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Biology

मल्टिप्लेक्स अनुप्रयोगों के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ जेनेटिक बारकोडिंग

Published: April 14, 2015 doi: 10.3791/52452
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, San Diego State University

Introduction

ऐसे प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry के रूप में प्रौद्योगिकी, सभी प्रतिदीप्ति पर भरोसा करते हैं, एक संपत्ति को व्यापक रूप से जैव रासायनिक, जैव चिकित्सा, और रासायनिक अनुप्रयोगों में शोषण किया। प्रतिदीप्ति, आंतरिक या लेबलिंग के माध्यम से, प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न और प्रोफाइल, सेल भाग्य, प्रोटीन बातचीत और जैविक कार्यों 1-9 के विश्लेषण के लिए शोषण किया गया है, और चाहे बायोमोलिक्यूल बातचीत और गठनात्मक परिवर्तन का पता लगाने के लिए प्रतिदीप्ति / Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण के माध्यम से 10-13। Aequorea विक्टोरिया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) 14 के अलगाव के बाद से, अन्य निडारियंस, विशेष रूप से मूंगों से अतिरिक्त प्राकृतिक रूप से उत्पन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन की खोज की है, काफी हद तक अलग पहचाना / उत्तेजना उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ मौजूदा फ्लोरोसेंट प्रोटीन की संख्या बढ़ गई है। ये एक साथ उनके जीनों 15-19 में परिवर्तन की शुरूआत के साथ, हवलदारई आगे उनके अनुसंधान के लिए cytometry और अन्य प्रतिदीप्ति आधारित प्रौद्योगिकियों प्रवाह, माइक्रोस्कोपी का फायदा उठाने कि वैज्ञानिकों के लिए उपलब्ध फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक सच पैलेट प्राप्त करने, संभावनाएं विस्तार किया।

समानांतर में, स्वतंत्र रूप से हालांकि, रेट्रोवायरल प्रौद्योगिकी के विकास के लिए काफी स्तनधारी कोशिकाओं 20-23 में अस्थानिक आनुवांशिक जानकारी के स्थिर अभिव्यक्ति में मदद की है। यह इस प्रौद्योगिकी प्रकार की कोशिकाओं और ऊतकों 24-28 की एक व्यापक संख्या में या ट्रांसजेनिक जानवरों 29-31 के उत्पादन के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन का जीन स्थानांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि इस प्रकार आश्चर्य की बात नहीं है। रेट्रोवायरस की प्रकृति के बाद, अस्थानिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के आनुवंशिक जानकारी सेल 32 के जीनोम के भीतर शुरू की है और सेल ever' के लिए `फ्लोरोसेंट हो जाता है। यह गुण सेल भाग्य की ट्रैकिंग की अनुमति दी है, या कोशिकाओं की आबादी के भीतर एक एकल कोशिका की गई है। अब फ्लोरोसेंट सेल इस प्रकार Acqui हैअपनी ही biosignature लाल और barcoded के रूप में परिभाषित किया जा सकता है। अपनी अनूठी biosignature अन्य कोशिकाओं से इसे पहचानती है, और महत्वपूर्ण बात है, आनुवंशिक रूप से अलग पहचाना अवशोषण / उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए चालाकी से कोशिकाओं से अलग करता है। ऐसे pluripotency 33 की ओर reprogramming के कारकों की ट्रैकिंग के रूप में जैविक अनुप्रयोगों, nucleolar स्थानीयकरण 34 की व्याख्या के लिए subnuclear कारकों का विश्लेषण, ट्रांसक्रिप्शनल पढ़ाई 35 या neuronal नेटवर्क वास्तुकला 36 के अध्ययन के लिए न्यूरॉन्स की आनुवंशिक लेबलिंग के लिए फ्लोरोसेंट संवाददाता plasmids के निर्माण , एक ही प्रयोगात्मक स्थापना के लिए विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन का शोषण किया है कि कई के सिर्फ चार उदाहरण हैं।

Cytometry के मोटे तौर पर इस तरह के जीन की अभिव्यक्ति, कोशिका चक्र, apoptosis के रूप में एकल कोशिका के स्तर पर जैविक प्रक्रियाओं, के विश्लेषण के लिए उपयोग किया है, और phosphoryl के माध्यम से संकेत दिया गया है प्रवाहस्तनधारी कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन की व्यावहारिक 37-43 व्याप्ति में स्थिर अभिव्यक्ति आगे सेल विश्लेषण 38,44 और ligand- रिसेप्टर बातचीत 45 के लिए फ्लो की उपयोगिता को बढ़ाया है। क्षमताओं को बढ़ाया cytometry के उच्च throughput और उच्च सामग्री 46 स्क्रीनिंग के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग कार्यप्रणाली बनने के प्रवाह की अनुमति दी है। युगल प्लेट रीडर प्रणाली, इमेजिंग और प्रवाह cytometry कर सकते हैं कि fluorometers और रोबोटिक्स प्रौद्योगिकियों का अब विस्तार संख्या के बावजूद, शोषण और इन बढ़ाया तकनीकी क्षमताओं फिट कर सकते हैं कि प्रयोगात्मक डिजाइन में कमी नहीं हो रहा है।

तेज, विश्वसनीय, सरल और मजबूत सेल आधारित तरीके में काफी आगे उच्च throughput क्षमता बढ़ाने कि मल्टिप्लेक्स अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक हैं। एक मल्टिप्लेक्स प्रारूप में इंजीनियरिंग सेल आधारित assays उच्च throughput स्क्रीनिंग 39,47-50 की शक्ति को बढ़ाने के लिए कर सकते हैं जहां यह दवाओं की खोज के क्षेत्र में विशेष रूप से सच है 51-54 को बढ़ाता है। फ्लोरोसेंट आनुवंशिक बारकोडिंग सुरुचिपूर्ण बहुसंकेतन के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी एक बार इंजीनियर, समय लेने वाली प्रोटोकॉल की जरूरत circumvents, एंटीबॉडी, माला और दाग 39,52,55 के साथ साथ लागत कम कर देता है, और उच्च के लिए आवश्यक स्क्रीन की संख्या को कम कर सकते हैं न केवल आवेदन throughput। हमने हाल ही में जैविक अनुप्रयोगों के लिए, पहले से विभिन्न चिकित्सकीय प्रचलित वेरिएंट 58 के साथ एचआईवी -1 प्रोटीज गतिविधि 56,57 नजर रखने के लिए विकसित की एक परख व्यक्त फ्लोरोसेंट आनुवंशिक बारकोडिंग के माध्यम से बहुसंकेतन वृद्धि कर सकते हैं कि कैसे रेट्रोवायरल प्रौद्योगिकी का वर्णन किया है। पद्धति का चयन करें और आनुवंशिक रूप से फ्लोरोसेंट बारकोड वाले कोशिकाओं बढ़ाना और विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन और / या अलग प्रतिदीप्ति intensit व्यक्त प्रतिरूप आबादी के पैनल निर्माण करने के लिए कैसे करने के तरीके पर ध्यान केंद्रित एक और वर्णनात्मक ढंग से समझाया गया हैएँ। उनके फ्लोरोसेंट विशेषताओं के आधार पर अलग पहचाना सेल आबादी के पैनलों आगे विभिन्न जैविक सवालों से निपटने कि सेल आधारित assays के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो मल्टिप्लेक्स क्षमताओं को बढ़ाने। प्रोटोकॉल भी उदाहरण 59 के रूप में, पहले से प्रयोगशाला में विकसित सेल आधारित assays के एक असर बारकोड वाले कोशिकाओं के एक पैनल इंजीनियर कैसे करें। इस प्रोटोकॉल इस प्रकार आनुवंशिक हस्तांतरण के लिए अच्छी तरह से स्थापित रेट्रोवायरल / lentiviral प्रौद्योगिकी, फ्लोरोसेंट प्रोटीन का मूल्य या 60,48 प्रवाह cytometry के आवेदनों को दिखाने के लिए इरादा नहीं है बल्कि मल्टिप्लेक्स अनुप्रयोगों के लिए तीन के संयोजन के बढ़ाने शक्ति दिखाने के लिए।

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Protocol

स्तनधारी कोशिकाओं, जेनेटिक बारकोडिंग के लिए वायरल उत्पादन और पारगमन के 1. तैयारी

  1. एक 10 सेमी की थाली में प्लेट 2.5 एक्स 10 6 पक्षपाती कोशिकाओं (या आसपास के 50-60 confluency%) Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ (DMEM) (एफसीएस) में पूर्व अभिकर्मक के लिए एक दिन है। ऐसे फीनिक्स-जीपी (गैरी नोलन, स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय से एक तरह का उपहार) के रूप में पसंद की रेट्रोवायरल उत्पादन प्रयोग पैकेजिंग सेल लाइन के लिए।
    नोट: पैकेजिंग सेल लाइन stably ट्रांस में रेट्रोवायरल कण गठन के लिए झूठ बोलना और पोल प्रोटीन व्यक्त करता है। यकीन है कि कोशिकाओं से पहले अभिकर्मक के लिए, स्वस्थ और एक monolayer में थाली का पालन कर रहे हैं।
  2. 24 घंटा बाद में, डीएनए अभिकर्मक मिश्रण तैयार करते हैं।
    1. सीरम मुक्त DMEM के 125 μl के लिए 3 माइक्रोग्राम प्रति vesicular stomatitis वायरस लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन वेक्टर (पीसीआई-VSVg) और ब्याज की फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन ले जाने स्थानांतरण वेक्टर के तीन माइक्रोग्राम प्रति जोड़ें। 2 मिलीग्राम / एमएल (मिक्स और polyethylimine के 15 μl जोड़ने)।
    2. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण को सेते हैं और ड्रॉप के लिहाज से कोशिकाओं में जोड़ें।
      नोट: Polyethylimine पॉलीप्लेक्सेस के गठन के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक के रूप में समरूप डीएनए मिश्रण में जोड़ा जाता है। विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर ले जाने वायरल कणों को प्राप्त करने के लिए, अपनी पसंद के मार्कर के साथ स्वतंत्र रूप से एक अभिकर्मक प्रदर्शन करते हैं। रेट्रोवायरल स्थानांतरण वेक्टर लंबाई में लगभग 7 KB है और अगर 10 केबी के ऊपर से पैक नहीं किया जा सकता है कि याद रखें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं। बजाय 30 डिग्री सेल्सियस या 32 डिग्री सेल्सियस पर वायरल उत्पादन जगह प्लेटों को बढ़ाने के लिए आदेश में।
    नोट: 24 घंटे बाद अभिकर्मक मीडिया ताजा मीडिया के 7 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, और इस सेल स्वास्थ्य में सुधार हो सकता है, हालांकि यह सतह पर तैरनेवाला में वायरल लोड कम हो सकती है।
  4. 48 घंटे बाद अभिकर्मक एक 0.45 माइक्रोन polytetrafluoroethylene फिल्टर के साथ सतह पर तैरनेवाला युक्त वायरल कणों और फिल्टर इकट्ठा। पारगमन के लिए हौसले से एकत्र वायरल सतह पर तैरनेवाला का प्रयोग करें। अन्य संगठनोंerwise डिग्री सेल्सियस -80 पर aliquots में सतह पर तैरनेवाला रखने के लिए और फ्रीज पिघलना से बचें। वायरल अनुमापांक प्रत्येक ठंड विगलन चक्र के साथ शायद ऊपर से 50% कम हो जाएगा कि याद रखें।
  5. पूर्व चुनाव 24 घंटा की प्लेट सेल लाइन पारगमन के अनुयायी हैं, या तुरंत पारगमन गैर पक्षपाती अगर पहले। 2.0 एक्स 10 5-3.0 (यहाँ हं 7.5.1 और HEK 293T) एक्स 10 5 पक्षपाती कोशिकाओं या 5.0 x 10 5 बीज 1 एक्स 10 6 गैर पक्षपाती कोशिकाओं (यहाँ SupT1) प्रति कुएं में 6 अच्छी तरह से थाली।
    नोट: कोशिकाओं पारगमन के समय में लगभग 60% की एक confluency हासिल ताकि कोशिकाओं की संख्या, विशेष रूप से पक्षपाती कोशिकाओं के लिए तो, पारगमन के लिए पहले वरीयता प्राप्त किए जाने की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें।
  6. वरीयता प्राप्त कोशिकाओं को 5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / polybrene (hexadimethrene ब्रोमाइड) जोड़ें और फिर चारों ओर 20-40% संक्रमण (यहां 2 मिलीलीटर) प्राप्त करने के लिए पहले से एकत्र वायरल सतह पर तैरनेवाला जोड़ें।
    नोट: छँटाई किसी भी subpopulat बढ़ाना करने की अनुमति देगा के रूप में MOI या संक्रमण का प्रतिशत, ज्यादातर मनमाना हैकोशिकाओं के आयन। जाहिर है, संक्रमण के एक उच्च दर आसान बनाता है और प्रवर्धन की प्रक्रिया को गति।
  7. 32 डिग्री सेल्सियस पर 120 मिनट के लिए 1500 XG पर एक फांसी बाल्टी रोटर में centrifugation द्वारा कोशिकाओं transduce। पूर्व ऊष्मायन के लिए ताजा मीडिया के साथ गैर-पक्षपाती कोशिकाओं Resuspend। पक्षपाती कोशिकाओं के लिए, ताजा मीडिया 24 घंटा के बाद पारगमन के साथ बदलें।
    नोट: यह खत्म spilling से बचने के लिए parafilm के साथ centrifugation करने से पहले प्लेटें सील करने के लिए सिफारिश की है। आनुवंशिक रूप से बारकोड वाले सेल विविधता बढ़ाने के लिए, (कदम 1.4 से प्राप्त) विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन ले जाने वायरल कणों के साथ कोशिकाओं transduce। फ्लोरोसेंट मार्कर का चयन, वे उपकरण के साथ संगत कर रहे हैं सुनिश्चित करें और वे अलग पहचाना फ्लोरोसेंट पैरामीटर है।

आनुवांशिक रूप से बारकोड वाले प्रकोष्ठों के 2. चयन और प्रवर्धन

  1. पारगमन की प्रतिशत दर quantitate के लिए फ्लो से कम से कम 72 घंटे बाद पारगमन transduced स्तनधारी कोशिकाओं का विश्लेषण। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक तुलनीय गैर transduced सेल लाइन का उपयोग करें।
    नोट: छँटाई, व्यक्तिगत बारकोड वाले सेल आबादी, प्रारंभिक पारगमन के एक उच्च प्रतिशत की दर को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा आवश्यक के रूप में नहीं है, जबकि प्रवर्धन की प्रक्रिया में तेजी लाने चाहिए।
  2. ब्याज की प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं है कि प्राप्त करने के लिए पसंद की सेल-सॉर्टर का उपयोग।
    1. उस प्रयोजन के लिए, फाटकों ठीक से सही चैनलों में सेट कर रहे हैं सुनिश्चित करते हैं।
      1. इतना नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक ही भोले सेल लाइन का उपयोग करें और नकारात्मक आबादी प्रत्येक फ्लोरोसेंट अक्ष पर 10 3 के मूल्य से कम इतना है कि पैरामीटर / चैनल वोल्टेज सेट करने के लिए। प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल के लिए नकारात्मक नियंत्रण की है कि ऊपर दिखाई देते हैं कि घटनाओं के रूप में सकारात्मक प्रतिदीप्ति के लिए gating निर्धारित करते हैं।
    2. प्रत्येक साधन अलग-अलग हो सकता है जागरूक होना और gating का निर्धारण करने के लिए सही वोल्टेज हर विस्तार में जरूरी सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण बना रही है, उसके अनुसार समायोजित किया जाना चाहिएerimental सेटअप।
      1. इस प्रयोगात्मक सेटअप में प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए TD टमाटर के लिए EGFP के लिए FITC चैनल (एक 502 लंबे समय से गुजारें फिल्टर द्वारा दीं 530/30 बैंड पास फिल्टर), पीई चैनल (एक 556 लंबे समय से गुजारें फिल्टर द्वारा दीं 585/42 बैंड पास फिल्टर) का उपयोग E2 के क्रिमसन के लिए, और एपीसी चैनल (660/20 बैंड पास फिल्टर)।
        नोट: E2 के क्रिमसन 633 एनएम लेजर से उत्साहित है, जबकि 488 एनएम लेजर EGFP और टीडी टमाटर उत्तेजित।
  3. 100% एफसीएस के 1 मिलीलीटर के साथ प्रकार में 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब।
    नोट: एक सीधे व्यक्ति के क्लोन (देखें नीचे) की तरह के साथ आगे बढ़ सकते हैं के रूप में फ्लोरोसेंट सेल आबादी छंटाई की प्रक्रिया अनिवार्य नहीं है। चुना प्रतिदीप्ति पर आधारित तंग आबादी छंटनी व्यक्ति क्लोन के भविष्य के चयन के लिए एक बैकअप आबादी सुनिश्चित करता है। व्यक्ति की कोशिकाओं समय पर कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी को आसानी से जमे हुए है, और फिर thawed और एक बाद में मंच पर परिलक्षित किया जा सकता है, जबकि विकसित करने के लिए मुश्किल हो जाता है कि मन में रखो।
  4. सपा5 मिनट के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर 524 जी पर एक फांसी बाल्टी रोटर अपकेंद्रित्र में हल आबादी नीचे में गोली कोशिकाओं। ताजा मीडिया के 1 मिलीलीटर में फिर से निलंबित, और कहा कि सेल confluency कम से कम दो दिनों के लिए विकास और विभाजन की अनुमति के लिए 60% से नीचे है तो कोशिकाओं प्लेट रहे हैं।
    1. उदाहरण के लिए, एक 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति मीडिया के 2 मिलीलीटर में लगभग 3 x 10 5 कोशिकाओं और एक 6 सेमी की थाली में मीडिया के 2 मिलीलीटर में 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं पर थाली पक्षपाती कोशिकाओं। गैर पक्षपाती कोशिकाओं के लिए पक्षपाती कोशिकाओं और RPMI के लिए DMEM का उपयोग करें (या किसी भी निर्दिष्ट मध्यम यदि आवश्यक हो)। प्रवर्धन अनुमति देने के लिए कई दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में चढ़ाया कोशिकाओं रखें।

3. विभिन्न तीव्रताओं में आनुवांशिक रूप से बारकोड वाले प्रकोष्ठों की clonal आबादी प्राप्त

  1. मूल रूप से transduced कोशिकाओं से क्लोनल आबादी प्राप्त (1.7 कदम) या हल जनसंख्या से (2.3 कदम)।
    नोट: यह सभी सेल के बीच में फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति के बराबर या इसी तरह के स्तर को सुनिश्चित करेगाजनसंख्या के भीतर है (अप करने के लिए 40% का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक छोटे से CV के साथ एक तंग आबादी)।
    1. उस प्रयोजन के लिए, एक स्वचालित सेल बयान इकाई (ACDU) के साथ 96 अच्छी तरह प्लेटों में क्रमबद्ध एकल कक्षों। ब्याज की आबादी के अनुसार छंटाई के लिए द्वार निर्धारित करें। सुनिश्चित करें फाटकों अलग फ्लोरोसेंट तीव्रता में कोशिकाओं का चयन करते समय अलग पहचाना आबादी को प्राप्त करने के अलावा कम से कम एक प्रवेश पैमाने पर स्थापित कर रहे हैं। यहाँ दिखाए गए प्रक्रिया के लिए, 2.2 कदम में वर्णित एक के रूप में स्थापित प्रयोगात्मक cytometry के एक ही प्रवाह का उपयोग करें।
  2. कम से कम दो सप्ताह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में व्यक्तिगत क्लोन बढ़ाना। प्रवर्धन की प्रक्रिया के माध्यम से बढ़ रही आबादी के एक से अधिक से व्यक्ति की कोशिकाओं से पैदा होती है और नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का विश्लेषण।
    नोट: सॉर्टर औसत पर अच्छी तरह से प्रति एक सेल जगह होगी, और कुछ कुओं सब पर किसी भी सेल नहीं हो सकता है, जबकि दूसरों को एक से अधिक हो सकता है कि याद रखें।
    1. एक PO है कि यह सुनिश्चित करने के लिएpulation ही, थाली के साथ अत्यंत कोमल हो और pipetting द्वारा कुओं को परेशान कभी नहीं एक सेल से उठता है। खुर्दबीन के नीचे, अच्छी तरह से अच्छी तरह से, थाली को ध्यान से देखें।
      नोट: व्यक्ति की कोशिकाओं समय पर वे आसानी से पहचानने योग्य हो जाएगा विभाजित शुरू एक बार, की पहचान करने के लिए मुश्किल हो सकता है।
    2. किनारों के साथ अक्सर 'कोशिकाओं पेड़ों का झुरमुट है कि' अवगत रहें। कई प्रतिरूप आबादी मनाया जा सकता है, जहां उन कुओं त्यागें और एक तंग आबादी उन है कि रखने के लिए।
      नोट: यह प्रवर्धन के लिए बड़े प्लेटों में उन हस्तांतरण करने की सलाह दी जाती है।
  3. फ्लो द्वारा उन्हें विश्लेषण करके ख्यात प्रतिरूप आबादी स्क्रीन। प्रयोगात्मक सेटअप cytometry के एक ही प्रवाह का उपयोग एक नकारात्मक नियंत्रण करने के लिए उन्हें तुलना करें।
    1. नमूने का केवल एक प्रतिशत का विश्लेषण करें और बैकअप के रूप में बाकी रहते हैं। औसत तीव्रता और जनसंख्या की तंगी के आधार पर सबसे साफ़ अलग आबादियों चुनें। जरूरत के रूप में उन्हें बढ़ाना या में शेयरों फ्रीजसमय के लिए समय या तरल नाइट्रोजन का संक्षिप्त अवधि के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 20% ग्लिसरॉल के साथ मीडिया ठंड।
      नोट: एक 'सच' क्लोनल जनसंख्या एक बहुत तंग प्रतिदीप्ति पैटर्न होना चाहिए कि याद रखें।

4. (एचटीएस) उच्च Throughput स्क्रीनिंग के लिए बहुसंकेतन क्षमताओं सुनिश्चित करें

  1. आगे एक मल्टिप्लेक्स प्रारूप में उपयोग किया जा सकता है कि जरूरत के रूप में के रूप में कई अलग प्रतिरूप आबादी का मिश्रण। अलग पहचाना अवशोषण / उत्सर्जन स्पेक्ट्रा और / या अलग अलग तीव्रता के साथ क्लोन चुनें। एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप एचटीएस के लिए उपयुक्त है, जो प्रयोग किया जाता है, तो 200 μl में 50,000 कोशिकाओं बीज प्रति अच्छी तरह से।
    नोट: कोशिकाओं की संख्या केवल एक अनुमान है और सेल प्रकार के आधार पर बदल सकता है और यह पक्षपाती है या नहीं है कि मन में रखो।
  2. स्वतंत्र स्थापित फ्लोरोसेंट सेल लाइनों में से प्रत्येक एक दूसरे से प्रतिष्ठित किया जा सकता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रवाह cytometry का उपयोग नमूना विश्लेषण। विश्लेषण करने से पहले नकारात्मक को तैयारऔर एकल रंग नियंत्रण मानकों और मुआवजा मूल्यों को निर्धारित करने के लिए।
    नोट: उन्हें स्पष्ट रूप से सक्षम हो जाएगा मिश्रित आबादी भेद करने के लिए मानकों की स्थापना के लिए आगे एक मल्टिप्लेक्स प्रारूप में उपयोग किया जा सके।

5. च्वाइस के जैविक आवेदन करने के लिए आनुवांशिक रूप से बारकोड वाले सेल लाइन्स को अपनाना

  1. Stolp एट अल।, 2013 59 में यहाँ वर्णित के रूप में पसंद की परख तत्व होते हैं कि वायरल कणों के साथ स्थापित आनुवंशिक रूप से barcoded सेल लाइनों, transduce। पसंद की परख के लिए एक अतिरिक्त और अलग पहचाना फ्लोरोसेंट चैनल पर होना चाहिए याद रखें कि और इस तरह यह उचित बारकोड वाले सेल लाइन को स्थानांतरित किया जा रहा है।
    नोट: प्रत्येक बारकोड वाले सेल लाइन एक अलग परख सहन कर सकते हैं।
  2. परख तत्व होते हैं कि उन लोगों के लिए क्रमबद्ध आनुवंशिक रूप से फ्लोरोसेंट बारकोड वाले कोशिकाओं।
    नोट: परख तत्वों एफ (एक संलयन के रूप में या एक आंतरिक राइबोसोम प्रविष्टि साइट के माध्यम से) एक टैग या फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए युग्मित इंजीनियर हो सकता हैया सीधा पता लगाने पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से cytometry, या माइक्रोस्कोपी प्रवाह। इस प्रोटोकॉल में उपयोग प्रणाली अकेले हा मिलान सतह अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है, या अतिरिक्त झंडा मिलान अभिव्यक्ति के साथ।
    1. हा और एपीसी-fluorescently युग्मित एंटीबॉडी के साथ परख युक्त प्रतिरूप आबादी दाग। तो फिर विरोधी झंडा और FITC संयुग्मित एंटीबॉडी धुंधला साथ प्रतिरूप आबादी का विश्लेषण।
    2. परख वापस ट्रैक करने के लिए, विश्लेषण या 'व्याख्या' विशिष्ट आनुवंशिक रूप से barcoded सेल लाइनों प्रतिष्ठित किया जा सकता है, जहां उपयुक्त चैनल में आबादी। इधर, टीडी टमाटर का पता लगाने के लिए पीई चैनल में विश्लेषण करके सब्सट्रेट की प्रकृति व्याख्या करना।

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Representative Results

बहुसंकेतन फ्लोरोसेंट आनुवंशिक रूप से अलग-अलग प्रतिरूप आबादी उत्पन्न किया गया है एक बार ही प्राप्त किया जा सकता जैविक अनुप्रयोगों के प्रयोजन के लिए कोशिकाओं barcoded। Barcoded आबादी न्यूनतम वर्णक्रमीय ओवरलैप के साथ स्पष्ट अलग फ्लोरोसेंट विशेषताएं हैं जब बहुसंकेतन सबसे प्रभावी है। स्तनधारी SupT1 कोशिकाओं के प्रतिरूप आबादी के साथ चित्र 1 में दिखाया उदाहरण mCherry और cyano फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी) के साथ बारकोड वाले कोशिकाओं को आसानी से अपने व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट विशेषताओं को खोने के बिना एक साथ विश्लेषण किया जा सकता है कि दिखाता है। इस मैट्रिक्स इस प्रकार अभी तक एक अतिरिक्त उपलब्ध चैनल में एक readout के साथ बहुसंकेतन जैविक अनुप्रयोगों के लिए प्रयोग करने योग्य है कि फ्लोरोसेंट आनुवंशिक रूप से barcoded कोशिकाओं के एक पैनल एक मिसाल है। इस तरह के एक पैनल प्राप्त करने के लिए आदेश में यह कारण insertional एफई के लिए आबादी के भीतर फ्लोरोसेंट तीव्रता के चर पर्वतमाला के लिए नेतृत्व करेंगे जो रेट्रोवायरल प्रौद्योगिकी की प्रकृति, याद रखना महत्वपूर्ण हैfects और / या MOI। दो दिखाता है आंकड़ा है कि वायरल कणों तीव्रता की एक विस्तृत श्रृंखला (बाएं पैनल) में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की या तो एक या दोनों व्यक्त कि कोशिकाओं में या तो टीडी टमाटर या E2 के क्रिमसन परिणामों को रोकने के साथ स्तनधारी कोशिकाओं के प्रारंभिक पारगमन। चयन और (मध्य पैनल) gated बक्से द्वारा दिखाए गए के रूप में 96 अच्छी तरह प्लेटों में एकल कक्षों की छँटाई, एक विस्तार (सही पैनल) निम्नलिखित तंग प्रतिरूप आबादी प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है। एक तंग आबादी सेल के प्रकार के अनुसार लेकर कर सकते हैं, जो एक छोटे से सीवी होने के रूप में परिभाषित किया जाना चाहिए, मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता में सामान्य रूप से 30-40%। यह भी दिखाता है कि दो आंकड़ा है कि आगे केवल दो फ्लोरोसेंट की एक मैट्रिक्स के साथ आनुवंशिक रूप से बारकोड वाले आबादी की संख्या में वृद्धि प्रोटीन, एक भी प्रतिदीप्ति तीव्रता का दोहन कर सकते हैं। आम तौर पर, आबादी के बीच मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक प्रवेश विचलन छंटाई और amplifica एक दूसरे के बाद से उचित जुदाई को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त हैtion। टीडी टमाटर मध्य और उच्च भिन्न तीव्रताओं के दो आबादी, एक एकल तीव्रता में E2 के क्रिमसन के साथ बहुसंकेतन के लिए प्राप्त किया गया है, जहां यह सुविधा वर्णन करने के लिए दिखाए गए उदाहरण में चुना गया था।

बहुसंकेतन एक ही समय में और नकाबपोश आबादी को डिकोड करने की क्षमता के लिए कई नमूनों के विश्लेषण की सुविधा के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। बढ़ाना बहुसंकेतन के रूप में लंबे समय के वर्णक्रमीय गुण एक दूसरे के साथ हस्तक्षेप नहीं करते, जैसा कि इस तरह के EGFP के रूप में अभी तक एक तिहाई फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ प्राप्त किया जा सकता है। चित्रा 3 में सचित्र प्रयोगात्मक प्रक्रिया में टीडी टमाटर और E2 क्रिमसन के साथ प्राप्त छह आबादी के पैनल EGFP साथ बहुसंकेतन बढ़ाने के लिए शोषण किया गया था। रेट्रोवायरल प्रौद्योगिकी matrices के एक में प्रतिनिधित्व आबादी के EGFP हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। EGFP चैनल में मनाया करते हैं, गैर-हरी भोले छह आबादी मैट्रिक्स (चित्रा 3 में ऊपरी बाएं पैनल) EGFP-transduced से अप्रभेद्य हैजनसंख्या मैट्रिक्स (चित्रा 3 में निचले बाएँ पैनल)। महत्वपूर्ण बात है, पैनलों मूल आनुवंशिक बारकोड द्वारा कब्जा चैनलों में विश्लेषण किया जा सकता है (टमाटर और E2 क्रिमसन टीडी)। जबकि इन चैनलों में histograms के रूप में दिखाया गया है, व्यक्तिगत आबादी, EGFP चैनल में विश्लेषण किया, और डीकोड या वापस पता लगाया जा सकता है (सही पैनल (आबादी के मध्य पैनलों में आबादी 7-12, चित्रा 3 के साथ 1-6 की तुलना) में अप्रभेद्य चित्र तीन)। सही मुआवजा संभव वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए समायोजित करने के लिए लागू नहीं है, तो पारगमन, चयन, छँटाई, और प्रवर्धन की प्रक्रिया को दोहरा खाली चैनलों का लाभ लेने के बाद बेकार है। भेद करने के लिए (चित्रा 4 में बाएं पैनल) की आबादी 1, 2, 3 (गैर हरा) और 7, 8, 9 (हरा) EGFP में विश्लेषण और टमाटर चैनलों td कर रहे हैं, आबादी 7 और 8 मुश्किल हो जाता है यह साबित करने के लिए । यह एक नकारात्मक चोर के रूप में भोले कोशिकाओं (जनसंख्या 1) का चयन करने के लिए इस प्रकार आवश्यक हैइंस्ट्रूमेंटेशन के मापदंडों सेट किया जा सकता है, ताकि trol। विशेष रूप से प्रेतसंबंधी ओवरलैप कि fluorophores के साथ किसी भी मैट्रिक्स, का विश्लेषण करते हैं, यह एकल रंग नियंत्रण सही मुआवजा मूल्यों का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाता है कि आवश्यक है। चित्रा के विश्लेषण में 4 आबादी 2 या 3, और 7 बेहतर सही मायने में डबल सकारात्मक रहे हैं कि आबादी को परिभाषित करने की अनुमति देता है, इस उद्देश्य की सेवा (आबादी 8 और 9)।

सही उपकरण के साथ सही फ्लोरोसेंट चैनल में विश्लेषण किया है, जब उनके biosignature द्वारा परिभाषित के रूप में फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ आनुवांशिक रूप से barcoded कोशिकाओं को अपनी खुद की पहचान बरकरार रहती है। जैविक अनुप्रयोगों के लिए शोषण बहरहाल, जब तक biosignature सिर्फ एक अतिरिक्त व्यक्तिगत संपत्ति बन जाता है। बहुसंकेतन के लिए फ्लोरोसेंट आनुवंशिक बारकोडिंग की शक्ति को साबित करने के क्रम में हम फ्लोरोसेंट बारकोड वाले स्तनधारी सेल लाइनों में से कुछ में दवाओं की खोज के लिए हमारे पहले से विकसित assays के एक पेश करने का फैसला किया। ऐसा करके, fluorescईएनटी आनुवंशिक बारकोडिंग एक नमूने में तीन assays के लक्ष्य को हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस प्रक्रिया में प्रोटियोलिसिस के लिए तीन ख्यात वायरल सब्सट्रेट के एक से युक्त एक पाड़ प्रोटीन आनुवंशिक रूप से barcoded कोशिकाओं में स्थानांतरित किया गया था। परख में, दरार कोशिका की सतह (चित्रा 5 ब) पर झंडा मिलान के नुकसान से पता चला है। इसके विपरीत, झंडा सतह धुंधला दरार की कमी का प्रतिनिधित्व करता है 5 तीन अलग अलग substrates के विश्लेषण का परिणाम दिखाता है चित्रा।; एचआईवी -1 लिफाफा जंगली प्रकार (पर्यावरण WT), एचआईवी -1 लिफाफा उत्परिवर्ती (पर्यावरण MUT), और डेंगू वायरस (Denv) PRM। (; चित्रा 5A मध्य और उच्च) उनमें से प्रत्येक भोले 1 से 3 के बारकोड वाले सेल लाइनों, और विभिन्न तीव्रताओं पर टीडी टमाटर के उपयोग के 2 अन्य लोगों में पेश किया गया था। झंडा सतह अभिव्यक्ति के लिए धुंधला संबंधित बारकोड के आधार पर cleaved गया था substrates के जो पता चलता है। हरे-फाई में देखा के रूप में उदाहरण में केवल एचआईवी लि MUT, झंडा टैग (सकारात्मक निम्नलिखित धुंधला) बरकरार रखती हैटीसी चैनल (चित्रा 5C, सही नीचे पैनल)। परख का विश्लेषण इस प्रकार स्वतंत्र रूप से मूल बारकोडिंग का प्रदर्शन किया जा सकता है, और आगे व्याख्या करना और अलग आबादी वापस ट्रैक करने के लिए शोषण किया जा। बहुसंकेतन का यह तरीका इस प्रकार ब्याज की जैविक readout के लिए आरक्षित एक अतिरिक्त चैनल पर निर्भर करता है।

चित्र 1
चित्रा 1:। बहुसंकेतन के लिए बारकोडिंग आनुवंशिक रूप से इस तरह के mCherry, सीएफपी या दोनों (बाएं पैनल) के रूप में अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग कर barcoded व्यक्तिगत आबादी, मिश्रित का विश्लेषण किया है, और प्रवाह cytometry के माध्यम से अपने-अपने चैनलों में (सही पैनल) डीकोड किया जा सकता है। Smurthwaite, सी एट अल।, 2014 में 58 से अनुकूलित। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 2:। छंटनी और बारकोड वाले कोशिकाओं के प्रवर्धन स्तनधारी कोशिकाओं टीडी टमाटर या E2-क्रिमसन (बाएं पैनल) या तो युक्त वायरल कणों के साथ पारगमन निम्नलिखित 48 घंटा विश्लेषण किया गया। गेट्स फिर, विभिन्न तीव्रताओं पर टीडी टमाटर व्यक्त कोशिकाओं को शामिल करने की छंटाई के लिए सेट कर रहे हैं / बाहर E2-क्रिमसन (मध्यम पैनल) के साथ। प्रकार से क्लोन परिलक्षित किया गया और छह अलग पहचाना आबादी (सही पैनल) के एक मैट्रिक्स उत्पन्न करने के लिए फिर से विश्लेषण किया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Decoding नकाबपोश आबादी का पता चलता है मैट्रिक्सचित्रा 2 (टमाटर और / या E2-क्रिमसन टीडी) में प्राप्त की छह आबादी के आगे इस तरह EGFP के रूप में एक अतिरिक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है। (ए) EGFP चैनल (बाएं पैनल) में विश्लेषण जब मूल मैट्रिक्स, नकारात्मक है और छह आबादी एक दूसरे से पृथक कर रहे हैं। Histograms (सही पैनल) के रूप में दिखाया छह आबादी के प्रत्येक स्वतंत्र EGFP चैनल में विश्लेषण किया जा सकता है। अब भी EGFP व्यक्त (बी) एक ही मैट्रिक्स, अब उनकी हरी फ्लोरोसेंट विशेषता खुलासा, एक के रूप में विश्लेषण किया गया था। Smurthwaite, सी एट अल।, 2014 में 58 से अनुकूलित। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: मुआवजा सही जुदाई सुनिश्चित करता आबादी के कुछ मूल टीडी टमाटर और / या EGFP अभिव्यक्ति (आबादी 7 और 8) एक साथ विश्लेषण किया जब ठीक से अलग नहीं किया जा सकता है (बाएं पैनल) इन चैनलों के लिए उचित मुआवजा जब तक निकाला जाता है (सही पर आधारित चुना। पैनल)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
पसंद की परख करने के लिए चुना परख करने के लिए आगे अनुकूलन के लिए बारकोड वाले कोशिकाओं के चुनाव में (ए) के चयन और अनुकूलन: चित्रा 5।। आनुवंशिक रूप से विभिन्न तीव्रताओं पर टीडी टमाटर (ऊपर बाएं पैनल) के साथ barcoded आबादी जैविक अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया। आबादी के प्रत्येक आगे दरार पर नज़र रखता है कि एक परख शामिल करने के लिए इंजीनियर था, लेकिन एक अलग सब्सट्रेट में से हर एक (शीर्ष सही पैनल)। परख का (बी) के चित्रण। नकारात्मक झंडा दाग दरार को इंगित करता है, जबकि सकारात्मक झंडा दाग दरार की कमी को दर्शाता है। झंडा धुंधला निम्नलिखित परख (सी) विश्लेषण। मिश्रित आबादी FITC चैनल (बाएं पैनल) में टीडी टमाटर बारकोड लेकिन पृथक के आधार पर अलग पहचाना जाता है। झंडा-FITC एंटीबॉडी के साथ दाग है, तो केवल एक जनसंख्या ध्वज के लिए सकारात्मक है। डिकोडिंग इस आबादी एचआईवी लि MUT सब्सट्रेट (सही पैनल) भालू, आनुवंशिक बारकोडिंग के आधार पर पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ दो अच्छी तरह से स्थापित प्रक्रियाओं के संयुक्त किया गया है; रेट्रोवायरल प्रौद्योगिकी और प्रवाह cytometry का उपयोग फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने के माध्यम से जेनेटिक इंजीनियरिंग। अद्वितीय सेल लाइनों के उत्पादन के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित आनुवंशिक बारकोडिंग मल्टिप्लेक्स अनुप्रयोगों के लिए एक मजबूत और आसान तरीका प्रदान करता है। रेट्रोवायरल प्रौद्योगिकी के माध्यम से अनुवांशिक इंजीनियर बारकोड वाले कोशिकाओं पैदा करने, शुरू में एक लंबी प्रक्रिया है, लेकिन एक एक बार, सेल सामग्री का एक विश्वसनीय और स्थिर स्रोत की स्थापना की, प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है। इस तकनीक की प्रकृति लगातार अपने स्वयं के सच अलग पहचाना biosignature हो जाते हैं स्थिर फ्लोरोसेंट विशेषताओं के साथ अनुवांशिक इंजीनियर सेल लाइनों पैदा करता है।

दोनों पक्षपाती और गैर पक्षपाती सेल प्रकार उनकी शारीरिक absorbance के / उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के आधार पर आसानी से साफ़ कर रहे हैं कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग barcoded जा सकता है। ये शामिल हैं, लेकिन इस तरह के सीएफपी, mCherry के रूप में प्रोटीन के लिए ही सीमित नहीं हैं, E2 के क्रिमसन और टीडी टमाटर। आनुवंशिक रूप से उनके अलग पहचाना फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ barcoded एक बार, वे सेल आबादी के एक पैनल का उत्पादन करने के लिए जोड़ा जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, पैनल उनके प्रतिदीप्ति विशेषता से ही भेदभाव सटीक genotypic मेकअप के साथ सेल आबादी लेकिन गये हैं। जैसे, इन पैनलों पूरी तरह से बहुत उच्च throughput क्षमताओं को बढ़ाने, मल्टिप्लेक्स अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं।

कारण MOI में मतभेदों के साथ युग्मित मेजबान जीनोम में रेट्रोवायरल कण, के विभिन्न insertional वरीयताओं को, किए गए विशेष फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन से चर प्रतिदीप्ति तीव्रता उम्मीद कर रहे हैं। एक अद्वितीय फ्लोरोसेंट जीन ले जाने के एक अनुवांशिक इंजीनियर आबादी का विश्लेषण इस प्रकार प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर परिभाषित किया जा सकता है कि अभिव्यक्ति प्रोफाइल की एक सीमा का पता लगाने जाएगा। इस अंतर अभिव्यक्ति प्रोफाइल प्रेतसंबंधी एक दूसरे से अलग कर रहे हैं कि आबादी को बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। एक इस प्रकार कोम्बी कर सकते हैंप्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ फ्लोरोसेंट मार्करों के पूर्वोत्तर चुनाव प्रयोगात्मक डिजाइन फिट करने के लिए। इधर, E2 के क्रिमसन और के साथ या EGFP बिना टीडी टमाटर के दो 6 जनसंख्या पैनल में शामिल हैं, जो 4, 6, और 12 आबादी के मेट्रिसेस, दिखाए जाते हैं। सिद्धांत रूप में, यह आगे के रूप में अच्छी तरह से 3 अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन की आबादी बनाने के लिए EGFP के विभिन्न तीव्रताओं के साथ विस्तारित किया जा सकता है; इसके साथ जुड़े विभिन्न तीव्रताओं के साथ हर एक। जैसा कि पहले कहा, विचार वास्तव में प्राप्त किया जा सकता है कि जुदाई सुनिश्चित करने के क्रम में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का चयन करते समय लिया जाना चाहिए। चुना प्रोटीन अलग absorbance के और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा होनी चाहिए; दो प्रेतसंबंधी अलग पहचाना लेकिन इसी तरह फ्लोरोसेंट प्रोटीन इस्तेमाल कर रहे हैं हालांकि, जब मुआवजा लागू किया जाना चाहिए। अलग fluorophores या फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बीच उत्सर्जन / absorbance के स्पेक्ट्रा के भौतिक जुदाई के लिए अनुमति देता है, जो महत्वपूर्ण बात है, उचित मुआवजा, उचित एकल रंग नियंत्रण के उपयोग के लिए साथ पूरा किया हैफ्लो के माध्यम से पता लगाने।

कम फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेकिन तीव्रता की एक किस्म का शोषण साथ बहुसंकेतन तो आगे ब्याज की जैविक आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि अतिरिक्त चैनलों को मुक्त कर देते। इस प्रयोगात्मक सेट अप का लचीलापन बढ़ाने के लिए और फ्लोरोसेंट मार्करों के संयोजन के चुनाव में इस्तेमाल किया जा करने के लिए सरल कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, चित्रा 5 में दिखाया गया है मल्टिप्लेक्स परख FITC के लिए युग्मित, इस मामले में एंटीबॉडी धुंधला पर निर्भर करता है। केवल पीई चैनल आनुवंशिक बारकोडिंग के कब्जे में है, के रूप में उपयुक्त उपकरण और / या एंटीबॉडी उपलब्धता के आधार पर बनाया जा सकता है कि एक निर्णय, एक FITC संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग कर सकते हैं, या इसके विपरीत, एपीसी युग्मित।

प्रवाह के क्षेत्र में तकनीकी उपलब्धियों cytometry, माइक्रोस्कोपी या संयुक्त तरीके प्रभावशाली हैं, टोंटी जैविक अनुप्रयोगों और एचटीएस के लिए उपलब्ध प्रौद्योगिकी सेल लगती है। रेट्रोवायरल तकनीकफ्लोरोसेंट प्रोटीन का विस्तार हो रहा संख्या के साथ युग्मित जरिए इस प्रश्न का उत्तर देने के विलय किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट आनुवंशिक बारकोडिंग काफी बदले में, सेल आधारित assays के एचटीएस क्षमताओं के विस्तार के लिए बढ़ाने की जरूरत को संतुष्ट करता है जो बहुसंकेतन, सुविधा। जेनेटिक बारकोडिंग जैविक अनुप्रयोगों और दवा स्क्रीनिंग के लिए उच्च throughput के तरीके के साथ जोड़ी सेल आधारित assays के लिए एक प्रभावी मजबूत, किफायती, और आसान तरीका होता है। 3 आबादी पैनल का उपयोग कर एक नहीं बल्कि तीन से स्क्रीन प्रदर्शन करने की शक्ति लाभकारी लागत और समय संबंधित निहितार्थ हैं। फ्लो, उच्च सामग्री इमेजिंग और प्रवाह cytometry के युग्मित माइक्रोस्कोपी में बढ़ बहुमुखी प्रतिभा के साथ, फ्लोरोसेंट आनुवंशिक बारकोडिंग परख के विकास के लिए एक लगातार विश्वसनीय उपकरण होगा।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम रेट्रोवायरल कणों के उत्पादन के लिए फीनिक्स जीपी पैकेजिंग सेल लाइन उपलब्ध कराने के लिए स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय से डॉ गैरी नोलन को धन्यवाद देना चाहूंगा। हम टीडी टमाटर प्रदान करने के लिए कैलिफोर्निया के सैन डिएगो के विश्वविद्यालय में डॉ रोजर Tsien धन्यवाद। हम भी उनकी सेवा और मदद के लिए सैन डिएगो स्टेट यूनिवर्सिटी फ्लो कोर सुविधा को धन्यवाद देना चाहूंगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 ml syringes BD 309604 used for filtering the virus
0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter Pall Corporation 4219 used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Corning 45000-304 cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine) poly sciences 23966-2 2 mg/ml concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated) Eppendorf 5805 000.017 used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline) Corning 21-040-CV used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide) Sigma-Aldrich 107689 Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration.
FACSAria BD Biosciences instrument used for sorting cell populations
FACSCanto BD Biosciences instrument used for cell analysis
Phoenix-GP Gift from Gary Nolan cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum Mediatech MT35015CV used for cell growth and sorting
SupT1 cells ATCC CRL-1942 Human T lymphoblasts
HEK 293T cells ATCC CRL-11268 Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640 Corning 10-040-CV cell growth media for SupT1 cells

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References

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527 (1997).
  3. Godwin, A. R., Stadler, H. S., Nakamura, K., Capecchi, M. R. Detection of targeted GFP-Hox gene fusions during mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13042-13047 (1998).
  4. Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
  5. Natarajan, L., Jackson, B. M., Szyleyko, E., Eisenmann, D. M. Identification of evolutionarily conserved promoter elements and amino acids required for function of the C. elegans beta-catenin homolog BAR-1. Dev Biol. 272 (2), 536-557 (2004).
  6. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin.Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  7. Valencia-Burton, M., et al. Spatiotemporal patterns and transcription kinetics of induced RNA in single bacterial cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16399-16404 (2009).
  8. Mahmoud, L., et al. Green fluorescent protein reporter system with transcriptional sequence heterogeneity for monitoring the interferon response.J Virol. 85 (18), 9268-9275 (2011).
  9. Saunders, M. J., et al. Fluorogen activating proteins in flow cytometry for the study of surface molecules and receptors.Methods. 57 (3), 308-317 (2012).
  10. Wang, Y. L., Taylor, D. L. Probing the dynamic equilibrium of actin polymerization by fluorescence energy transfer. Cell. 27 (3 Pt 2), 429-436 (1981).
  11. He, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence (Forster) resonance energy transfer from cyan fluorescent protein to yellow fluorescent protein using single-laser excitation at 458 nm. Cytometry A. 53 (1), 39-54 (2003).
  12. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  13. Clayton, A. H., et al. Ligand-induced dimer-tetramer transition during the activation of the cell surface epidermal growth factor receptor-A multidimensional microscopy analysis. J Biol Chem. 280 (34), 30392-30399 (2005).
  14. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  15. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
  16. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  17. Ai, H. W., Shaner, N. C., Cheng, Z., Tsien, R. Y., Campbell, R. E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry. 46 (20), 5904-5910 (2007).
  18. Mishin, A. S., et al. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry. 47 (16), 4666-4673 (2008).
  19. Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 48 (31), 5612-5626 (2009).
  20. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  21. Klages, N., Zufferey, R., Trono, D. A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther. 2 (2), 170-176 (2000).
  22. Lai, Z., Brady, R. O. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinanat lentivirus vector. J Neurosci Res. 67 (3), 363-371 (2002).
  23. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol Biol. 246, 391-411 (2004).
  24. Grignani, F., et al. High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein. Cancer Res. 58 (1), 14-19 (1998).
  25. Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Mol Ther. 2 (5), 458-469 (2000).
  26. Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6 (3), 127-134 (2000).
  27. Zhang, X. Y., et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol Ther. 5 (5 Pt 1), 555-565 (2002).
  28. Rossi, G. R., Mautino, M. R., Morgan, R. A. High-efficiency lentiviral vector-mediated gene transfer into murine macrophages and activated splenic B lymphocytes. Hum Gene Ther. 14 (4), 385-391 (2003).
  29. Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
  30. Chan, A. W., Chong, K. Y., Martinovich, C., Simerly, C., Schatten, G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science. 291 (5502), 309-3012 (2001).
  31. Linney, E., Hardison, N. L., Lonze, B. E., Lyons, S., DiNapoli, L. Transgene expression in zebrafish: A comparison of retroviral-vector and DNA-injection approaches. Dev Biol. 213 (1), 207-2016 (1999).
  32. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
  33. Tiemann, U., et al. Optimal reprogramming factor stoichiometry increases colony numbers and affects molecular characteristics of murine induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 79 (6), 426-435 (2011).
  34. Leung, A. K., Lamond, A. I. In vivo analysis of NHPX reveals a novel nucleolar localization pathway involving a transient accumulation in splicing speckles. J Cell Biol. 157 (4), 615-629 (2002).
  35. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  36. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  37. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
  38. Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C.J Cell Biol. 161 (5), 899-909 (2003).
  39. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
  40. Edwards, B. S., Ivnitski-Steele, I., Young, S. M., Salas, V. M., Sklar, L. A. High-throughput cytotoxicity screening by propidium iodide staining. Curr Protoc Cytomt. 9 (Unit 9 24), (2007).
  41. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 8 (Unit 8 17), (2007).
  42. Lu, R., Neff, N. F., Quake, S. R., Weissman, I. L. Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding. Nat Biotechnol. 29 (10), 928-933 (2011).
  43. Grant, G. D., et al. Live-cell monitoring of periodic gene expression in synchronous human cells identifies Forkhead genes involved in cell cycle control. Mol Biol Cell. 23 (16), 3079-3093 (2012).
  44. Fiering, S. N., et al. Improved FACS-Gal: flow cytometric analysis and sorting of viable eukaryotic cells expressing reporter gene constructs. Cytometry. 12 (4), 291-301 (1991).
  45. Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (1991).
  46. Edwards, B. S., Oprea, T., Prossnitz, E. R., Sklar, L. A. Flow cytometry for high-throughput, high-content screening. Curr Opin Chem Biol. 8 (4), 392-398 (2004).
  47. Durick, K., Negulescu, P. Cellular biosensors for drug discovery. Biosens Bioelectron. 16 (7-8), 587-592 (2001).
  48. Edwards, B. S., et al. High-throughput flow cytometry for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 2 (5), 685-696 (2007).
  49. Sklar, L. A., Carter, M. B., Edwards, B. S. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 7 (5), 527-534 (2007).
  50. Curpan, R. F., et al. High-throughput screen for the chemical inhibitors of antiapoptotic bcl-2 family proteins by multiplex flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 465-474 (2011).
  51. Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry A. 61 (2), 142-152 (2004).
  52. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Trejo, A., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding for multiplex flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 6 (Unit 6 31), (2011).
  53. Surviladze, Z., Young, S. M., Sklar, L. A. High-throughput flow cytometry bead-based multiplex assay for identification of Rho GTPase inhibitors. Methods Mol Biol. 827, 253-270 (2012).
  54. Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PLoS One. 8 (1), e53015 (2013).
  55. Vignali, D. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods. 342 (1-2), 243-255 (2000).
  56. Hilton, B. J., Wolkowicz, R. An assay to monitor HIV-1 protease activity for the identification of novel inhibitors in T-cells. PLoS One. 5 (6), e10940 (2010).
  57. Rajakuberan, C., Hilton, B. J., Wolkowicz, R. Protocol for a mammalian cell-based assay for monitoring the HIV-1 protease activity. Methods Mol Biol. 903, 393-405 (2012).
  58. Smurthwaite, C. A., et al. Fluorescent genetic barcoding in mammalian cells for enhanced multiplexing capabilities in flow cytometry. Cytometry A. 85 (1), 105-113 (2014).
  59. Stolp, Z. D., et al. A Novel Two-Tag System for Monitoring Transport and Cleavage through the Classical Secretory Pathway - Adaptation to HIV Envelope Processing. PLoS One. 8 (6), e68835 (2013).
  60. Schwartz, A., et al. Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry. 33 (2), 106-114 (1998).

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 98 आनुवंशिक बारकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन रेट्रोवायरल प्रौद्योगिकी उच्च throughput cytometry बहुसंकेतन प्रवाह
मल्टिप्लेक्स अनुप्रयोगों के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ जेनेटिक बारकोडिंग
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Smurthwaite, C. A., Williams, W.,… More

Smurthwaite, C. A., Williams, W., Fetsko, A., Abbadessa, D., Stolp, Z. D., Reed, C. W., Dharmawan, A., Wolkowicz, R. Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications. J. Vis. Exp. (98), e52452, doi:10.3791/52452 (2015).

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