la retinopatía diabética, oclusión venosa de la retina y las enfermedades respiratorias, la hipoxia de la retina provoca fugas a través de la BRB 7-9. Esta ruptura se asocia con un aumento de la permeabilidad vascular que conduce a edema vasogénico, desprendimiento de retina y daño en la retina.
Las células de Müller están estrechamente asociados con los vasos sanguíneos y la membrana basal, jugando un papel importante tanto en la integridad BRB y ILM. En consecuencia, el etiquetado de las células gliales de Müller es particularmente relevante para el estudio del estado físico de estas barreras de la retina.
Clásicoaliado, BRB permeabilidad se mide utilizando el ensayo de azul de Evans que consiste en la inyección sistémica de colorante azul de Evans, que se une no covalentemente a la albúmina plasmática. Este ensayo mide la pérdida de albúmina (proteína de tamaño intermedio, ~ 66 kDa) de los vasos sanguíneos en la retina (ver Protocolos Sección 5) 10. Alternativamente, la fuga vascular puede ser visualizado por la angiografía de fluorescencia de la retina en el que conste de fuga de fluoresceína (molécula pequeña, ~ 359 Da; véase Protocolos Sección 6) 11. Sin embargo, ambos métodos permiten la evaluación de la permeabilidad BRB a pequeñas moléculas y proteínas, pero que no proporcionan información sobre la integridad ILM.
Por lo tanto, para estudiar BRB permeabilidad, se utilizó un método basado en AAV que da información sobre la permeabilidad BRB a moléculas más grandes (por ejemplo, partículas de AAV, 25 nm de diámetro). De hecho, nuestro método puede detectar la presencia de transgen AAV en la sangre, lo que sugeriría que ~ partículas de 25 nm de diámetro haríaser capaces de infiltrarse en el torrente sanguíneo. Este método también proporciona información sobre la estructura de la ILM y las proteínas de la matriz extracelular en condiciones patológicas. Dos variantes de AAV son útiles para tal estudio: AAV5 y ShH10. Subretinally inyectado, AAV5 tiene un tropismo natural para los fotorreceptores y el epitelio pigmentario de la retina 12 pero no se puede conseguir a través de la retina externa cuando se administra en el vítreo en las retinas de tipo salvaje con ILM intacta 5,13. ShH10 es una variante de AAV que ha sido diseñado para dirigirse específicamente a las células gliales más de neuronas 14,15. ShH10 etiquetas selectivamente las células de Müller en ambas retinas sanas y enfermas con una mayor eficiencia en las retinas con barreras comprometidas 16. Estas herramientas virales junto con immuhistochemistry y el análisis de ADN de sangre proporcionan información sobre el estado de las barreras de la retina y su implicación en la enfermedad (Figura 1).
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Protocol
Todos los animales utilizados en este estudio fueron atendidos y manejados de acuerdo a la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research.
1. Producción de AAV recombinante (rAAV) por transfección transitoria de células HEK-293 17,18
NOTA: Ver McClure C, JoVE (2011) 19.
- Se purifica una preparación de plásmido a gran escala (por lo menos 1 mg / ml) de los plásmidos vectores de AAV. Utilice 3 plásmidos. El plásmido auxiliar AAV que lleva los genes de replicación y de la cápsida sin el terminal invertida de AAV ITRs se repite, el casete de expresión del transgén que lleva el AAV ITR conoce como el plásmido de transferencia, y el plásmido suministro de los genes auxiliares de adenovirus E2, E4, y los genes VA RNA que se hace referencia como pHELPER.
- Transfectar células 293 con estos 3 plásmidos usando polietilenimina (u otro reactivo de transfección). Por encima de 80% de eficiencia de transfección es necesario para una buena virendimientos RAL.
- Purificar AAV recombinante a partir de lisados de células 293 en un gradiente de iodixanol. 15%, 25%, 40% y 60% iodixanol se utiliza para obtener el gradiente. Recoger la fracción de iodixanol 40% que contiene partículas de AAV, concentrar la fracción después de ultracentrifugación a 500.000 xg durante 1 hr y tampón de intercambio frente a PBS (tampón fosfato salino) con 0,001% de Pluronic.
- Para determinar el título genómica viral 20, realizar una DNAsa proteinaseK compendio seguido por QPCR. Los cebadores directo e inverso amplificar la región de 62 pb situada en el AAV2 ITR. Para el estándar plásmido, la sonda está marcada con FAM y tiene un agujero negro extintor (BHQ).
- Llevar a cabo qPCR (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa) en un volumen final de 25 l usando 340 nM cebador inverso ITR, 100 nM de cebador ITR hacia adelante, 100 nM de la sonda AAV2 ITR, 0,4 mM dNTPs, 2 mM MgCl2, 1x Platinum Taq Buffer, 1U Platinum Taq y plantilla 5 l (estándar, muestra y control sin molde).
- Parael estándar, utilice el plásmido para la transfección en 7 x 10 veces diluciones seriadas (5 l de cada uno de 2 x 10 9 a 2 x 10 3 genomas / ml que resulta en una concentración final de 10 octubre-10 abril genomas / ml).
- Comience el programa de una etapa de desnaturalización inicial a 95 ° C durante 15 min seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C en durante 1 min y recocido / extensión a 60 ° C durante 1 min. Almacenar a 4 ° C durante un almacenamiento a corto plazo oa -20 ° C para el almacenamiento prolongado.
2. inyección intravítrea de AAV
- Anestesiar a los ratones C57BL6J con ketamina (50 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) y verificar la pérdida del reflejo de enderezamiento, el reflejo de retirada y de pinzamiento del rabo de respuesta que indica una anestesia adecuada. Dilatar los alumnos mediante la aplicación de la córnea de neosinefrina 5% y 0,5% mydriaticum gotas para los ojos. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
- Aprobar un ultrafino 30 G disposabLe aguja a través de la línea ecuatorial y al lado del limbo, en la cavidad vítrea (ver Chiu K, JoVE (2007) 21). Inyectar 1 l de stock contiene de 1 a 4 x 10 11 vp de ShH10-GFP o AAV5-GFP con la observación directa de la aguja en el centro de la cavidad vítrea (Figura 1). Utilice un ojo como un control para los experimentos de ILM. Inyectar ambos ojos para experimentos BRB. Aplicar un tratamiento tópico antiinflamatorio y antibacteriano en los ojos inyectados.
- Dilatar alumnos con neosinefrina y cae mydriaticum ojo para la imagen. Realizar exámenes de fondo de ojo con una cámara de fondo de ojo para seguir GFP (Green Fluorescent Protein) expresión 1 semana, 2 semanas, 1 mes y 2 meses después de la inyección intravítrea (Figura 1). Sacrificar los ratones por inhalación de CO2 1 a 2 meses después de la inyección.
3. La inmunohistoquímica
- Para cryosections de la retina (Figura 1), diseccionar ojos enucleados para eliminar lens y la córnea, y la inmersión en solución 4% de paraformaldehído durante 1 hr.
- Cryoprotect los ojos previamente fijados en 10% de sacarosa durante 1 hora a temperatura ambiente, 20% de sacarosa para otra hora a temperatura ambiente. Cryoprotect en solución de sacarosa al 30%, durante la noche a 4 ° C. Congelar y incrustar ojeras en la incrustación de resina tal como Cryo-matriz. Hacer 10 micras cryosections y montar en portaobjetos tratados especialmente para las secciones de tejido congelado y que mejoran la adherencia del tejido durante la tinción.
- Permeabilizar secciones con 0,1% de Triton X100 en PBS pH 7,4 durante 5 min. Lavar 2x en PBS y el bloque durante 1 hora a temperatura ambiente en PBS con 1% de BSA, 0,1% de Tween 20.
- Para flatmounts de la retina (Figura 1), fijar los ojos enucleados en 4% de paraformaldehído durante 15 min para facilitar la disección.
- En 15-30 min, diseccionar los ojos para eliminar la córnea y el cristalino. Se separa la retina del epitelio pigmentario de la retina (RPE) y la esclerótica cortando alrededor de la ora serrata yel nervio óptico. Sumergir en paraformaldehído al 4% durante otros 30 min para fijar la retina y la proteína fluorescente en las células de la retina transducidas (fijación no debe exceder de 24 hr). Lavar 5 min en PBS estéril, pH 7,4.
- Cambiar el PBS a tampón de bloqueo (PBS con 1% de BSA, 2% de suero normal de cabra o de burro, 0,5% Triton X-100), e incubar en tampón de bloqueo, ya sea para 4 hr a temperatura ambiente o 4 ° C durante la noche.
- Incubar los tejidos con anticuerpos primarios en tampón de bloqueo, ya sea para 4 horas a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la noche. Lavar 3 veces con PBS.
NOTA: Los anticuerpos utilizados son los siguientes: anti-laminina (1 / 1.000) marcar la ILM, clon anti-rodopsina 4D2 (1/500) varillas de etiquetado, (1 / 1.500) de etiquetado células de Müller clon sintetasa anti-glutamina GS-6 , PNA lectina (1/40) conos de etiquetado. - Incubar los tejidos con dilución 1: 500 de anticuerpos secundarios conjugados Alexa Fluor en tampón de bloqueo durante 1 hora (cryosections) o 2 hr (flatmounts) a tempe habitacióntura y protegido de la luz. Lavar 3 veces con PBS.
- Hacer el alivio de los recortes a la retina y flatmount sobre un portaobjetos de vidrio, ya sea con el fotorreceptor o el lado de células ganglionares de la retina (RGC) mirando hacia arriba. Añadir mountingmedium acuosa, aplique cubreobjetos y se almacena a 4 ° C.
- Realizar la microscopía confocal de escaneo láser confocal microscopio. Adquirir imágenes de forma secuencial, línea por línea, para reducir la excitación y la diafonía de emisiones. Definir tamaño de paso de acuerdo con el teorema de muestreo de Nyquist-Shannon. Utilice los ajustes de exposición que minimicen píxeles sobresaturados en las imágenes finales. Proceso de imágenes de 12 bits con FIJI, proyecto Z-secciones en un solo plano utilizando máxima intensidad bajo la función Z-proyecto y, finalmente, convertirse al modo de color de 8 bits RGB.
4. Análisis de PCR de muestras de sangre de ratón
- Inyectar 100 l de stock contiene de 1 a 4 x 10 11 partículas de un AAV-GFP en la vena del pene de ratones C57BL6J anestesiados (5% de isofluranopara la inducción en una cámara de cierre y 2,5% de isoflurano a través de un cono de la nariz durante la cirugía) usando una jeringa de insulina con una aguja de ultra-fina 6 mm. Este animal servirá como control positivo de la circulación de partículas de AAV.
- Muestra de sangre de la cola del ratón antes de la inyección y 3 horas, 24 horas, 2 días y 3 días después de la inyección intravítrea ShH10 o después de la inyección intrapeniles (Figura 1). Acerca de 10-20 l se recoge en tubos de heparina. Sacrificar los ratones por inhalación de CO 2 después de la finalización del procedimiento.
- Extraer el ADN genómico de las muestras de sangre utilizando el kit de extracción de su elección.
- Realizar la amplificación por PCR de ADN genómico. Para este protocolo utilice el siguiente par de cebadores: GFP, sentido 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', 5'-antisentido CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3'. El siguiente programa de PCR se realizó: 95 ° C 2 min (1 ciclo); 95 ° C 45 seg, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 seg (30 ciclos); 72 ° C 5 min (1 ciclo);4 ° C espera.
5. Opcional Evans Método Azul
NOTA: Cuantificar la permeabilidad vascular mediante la medición de la albúmina de fuga de los vasos sanguíneos en la retina utilizando el método de azul de Evans 10.
- Preparar colorante azul de Evans por disolución en una solución salina normal (6 mg / ml), sonicación durante 5 min en un limpiador ultrasónico, y filtración a través de un filtro de 5 micras.
- Anestesiar ratones C57BL6J (inhalación isoflurano, consulte el paso 4.1), comprobar la pérdida de los reflejos, el reflejo de retirada y la respuesta pizca de cola que indica una anestesia adecuada, y se inyecta azul de Evans (45 mg / kg) a través de la vena del pene (Figura 1). Compruebe que las patas, el hocico y las orejas de ratones se vuelven claramente azul después de la inyección azul de Evans, lo que confirma la captación y distribución del colorante.
- Anestesiar a los ratones C57BL6J 3 hr después de la inyección del colorante con ketamina (50 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) y verificar la pérdida de righting reflex que indica una anestesia adecuada. Muestra intracardially aproximadamente 500 l de sangre en tubos de heparina y perfundir los ratones para 2 min a través del ventrículo izquierdo con un tampón de citrato (0,05 M, pH 3,5; disolver 7,8 g de ácido cítrico y 3,8 g de citrato de sodio en 1 L de agua destilada) pre-calentado a 37 ° C para evitar la vasoconstricción. Los ratones se sacrificaron a través de la perfusión.
- Después de la perfusión, enucleate y cuidadosamente diseccionar los dos ojos bajo un microscopio quirúrgico para recoger las retinas (ver sección 3.2). Retinas secos en un evaporador centrífugo durante la noche, pesan, y extraer el colorante azul de Evans incubando retinas con 100 l de formamida de 18 horas a 65 ° C con agitación (100 xg). Muestras Centrífuga retina en 30K tubos de filtro omega en 20,798.5 xg durante 2 horas a 4 ° C y las muestras de sangre se centrifuga a 20,798.5 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Use ambos sobrenadantes para medir la absorbancia. Determinar la absorbancia de cada muestra sustrayendo la absorbancia máxima for Evans azul a 620 nm al mínimo la absorbancia a 740 nm. Calcular la concentración de azul de Evans en el plasma y la retina de una curva patrón de azul de Evans en formamida. Expresar BRB permeabilidad en microlitros de azul de Evans por gramo de retina seco por hora (l plasma / g de peso seco de la retina / hr).
6. Opcional angiografía con fluoresceína
NOTA: Las fugas de los vasos sanguíneos de la retina en ratones puede ser visualizado por inyección intraperitoneal de fluoresceína de sodio.
- Anestesiar ratones C57BL6J (inhalación isoflurano, consulte el paso 4.1) y dilatar pupilas con gotas para los ojos (neosinefrina y mydriaticum). Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
- Inyectar por vía intraperitoneal 0,01-0,02 ml de 10% de fluoresceína sódica en 0,1 ml de solución salina estéril para la angiografía con fluoresceína.
- Recoge imágenes de ambos ojos después de la inyección utilizando una cámara de fondo de ojo. Sacrificar los ratones por inhalación de CO2 después de la proprocedimiento.
NOTA: 20 segundos son necesarios para los vasos de la retina que se hacen visibles en la angiografía. Las imágenes tienen que ser capturado entre 3-10 min máximo después de la inyección de fluoresceína. Los puntos de fuga (si existe) se observan después de 2,5 min. En los puntos de tiempo posteriores la calidad de la imagen se pierde debido a la fluoresceína sódica difundirse en los así sólo imágenes vítreas, poco después de obtenidos se utilizan para el análisis.
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Representative Results
Nos esperar un aumento de la transducción de la retina de las células gliales de Müller utilizando ShH10 si el modelo animal muestra perturbaciones en la estructura de la ILM (Figura 2A - B). Por ejemplo, hemos demostrado que, en ausencia de DP71, objetivos ShH10 específicamente, pero de manera más eficiente Müller células gliales por inyección intravítrea, lo que indica aumento de la permeabilidad de la ILM en esta línea de ratón en comparación con ratones de tipo salvaje 16 (Figura 2C - F).
AAV5 también se puede utilizar como un indicador de la ILM permeabilidad. AAV5, ineficaz por inyección intravítrea en ratones de tipo salvaje, se vuelve fuertemente eficaz en el suministro de genes a los fotorreceptores en ratones con barreras de la retina comprometidos, tales como los ratones DP71-null 16 o en otras degeneraciones de la retina 22 (Figura 2G - H). Esto confirma una vez más la desorganización ILM y potenciales Increas permeabilidade en la matriz extra-celular que rodea las neuronas de la retina.
Se encontró que, el desglose BRB de ratones DP71 nulo sigue siendo selectivo para partículas de AAV ya no hay rastro de AAV se encontraron en las muestras de sangre de Inyección intravítrea-DP71 nulo ratones 16 (Figura 3).
Figura 1:. Representación esquemática del protocolo general Después de la producción de AAV, las partículas se inyectan en el vítreo o en la vena del pene para ratones adultos anestesiados. Imágenes de fondo de ojo con cámara Micron III se realizan para seguir la expresión de GFP. El patrón de expresión de GFP se analizó en criosecciones de la retina y flatmounted retinas gracias a la inmunohistoquímica y las imágenes confocales. El paso a través de la AAV BRB se determinó mediante análisis de PCR en muestras de sangre procedentes de ratones por vía intravítrea o intrapenially inyectados, in fin de detectar la presencia de la secuencia GFP, indicador de la presencia de AAV partículas en el torrente sanguíneo.
Figura 2: ILM permeabilidad a la transducción de AAV Confocal imágenes de flatmounted de tipo salvaje y DP71 nulos retinas marcado con un anticuerpo pan-laminina (A, B). (Barra de escala: 50 micras). Imágenes de fondo de ojo que muestran la expresión de GFP (C, D). Retinas Flatmounted un mes después ShH10-GFP inyección intravítrea (E, F). Tres reconstitución dimensiones (E *) de la zona indicada por un asterisco en E muestra transduce células gliales de Müller en verde y astrocitos en rojo (anticuerpo anti-GFAP). Retinas Flatmounted un mes después de la inyección intravítrea de AAV5-GFP (G, H) (barra de escala: 500 micras). Imagen confocal de la zona indicada por un asterisco en H mostrando fotorreceptores transducidas en segmentos externos verdes y conos en rojo (tinción de lectina PNA) (H *). La columna de la izquierda muestra los resultados de las retinas de ratones de tipo salvaje y la columna central muestra los resultados de las retinas de ratones DP71-nulos. El esquema (I) representa AAV transducción de retina con barreras comprometidas como DP71 nulo retina, a través del humor vítreo. Abreviaturas: CV, vasos coroideos; RPE, el epitelio pigmentario de la retina; PhR, células fotorreceptoras (conos y bastones); Células gliales MGC, Müller; HC, las células horizontales; BC, células bipolares; AC, células amacrinas; M, microglia; EC, células endoteliales; P, pericitos; GC, células ganglionares; A, astrocitos; ILM, la membrana limitante interna; V, vítreo; AAV, virus adeno-asociado. (Re-imprimir con permiso de Vacca et al., Glía (2013) 16, # 3483740951391).
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Figura 3: la permeabilidad BRB a partículas de AAV amplificación por PCR del transgén GFP extraído de muestras de sangre de ratón.. Los ratones ya sea inyectado por vía intravítrea (IVT) con ShH10-GFP o intrapenially (IP) con AAV-GFP en diferentes momentos después de la inyección. Carril 5-18, los números impares para los ratones de tipo salvaje y los números pares de ratones DP71 nulos; carril 2, 1 ng del plásmido AAV, PTR-SB-smCBA-hGFP; carril 3, el agua; carriles 5-6, el ADN de la sangre antes de la inyección; carriles 7-8, 3 horas después de la formación profesional inicial; carriles 9-10, 24 horas después de la formación profesional inicial; carriles 11-12, 24 horas después de la IP; carriles 13-14, 48 horas después de la formación profesional inicial; carriles 15-16, 48 horas después de la IP; carriles 17-18, 72 horas después de la formación profesional inicial; carriles 19-20, 72 horas después de la IP. Los carriles 1 y 4, escalera de escala de Invitrogen (100 bp): 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000 pb. (Re-imprimir con permiso de Vacca et al., Glía (2013) 16, # 3483740951391).
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Discussion
El BRB regula el intercambio de moléculas entre la sangre y la retina. Su composición se asocia con varias enfermedades tales como la retinopatía diabética o la degeneración macular relacionada con la edad (AMD). Recientemente, hemos demostrado que en un ratón distrofina ronda, que muestra permeable BRB, la retina se vuelve más permisiva para la entrega de genes mediada por vectores virales adeno-asociados (AAV). Sin embargo, a pesar de BRB partículas de AAV permeabilidad intraocular inyectado mantenerse confinado en el compartimiento ocular en este modelo. Nuestros resultados indican que la terapia génica para las enfermedades que muestran BRB permeable no representa riesgos adicionales de efectos secundarios sistémicos. Además, apoyan el hecho de que otras barreras como la ILM verse en peligro durante la enfermedad de la retina que permite un mejor acceso a las partículas virales. Nuestros resultados nos llevan a pensar que los genes indicadores codificación AAV es una excelente herramienta para estudiar BRB permeabilidad e integridad ILM en modelos animales de enfermedad de la retina. Particucialmente, la ShH10 variante AAV, que marca específicamente las células de Müller se puede utilizar como una herramienta para etiquetar glía retina e informar sobre el estado de la retina en respuesta a la enfermedad. ShH10 etiquetará selectivamente células de Müller en ambas retinas sanas y enfermas. Sin embargo, tanto ShH10 y otros AAVs proporcionarán la entrega de genes más eficiente en retinas con barreras comprometidos.
Algunos pasos críticos en la aplicación de los protocolos descritos anteriormente son (1) el desarrollo de la destreza manual para realizar la inyección intravítrea más segura, y (2) la fijación adecuada del tejido antes y después de la disección. En el estudio de las barreras de la retina, la inyección intravítrea debe ser bien ejecutado que es - sin tocar la lente o la retina. Dañar la lente o quite la retina influye en la permeabilidad 23,24 BRB. Además daño de la lente impide formación de imágenes del fondo de ojo. Tocar la retina puede romper la ILM y dañar la estructura de la retina. Para evitar el contacto con la retina, la expeMenter debe observar la punta de la jeringa Hamilton en el medio de la cavidad vítrea, delante de la retina. Un colorante no tóxico puede ser incluido (tales como fenol rojo o fluoresceína) en la solución viral para ayudar en la observación de la inyección de fluido en el humor vítreo. El daño a la retina se puede observar fácilmente durante la exploración del fondo de ojo, siguiendo el procedimiento de inyección. Otro paso crítico es la fijación del tejido después de que se alcancen los niveles de expresión suficientes. Después de la enucleación, los ojos deben sumergirse inmediatamente en tampón fijador y antes de la permeabilización de tejido es necesaria una segunda fijación con el fin de evitar fugas de GFP. Puede ser útil para cortar la córnea antes de sumergir todo el ojo en el fijador - esto le dará el fijador oportunidad de penetrar en el vítreo. Este paso puede aumentar la estabilidad general del tejido.
Por último, también es importante para inyectar partículas de AAV suficientes para transducir eficientemente la retina y para observar GFP excompresión de imágenes de fondo de ojo. La cantidad óptima de partículas de AAV es de aproximadamente 10 10 -10 11 vg por ojo, por debajo de 10 10 partículas de la expresión de GFP no siempre se observa por imágenes de fondo de ojo.
Esta técnica no va a dar la posibilidad de observar directamente la ILM o la vasculatura debajo de la BRB. Sin embargo, proporciona una forma de examinar las barreras de la retina y su modificación en estados de enfermedad, de manera que anteriormente no era posible utilizando el ensayo de azul de Evans y angiografía con fluoresceína. El uso de AAV con propiedades específicas de transducción de la retina, es posible obtener una mejor visión en el estado de la retina con respecto a las células gliales, su matriz extracelular y ILM. Después de dominar esta técnica, se puede comprobar la eficacia de las estrategias terapéuticas y su influencia en BRB y la permeabilidad de la retina e ir hacia una mejor comprensión de la evolución de la enfermedad y la posibilidad de restablecer las condiciones normales después del tratamiento ina modelo de ratón de enfermedad de la retina.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0.5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight - 8.5 cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| curved Vanna scissor | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
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