Introduction
Technologien wie Fluoreszenz-Spektroskopie, Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie, alle auf Fluoreszenz, eine Eigenschaft, die weithin in biochemischen, biomedizinischen und chemischen Anwendungen genutzt. Fluoreszenz, ob intrinsische oder durch eine entsprechende Kennzeichnung, wurde für die Analyse von Protein-Expressionsmuster und Profile des Zellschicksals, Protein-Interaktionen und biologischen Funktionen 1-9 ausgeschöpft und durch Fluoreszenz / Förster-Resonanzenergietransfer zur Detektion von Biomolekül-Wechselwirkungen und Konformationsänderungen 10-13. Seit der Isolierung des Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) 14, die Entdeckung weiterer natürlich vorkommende fluoreszierende Proteine aus anderen Cnidaria, insbesondere Korallen, weitgehend die Anzahl der vorhandenen fluoreszierenden Proteinen mit unterscheidbaren Anregungs / Emissionsspektren erhöht. Dies, zusammen mit der Einführung von Mutationen in den Genen 15-19 HAVe die Möglichkeiten weiter ausgebaut, wodurch eine wahre Palette von fluoreszierenden Proteinen den Wissenschaftlern, die Mikroskopie nutzen, Durchflusszytometrie und andere Fluoreszenz-basierten Technologien für ihre Forschung.
Parallel zwar unabhängig, die Entwicklung von Retrovirus-Technologie drastisch die stabile Expression des ektopischen genetische Information in Säugerzellen 20-23 erleichtert. Es ist daher nicht überraschend, dass diese Technik verwendet worden, um Gene von fluoreszierenden Proteinen in einer breiten Anzahl von Zelltypen und Geweben 24-28 oder zur Herstellung von transgenen Tieren 29-31 übertragen. Nach der Art der Retroviren wird die genetische Information der ektopischen fluoreszierenden Proteins in das Genom der Zelle 32 eingeführt, und die Zelle wird fluoreszierenden `für ever'. Diese Eigenschaft wurde Tracking der Zellschicksal erlaubt, oder einer einzelnen Zelle innerhalb einer Population von Zellen. Die jetzt fluoreszierende Zelle so acqui hatrot sein eigenes Biosignatur und definiert als Barcode versehen werden. Seine einzigartige Biosignatur identifiziert sie von anderen Zellen, und wichtiger ist, unterscheidet sie von Zellen, die genetisch manipuliert, um verschiedene fluoreszierende Proteine mit unterscheidbaren Absorptions- / Emissionsspektren zum Ausdruck bringen. Biologische Anwendungen wie die Verfolgung von Pluripotenz Reprogrammierungsfaktoren Richtung 33, die Analyse subnuclear Faktoren für die Aufklärung der nukleoläres Lokalisierungs 34, der Aufbau der fluoreszierenden Reporter-Plasmide für die Transkriptionsstudien 35 oder dem genetischen Markierung von Neuronen für die Untersuchung der neuronalen Netzwerkarchitektur 36 sind nur vier Beispiele der vielen, unterschiedlichen Fluoreszenzprotein-Gene für die gleiche Versuchsanordnung ausgenutzt haben.
Durchflusszytometrie wurde allgemein zur Analyse der biologischen Prozesse in der Ebene einer einzelnen Zelle, wie beispielsweise die Genexpression, Zellzyklus, Apoptose verwendet und Signalisierung durch Phosphorylation 37-43 .Die stabile Expression von fluoreszierenden Protein Gene in Säugerzellen wurde weiter verbessert den Nutzen der Durchflusszytometrie zur Zellanalyse 38,44 und Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen 45. Erweiterte Möglichkeiten haben Fluss erlaubt Zytometrie auf eine weit verwendete Methode für die Hochdurchsatz-und High-Content-Screening-46 geworden. Trotz der nun erweiterten Anzahl von Fluorometer und Robotik-Technologien, die paar Plattenleser Systeme, Bildgebung und fließen Cytometry, scheint es einen Mangel in der experimentellen Design, das zu nutzen und passen diese erweiterten technologischen Möglichkeiten können.
Schnell, zuverlässig, einfach und robust zellbasierten Methoden drastisch für Multiplex-Anwendungen, die weiter zu verbessern Hochdurchsatz-Kapazität benötigt. Dies gilt insbesondere auf dem Gebiet der Wirkstoffentdeckung, wo technische Tests auf Zellbasis in einem gemultiplexten Format kann die Kraft des Hochdurchsatz-Screening-39,47-50 erweitern 51-54. Fluorescent genetischen Barcodes ermöglicht nicht nur elegant Multiplexing, sondern auch, einmal entwickelt, umgeht die Notwendigkeit der zeitaufwendig Protokollen, senkt die Kosten einher mit Antikörpern, Perlen und Flecken 39,52,55 und können die Anzahl der Bildschirme für Hoch zu reduzieren Durchsatz-Anwendungen. Vor kurzem haben wir beschrieben, wie retrovirale Technologie Multiplexing durch fluoreszierende genetischen Barcodes für biologische Anwendungen, durch eine zuvor entwickelte, um HIV-1-Protease-Aktivität 56,57 mit verschiedenen klinisch gängigen Varianten 58 überwachen Test zum Ausdruck zu verbessern. Die Methodik wird in einem aussagekräftigeren Weise erklärt sich auf die Auswahl und verstärken genetisch fluoreszierende Barcode-Zellen und, wie man Platten von klonalen Populationen Ausdruck unterschiedlichen fluoreszierenden Proteinen und / oder unterschiedliche Fluoreszenz intensit produzierener Jahren. Panels von Zellpopulationen zu unterscheiden, basierend auf ihren Fluoreszenzeigenschaften zu verbessern multiplexierten Funktionen, die weiter in Kombination mit zellbasierten Assays, die verschiedene biologische Fragen anzugehen nutzt werden können. Das Protokoll beschreibt auch, wie man eine Gruppe von Barcode-Zellen, die einen der zuvor im Labor entwickelt die zellbasierte Assays zu konstruieren, wie beispielsweise 59. Dieses Protokoll wird damit nicht beabsichtigt, den etablierten retroviralen / lentiviralen Technik des Gentransfers, den Wert von fluoreszierenden Proteinen oder die Anwendungen der Durchflusszytometrie 60,48 zeigen, sondern die Verbesserung der Leistung der Kombination der drei für die Multiplex-Anwendungen zeigen.
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Protocol
1. Herstellung von Säugerzellen, virale Produktion und Transduction für Genetische Barcoding
- Tafel 2.5 x 10 6 adhärenten Zellen in einer 10 cm-Platte (oder ungefähr 50-60% Konfluenz) einen Tag vor der Transfektion in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS). Für den produktiven Einsatz retroviralen Verpackungszelllinie der Wahl wie Phoenix-GP (eine Art Geschenk von Gary Nolan, der Stanford University).
HINWEIS: Die Verpackungszelllinie stabil exprimiert Gag- und Pol-Proteine, die für retrovirale Teilchenbildung in trans. Vergewissern Sie Zellen gesund sind und an der Platte in einer Monoschicht anhaftet, vor der Transfektion. - 24 Stunden später, bereiten Sie die DNA-Transfektion Mischung.
- Bis 125 & mgr; l serumfreiem DMEM hinzuzufügen 3 ug Vesicular Stomatitis Virus-Hüllglykoprotein Vektor (pCI-VSVg) und 3 ug des Transfervektor, der die Fluoreszenz-Protein-Gen von Interesse. Mischen Sie und fügen Sie 15 ul Polyethylimin (2 mg / ml).
- Inkubieren Mischung bei Raumtemperatur für 15 Minuten und in den Zellen tropfenweise.
HINWEIS: Polyethylimin wird die homogene DNA-Gemisch als Transfektionsreagenz zur Bildung von Polyplexen zugegeben. Um virale Partikel zu erhalten, die unterschiedliche fluoreszierende Protein-Marker, führen Sie jede Transfektion unabhängig mit dem Marker der Wahl. Denken Sie daran, dass die retroviralen Transfervektors liegt bei etwa 7 kb Länge und kann nicht, wenn oberhalb von 10 kb verpackt werden.
- Inkubiere Platten bei 37 ° C. Um Virusproduktion statt Platten bei 30 ° C oder 32 ° C, statt zu erhöhen.
HINWEIS: 24 h nach der Transfektion Medien können mit 7 ml frisches Medium ersetzt, und obwohl dies die Zellgesundheit zu verbessern, kann die Viruslast in den Überstand zu verringern. - 48 Stunden nach der Transfektion sammeln die Überstand-haltigen Viruspartikeln und Filter mit 0,45 uM Polytetrafluorethylenfilter. Verwenden Sie frisch gesammelten Virusüberstand für die Weiterleitung. OthDERNFALLS halten Stand in Aliquots bei -80 ° C und vermeiden Frost-Tau. Beachten Sie, dass Virustiter wird wahrscheinlich bis zu 50% bei jedem Gefrier-Tau-Zyklus zu verringern.
- Plattenzelllinie der Wahl, 24 Stunden vor der Transduktion wenn adhärenten oder unmittelbar vor der Transduktion wenn nicht adhärenten. Seed 2,0 x 10 5 bis 3,0 x 10 5 anhaftenden Zellen (hier Huh 7.5.1 und HEK 293T) oder 5,0 x 10 5 bis 1 x 10 6 nicht-adhärenten Zellen (hier SupT1) pro Napf in einer 6-Well-Platte.
HINWEIS: Achten Sie darauf, für die Kalibrierung die Anzahl der Zellen vor der Weiterleitung an ausgesät werden, insbesondere also für adhärente Zellen, also Zellen erreichen eine Konfluenz von etwa 60% zum Zeitpunkt der Weiterleitung. - Plus 5 ug / ml Polybrene (hexadimethrene Bromid) an ausgesäten Zellen und fügen zuvor gesammelten viralen Überstand auf etwa 20-40% Befall (hier 2 ml) zu erhalten.
HINWEIS: Die MOI oder der Prozentsatz der Infektion ist meist willkürlich, da Sortierung ermöglicht, jede subpopulat verstärkenIonen von Zellen. Offensichtlich kann eine höhere Rate der Infektion erleichtert und beschleunigt den Prozess der Amplifikation. - Transduzieren Zellen durch Zentrifugieren in einer hängenden Schaufelrotor bei 1.500 × g für 120 min bei 32 ° C. Resuspendieren nicht adhärente Zellen mit frischem Medium vor der Inkubation. Für adhärente Zellen, ersetzen Sie sie durch frische Medien 24 Stunden nach der Transduktion.
HINWEIS: Es wird empfohlen, die Platten vor der Zentrifugation mit Parafilm versiegeln, damit kein Ende. Genetisch Barcode-Zellvielfalt zu erhöhen, transduzieren Zellen mit Viruspartikeln, die unterschiedliche Fluoreszenzproteine (aus Schritt 1.4 erhalten). Bei der Auswahl von Fluoreszenzmarkern, sicherzustellen, dass sie mit der Instrumentierung kompatibel sind und diese unterscheiden sich fluoreszierende Parameter.
2. Auswahl und Verstärkung von genetisch mit Strichcode Cells
- Analysieren transduzierten Säugerzellen mittels Durchflusszytometrie mindestens 72 Stunden nach der Transduktion die Zinses Transduktion quantifizieren. Verwenden Sie einen vergleichbaren nicht-transduzierten Zelllinie als negative Kontrolle.
HINWEIS: Sortierung wird verwendet, um einzelne Barcode-Zellpopulationen, einen hohen Prozentsatz der Anfangsübertragung zu reinigen, werden zwar nicht erforderlich, sollte den Prozess der Verstärkung. - Nutzen Sie die Zell-Sorter der Wahl, um die Zellen, die das Protein von Interesse zum Ausdruck zu erhalten.
- Zu diesem Zweck sorgen die Tore richtig in die richtigen Kanäle eingestellt.
- Verwenden Sie dazu die gleiche naive Zelllinie als negative Kontrolle und den Parameter / Kanal-Spannung, so dass die negativen Bevölkerung ist unter den Wert von 10 3 auf jeder Fluoreszenzachse. Bestimmen Sie Gating für positive Fluoreszenz als Ereignisse, die über der von der Negativkontrolle für jede Leuchtstoffkanal angezeigt.
- Seien Sie sich bewusst, dass jedes Instrument kann variieren und die richtige Spannung für die Bestimmung Gating entsprechend angepasst werden, so dass positive und negative Kontrollen unerlässlich in jeder experimental Setup.
- Für Fluoreszenzdetektion in diesem Versuchsaufbau mit dem FITC-Kanal (530/30 Bandpassfilter mit einer 502 Langpassfilter vorgegangen) für eGFP, den PE-Kanal (585/42 Bandpassfilter mit einer 556 Langpassfilter vorgegangen) für td Tomato und die APC-Kanal (660/20 Bandpassfilter) für E2 Hochrot.
HINWEIS: Die 488-nm-Laser regt eGFP und td Tomate, während E2 Hochrote wird von der 633 nm Laser angeregt.
- Für Fluoreszenzdetektion in diesem Versuchsaufbau mit dem FITC-Kanal (530/30 Bandpassfilter mit einer 502 Langpassfilter vorgegangen) für eGFP, den PE-Kanal (585/42 Bandpassfilter mit einer 556 Langpassfilter vorgegangen) für td Tomato und die APC-Kanal (660/20 Bandpassfilter) für E2 Hochrot.
- Zu diesem Zweck sorgen die Tore richtig in die richtigen Kanäle eingestellt.
- Sortieren in 15 ml konischen Röhrchen mit 1 ml 100% FCS.
HINWEIS: Der Prozess des Sortierens fluoreszierenden Zellpopulationen ist nicht zwingend als eine direkt mit der Art von individuellen Klonen (siehe unten) zu gelangen. Sortieren engen Populationen basierend auf ausgewählten Fluoreszenz sorgt für eine Backup-Bevölkerung für die zukünftige Auswahl von Einzelklonen. Beachten Sie, dass einzelne Zellen sind manchmal schwierig zu wachsen, während eine große Population von Zellen kann leicht eingefroren werden und dann aufgetaut und in einer späteren Phase verstärkt. - Spin unten sortierten Populationen in einem hängenden Becherrotor Zentrifuge bei 524 g bei 32 ° C für 5 min Zellen zu pelletieren. Re-suspendieren in 1 ml frischem Medium und Wiederplatte Zellen, so dass Zellkonfluenz unter 60% liegt, um das Wachstum und Teilung für mindestens zwei Tage beträgt.
- Beispielsweise Platte anhaftenden Zellen bei etwa 3 x 10 5 Zellen in 2 ml Medium pro Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen und 2 x 10 6 Zellen in 2 ml Medium in einer 6 cm Platte. Verwenden DMEM für adhärente Zellen und RPMI für nicht-adhärente Zellen (oder einem festgelegten Medium falls erforderlich). Platzieren plattierten Zellen in einem Brutschrank bei 37 ° C über mehrere Tage, um die Amplifikation zu ermöglichen.
3. Beschaffen Klonpopulationen gentechnisch mit Strichcode-Zellen bei unterschiedlichen Intensitäten
- Erhalten klonalen Populationen von Zellen, die ursprünglich transduziert (Schritt 1.7) oder aus der sortierten Population (Schritt 2.3).
Hinweis: das wird gleich oder ähnlich Niveau der Fluoreszenz-Protein-Expression unter all der Zelle zu gewährleistens innerhalb der Population (a dichten Population mit einem kleinen CV der mittleren Fluoreszenzintensität von bis zu 40%).- Zu diesem Zweck sortiert einzelnen Zellen in 96-Well-Platten mit einer automatischen Zellablagerungseinheit (ACDU). Stellen Tore für die Sortierung nach Populationen von Interesse. Stellen Sie sicher, Tore sind mindestens eine log-Skala abheben, um unterscheidbare Populationen bei der Auswahl von Zellen mit unterschiedlichen Fluoreszenzintensitäten zu erhalten. Bei dem hier dargestellten Vorgehensweise die gleiche Durchflusszytometrie experimentellen up wie die in Schritt 2.2 beschrieben, eingestellt.
- Amplifizieren einzelnen Klone in einem Brutschrank bei 37 ° C für mindestens 2 Wochen. Durch den Prozess der Amplifikation analysiert die Zellen unter dem Mikroskop, um zu gewährleisten, dass die wachsende Bevölkerung ergeben sich aus Einzelzellen und nicht aus mehr als einer.
HINWEIS: Denken Sie daran, dass der Sorter wird eine Zelle pro Vertiefung im Durchschnitt platzieren, und während einige Brunnen darf keine Zelle überhaupt, andere können mehr als eine haben.- Um dies zu gewährleisten, ein povölkerung ergibt sich aus einer Zelle nur, extrem sanft mit der Platte und nicht stören die Brunnen durch Pipettieren. Beachten Sie die Platte gut gut, unter dem Mikroskop.
HINWEIS: Während der einzelnen Zellen kann manchmal schwierig sein, zu erkennen, sobald sie anfangen Division sie leicht erkennbar sein. - Beachten Sie, dass oft Zellen Klumpen "an den Rändern. Entsorgen Sie diese Brunnen, in denen mehrere klonalen Populationen beobachtet werden kann und so alle, die einen engen Bevölkerung haben.
HINWEIS: Es ist ratsam, die zu größeren Platten zur Verstärkung übertragen.
- Um dies zu gewährleisten, ein povölkerung ergibt sich aus einer Zelle nur, extrem sanft mit der Platte und nicht stören die Brunnen durch Pipettieren. Beachten Sie die Platte gut gut, unter dem Mikroskop.
- Bildschirm des vermeintlichen klonalen Populationen von mittels Durchflusszytometrie analysiert sie. Vergleichen Sie sie mit einer negativen Kontrolle unter Verwendung der gleichen Durchflusszytometrie Versuchsaufbau.
- Analysieren Sie nur einen Prozentsatz der Probe und den Rest als Backup. Wählen Sie die am deutlichsten getrennte Populationen nach durchschnittlichen Intensität und Engegefühl in der Bevölkerung. Verstärken sie nach Bedarf oder Gefrier Aktien inGefriermedien mit 20% Glycerin bei -80 ° C für kurze Zeit oder flüssigem Stickstoff für längere.
HINWEIS: Denken Sie daran, dass eine "wahre" klonalen Population sollte einen sehr engen Fluoreszenzmuster haben.
- Analysieren Sie nur einen Prozentsatz der Probe und den Rest als Backup. Wählen Sie die am deutlichsten getrennte Populationen nach durchschnittlichen Intensität und Engegefühl in der Bevölkerung. Verstärken sie nach Bedarf oder Gefrier Aktien inGefriermedien mit 20% Glycerin bei -80 ° C für kurze Zeit oder flüssigem Stickstoff für längere.
4. Stellen Sie sicher Multiplexing-Funktionen für High Throughput Screening (HTS)
- Zu kombinieren, wie viele verschiedene klonale Populationen wie benötigt, das in einem gemultiplexten Format weiter genutzt werden kann. Wählen Klone mit unterscheidbaren Absorptions- / Emissionsspektren und / oder unterschiedlicher Intensitäten. Wenn eine 96-Well-Platten-Format verwendet wird, welches geeignet für HTS, Samen 50.000 Zellen in 200 ul pro Vertiefung.
HINWEIS: Beachten Sie, dass die Anzahl der Zellen ist nur eine Schätzung und kann auf Zelltyp noch ändern und ob es adhärenten ist oder nicht. - Analysieren der Probe unter Verwendung von Durchflußzytometrie, um sicherzustellen, daß jeder der unabhängigen fest fluoreszierenden Zelllinien können voneinander unterschieden werden. Vor der Analyse vorzubereiten negativenund einfarbige Controller zu Parametern und Korrekturwerte eingestellt.
HINWEIS: Parameter einstellen, um die Mischpopulationen deutlich unterscheiden werden, damit sie weiter in einem Multiplexformat genutzt werden.
5. Passen Genetisch Barcode-Zelllinien auf die biologische Anwendung der Wahl
- Transduzieren fest genetisch barcodiert Zellinien mit Viruspartikeln, die die Analysenelemente der Wahl enthalten, wie sie hier in Stolp et al. 2013 59 beschrieben. Denken Sie daran, dass der Test der Wahl sollte eine zusätzliche und unterscheidbare Fluoreszenzkanal zu besetzen und so ist es bis zur entsprechenden Barcode-Zelllinie übertragen werden sollen.
HINWEIS: Jeder Barcode-Zelllinie können einen anderen Test zu tragen. - Sortieren genetisch fluoreszierende Barcode-Zellen, die für die, die Testelemente enthalten.
HINWEIS: Assay Elemente können an eine Markierung oder fluoreszierende Protein gekoppelt (als Fusion oder durch eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle) konstruiert werden, foder einfache Erkennung durch Western-Blot, Durchflusszytometrie oder Mikroskopie. Der in diesem Protokoll verwendete System beruht auf HA-Epitop Oberflächenexpression alleine oder mit zusätzlichen FLAG-Epitop Ausdruck.- Färben die klonalen Populationen, die den Test mit HA und APC-Fluoreszenz-gekoppelten Antikörpern. Dann analysieren die klonalen Populationen mit anti-FLAG und FITC-konjugierten Antikörperfärbung.
- Auf die Spur wieder den Test, Analyse oder "decodieren" die Bevölkerung in den entsprechenden Kanal, wo die verschiedenen gentechnisch Barcode versehen Zelllinien unterschieden werden können. Hier dekodieren die Art des Substrats durch Analysieren von in dem PE-Kanal für td Tomato Detektion.
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Representative Results
Multiplexing Fluoreszenz genetisch barcodiert Zellen zum Zwecke der biologischen Anwendungen kann nur erreicht werden, wenn individuelle klonale Populationen wurden erzeugt. Multiplexing ist am effektivsten, wenn mit Barcode Populationen deutlich unterschiedlichen fluoreszierenden Eigenschaften mit minimalen spektralen Überlappung. Die in Figur 1 mit klonalen Populationen von Säugerzellen SupT1 gezeigte Beispiel zeigt, dass Zellen, die mit Strichcode versehene mCherry und Cyano fluoreszierendes Protein (GFP) kann einfach gleichzeitig, ohne ihre einzelnen fluoreszierenden Eigenschaften analysiert werden. Diese Matrix veranschaulicht somit eine Gruppe von fluoreszierenden Zellen, die genetisch mit Strichcode zum Multiplexen biologische Anwendungen mit einer Anzeige in noch einem weiteren verfügbaren Kanal verwendbar ist. Um eine solche Platte zu erhalten, ist es wichtig, die Natur der retroviralen Technologie, die variable Bereiche der Fluoreszenzintensitäten innerhalb der Population aufgrund Insertions ef führen erinnernkungen und / oder MOI. Figur 2 veranschaulicht, dass die ersten Transduktion von Säugerzellen mit viralen Partikeln, die entweder td Tomate oder E2 purpurnen Ergebnisse in Zellen, die entweder eine oder beide der fluoreszierenden Proteine exprimieren in einem weiten Bereich von Intensitäten (linkes Feld). Auswahl und Sortierung der einzelnen Zellen in 96-Well-Platten, wie durch die geschlossene Kästen (mittleres Feld) gezeigt ist, ermöglicht es, enge Klonpopulationen folgenden Expansion (rechte Spalte) erhalten wurden. Eine dichte Population als mit einem kleinen CV, die je nach Zelltyp Bereich definiert werden kann, in der Regel 30-40% der mittleren Fluoreszenzintensität dar. 2 zeigt auch, dass eine weitere Anzahl von genetisch barcodierte Populationen mit einer Matrix von nur zwei Fluoreszenz erhöhen Proteine kann man auch die Fluoreszenzintensität zu nutzen. Im Allgemeinen ist eine Protokoll Abweichung in der mittleren Fluoreszenzintensität zwischen Populationen geeignet zur Erzielung ausreichender Abstand voneinander folgenden Sortieren und amplification. Td Tomate wurde im gezeigten Beispiel gewählt, um diese Funktion, in der zwei Populationen von unterschiedlicher Intensität, mittleren und hohen, wurden zum Multiplexen mit E2 purpurnen an einem einzigen Intensität gewonnen zu veranschaulichen.
Multiplexing ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Analyse von vielen Proben gleichzeitig und auf die Fähigkeit, um maskierte Populationen dekodieren erleichtern. Verbesserung Multiplexen mit einer dritten Fluoreszenzprotein eGFP wie erreicht werden kann, solange die spektralen Eigenschaften nicht gegenseitig stören. In der in 3 dargestellten Versuchsdurchführung die Jury aus sechs Populationen mit td Tomaten und E2 purpurnen erhalten wurde ausgenutzt, um Multiplexen mit eGFP erhöhen. Retrovirale Technologie wurde verwendet, um eGFP den Populationen in einer der Matrizen dargestellt übertragen. Wenn in der eGFP-Kanal beobachtet wird, ist die nicht-grünen naiv sechs Bevölkerung Matrix (obere links in Abbildung 3) nicht von der eGFP-transduziertenBevölkerung Matrix (unten links in Abbildung 3). Wichtig ist, dass die Platten in den Kanälen durch die ursprüngliche genetische Barcode besetzt analysiert werden (td Tomaten und E2 Hochrot). Während in diesen Kanälen nicht zu unterscheiden (vgl Populationen 1-6 mit einer Bevölkerung von 7 bis 12 in Mittenfelder, Bild 3), die einzelnen Bevölkerungsgruppen in der eGFP-Kanal untersucht werden, und decodiert oder zurück verfolgt, wie in den Histogrammen gezeigt (rechte Bilder in Abbildung 3). Nach Wiederholung des Prozesses der Transduktion Auswahl, Sortierung und Amplifikation unter Ausnutzung der belegten Kanäle ist nutzlos, wenn richtige Kompensation wird nicht angewendet, um eine mögliche spektrale Überlappung einzustellen. Um dies zu, wenn Populationen 1, 2, 3 (nicht grün) und 7, 8, 9 (grün) sind in der eGFP analysiert und td Tomato Kanälen Bevölkerung 7 und 8 sind als schwierig erweisen, zu unterscheiden (links in der Abbildung 4) . Es ist daher notwendig, naive Zellen (Population 1) als negatives con wählentrol so daß die Parameter der Instrumentierung kann eingestellt werden. Bei der Analyse jedes Matrix, insbesondere Fluorophore spektral überlappen, ist es zwingend notwendig, dass einzelne Farbeinstellungen verwendet werden, um die richtigen Korrekturwerte zu bestimmen. Bei der Analyse von 4 Populationen 2 oder 3, und 7 dienen diesem Zweck, so dass Bevölkerungsgruppen besser zu definieren, die wirklich doppelt positiven (Populationen 8 und 9).
Genetisch Barcode versehen Zellen mit Fluoreszenzmarkern, ihre eigene Identität zu behalten, wie durch ihre Biosignatur definiert, wenn in der richtigen Leuchtstoffkanal mit dem rechten Instrumenten analysiert. Wird die Biosignatur jedoch nur ein zusätzliches individuelles Eigentum, es sei denn für biologische Anwendungen ausgenutzt. Um die Leistung von fluoreszierenden genetischen Barcodes zum Multiplexen beweisen haben wir beschlossen, eine unserer bisher entwickelten Assays für die Wirkstoffforschung in einige der fluoreszierenden Barcode-Säugerzelllinien einzuführen. Dadurch fluoreszierent genetische Barcoding wurde genutzt, um drei Assays in einer Probe zu erzielen. In diesem Verfahren wurde ein Gerüstprotein, die eine der drei putative virale Substrat für die Proteolyse in die genetisch barcodiert Zellen transferiert. Bei dem Test wird die Spaltung durch den Verlust des FLAG-Epitop an der Zelloberfläche (5B) offenbart. Demgegenüber FLAG Oberflächenfärbung stellt fehlende Spaltung 5 zeigt das Ergebnis der Analyse von drei verschiedenen Substraten. HIV-1-Wildtyp-Envelope (Env wt), HIV-1 Envelope-Mutante (Env mut) und Dengue-Virus (DENV) prM. (; 5A Mitten und Höhen) Jeder von ihnen wurde in 1 von 3 Barcode-Zelllinien, naiv, und 2 andere Verwendung td Tomato bei unterschiedlichen Intensitäten eingeführt. Färbung für FLAG Oberflächenexpression zeigt, welche der Substrate auf der Basis des jeweiligen Barcode gespalten wurde. Im Beispiel nur HIV Env mut behält die FLAG-Tag (positiv folgenden Färbung), wie im Grün FI gesehenTC-Kanal (5C rechten unteren Bereich). Die Analyse der Assay kann somit unabhängig von dem ursprünglichen Strichcodierung durchgeführt werden und weiter genutzt werden, um zu decodieren und zu verfolgen zurück die unterschiedliche Populationen werden. Diese Methode zum Multiplexen beruht somit auf einem zusätzlichen Kanal für die biologische Auslese von Interesse vorbehalten.
Abb. 1: Strichkodierung zum Multiplexen Einzelne Populationen mit unterschiedlichen fluoreszierenden Proteine wie mCherry, GFP oder beides (links) genetisch mit Barcode können gemischt werden, analysiert und über Strömungs decodiert (rechts) in ihren jeweiligen Kanälen Zytometrie. Von Smurthwaite, C. et al., 2014 58 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abb. 2: Sortieren und Verstärkung von Barcode-Zellen Säugetierzellen wurden 48 Stunden nach Transduktion mit Viruspartikeln, die entweder td Tomate oder E2-Hochrot (linkes Bild) analysiert. Tore werden dann für die Sortierung zu Zellen, die td Tomato bei unterschiedlichen Intensitäten sind gesetzt, mit / ohne E2-Hochrot (Mitte). Klone aus den Sorten wurden verstärkt und neu analysiert, um eine Matrix aus sechs unterscheidbare Populationen (rechts) zu generieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abb. 3: Die Dekodierung zeigt maskierten Populationen Die Matrixsechs Populationen in 2 (td Tomaten und / oder E2-purpurnen) erhalten wird, kann weiter manipuliert werden, um eine zusätzliche fluoreszierende Protein wie eGFP exprimieren. (A) die ursprüngliche Matrix, wenn sie in der eGFP Kanal (linkes Bild) analysiert negativ ist und die sechs Populationen sind voneinander nicht unterscheidbar. Jeder der sechs Populationen können unabhängig in der eGFP Kanal analysiert, wie in den Histogrammen (rechte Abbildungen) angezeigt. (B) Das gleiche Matrix, jetzt auch zum Ausdruck eGFP, wurde wie in A analysiert und enthüllt nun die grün fluoreszierendes Merkmal. Von Smurthwaite, C. et al., 2014 58 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 4: Kompensation sorgt für die korrekte Trennung Einige der Bevölkerung ursprünglich gewählten Basis td Tomaten und / oder eGFP-Expression (Populationen 7 und 8) kann nicht richtig getrennt, wenn sie zusammen analysiert werden (linkes Bild), es sei denn, eine angemessene Entschädigung für diese Kanäle eingestellt (rechts. Panel). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abb. 5: Auswahl der Barcode-Zellen für die weitere Anpassung an den gewählten Test (A) Auswahl und Anpassung an den Test der Wahl. Populationen genetisch mit td Tomato bei unterschiedlichen Intensitäten (oben links) Barcode versehen wurden für biologische Anwendungen eingesetzt. Jede der Populationen wurde weiter ausgeführt, um einen Test, der die Spaltung überwacht enthalten, Aber jeder von einem unterschiedlichen Substrat (oben rechts). (B) Darstellung des Assays. Positive FLAG Fleck zeigt fehlende Spaltung während negative FLAG Fleck zeigt Spaltung. (C) Analyse der Assay folgende FLAG Färbung. Mischpopulationen unterscheiden sich auf Basis des td Tomato Barcode, aber nicht zu unterscheiden in der FITC Kanal (linke Felder). Wenn mit FLAG-FITC-Antikörper gefärbt, nur eine Bevölkerung positiv für FLAG. Decoding zeigt, basierend auf genetischen Barcodes, dass diese Bevölkerung trägt das HIV Env mut Substrat (rechtes Bild). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Hier zwei etablierte Verfahren kombiniert wurden; Gentechnik durch retrovirale Technologie und Detektion von fluoreszierenden Proteinen unter Verwendung der Durchflusszytometrie. Fluorescent Protein basierenden genetischen Barcodes für die Herstellung von einzigartigen Zellinien stellt eine robuste und einfache Weise für Verbundanwendungen. Erzeugung gentechnisch barcodierte Zellen durch Retrovirus-Technologie ist zunächst ein langwieriger Prozess, sondern erlaubt es, zu erhalten, einmal etabliert, eine zuverlässige und stabile Quelle von Zellmaterial. Die Natur dieser Technologie konsequent produziert gentechnisch veränderte Zelllinien mit stabilen fluoreszierenden Eigenschaften, die ihre eigenen echten zu unterscheiden Biosignatur werden.
Sowohl adhärenten und nicht-adhärenten Zelltypen können mit Barcode Verwendung fluoreszierende Proteine, die auf der Grundlage ihrer physikalischen Absorption / Emissionsspektren leicht zu unterscheiden sind werden. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Proteine, wie GFP, mCherry eingeschränkt, E2 Hochrot und td Tomaten. Nachdem die genetisch mit unterscheidbaren Fluoreszenzprotein strichcodiert, können sie kombiniert werden, um ein Panel von Zellpopulationen zu erzeugen. Wichtig ist, enthält das Feld Zellpopulationen mit der genauen genotypische Make-up, sondern nur durch ihre Fluoreszenz Merkmal unterschieden. Als solche sind diese Platten perfekt für Multiplex-Anwendungen geeignet, stark verbessert Hochdurchsatz-Funktionen.
Aufgrund der unterschiedlichen Insertions Präferenzen des retroviralen Partikel in das Wirtsgenom, in Verbindung mit Unterschieden in MOI werden variable Fluoreszenz-Intensitäten der durch insbesondere fluoreszierendes Protein-Gen erwartet. Analyse eines gentechnisch Population trägt ein einzigartiges Fluoreszenz Gen so erkennen, eine Reihe von Expressionsprofilen, die auf der Grundlage der Fluoreszenzintensität bestimmt werden kann. Diese unterschiedliche Expressionsprofil kann ausgenutzt werden, um Populationen, die spektral voneinander getrennt sind, zu schaffen. Man kann somit Kombine Auswahl von Fluoreszenzmarkern mit Fluoreszenzintensität, um die Versuchsplanung passen. Hier Matrizen von 4, 6 und 12 Populationen, die zwei 6 Population Paneele E2 purpurnen und td Tomate, mit oder ohne eGFP umfassen gezeigt. Theoretisch kann dies weiter mit verschiedenen Intensitäten eGFP sowie Populationen von 3 verschiedenen fluoreszierenden Proteinen zu erzeugen, erweitert werden kann; ein jedes mit unterschiedlichen Intensitäten zugeordnet. Wie bereits erwähnt, sollte bei der Wahl der fluoreszierenden Proteinen, um diese Trennung zu gewährleisten kann zwar erreicht werden, genommen werden. Gewählt Proteine sollten unterschiedliche Absorptions- und Emissionsspektren haben; Wenn jedoch zwei spektral unterscheidbaren aber ähnliche fluoreszierende Proteine eingesetzt werden, Kompensation angewandt werden. Wichtig ist, dass eine angemessene Entschädigung, die für die räumliche Trennung von Emissions / Absorptionsspektren zwischen verschiedenen Fluorophore oder Fluoreszenzproteinen ermöglicht, wird durch den Einsatz von geeigneten einfarbig Steuerungen für vollErkennung über Durchflusszytometrie.
Multiplexen mit weniger fluoreszierende Proteine aber Ausnutzung einer Vielzahl von Intensitäten befreit zusätzliche Kanäle, die dann weiter für die biologische Anwendung von Interesse ausgenutzt werden kann. Dies kann die Flexibilität des Versuchsaufbaus erhöhen und vereinfachen die Auswahl der Kombination von fluoreszierenden Markierungen verwendet werden. Zum Beispiel kann die in Figur 5 gezeigten gemultiplexten Assay beruht auf Antikörperfärbung, in diesem Fall an FITC gekoppelt. Da nur die PE-Kanal wird durch genetische Strichcode- besetzt, kann man FITC-konjugierte Antikörper zu verwenden, oder umgekehrt, APC-gekoppelte, eine Entscheidung, die sich auf die entsprechende Mess-und / oder Antikörper Verfügbarkeit vorgenommen werden können.
Während die technologischen Errungenschaften auf dem Gebiet der Durchflusszytometrie, Mikroskopie oder kombinierte Methoden sind beeindruckend, scheint der Engpass auf die zur Verfügung stehende Zellentechnologie für biologische Anwendungen und HTS sein. Retrovirale techlogie in Verbindung mit dem Ausbau Anzahl der fluoreszierenden Proteine können zusammengeführt, um diese Abfrage zu beantworten. Fluoreszenz genetischen Strichcode- drastisch erleichtert Multiplexen, die wiederum, erfüllt den steigenden Bedarf erweitert HTS Fähigkeiten des Tests auf Zellbasis. Genetic Strichcode- führt zu einem robusten, kostengünstigen und einfachen Art und Weise zu koppeln, Assays auf Zellbasis mit hohem Durchsatz Methodologien für biologische Anwendungen und Wirkstoff-Screening. Die Macht der Durchführung einer statt drei Bildschirme mit einem 3 Bevölkerungsfeld hat positive Kosten- und zeitbezogene Auswirkungen. Mit der zunehmenden Vielseitigkeit in der Durchflusszytometrie, High-Content-Bildgebung und Durchflusszytometrie-gekoppelten Mikroskopie, wird fluoreszierende genetischen Barcodes eine konstant zuverlässiges Werkzeug für die Assay-Entwicklung sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir möchten Dr. Garry Nolan danken der Stanford University für die Bereitstellung der Phoenix GP Verpackungszelllinie für die Herstellung von retroviralen Partikeln. Wir danken Herrn Dr. Roger Tsien an der University of California in San Diego für die Bereitstellung von td Tomaten. Wir möchten auch die San Diego State University Durchflusszytometrie Core Facility für ihre Dienste und Hilfe danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | used for filtering the virus |
| 0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter | Pall Corporation | 4219 | used for filtering the virus |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 45000-304 | cell growth media for HEK 293T cells |
| PEI (Polyethylenimine) | poly sciences | 23966-2 | 2 mg/ml concentration used |
| Hanging bucket centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5805 000.017 | used for spin infection |
| PBS (phosphate buffered saline) | Corning | 21-040-CV | used for washing of cells |
| Polybrene (hexadimethreen bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration. |
| FACSAria | BD Biosciences | instrument used for sorting cell populations | |
| FACSCanto | BD Biosciences | instrument used for cell analysis | |
| Phoenix-GP | Gift from Gary Nolan | cell line used to produced retroviral particles | |
| Fetal calf serum | Mediatech | MT35015CV | used for cell growth and sorting |
| SupT1 cells | ATCC | CRL-1942 | Human T lymphoblasts |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | cell growth media for SupT1 cells |
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