Introduction
Tecnologias como a espectroscopia de fluorescência, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo, todos dependem de fluorescência, uma propriedade amplamente explorado em aplicações bioquímicos, biomédicos e químicos. A fluorescência, quer intrínseca ou por meio de rotulagem, tem sido explorada para a análise dos padrões de expressão de proteína, e os perfis de destino celular, as interacções proteína e funções biológicas 1-9, e através de fluorescência / Förster transferência de energia de ressonância para a detecção de interacções biomoleculares e alterações conformacionais 10-13. Uma vez que o isolamento da proteína fluorescente verde victoria de Aequorea (GFP) 14, a descoberta de proteínas fluorescentes adicionais que ocorrem naturalmente a partir de outros cnidários, em especial os corais, aumentou marcadamente o número de proteínas fluorescentes existentes com os espectros de excitação / emissão distinguíveis. Estes, em conjunto com a introdução de mutações nos seus genes 15-19, Have expandiu ainda mais as possibilidades, a obtenção de uma verdadeira paleta de proteínas fluorescentes disponíveis para os cientistas que exploram microscopia, citometria de fluxo e outras tecnologias baseadas em fluorescência para a sua pesquisa.
Em paralelo, embora de forma independente, o desenvolvimento da tecnologia retroviral tem facilitado drasticamente a expressão estável de informação genética em células de mamíferos ectópica 20-23. Assim, não é surpreendente que esta tecnologia tem sido utilizado para transferir genes de proteínas fluorescentes em uma ampla série de tipos de células e tecidos ou 24-28 para a produção de animais transgénicos 29-31. Seguindo a natureza dos retrovírus, a informação genética da proteína fluorescente ectópica é introduzido no genoma da célula 32 e a célula torna-se fluorescente `para ever'. Esta propriedade permitiu a localização de destino celular, ou de uma única célula de uma população de células. A célula agora fluorescente tem assim acquivermelho sua própria bioassinatura e pode ser definida como com código de barras. A sua bioassinatura único identifica-lo a partir de outras células e, muito importante, que distingue a partir de células geneticamente manipuladas para expressar as proteínas fluorescentes diferentes com espectros de absorção / emissão distinguíveis. Aplicações biológicas, tais como a localização dos fatores de reprogramação para pluripotência 33, a análise dos factores subnucleares para a elucidação da localização nucleolar 34, a construção de plasmídeos repórter fluorescentes para estudos de transcrição 35 ou com a etiqueta genética de neurónios para o estudo da arquitectura da rede neuronal 36 , são apenas quatro exemplos dos muitos que têm explorado diferentes genes da proteína fluorescente para a mesma configuração experimental.
A citometria de fluxo tem sido amplamente utilizada para a análise de processos biológicos ao nível de uma única célula, tais como a expressão do gene, do ciclo celular, apoptose, e a sinalização através de fosforiloção 37-43 .A expressão estável de genes de proteínas fluorescentes em células de mamíferos tem melhorado ainda mais a utilidade de citometria de fluxo para análise das células 38,44 e interacções ligando-receptor 45. Recursos avançados têm permitido citometria de fluxo para se tornar uma metodologia amplamente utilizada para alto rendimento e alto teor de triagem 46. Apesar de o número agora se expandiu de fluorímetros e robótica tecnologias que podem sistemas de leitor de placas pares, imagens e citometria de fluxo, parece haver uma falta no projeto experimental que poderá explorar e encaixar essas capacidades tecnológicas avançadas.
Metodologias rápido, confiável, simples e robustas baseadas em células são drasticamente necessária para aplicações multiplexados que melhoram ainda mais a capacidade de alto rendimento. Isto é especialmente verdadeiro no campo da descoberta de drogas onde ensaios baseados em células de engenharia em um formato multiplex pode aumentar o poder de rastreio de alto rendimento 39,47-50 51-54. O código de barras genético fluorescente não só permite a multiplexagem elegante, mas também, uma vez engenharia, contorna a necessidade de protocolos que consomem tempo, reduz os custos acompanhados com anticorpos, grânulos e manchas 39,52,55, e pode reduzir o número de telas necessários para alta aplicações de transferência. Descrevemos recentemente como a tecnologia pode melhorar retroviral multiplexing através barcoding genético fluorescente para aplicações biológicas, por expressar um ensaio previamente desenvolvido para monitorar o HIV-1 atividade protease 56,57 com diferentes variantes clinicamente prevalentes 58. A metodologia é explicada de forma mais descritiva com foco em como selecionar e ampliar células geneticamente com código de barras fluorescentes e como produzir painéis de populações clonais que expressam proteínas fluorescentes distintas e / ou diferente intensit fluorescênciaies. Painéis de populações celulares distintas com base nas suas características fluorescentes melhorar as capacidades de multiplexados, que pode ainda ser exploradas em combinação com ensaios baseados em células que atacam diferentes questões biológicas. O protocolo também descreve como a engenharia de um painel de células com código de barras com um dos ensaios baseados em células previamente desenvolvidos no laboratório, como exemplo 59. Este protocolo, assim, não se destina a mostrar a tecnologia bem estabelecida retroviral / lentivírus para transferência genética, o valor de proteínas fluorescentes ou as aplicações de citometria de fluxo 60,48 mas sim para mostrar o reforço do poder combinar os três para aplicações multiplexados.
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Protocol
1. Preparação de células de mamíferos, Produção Viral e Transdução de Código de Barras Genetic
- Placa de 2,5 x 10 6 culas aderentes em uma placa de 10 cm (ou seja, cerca de 50-60% de confluência) um dia antes da transfecção em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal de vitelo (FCS). Para uso em produção de embalagens de células-line retroviral de escolha, como Phoenix-GP (a simpática oferta do Gary Nolan, da Universidade de Stanford).
NOTA: A linha celular de empacotamento expressa estavelmente proteínas gag e pol para a formação de partículas retrovirais em trans. Adicione certeza células são saudáveis e aderiu à placa numa monocamada, antes da transfecção. - 24 horas mais tarde, se preparar a mistura de transfecção de ADN.
- Para 125 uL de meio DMEM isento de soro, adicionar 3 ug Vírus da Estomatite Vesicular vector glicoproteína do envelope (pCI-VSVG) e 3 ug de vector de transferência que transporta o gene da proteína fluorescente de interesse. Misture e adicione 15 mL de polietilimina (2 mg / ml).
- Incubar mistura à temperatura ambiente durante 15 min e adicionar às células gota a gota.
NOTA: polietilimina é adicionada à mistura homogénea de ADN como reagente de transfecção para a formação de poliplexos. A fim de se obter partículas virais contendo diferentes marcadores de proteínas fluorescentes, executar cada transfecção, de forma independente com o marcador de escolha. Lembrar que o vector de transferência retroviral é de aproximadamente 7 kb de comprimento e não podem ser embalados se acima de 10 kb.
- Incubar as placas a 37 ° C. A fim de aumentar a produção de placas virais lugar a 30 ° C ou 32 ° C em seu lugar.
NOTA: 24 h pós meios de transfecção pode ser substituído com 7 ml de meio fresco, e embora isto possa melhorar a saúde das células, pode diminuir a carga viral no sobrenadante. - 48 horas após a transfecção coletar as partículas virais contendo sobrenadante e filtro com um filtro de 0,45 mM de politetrafluoretileno. Use sobrenadante viral recém coletado para a transdução. OthDe outra manter sobrenadante em aliquotas a -80 ° C e evitar a congelação-descongelação. Lembre-se que título viral provavelmente diminuirá até 50% em cada ciclo de congelamento-descongelamento.
- Linha celular placa de escolha de 24 horas antes da transdução se aderente, ou imediatamente antes de transdução se não-aderente. Semente de 2,0 x 10 5-3,0 x 10 5 células aderentes (aqui Huh 7.5.1 e HEK 293T) ou 5,0 x 10 5 a 1 x 10 6 células não-aderentes (aqui SupT1) por poço numa placa de 6 poços.
Nota: certifique-se para calibrar o número de células a ser semeado antes da transdução, especialmente para células aderentes, de modo que as células atingir uma confluência de cerca de 60% no tempo de transdução. - Adicionam-se 5 ug / ml de polibreno (brometo de hexadimethrene) para células semeadas e, em seguida, adicionar o sobrenadante viral previamente recolhidas para se obter cerca de 20-40% de infecção (aqui 2 ml).
NOTA: O MOI ou a percentagem de infecção é mais arbitrário, como triagem vai permitir a amplificar qualquer subpopulatião de células. Obviamente, um aumento da taxa de infecção facilita e acelera o processo de amplificação. - Transduzir as células por centrifugação num rotor de cesto de suspensão a 1500 xg durante 32 min a 120 ° C. Ressuspender as células não aderentes por meio fresco antes da incubação. Para as células aderentes, substitua por fresco media 24 horas após a transdução.
NOTA: Recomenda-se a selar as placas antes da centrifugação com parafilme para evitar transbordando. Para aumentar a diversidade de células geneticamente com código de barras, a transdução de células com as partículas virais portadoras diferentes proteínas fluorescentes (obtidos a partir do passo 1.4). Ao escolher marcadores fluorescentes, verifique se eles são compatíveis com a instrumentação e eles têm parâmetros fluorescentes distinguíveis.
2. Escolha e amplificação de células geneticamente com código de barras
- Analise as células de mamíferos transduzidas por citometria de fluxo, pelo menos, 72 horas de pós transdução para quantificar a taxa percentual de transdução. Utilize uma linha de células não transduzidas comparável como controlo negativo.
NOTA: Como triagem são utilizados para purificar as populações de células de códigos de barras individuais, uma alta taxa de transdução inicial, embora não necessário, deverá acelerar o processo de amplificação. - Utilizar a célula-classificador de escolha para obter as células que expressam a proteína de interesse.
- Para o efeito, assegurar as portas estão devidamente posicionados nos canais certos.
- Para isso utiliza a linha de células naïve como controlo negativo e ajustar a tensão parâmetro / canal de modo a que a população negativa é inferior ao valor de 3 a 10 em cada eixo fluorescente. Determinar gating por fluorescência positiva como eventos que aparecem acima da do controlo negativo para cada canal fluorescente.
- Esteja ciente de que cada instrumento pode variar e a voltagem correta para determinar gating devem ser ajustados em conformidade, fazendo controles positivos e negativos imperativos em cada expconfiguração erimental.
- Para a detecção de fluorescência nesta configuração experimental usar o canal FITC (filtro 530/30 passa banda passou por um filtro de 502 passe longo) para eGFP, o canal PE (filtro 585/42 passa banda passou por um filtro de 556 passe longo) para td Tomato eo canal APC (filtro passa banda 660/20) para E2 Carmesim.
NOTA: O laser de 488 nm excita eGFP e td Tomato enquanto E2 Carmesim está animado com o laser de 633 nm.
- Para a detecção de fluorescência nesta configuração experimental usar o canal FITC (filtro 530/30 passa banda passou por um filtro de 502 passe longo) para eGFP, o canal PE (filtro 585/42 passa banda passou por um filtro de 556 passe longo) para td Tomato eo canal APC (filtro passa banda 660/20) para E2 Carmesim.
- Para o efeito, assegurar as portas estão devidamente posicionados nos canais certos.
- Ordenar em 15 ml tubos cónicos com 1 ml de 100% de FCS.
NOTA: O processo de triagem de populações de células fluorescentes não é obrigatório, como se pode proceder directamente com o tipo de clones individuais (ver abaixo). Classificando populações apertados com base em fluorescência escolhido garante uma população de backup para futura seleção de clones individuais. Tenha em mente que as células individuais são, por vezes, difícil de crescer, enquanto uma grande parte da população de células pode ser facilmente congelado, descongelado e depois amplificado e, numa fase posterior. - Spem baixo as populações classificadas num rotor de centrífuga balde suspensão em 524 g a 32 ° C durante 5 min para sedimentar as células. Re-suspender em 1 ml de meio fresco, e re-placa de modo a que as células de confluência de células é inferior a 60% para permitir o crescimento e divisão para pelo menos dois dias.
- Por exemplo, as células aderentes a placa cerca de 3 x 10 5 células em 2 ml de meio por poço numa placa de 6 poços e 2 x 10 6 células em 2 ml de meio em uma placa de 6 cm. Use DMEM para células aderentes e meio RPMI para células não-aderentes (ou qualquer meio especificado, se necessário). Coloque células plaqueadas numa incubadora a 37 ° C durante vários dias para permitir a amplificação.
3. Obter clonais populações de células geneticamente com código de barras em diferentes intensidades
- Obtenção de populações clonais de células originalmente transduzidas (passo 1.7) ou a partir da população classificada (passo 2.3).
NOTA: Este vai assegurar um nível igual ou semelhante da expressão da proteína fluorescente entre todas as célulass dentro da população (uma população apertado com uma pequena CV na intensidade de fluorescência média de até 40%).- Para esse efeito, as células individuais tipo em placas de 96 poços com uma unidade de deposição de células automatizado (ACDU). Definir portas para a classificação de acordo com a população de interesse. Assegurar portões são apart definir pelo menos um log-escala para obtenção de populações distintas ao escolher células em diferentes intensidades fluorescentes. Para o procedimento mostrado aqui, utilizar a mesma citometria de fluxo montagem experimental que o descrito no passo 2.2.
- Amplificar clones individuais em uma incubadora a 37 ° C durante pelo menos 2 semanas. Através do processo de amplificação analisar as células ao microscópio para assegurar que as populações em crescimento surgem a partir de células individuais, e não a partir de mais do que um.
NOTA: Lembre-se que o classificador irá colocar um celular por bem, em média, e enquanto alguns poços não podem ter qualquer célula em tudo, outros podem ter mais de um.- Para garantir que a população surge de uma célula só, ser extremamente gentil com a placa e nunca perturbar os poços por pipetagem. Observar a placa, bem pelo bem, sob o microscópio.
NOTA: Enquanto as células individuais podem às vezes ser difícil de identificar, uma vez que eles começam a dividir eles serão facilmente reconhecíveis. - Esteja ciente de que muitas vezes as células 'moita' ao longo das bordas. Descarte esses poços onde várias populações clonais podem ser observados e manter aqueles que têm uma população apertado.
NOTA: É aconselhável transferir aqueles em placas maiores para a amplificação.
- Para garantir que a população surge de uma célula só, ser extremamente gentil com a placa e nunca perturbar os poços por pipetagem. Observar a placa, bem pelo bem, sob o microscópio.
- Peneirar os populações clonais putativos por analisadas por citometria de fluxo. Compará-los com um controlo negativo, utilizando o mesmo dispositivo experimental de citometria de fluxo.
- Analisar apenas uma porcentagem da amostra e manter o resto como backup. Escolha as populações mais nitidamente separadas com base em intensidade média e aperto da população. Amplificá-los conforme a necessidade ou congelar stocks emmeios com 20% de glicerol a congelação a -80 ° C, durante curtos períodos de tempo ou de azoto líquido para um maior tempo.
NOTA: Lembre-se que a "verdadeira" população clonal deve ter um padrão de fluorescência muito apertado.
- Analisar apenas uma porcentagem da amostra e manter o resto como backup. Escolha as populações mais nitidamente separadas com base em intensidade média e aperto da população. Amplificá-los conforme a necessidade ou congelar stocks emmeios com 20% de glicerol a congelação a -80 ° C, durante curtos períodos de tempo ou de azoto líquido para um maior tempo.
4. Certifique-se de Capacidades de multiplexação para High Throughput Screening (HTS)
- Combinar o número de populações clonais distintos conforme a necessidade, que pode ainda ser utilizado num formato multiplex. Escolha clones com absorção de espectros distinguíveis / emissão e / ou intensidades diferentes. Se um formato de placa de 96 poços é utilizado, o qual é adequado para HTS, sementes 50.000 células em 200 ul por poço.
NOTA: Tenha em mente que o número de células é apenas uma estimativa e podem mudar com base no tipo de célula e se é aderente ou não. - Analisar a amostra utilizando a citometria de fluxo para garantir que cada uma das linhas de células independentes estabelecidas fluorescentes podem ser distinguidos um do outro. Antes da análise preparar negativoe controles de cor única para definir parâmetros e valores de compensação.
Nota: definir os parâmetros para distinguir claramente as populações mistas lhes permitam ser mais utilizado em um formato multiplexado.
5. Adaptar linhas celulares geneticamente com código de barras para a aplicação biológica of Choice
- Transduzir linhas de células estabelecidas geneticamente códigos de barras com partículas virais que contêm os elementos de ensaio de escolha, tal como descritos aqui em Stolp et al., 2013 59. Lembrar que o ensaio de escolha deve ocupar um canal fluorescente adicional e distinguíveis e, portanto, é para ser transferido para a linha celular de código de barras apropriado.
NOTA: Cada linha celular com código de barras pode suportar um ensaio diferente. - Células com código de barras tipo geneticamente fluorescentes para aqueles que contêm elementos de ensaio.
NOTA: elementos de ensaio podem ser manipuladas acoplado a um marcador fluorescente ou proteína (como uma fusão ou por meio de um local de entrada de ribossoma interno) fou detecção direta por meio de transferência de western, citometria de fluxo ou microscopia. O sistema utilizado neste protocolo baseia-se na expressão de superfície de HA epitopo sozinho, ou com expressão epitopo FLAG adicional.- Corar as populações clonais contendo o ensaio com anticorpos acoplados HA e APC-fluorescentemente. Em seguida, analisar as populações clonais com anti-FLAG e coloração com anticorpo conjugado com FITC.
- Para rastrear o ensaio, analisar ou "decodificar" as populações no canal apropriado, onde as linhas de células geneticamente distintas códigos de barras podem ser distinguidos. Aqui, decodificar a natureza do substrato por meio da análise no canal PE td para a detecção de tomate.
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Representative Results
Multiplexing fluorescente células geneticamente barcoded para a finalidade de aplicações biológicas só pode ser alcançado quando as populações clonais individuais foram gerados. Multiplexing é mais eficaz quando as populações códigos de barras têm características distintas fluorescentes claras com sobreposição espectral mínima. O exemplo mostrado na Figura 1 com populações clonais de células de mamífero SupT1 ilustra que as células com o código de barras mCherry e proteína fluorescente ciano (PCP) podem ser facilmente analisadas simultaneamente, sem perder as suas características fluorescentes individuais. Esta matriz exemplifica assim um painel de células geneticamente códigos de barras fluorescentes que é utilizável para aplicações biológicas de multiplexação com uma leitura em ainda disponível um canal adicional. A fim de obter um tal painel, é importante lembrar da natureza da tecnologia retroviral, o que levará a intervalos variáveis de intensidade de fluorescência dentro da população devido ao ef insercionalfects e / ou MOI. A Figura 2 ilustra que a transdução inicial de células de mamíferos com partículas virais contendo quer td resultados tomate carmesim ou E2 em células que expressam quer uma ou ambas das proteínas fluorescentes em uma ampla gama de intensidades (painel da esquerda). Selecção e triagem de células individuais em placas de 96 poços como mostrado pelas caixas fechadas (meados do painel), permite a obtenção de populações clonais apertados seguintes expansão (painel da direita). Uma população apertado deverá ser definida como tendo um pequeno CV que pode variar de acordo com o tipo celular, normalmente 30-40% da intensidade média da fluorescência. A Figura 2 também ilustra que, para aumentar ainda mais o número de populações geneticamente código de barras com uma matriz de apenas dois fluorescente proteínas, também se pode explorar a intensidade de fluorescência. Geralmente, um desvio de log na intensidade de fluorescência média entre populações é adequado para alcançar separação adequada em relação uns aos outros após triagem e amplificação. Td tomate foi escolhido, no exemplo mostrado para ilustrar esta função, em que duas populações de diferentes intensidades, médias e altas, foram obtidos por multiplexagem com E2 carmesim numa única intensidade.
A multiplexação é uma ferramenta poderosa para facilitar a análise de várias amostras ao mesmo tempo e para a capacidade de descodificar populações mascarados. Melhorar a multiplexagem pode ser alcançado com uma terceira proteína fluorescente tal como eGFP, contanto que as propriedades espectrais não interferem uns com os outros. No procedimento experimental ilustrada na Figura 3, o painel de seis populações obtidas com td tomate e E2 Carmesim foi explorada para aumentar a multiplexagem com eGFP. Retroviral tecnologia foi utilizada para transferir eGFP para as populações representadas em uma das matrizes. Quando observado no canal eGFP, a matriz ingénuos seis população não-verde (painel superior esquerdo na Figura 3) é indistinguível do eGFP-transduzidomatriz população (painel inferior esquerdo da Figura 3). É importante notar que os painéis podem ser analisadas nos canais ocupados pelo código de barras genético de origem (td tomate e E2 carmesim). Enquanto indistinguíveis nestes canais (comparar populações 1-6 com populações 12/07 em meados painéis, figura 3), as populações individuais podem ser analisados no canal eGFP, e decodificados ou rastreados de volta, como mostrado nos histogramas (painéis da direita em A Figura 3). Depois de repetir o processo de transdução, seleção, classificação e amplificação, aproveitando os canais desocupados é inútil se não for aplicada a compensação direita para ajustar para uma possível sobreposição espectral. Para provar isso, quando as populações 1, 2, 3 (não-verde) e 7, 8, 9 (verde) são analisados no eGFP e td canais de tomate, as populações de 7 e 8 são difíceis de distinguir (painel da esquerda na Figura 4) . Assim, é necessário escolher células naïve (população 1) como um con negativotrolar de modo que os parâmetros da instrumentação pode ser ajustado. Ao analisar qualquer matriz, especialmente com fluorophores que espectralmente se sobrepõem, é imperativo que os controles de cor individuais são usados para determinar os valores de compensação corretos. Na análise da Figura 4 populações 2 ou 3, e 7 de servir a esse propósito, permitindo definir melhor as populações que são verdadeiramente duplo positivos (populações 8 e 9).
Células geneticamente códigos de barras com marcadores fluorescentes manter a sua própria identidade, tal como definido pela sua bioassinatura, quando analisados no canal fluorescente direito com o instrumento adequado. No entanto, o bioassinatura torna-se apenas uma propriedade individual adicional, a menos explorada para aplicações biológicas. A fim de provar o poder do código de barras genético fluorescente para multiplexação, decidimos introduzir um dos nossos ensaios desenvolvidos anteriormente para a descoberta de drogas em algumas das linhas de células de mamíferos com código de barras fluorescentes. Ao fazer isso, fluoresent barcoding genética foi explorada para atingir três ensaios em uma amostra. Neste procedimento uma proteína contendo um andaime de três viral substrato putativo para a proteólise foi transferido para as células geneticamente códigos de barras. No ensaio, a clivagem é revelada pela perda do epitopo FLAG na superfície da célula (Figura 5B). Em contraste, a coloração da superfície FLAG representa a falta de clivagem Figura 5 ilustra o resultado da análise de três substratos diferentes.; HIV-1 Envelope tipo selvagem (Env wt), HIV-1 mutante Envelope (Env mut) e Vírus da Dengue (DENV) PMR. Cada um deles foi introduzido em 1 de 3 linhas de código de barras celulares, ingénuo, e 2 outros que utilizam td tomate em diferentes intensidades (média e alta; Figura 5A). Coloração para a expressão de superfície FLAG revela qual dos substratos foi clivado com base no respectivo código de barras. No exemplo apenas HIV Env mut mantém a tag FLAG (após coloração positiva), como visto no FI-verdeTC canal (Figura 5C, painel inferior direito). A análise do ensaio pode assim ser executada independentemente do código de barras original, e ser ainda mais explorado para descodificar e rastrear as populações distintas. Este método de multiplexação repousa, assim, um canal adicional reservada para a leitura biológico de interesse.
Figura 1:. Barcoding para multiplexação populações individuais geneticamente códigos de barras utilizando proteínas fluorescentes distintas, tais como mCherry, PCP ou ambos (painel da esquerda) pode ser misturado, analisado e descodificado (painel da direita) nos seus respectivos canais através de citometria de fluxo. Adaptado de Smurthwaite, C. et al., 2014 58. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Separar e amplificação de células As células de mamífero com código de barras foram analisados 48 horas a seguir a transdução com partículas virais contendo quer td tomate ou E2-carmesim (painel da esquerda). Portões são, então, definido para a classificação para incluir as células que expressam td tomate em diferentes intensidades, com / out E2-Crimson (painel do meio). Clones das sortes foram amplificados e re-analisados para gerar uma matriz de seis populações distintas (painel direito). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Decoding revela populações mascarados A matrizde seis populações obtidas na Figura 2 (td tomate e / ou E2-carmesim) pode ser adicionalmente manipulada para expressar uma proteína fluorescente adicional, como eGFP. (A) A matriz original, quando analisada no canal eGFP (painel da esquerda) é negativa e as seis populações são indistinguíveis uns dos outros. Cada um dos seis populações podem ser analisadas de forma independente no canal eGFP como mostrado nos histogramas (painéis da direita). (B) A mesma matriz, agora expressando também eGFP, foi analisada como em A, revelando agora a sua característica verde fluorescente. Adaptado de Smurthwaite, C. et al., 2014 58. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Compensação garante a separação correta Algumas das populações escolhido originalmente baseado em td Tomate e / ou expressão eGFP (populações 7 e 8) não pode ser devidamente separados quando analisados em conjunto (painel esquerdo), a menos que uma compensação adequada desses canais é ajustado (direita. painel). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. A selecção de células com código de barras para uma nova adaptação para ensaio escolhido (A) Seleção e adaptação ao ensaio de escolha. Populações geneticamente códigos de barras com td tomate em diferentes intensidades (painel superior esquerdo) foram usados para aplicações biológicas. Cada uma das populações foi ainda modificado para conter um ensaio que monitora a clivagem, Mas cada um de um substrato diferente (painel superior direito). (B) Representação do ensaio. Mancha FLAG positivo indica falta de clivagem enquanto mancha FLAG negativo indica clivagem. (C) Análise de ensaio após coloração FLAG. Populações mistas são distinguíveis com base no código de barras do tomate td mas indistinguíveis no canal FITC (painéis da esquerda). Quando corados com anticorpo FLAG-FITC, apenas uma população é positiva para FLAG. Decoding revela, com base no código de barras genético, que esta população carrega o substrato mut HIV Env (painel direito). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui dois procedimentos bem estabelecidos foram combinados; através de tecnologia de engenharia genética retroviral e detecção de proteínas fluorescentes utilizando citometria de fluxo. Fluorescent barcoding genética à base de proteínas para a produção de linhagens de células únicas fornece uma maneira simples e robusta para aplicações multiplexados. Geração de células geneticamente modificadas com código de barras por meio da tecnologia retroviral, é inicialmente um processo demorado, mas permite a obtenção de, uma vez estabelecido, uma fonte fiável e estável de material celular. A natureza dessa tecnologia produz consistentemente linhas de células geneticamente modificadas com características fluorescentes estáveis que se tornam sua própria verdade bioassinatura distinguíveis.
Ambos os tipos de células aderentes e não aderentes podem ser códigos de barras, utilizando proteínas fluorescentes que são facilmente distinguíveis com base na sua espectros de absorvância / emissão física. Estes incluem, mas não se restringem a proteínas, tais como PCP, mCherry, E2 Crimson and td Tomato. Uma vez geneticamente com código de barras com a sua proteína fluorescente distinguível, eles podem ser combinados para produzir um painel de populações de células. É importante ressaltar que o painel contém populações de células com a exata genotípica make-up, mas diferenciadas apenas pela sua característica de fluorescência. Como tal, estes painéis são perfeitamente adequados para aplicações multiplexados, aumentando consideravelmente as capacidades de alto rendimento.
Devido às diferentes preferências de inserção da partícula retroviral no genoma do hospedeiro, juntamente com as diferenças de MOI, são esperados intensidades de fluorescência variável do gene de proteína fluorescente em particular realizado. A análise de uma população geneticamente modificada portadora de um gene fluorescente única irá, assim, detectar uma gama de perfis de expressão que podem ser definidos com base na intensidade de fluorescência. Este perfil de expressão diferencial pode ser explorada para criar populações que são espectralmente distintos um do outro. Pode-se, assim, combine escolha de marcadores fluorescentes, com intensidade de fluorescência para caber o projeto experimental. Aqui, matrizes de 4, 6 e 12 populações, que incluem dois painéis 6 populacionais de E2 Crimson and td tomate, com ou sem eGFP, são mostrados. Em teoria, isso pode ser expandida com diferentes intensidades de eGFP bem para criar populações de três proteínas fluorescentes diferentes; cada uma com diferentes intensidades associados. Como afirmado anteriormente, devem ser considerados ao escolher as proteínas fluorescentes, a fim de assegurar que a separação pode de facto ser conseguido. Proteínas escolhidas devem ter absorção distinta e espectros de emissão; no entanto, quando duas proteínas fluorescentes espectralmente distintas, mas semelhantes são usados, a compensação deve ser aplicado. Importante, a compensação apropriada, o que permite a separação física dos espectros de emissão / absorção entre diferentes fluoróforos ou proteínas fluorescentes, é realizado com a utilização de controlos de cor simples e adequadas paradetecção através de citometria de fluxo.
A multiplexação com menos proteínas fluorescentes mas explorando uma variedade de intensidades liberta canais adicionais que podem ser, em seguida, ainda mais explorados para a aplicação biológica de interesse. Isto pode aumentar a flexibilidade da instalação experimental e simplificar a escolha da combinação de marcadores fluorescentes para ser utilizado. Por exemplo, o ensaio multiplexado mostrado na Figura 5 baseia-se na coloração do anticorpo, neste caso, acoplado a FITC. Como apenas o canal PE é ocupada por código de barras genética, pode-se utilizar anticorpos conjugados com FITC, ou, inversamente, a APC-acoplada, uma decisão de que pode ser feita com base na instrumentação apropriada e / ou disponibilidade de anticorpos.
Embora os avanços tecnológicos no campo da citometria de fluxo, microscopia ou metodologias combinadas são impressionantes, o gargalo parece ser a tecnologia de células disponíveis para aplicações biológicas e HTS. Tecnologia Retrovirallogia, juntamente com o número cada vez maior de proteínas fluorescentes podem ser fundidas para responder a esta consulta. O código de barras genético fluorescente drasticamente facilita a multiplexagem, o qual, por sua vez, satisfaz a necessidade crescente de expansão HTS capacidades de ensaios baseados em células. Barcoding genética leva a uma robusta, eficaz e maneira simples de ensaios baseados em células casal com metodologias de alto rendimento de aplicações biológicas e triagem de drogas. O poder de realizar um ao invés de três telas usando um painel de 3 população tem custo benéfico e implicações relacionadas com o tempo. Com a crescente versatilidade em citometria de fluxo, de imagem de alta conteúdo e microscopia de citometria de fluxo acoplado, barcoding genético fluorescente será uma ferramenta consistente e confiável para o desenvolvimento do ensaio.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Garry Nolan pela Universidade de Stanford para fornecer a linha de células de empacotamento Phoenix GP para a produção de partículas retrovirais. Agradecemos ao Dr. Roger Tsien da Universidade da Califórnia em San Diego para a prestação de td Tomato. Gostaríamos também de agradecer ao Facility San Diego State University Citometria de Fluxo do núcleo para o seu serviço e ajuda.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | used for filtering the virus |
| 0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter | Pall Corporation | 4219 | used for filtering the virus |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 45000-304 | cell growth media for HEK 293T cells |
| PEI (Polyethylenimine) | poly sciences | 23966-2 | 2 mg/ml concentration used |
| Hanging bucket centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5805 000.017 | used for spin infection |
| PBS (phosphate buffered saline) | Corning | 21-040-CV | used for washing of cells |
| Polybrene (hexadimethreen bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration. |
| FACSAria | BD Biosciences | instrument used for sorting cell populations | |
| FACSCanto | BD Biosciences | instrument used for cell analysis | |
| Phoenix-GP | Gift from Gary Nolan | cell line used to produced retroviral particles | |
| Fetal calf serum | Mediatech | MT35015CV | used for cell growth and sorting |
| SupT1 cells | ATCC | CRL-1942 | Human T lymphoblasts |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | cell growth media for SupT1 cells |
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