Introduction
Les technologies telles que la spectroscopie de fluorescence, microscopie par fluorescence et la cytométrie en flux, toutes reposent sur la fluorescence, une propriété largement exploitée dans les applications biochimiques, biomédicales et chimiques. La fluorescence, si intrinsèque ou par un étiquetage, a été exploitée pour l'analyse du profil des protéines d'expression et profilés, le destin des cellules, les interactions entre protéines et les fonctions biologiques 9.1, et par fluorescence / Förster transfert d'énergie de résonance pour la détection d'interactions biomoléculaires et des changements conformationnels 10-13. Depuis l'isolement de la Aequorea victoria protéine fluorescente verte (GFP) 14, la découverte des protéines fluorescentes naturels supplémentaires provenant d'autres cnidaires, en particulier les coraux, a largement augmenté le nombre de protéines fluorescentes existantes avec des spectres d'excitation / émission distinguer. Ceux-ci, ainsi que l'introduction de mutations dans leurs gènes 15-19, VHAe élargi les possibilités, obtenir une véritable palette de protéines fluorescentes disponibles pour les scientifiques qui exploitent la microscopie, cytométrie en flux et d'autres technologies basées sur la fluorescence pour leur recherche.
En parallèle, bien que de façon indépendante, le développement de la technologie rétroviral a considérablement facilité l'expression stable de l'information génétique dans des cellules de mammifères ectopique 20-23. Il ne est donc pas surprenant que cette technologie a été utilisée pour transférer des gènes de protéines fluorescentes dans un large nombre de types cellulaires et tissus 24-28 ou pour la production d'animaux transgéniques 29-31. Suite à la nature des rétrovirus, de l'information génétique de la protéine fluorescente ectopique est introduit dans le génome de la cellule 32 et la cellule devient fluorescent pour ever' `. Cette propriété a permis le suivi du destin cellulaire, ou d'une seule cellule dans une population de cellules. La cellule a donc maintenant fluorescente acquiRED sa propre biosignature et peut être défini comme un code à barres. Son biosignature unique identifie des autres cellules, et surtout, le distingue des cellules génétiquement manipulées pour exprimer différentes protéines fluorescentes avec des spectres d'absorption / émission distinguables. Applications biologiques tels que le suivi des facteurs de reprogrammation vers la pluripotence 33, l'analyse des facteurs subnucléaires pour l'élucidation de localisation nucléolaire 34, la construction de plasmides rapporteurs fluorescents pour les études de la transcription 35 ou l'étiquetage génétique de neurones pour l'étude de l'architecture de réseau neuronal 36 , ne sont que quatre exemples de nombreux qui ont exploité différents gènes de la protéine fluorescente pour le même dispositif expérimental.
La cytométrie en flux a été largement utilisé pour l'analyse de processus biologiques au niveau de la cellule unique, comme l'expression du gène, le cycle cellulaire, l'apoptose et la signalisation par phosphoryleation 37-43 .Le expression stable de gènes de protéines fluorescentes dans les cellules de mammifères a encore amélioré l'utilité de la cytométrie en flux pour l'analyse cellulaire 38,44 et interactions ligand-récepteur 45. Renforcement des capacités ont permis cytométrie en flux pour devenir une méthode largement utilisée pour à haut débit et à haute teneur de dépistage 46. Malgré le nombre de fluoromètres maintenant élargi et technologies robotiques que les systèmes de lecteur de quelques plaques, l'imagerie et peuvent cytométrie en flux, il semble y avoir un manque dans la conception expérimentale qui peut exploiter et adapter ces capacités technologiques accrues.
Méthodologies à base de cellules rapides, fiables, simples et robustes sont nécessaires pour des applications radicalement multiplexés qui améliorent la capacité à haut débit. Cela est particulièrement vrai dans le domaine de la découverte de médicaments où les dosages à base de cellules ingénierie dans un format multiplexé peuvent améliorer la puissance de criblage à haut débit 39,47-50 de 51 à 54. Codes-barres génétique fluorescent permet non seulement de multiplexage élégant, mais aussi, une fois conçu, contourne la nécessité de protocoles de longs, de réduire les coûts accompagnés avec des anticorps, des perles et des taches 39,52,55, et peut réduire le nombre d'écrans nécessaires à haute les demandes de débit. Nous avons récemment décrit comment la technologie retroviral peut améliorer multiplexage par codes à barres génétique fluorescent pour des applications biologiques, en exprimant un dosage précédemment développé pour surveiller le VIH-1 l'activité de protease avec différentes variantes 56,57 cliniquement 58 prévalents. La méthodologie est expliquée de manière plus descriptive en se concentrant sur la façon de sélectionner et amplifier les cellules fluorescentes génétiquement code-barres et comment produire des panneaux de populations clonales exprimant des protéines fluorescentes distinctes et / ou différente fluorescence intensits. Panneaux de populations cellulaires distinctes en fonction de leurs caractéristiques fluorescentes améliorer les capacités multiplexées, qui peut encore être exploité en combinaison avec les tests cellulaires qui abordent différentes questions biologiques. Le protocole décrit également comment concevoir un panneau de cellules portant un code à barres des tests cellulaires précédemment développés dans le laboratoire, à titre d'exemple 59. Ce protocole est donc pas destinée à présenter la technologie bien établie rétroviral / lentiviral pour le transfert génétique, la valeur des protéines fluorescentes ou les applications de la cytométrie de flux 60,48, mais plutôt de démontrer l'amélioration de la puissance de combiner les trois pour les applications multiplexées.
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Protocol
1. Préparation de cellules de mammifères, la production virale et la transduction des codes à barres génétique
- Plate 2,5 x 10 6 cellules adhérentes dans une plaque de 10 cm (soit environ 50-60% de confluence) un jour avant la transfection dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum de veau foetal (SVF). Pour une utilisation en production rétrovirale emballage lignée cellulaire de choix tels que Phoenix-GP (une sorte cadeau de Gary Nolan, l'Université de Stanford).
NOTE: La lignée cellulaire d'emballage exprime de manière stable Gag et Pol protéines pour la formation de particules rétrovirales en trans. Assurez-vous que les cellules sont en bonne santé et collée à la plaque dans une monocouche, avant la transfection. - 24 h plus tard, préparer le mélange d'ADN de transfection.
- Pour 125 ul de DMEM sans sérum ajouter 3 ug d'enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire vecteur glycoprotéine (pCI-VSVg) et 3 ug de vecteur de transfert portant le gène de la protéine fluorescente d'intérêt. Mélanger et ajouter 15 pi de polyéthylimine (2 mg / ml).
- Incuber mélange à la température ambiante pendant 15 minutes et ajouter aux cellules goutte à goutte.
REMARQUE: polyéthylimine est ajouté au mélange homogène de l'ADN en tant que réactif de transfection pour la formation de polyplexes. Afin d'obtenir des particules virales portant différents marqueurs protéiques fluorescents, chaque transfection effectuer de façon indépendante avec le marqueur de sélection. Rappelez-vous que le vecteur de transfert rétroviral est d'environ 7 kb de longueur et ne peut être emballé si supérieure à 10 ko.
- Incuber les plaques à 37 ° C. Afin d'augmenter virales lieu de production des plaques à 30 ° C ou 32 ° C à la place.
NOTE: 24 heures après les médias de transfection peuvent être remplacés par 7 ml de milieu frais, et bien que cela peut améliorer la santé cellulaire, il peut diminuer la charge virale dans le surnageant. - 48 heures après transfection recueillir les particules virales contenant surnageant et le filtre avec un filtre de 0,45 uM de polytétrafluoroéthylène. Utilisez surnageant viral fraîchement prélevé pour la transduction. OthErwise garder surnageant en aliquots à -80 ° C et éviter le gel-dégel. Rappelez-vous que le titre viral diminuera probablement jusqu'à 50% à chaque cycle de congélation-décongélation.
- ligne de choix 24 heures avant de la cellule de la plaque à transduction si adhérent, ou immédiatement avant transduction si non-adhérent. Graine 2,0 x 10 5 à 3,0 x 10 5 cellules adhérentes (ici Huh 7.5.1 et HEK 293T) ou 5,0 x 10 5 à 1 x 10 6 cellules non adhérentes (ici SupT1) par puits dans une plaque à 6 puits.
REMARQUE: Assurez-vous de calibrer le nombre de cellules à ensemencer avant transduction, particulièrement pour les cellules adhérentes, afin d'atteindre un cellules confluence d'environ 60% au moment de la transduction. - Ajouter 5 ug / ml Polybrene (bromure de hexadimethrene) aux cellules ensemencées puis ajouter surnageant viral déjà recueillis pour obtenir autour de 20 à 40% d'infection (ici 2 ml).
NOTE: Le MOI ou le pourcentage d'infection est le plus souvent arbitraires, comme le tri permettra d'amplifier toute subpopulation de cellules. De toute évidence, un taux d'infection élevé facilite et accélère le processus d'amplification. - Transduire des cellules par centrifugation dans un rotor à godets de suspension à 1500 xg pendant 32 min à 120 ° C. Remettre en suspension les cellules non adhérentes par du milieu frais avant l'incubation. Pour les cellules adhérentes, remplacer par Fresh Media 24 h post-transduction.
NOTE: Il est recommandé de sceller les plaques avant la centrifugation avec du parafilm pour éviter de renverser plus. Pour augmenter la diversité des cellules génétiquement code-barres, la transduction de cellules avec des particules virales portant différentes protéines fluorescentes (obtenus à partir de l'étape 1.4). Lors du choix des marqueurs fluorescents, assurez-vous qu'ils sont compatibles avec l'instrumentation et ils ont des paramètres fluorescents distinguables.
2. Sélection et amplification de cellules génétiquement BarCoded
- Analyser les cellules de mammifères transduites par cytométrie de flux au moins 72 heures après transduction pour quantifier le taux de pourcentage de transduction. Utilisez une lignée de cellules non-transduites comparables comme contrôle négatif.
NOTE: Comme tri sera utilisé pour purifier des populations de cellules individuelles à code-barres, un pourcentage élevé de transduction initiale, tout pas nécessaire, devrait accélérer le processus d'amplification. - Utiliser le trieur cellulaire de choix pour obtenir les cellules qui expriment la protéine d'intérêt.
- A cet effet, se assurer que les portes sont correctement réglés dans les bons canaux.
- Pour ce faire utiliser la même lignée cellulaire naïve comme contrôle négatif et régler la tension paramètre / canal de sorte que la population négative, est inférieure à la valeur de 10 trois sur chaque axe fluorescent. Déterminer déclenchement pour une fluorescence positive que les événements qui apparaissent au-dessus de celui du témoin négatif pour chaque canal fluorescent.
- Soyez conscient que chaque instrument peut varier et la tension correcte pour déterminer déclenchement devrait être ajustée en conséquence, ce qui rend les contrôles positifs et négatifs impératives dans chaque experimental configuration.
- Pour la détection de fluorescence dans ce dispositif expérimental utiliser le canal FITC (530/30 du filtre passe-bande a procédé par une longue filtre 502 passe) pour eGFP, le canal de PE (585/42 filtre passe-bande a procédé par un filtre 556 long passe) pour td tomate et le canal APC (660/20 filtre passe-bande) pour E2 Crimson.
NOTE: Le laser 488 nm excite eGFP et td Tomato tandis que Crimson E2 est excité par le laser 633 nm.
- Pour la détection de fluorescence dans ce dispositif expérimental utiliser le canal FITC (530/30 du filtre passe-bande a procédé par une longue filtre 502 passe) pour eGFP, le canal de PE (585/42 filtre passe-bande a procédé par un filtre 556 long passe) pour td tomate et le canal APC (660/20 filtre passe-bande) pour E2 Crimson.
- A cet effet, se assurer que les portes sont correctement réglés dans les bons canaux.
- Trier dans 15 ml tubes coniques avec 1 ml de 100% de SVF.
NOTE: Le processus de tri des populations de cellules fluorescentes ne est pas obligatoire que l'on peut directement procéder à la sorte de clones individuels (voir ci-dessous). Tri populations stricts basés sur la fluorescence choisie garantit une population de sauvegarde pour la sélection future des clones individuels. Gardez à l'esprit que les cellules individuelles sont parfois difficiles à cultiver alors qu'une grande population de cellules peut être facilement congelé, puis décongelé et amplifié à un stade ultérieur. - Spvers le bas dans les populations triées dans un rotor centrifuge suspension du godet à 524 g à 32 ° C pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules. Remettre en suspension dans 1 ml de milieu frais, et ré-plaque afin que la confluence des cellules de la cellule est inférieur à 60% pour permettre la croissance et la division d'au moins deux jours.
- Par exemple, les cellules adhérentes dans des plaques à environ 3 x 10 5 cellules dans 2 ml de milieu par puits dans une plaque à 6 puits et 2 x 10 6 cellules dans 2 ml de milieu dans une plaque de 6 cm. Utilisation du DMEM pour les cellules adhérentes et un milieu RPMI pour les cellules non adhérentes (ou ne importe quel support spécifié si nécessaire). Passer cellules étalées dans un incubateur à 37 ° C pendant plusieurs jours pour permettre l'amplification.
3. Obtenir des populations de cellules clonales génétiquement BarCoded à différentes intensités
- Obtenir des populations clonales de cellules transduites initialement (étape 1.7) ou de la population triée (étape 2.3).
NOTE: Cela permettra d'assurer un niveau égal ou similaire d'expression de la protéine fluorescente entre tous la cellules au sein de la population (une population serré avec un petit CV en intensité de fluorescence moyenne de près de 40%).- A cet effet, les cellules de tri simples dans des plaques à 96 puits avec une unité de dépôt de cellules automatisé (ACDU). Réglez portes pour le tri selon les populations d'intérêt. Assurer portes sont fixés au moins une échelle logarithmique à part pour obtenir des populations distinctes au moment de choisir les cellules à différentes intensités fluorescentes. Pour la procédure indiquée ici, utiliser le même cytométrie en flux expérimental mis en place que celle décrite dans l'étape 2.2.
- Amplifier clones individuels dans un incubateur à 37 ° C pendant au moins deux semaines. Par l'intermédiaire du processus d'amplification analyser les cellules au microscope pour se assurer que les populations croissantes proviennent de cellules individuelles et non pas à partir de plus d'un.
NOTE: Rappelez-vous que la trieuse placera une cellule par puits en moyenne, et même si certains puits peuvent ne pas avoir ne importe quelle cellule du tout, d'autres peuvent avoir plus d'un.- Pour se assurer qu'un population se pose d'une cellule seule, être extrêmement doux avec la plaque et ne jamais déranger les puits par pipetage. Observer la plaque, puits par puits, sous le microscope.
REMARQUE: Alors que les cellules individuelles peuvent parfois être difficiles à identifier, une fois qu'ils commencent à se diviser, ils seront facilement reconnaissables. - Soyez conscient que, souvent, les cellules 'bouquet' le long des bords. Jeter ces puits où plusieurs populations clonales peuvent être observés et de garder ceux qui ont une population serré.
NOTE: Il est conseillé de transférer ceux en plaques plus grandes pour l'amplification.
- Pour se assurer qu'un population se pose d'une cellule seule, être extrêmement doux avec la plaque et ne jamais déranger les puits par pipetage. Observer la plaque, puits par puits, sous le microscope.
- Tamiser les populations clonales putatifs en les analysant par cytométrie en flux. Comparez-les à un contrôle négatif en utilisant le même dispositif expérimental cytométrie de flux.
- Analyser seulement un pourcentage de l'échantillon et de garder le reste comme sauvegarde. Choisissez les populations les plus nettement distincts fondés sur l'intensité moyenne et l'étanchéité de la population. Amplifier au besoin ou congeler stocksdes milieux de congélation avec 20% de glycérol à -80 ° C pour de courtes périodes de temps ou de l'azote liquide pour plus longtemps.
NOTE: Ne oubliez pas qu'un «véritable» population clonale devrait avoir un profil de fluorescence très serré.
- Analyser seulement un pourcentage de l'échantillon et de garder le reste comme sauvegarde. Choisissez les populations les plus nettement distincts fondés sur l'intensité moyenne et l'étanchéité de la population. Amplifier au besoin ou congeler stocksdes milieux de congélation avec 20% de glycérol à -80 ° C pour de courtes périodes de temps ou de l'azote liquide pour plus longtemps.
4. Assurer capacités de multiplexage pour criblage à haut débit (HTS)
- Moissonneuse autant de populations clonales distinctes selon les besoins qui peuvent être en outre utilisée dans un format multiplexé. Choisir clones avec absorption / spectres d'émission distinguables et / ou des intensités différentes. Si un format de plaque à 96 puits est utilisée, qui est approprié pour HTS, ensemencer 50 000 cellules dans 200 pi par puits.
NOTE: Gardez à l'esprit que le nombre de cellules est seulement une estimation et peut changer en fonction du type de cellule et se il est adhérent ou non. - Analyser l'échantillon en utilisant la cytométrie de flux pour assurer que chacune des lignées cellulaires indépendantes établies fluorescentes peuvent être distingués les uns des autres. Avant de préparer l'analyse négativeet les contrôles de couleur unique pour définir les paramètres et les valeurs de rémunération.
NOTE: Réglage des paramètres de distinguer clairement les populations mixtes leur permettra d'être encore utilisé dans un format multiplexé.
5. Adapter lignées cellulaires génétiquement Barcoded à l'application biologique de choix
- Transduction établies génétiquement code-barres lignées cellulaires avec des particules virales qui contiennent les éléments d'analyse de choix, tel que décrit ici, à Stolp et al., 2013 59. Ne oubliez pas que le test de choix devrait occuper un canal supplémentaire fluorescente et distinguables et donc il doit être transféré à la ligne de code à barres cellulaire appropriée.
NOTE: Chaque lignée cellulaire code-barres peut supporter un dosage différent. - Cellules à code-barres Trier génétiquement fluorescentes pour ceux qui contiennent des éléments dosage.
NOTE: les éléments de dosage peuvent être conçus couplé à un marqueur fluorescent ou d'une protéine (comme une fusion ou à travers un site d'entrée interne du ribosome) fou la détection directe par Western blot, cytométrie en flux ou microscopie. Le système utilisé dans ce protocole repose sur l'expression en surface HA epitope seul, ou avec plus d'expression de l'épitope FLAG.- Colorer les populations clonales contenant le dosage avec des anticorps couplés HA et APC-fluorescence. Puis analyser les populations clonales avec anti-FLAG et la coloration d'anticorps conjugué à FITC.
- Pour retracer l'essai, analyser ou «décoder» les populations dans le canal approprié où les lignées cellulaires génétiquement distinctes code-barres peuvent être distingués. Ici, décoder la nature du substrat en analysant dans le canal pour la détection du PE td tomate.
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Representative Results
Multiplexage fluorescente cellules génétiquement barres pour le but d'applications biologiques ne peut être atteint une fois populations clonales individuelles ont été générés. Le multiplexage est plus efficace lorsque les populations code-barres ont des caractéristiques fluorescentes claires et distinctes avec chevauchement spectral minimal. L'exemple de la figure 1 avec les populations clonales de cellules de mammifères SupT1 illustre que les cellules à code-barres avec mCherry et cyano protéine fluorescente (PCP) peuvent être facilement analysés simultanément sans perdre leurs caractéristiques fluorescentes individuelles. Cette matrice illustre ainsi un panneau de cellules génétiquement code-barres fluorescentes qui est utilisable pour des applications biologiques multiplexage avec une lecture à encore un canal disponible supplémentaire. Afin d'obtenir un tel panneau, il est important de se rappeler la nature de la technologie rétroviral, ce qui conduira à des plages variables d'intensités fluorescentes sein de la population en raison de ef insertiondéfauts et / ou MOI. La figure 2 illustre le fait que la transduction de cellules mammaliennes initiale avec des particules virales contenant soit td tomate ou E2 Crimson résultats dans des cellules qui expriment un ou l'autre ou les deux des protéines fluorescentes à une large gamme d'intensités (panneau de gauche). Sélection et tri des cellules individuelles dans des plaques à 96 puits comme indiqué par les boîtes gated (mi panneau), permet d'obtenir une populations clonales serrés suivantes expansion (panneau de droite). Une population serré doit être définie comme ayant un petit CV qui peut varier en fonction du type cellulaire, normalement de 30 à 40% de l'intensité moyenne de fluorescence. La figure 2 montre également que pour augmenter encore le nombre de populations génétiquement code à barres avec une matrice de seulement deux fluorescent protéines, on peut aussi exploiter l'intensité de fluorescence. Généralement, une déviation de journal de l'intensité de fluorescence moyenne entre les populations est adapté pour obtenir une séparation appropriée de l'autre suivant le tri et 'amplificationtion. Td tomate a été choisi dans l'exemple représenté pour illustrer cette fonctionnalité, où deux populations de différentes intensités, moyennes et hautes, ont été obtenus pour le multiplexage avec E2 Crimson à une seule intensité.
Le multiplexage est un outil puissant pour faciliter l'analyse de nombreux échantillons en même temps et de la capacité de décoder populations masqués. Renforcement de multiplexage peut être réalisé avec une troisième protéine fluorescente comme eGFP, aussi longtemps que les propriétés spectrales ne interfèrent pas les uns avec les autres. Dans la procédure expérimentale montre la figure 3 le panneau de six populations obtenus avec td tomate et E2 Crimson a été exploitée pour augmenter multiplexage avec eGFP. Technologie retroviral a été utilisé pour transférer eGFP aux populations représentées dans l'une des matrices. Quand on l'observe dans le canal eGFP, les naïfs grille à six de la population non-vert (panneau supérieur gauche de la figure 3) se confond avec l'eGFP-transduitesmatrice de la population (panneau inférieur gauche de la figure 3). Surtout, les panneaux peuvent être analysés dans les canaux occupés par le code-barres génétique d'origine (TD tomate et E2 Crimson). Bien distinguer dans ces canaux (1-6 comparer les populations avec des populations 7-12 dans les panneaux milieu, figure 3), les populations individuelles peuvent être analysés dans le canal eGFP, et décodés ou à chenilles arrière, comme illustré dans les histogrammes (panneaux de droite dans Figure 3). Après avoir répété le processus de transduction, sélection, tri, et l'amplification, profitant des canaux inoccupés est inutile si la compensation droit ne est pas appliqué pour ajuster possible chevauchement spectral. Pour le prouver, lorsque les populations 1, 2, 3 (non-vert) et 7, 8, 9 (vert) sont analysés dans le eGFP et TD canaux tomates, les populations 7 et 8 sont difficiles à distinguer (panneau de gauche de la figure 4) . Il est donc nécessaire de choisir des cellules naïves (population 1) comme un con négativecontrôle de sorte que les paramètres de l'instrumentation peuvent être réglés. Lors de l'analyse toute matrice, en particulier avec des fluorophores qui se chevauchent spectrale, il est impératif que les contrôles de couleurs simples sont utilisés pour déterminer les valeurs de compensation correctes. Dans l'analyse de la figure 4 populations 2 ou 3, et 7 servent à cette fin, ce qui permet de mieux définir les populations qui sont vraiment positifs (deux populations 8 et 9).
Cellules génétiquement code-barres avec des marqueurs fluorescents conservent leur propre identité tel que défini par leur biosignature, lorsqu'il est analysé dans le canal fluorescente droite avec le bon instrument. Toutefois, le biosignature devient juste une propriété individuelle supplémentaire, sauf si exploitées pour des applications biologiques. Afin de prouver la puissance de codes-barres génétique fluorescent pour multiplexage nous avons décidé d'introduire un de nos analyses développées précédemment pour la découverte de médicaments dans certaines des lignes fluorescentes de cellules de mammifères à code-barres. Ce faisant, Déessent codes-barres génétique a été exploitée pour réaliser trois essais dans un échantillon. Dans cette procédure une protéine d'échafaudage contenant l'un des trois substrat virale putative pour la protéolyse a été transféré dans les cellules génétiquement code-barres. Dans le dosage, le clivage est révélée par la perte de l'épitope FLAG sur la surface cellulaire (figure 5B). En revanche, la coloration de surface de drapeau représente l'absence de clivage figure 5 illustre le résultat de l'analyse de trois substrats différents. VIH-1 enveloppe de type sauvage (Env en poids), le VIH-1 mutant enveloppe (Env mut) et virus de la dengue (DENV) prM. Chacun d'entre eux a été introduit dans une des trois lignes à code-barres de cellules, naïf, et deux autres en utilisant td tomate à différentes intensités (moyenne et haute; Figure 5A). La coloration pour l'expression de surface de FLAG qui révèle des substrats a été clivé sur la base du code à barres respectif. Dans l'exemple que mut Env du VIH conserve l'étiquette FLAG (de coloration suivante positif), comme on le voit dans le vert-FITC canal (figure 5C, le panneau en bas à droite). L'analyse de l'essai peut donc être effectuée indépendamment du codage à barres d'origine, et de continuer d'être exploité à décoder et à retracer les populations distinctes. Cette méthode de multiplexage se appuie donc sur un canal supplémentaire réservée pour la lecture biologique d'intérêt.
Figure 1:. Barcoding pour le multiplexage populations individuelles génétiquement code-barres en utilisant des protéines fluorescentes distinctes telles que mCherry, PCP ou les deux (à gauche) peut être mélangé, analysé et décodé (panneau de droite) dans leurs canaux respectifs par cytométrie de flux. Adapté de Smurthwaite, C. et al., 2014 58. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Tri et l'amplification des cellules à code-barres cellules de mammifères ont été analysées 48 heures suivant la transduction avec des particules virales contenant soit td tomate ou E2-Crimson (panneau de gauche). Portes sont ensuite fixés pour le tri pour inclure des cellules exprimant td tomate à différentes intensités, avec / sans-E2 Crimson (panneau du milieu). Les clones des sortes ont été amplifiés et ré-analysés pour générer une matrice de six populations distinctes (panneau de droite). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Décodage révèle populations masqués La matricede six populations obtenues sur la figure 2 (td tomate et / ou E2 Crimson) peut être en outre modifié pour exprimer une protéine fluorescente supplémentaire comme eGFP. (A) La matrice d'origine, lorsqu'il est analysé dans le canal eGFP (panneau de gauche) est négatif et les six populations sont impossibles à distinguer les uns des autres. Chacun des six populations peuvent être analysés de façon indépendante dans le canal eGFP comme le montrent les histogrammes (panneaux de droite). (B) La même matrice, exprimant désormais eGFP, a été analysé comme dans A, révélant désormais leur caractéristique fluorescente verte. Adapté de Smurthwaite, C. et al., 2014 58. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Compensation assure une séparation correcte Certaines des populations à l'origine choisie en fonction de td tomate et / ou eGFP expression (populations 7 et 8) ne peut pas être correctement séparés lorsqu'ils sont analysés ensemble (panneau de gauche), sauf si une compensation appropriée pour ces canaux est ajusté (à droite. panneau). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: (A) Sélection Sélection de cellules barres pour une adaptation supplémentaire de dosage choisi et à l'adaptation de dosage de choix.. Populations génétiquement code-barres avec td tomate à différentes intensités (panneau en haut à gauche) ont été utilisés pour des applications biologiques. Chacune des populations a été encore modifié pour contenir un dosage qui surveille clivage, Mais chacun d'un substrat différent (panneau en haut à droite). (B) Représentation de l'essai. FLAG tache positif indique l'absence de clivage tout FLAG négative tache indique clivage. (C) Analyse de l'essai suivant FLAG coloration. Populations mixtes se distinguent sur la base du code à barres td tomate indiscernables dans le canal FITC (panneaux de gauche). Lorsque colorées avec un anticorps FLAG-FITC, une seule population est positif pour FLAG. Décodage révèle, sur la base de codes-barres génétique, que cette population porte le substrat mut Env du VIH (panneau de droite). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Voici deux procédures bien établies ont été combinées; génie génétique grâce à la technologie rétroviral et la détection des protéines fluorescentes utilisant la cytométrie de flux. Fluorescent codes-barres génétique à base de protéines pour la production de lignées de cellules uniques fournit un moyen simple et robuste pour les applications multiplexées. Générer des cellules génétiquement modifiées à code-barres grâce à la technologie rétroviral, est d'abord un processus de longue haleine, mais permet d'obtenir, une fois établie, une source fiable et stable de matériau cellulaire. La nature de cette technologie produit régulièrement des lignées cellulaires génétiquement modifiées avec des caractéristiques fluorescentes stables qui deviennent leur propre vrai biosignature distinguer.
Les deux types de cellules adhérentes et non adhérentes peuvent être un code à barres en utilisant des protéines fluorescentes qui sont faciles à distinguer sur la base de leurs spectres d'absorption / émission physique. Ceux-ci comprennent, mais ne sont pas limités à des protéines telles que la PCP, mCherry, E2 Crimson et td tomate. Une fois génétiquement un code à barres avec leur protéine fluorescente distinguables, ils peuvent être combinés pour produire un panneau de populations de cellules. Surtout, le panneau contient des populations de cellules avec l'exacte génotypique maquillage mais différenciées seulement par leur trait de fluorescence. En tant que tel, ces panneaux sont parfaitement adaptés aux applications multiplexées, augmentant considérablement les capacités à haut débit.
En raison des différentes préférences d'insertion de la particule rétrovirale dans le génome de l'hôte, couplé à des différences de MOI, variables intensités de fluorescence provenant du gène de la protéine fluorescente réalisée particulier sont attendus. Analyse d'une population génétiquement modifié portant un gène fluorescent unique va donc détecter une gamme de profils d'expression qui peuvent être définis en fonction de l'intensité de fluorescence. Ce profil d'expression différentielle peut être exploitée pour créer des populations qui sont spectralement distinctes l'une de l'autre. On peut donc combiNE choix de marqueurs fluorescents avec une intensité de fluorescence pour se adapter à la conception expérimentale. Ici, matrices de 4, 6 et 12 populations, qui comprennent deux six panneaux de la population de E2 Crimson et td tomate, avec ou sans eGFP, sont présentés. En théorie, cela peut être étendu à des intensités différentes de la EGFP ainsi de créer trois populations de différentes protéines fluorescentes; chacune avec des intensités différentes sont associés. Comme indiqué précédemment, il sera tenu compte au moment de choisir les protéines fluorescentes afin d'assurer que la séparation peut en effet être atteint. Protéines choisies devraient avoir absorbance distincte et spectres d'émission; Toutefois, lorsque deux protéines fluorescentes spectralement distinctes mais similaires sont utilisés, la compensation doit être appliqué. Surtout, une compensation adéquate, ce qui permet la séparation physique des spectres d'émission / absorption entre les différents fluorophores ou des protéines fluorescentes, est accompli avec l'utilisation des contrôles de couleurs simples appropriées pourla détection par cytométrie de flux.
Multiplexage avec moins de protéines fluorescentes mais exploiter une variété d'intensités libère canaux supplémentaires qui peuvent être ensuite encore exploitées pour l'application biologique d'intérêt. Ceci peut augmenter la flexibilité du dispositif expérimental et de simplifier le choix de la combinaison de marqueurs fluorescents à utiliser. Par exemple, le dosage multiplex représenté sur la figure 5 repose sur la coloration des anticorps, en l'espèce couplé au FITC. Comme seul le canal PE est occupé par des codes-barres génétique, on peut utiliser des anticorps conjugués au FITC, ou inversement, APC-couplé, une décision qui peut être faite sur la base des instruments appropriés et / ou la disponibilité d'anticorps.
Bien que les réalisations technologiques dans le domaine de la cytométrie de flux, la microscopie ou méthodes combinées sont impressionnants, le goulot d'étranglement semble être la technologie cellulaire disponible pour les applications biologiques et HTS. Technologie rétroviralnologie couplé avec le nombre croissant de protéines fluorescentes peut être fusionné pour répondre à cette requête. Codes-barres génétique Fluorescent facilite considérablement multiplexage, qui à son tour, répond à la nécessité croissante pour l'expansion HTS capacités de tests cellulaires. Codes-barres génétique conduit à une robuste, rentable et moyen simple de tests cellulaires couple avec des méthodologies à haut débit pour des applications biologiques et le dépistage des drogues. Le pouvoir d'effectuer une plutôt que trois écrans à l'aide d'un panneau 3 de la population a coûté bénéfique et les implications liées au temps. Avec la polyvalence croissante dans la cytométrie en flux, imagerie à haute teneur et la microscopie cytométrie de flux couplé, codes-barres génétique fluorescente sera toujours un outil fiable pour le développement de tests.
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Disclosures
Les auteurs ne ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Garry Nolan de l'Université Stanford pour fournir la lignée cellulaire d'emballage Phoenix GP pour la production de particules rétrovirales. Nous remercions le Dr Roger Tsien à l'Université de Californie à San Diego pour fournir td tomate. Nous tenons également à remercier le Fonds de San Diego State University cytométrie de flux de base pour leur service et de l'aide.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | used for filtering the virus |
| 0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter | Pall Corporation | 4219 | used for filtering the virus |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 45000-304 | cell growth media for HEK 293T cells |
| PEI (Polyethylenimine) | poly sciences | 23966-2 | 2 mg/ml concentration used |
| Hanging bucket centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5805 000.017 | used for spin infection |
| PBS (phosphate buffered saline) | Corning | 21-040-CV | used for washing of cells |
| Polybrene (hexadimethreen bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration. |
| FACSAria | BD Biosciences | instrument used for sorting cell populations | |
| FACSCanto | BD Biosciences | instrument used for cell analysis | |
| Phoenix-GP | Gift from Gary Nolan | cell line used to produced retroviral particles | |
| Fetal calf serum | Mediatech | MT35015CV | used for cell growth and sorting |
| SupT1 cells | ATCC | CRL-1942 | Human T lymphoblasts |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | cell growth media for SupT1 cells |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527 (1997).
- Godwin, A. R., Stadler, H. S., Nakamura, K., Capecchi, M. R. Detection of targeted GFP-Hox gene fusions during mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13042-13047 (1998).
- Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
- Natarajan, L., Jackson, B. M., Szyleyko, E., Eisenmann, D. M. Identification of evolutionarily conserved promoter elements and amino acids required for function of the C. elegans beta-catenin homolog BAR-1. Dev Biol. 272 (2), 536-557 (2004).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin.Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Valencia-Burton, M., et al. Spatiotemporal patterns and transcription kinetics of induced RNA in single bacterial cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16399-16404 (2009).
- Mahmoud, L., et al. Green fluorescent protein reporter system with transcriptional sequence heterogeneity for monitoring the interferon response.J Virol. 85 (18), 9268-9275 (2011).
- Saunders, M. J., et al. Fluorogen activating proteins in flow cytometry for the study of surface molecules and receptors.Methods. 57 (3), 308-317 (2012).
- Wang, Y. L., Taylor, D. L. Probing the dynamic equilibrium of actin polymerization by fluorescence energy transfer. Cell. 27 (3 Pt 2), 429-436 (1981).
- He, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence (Forster) resonance energy transfer from cyan fluorescent protein to yellow fluorescent protein using single-laser excitation at 458 nm. Cytometry A. 53 (1), 39-54 (2003).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Clayton, A. H., et al. Ligand-induced dimer-tetramer transition during the activation of the cell surface epidermal growth factor receptor-A multidimensional microscopy analysis. J Biol Chem. 280 (34), 30392-30399 (2005).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
- Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Ai, H. W., Shaner, N. C., Cheng, Z., Tsien, R. Y., Campbell, R. E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry. 46 (20), 5904-5910 (2007).
- Mishin, A. S., et al. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry. 47 (16), 4666-4673 (2008).
- Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 48 (31), 5612-5626 (2009).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Klages, N., Zufferey, R., Trono, D. A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther. 2 (2), 170-176 (2000).
- Lai, Z., Brady, R. O. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinanat lentivirus vector. J Neurosci Res. 67 (3), 363-371 (2002).
- Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol Biol. 246, 391-411 (2004).
- Grignani, F., et al. High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein. Cancer Res. 58 (1), 14-19 (1998).
- Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Mol Ther. 2 (5), 458-469 (2000).
- Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6 (3), 127-134 (2000).
- Zhang, X. Y., et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol Ther. 5 (5 Pt 1), 555-565 (2002).
- Rossi, G. R., Mautino, M. R., Morgan, R. A. High-efficiency lentiviral vector-mediated gene transfer into murine macrophages and activated splenic B lymphocytes. Hum Gene Ther. 14 (4), 385-391 (2003).
- Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
- Chan, A. W., Chong, K. Y., Martinovich, C., Simerly, C., Schatten, G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science. 291 (5502), 309-3012 (2001).
- Linney, E., Hardison, N. L., Lonze, B. E., Lyons, S., DiNapoli, L. Transgene expression in zebrafish: A comparison of retroviral-vector and DNA-injection approaches. Dev Biol. 213 (1), 207-2016 (1999).
- Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
- Tiemann, U., et al. Optimal reprogramming factor stoichiometry increases colony numbers and affects molecular characteristics of murine induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 79 (6), 426-435 (2011).
- Leung, A. K., Lamond, A. I. In vivo analysis of NHPX reveals a novel nucleolar localization pathway involving a transient accumulation in splicing speckles. J Cell Biol. 157 (4), 615-629 (2002).
- Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
- Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C.J Cell Biol. 161 (5), 899-909 (2003).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
- Edwards, B. S., Ivnitski-Steele, I., Young, S. M., Salas, V. M., Sklar, L. A. High-throughput cytotoxicity screening by propidium iodide staining. Curr Protoc Cytomt. 9 (Unit 9 24), (2007).
- Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 8 (Unit 8 17), (2007).
- Lu, R., Neff, N. F., Quake, S. R., Weissman, I. L. Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding. Nat Biotechnol. 29 (10), 928-933 (2011).
- Grant, G. D., et al. Live-cell monitoring of periodic gene expression in synchronous human cells identifies Forkhead genes involved in cell cycle control. Mol Biol Cell. 23 (16), 3079-3093 (2012).
- Fiering, S. N., et al. Improved FACS-Gal: flow cytometric analysis and sorting of viable eukaryotic cells expressing reporter gene constructs. Cytometry. 12 (4), 291-301 (1991).
- Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (1991).
- Edwards, B. S., Oprea, T., Prossnitz, E. R., Sklar, L. A. Flow cytometry for high-throughput, high-content screening. Curr Opin Chem Biol. 8 (4), 392-398 (2004).
- Durick, K., Negulescu, P. Cellular biosensors for drug discovery. Biosens Bioelectron. 16 (7-8), 587-592 (2001).
- Edwards, B. S., et al. High-throughput flow cytometry for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 2 (5), 685-696 (2007).
- Sklar, L. A., Carter, M. B., Edwards, B. S. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 7 (5), 527-534 (2007).
- Curpan, R. F., et al. High-throughput screen for the chemical inhibitors of antiapoptotic bcl-2 family proteins by multiplex flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 465-474 (2011).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Trejo, A., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding for multiplex flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 6 (Unit 6 31), (2011).
- Surviladze, Z., Young, S. M., Sklar, L. A. High-throughput flow cytometry bead-based multiplex assay for identification of Rho GTPase inhibitors. Methods Mol Biol. 827, 253-270 (2012).
- Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PLoS One. 8 (1), e53015 (2013).
- Vignali, D. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods. 342 (1-2), 243-255 (2000).
- Hilton, B. J., Wolkowicz, R. An assay to monitor HIV-1 protease activity for the identification of novel inhibitors in T-cells. PLoS One. 5 (6), e10940 (2010).
- Rajakuberan, C., Hilton, B. J., Wolkowicz, R. Protocol for a mammalian cell-based assay for monitoring the HIV-1 protease activity. Methods Mol Biol. 903, 393-405 (2012).
- Smurthwaite, C. A., et al. Fluorescent genetic barcoding in mammalian cells for enhanced multiplexing capabilities in flow cytometry. Cytometry A. 85 (1), 105-113 (2014).
- Stolp, Z. D., et al. A Novel Two-Tag System for Monitoring Transport and Cleavage through the Classical Secretory Pathway - Adaptation to HIV Envelope Processing. PLoS One. 8 (6), e68835 (2013).
- Schwartz, A., et al. Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry. 33 (2), 106-114 (1998).
