Introduction
Teknologier som fluorescens spektroskopi, fluorescens mikroskopi og flowcytometri, alle er afhængige af fluorescens, en ejendom i vid udstrækning udnyttet i biokemiske, biomedicinske, og kemiske applikationer. Fluorescens, enten iboende eller gennem mærkning, er blevet udnyttet til analyse af protein udtryk mønstre og profiler, celle skæbne, protein interaktioner og biologiske funktioner 1-9, og gennem fluorescens / Förster resonansenergioverførsel til påvisning af biomolekylære interaktioner og konformationsændringer 10-13. Da isoleringen af Aequorea victoria-grønt fluorescerende protein (GFP) 14 opdagelsen af naturligt forekommende fluorescerende proteiner fra andre cnidarianer, især koraller, har i høj grad øget antallet af eksisterende fluorescerende proteiner med skelnes excitation / emission spektre. Disse, sammen med indførelsen af mutationer i deres gener 15-19, have yderligere udvidet mulighederne, opnåelse af et ægte palet af fluorescerende proteiner til rådighed for forskere, der udnytter mikroskopi, flowcytometri og andre fluorescens-baserede teknologier til deres forskning.
Sideløbende, selv uafhængigt af udviklingen af retrovirale teknologi har drastisk lettet stabil ekspression af ektopisk genetisk information i pattedyrceller 20-23. Det er således ikke overraskende, at denne teknologi er blevet anvendt til at overføre gener af fluorescerende proteiner i en bred række af celletyper og væv 24-28 eller til produktion af transgene dyr 29-31. Efter arten af retrovira, er den genetiske information af ektopisk fluorescerende protein indføres i genomet af cellen 32, og cellen bliver fluorescerende `for ever'. Denne egenskab har gjort sporing af celle skæbne, eller en enkelt celle inden for en population af celler. Den nu fluorescerende celle har således Acquirød sin egen Biosignatur og kan defineres som Barcoded. Dens unikke Biosignatur identificerer det fra andre celler, og vigtigere, adskiller den fra celler genetisk manipulerede til at udtrykke forskellige fluorescerende proteiner med skelnes absorption / emission spektre. Biologiske applikationer såsom sporing af omprogrammering faktorer mod pluripotens 33, analyse af inde i kernen faktorer til belysning af nucleolar lokalisering 34, opførelsen af fluorescerende reporterplasmider for transkriptionelle studier 35 eller den genetiske mærkning af neuroner til studiet af neuronal netværksarkitektur 36 er kun fire eksempler på de mange, der har udnyttet forskellige fluorescerende protein gener for den samme forsøgsopstilling.
Flowcytometri er bredt anvendt til analyse af biologiske processer på enkelt celle niveau, såsom genekspression, cellecyklus, apoptose og signalering via phosphorylation 37-43 .Den stabil ekspression af fluorescerende protein-gener i mammale celler er yderligere forbedret anvendeligheden af flowcytometri for celleanalyse 38,44 og ligand-receptor-interaktioner 45. Øget kapacitet har tilladt flowcytometri bliver en almindeligt anvendt metode til high-throughput og med højt indhold screening 46. På trods af den nu udvidet antal fluorometre og robotter teknologier, der kan par pladelæser systemer, billedbehandling og flowcytometri, synes der at være en mangel i eksperimentel design, der kan udnytte og passe disse forbedrede teknologiske muligheder.
Hurtig, pålidelig, enkle og robuste cellebaserede metoder drastisk nødvendige for multiplex applikationer, som yderligere forstærker high-throughput kapacitet. Dette er især tilfældet inden for drug discovery hvor engineering cellebaserede assays i et multiplekset format kan øge kraften i high-throughput screening 39,47-50 51-54. Fluorescent genetisk barcoding ikke kun giver mulighed for elegant multiplexing, men også, når manipuleret, omgår behovet for tidskrævende protokoller, reducerer omkostningerne ledsaget med antistoffer, perler og pletter 39,52,55, og kan reducere antallet af skærme, der kræves for høj throughput applikationer. Vi har for nylig beskrevet, hvordan retroviral teknologi kan forbedre multiplexing gennem fluorescerende genetiske stregkoder for biologiske anvendelser, ved at udtrykke et assay tidligere udviklet til at overvåge HIV-1-protease aktivitet 56,57 med forskellige klinisk fremherskende varianter 58. Metoden forklares i en mere beskrivende måde med fokus på, hvordan du vælger og forstærke genetisk fluorescerende stregkodede celler og hvordan man producerer paneler af klonpopulationer udtrykker forskellige fluorescerende proteiner og / eller forskellige fluorescens intensiterne. Paneler af cellepopulationer skelnes baseret på deres fluorescerende egenskaber forbedre multipleksede kapaciteter, som yderligere kan udnyttes i kombination med cellebaserede assays, der tackle forskellige biologiske spørgsmål. Protokollen beskriver også, hvordan at konstruere et panel af stregkodede celler, der bærer en af de cellebaserede assays, der tidligere er udviklet i laboratoriet, som eksempel 59. Denne protokol er således ikke til formål at vise veletablerede retroviral / lentiviral teknologi for genoverførsel, værdien af fluorescerende proteiner eller anvendelser af flowcytometri 60,48, men snarere for at vise styrke magt kombinere tre for multiplex applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af pattedyrsceller, Viral Produktion og transduktion for Genetisk Barcoding
- Plate 2,5 x 10 6 adhærente celler i en 10 cm plade (eller ca. 50-60% konfluens) en dag før transfektion i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med 10% føtalt kalveserum (FCS). For retroviral brug produktionsforpakning cellelinie af valg, såsom Phoenix-GP (en slags gave fra Gary Nolan, Stanford University).
BEMÆRK: pakkende cellelinie stabilt udtrykker gag og pol proteiner til retroviral partikeldannelse i trans. Sørg celler er sunde og klæbet til pladen i et monolag, før transfektion. - 24 timer senere, forberede DNA-transfektion blandingen.
- Til 125 pi serumfrit DMEM tilsættes 3 ug vesikulær stomatitis-virus kappeglycoprotein vektor (PCI-VSVg) og 3 ug transfer vektor, der bærer det fluorescerende protein-gen af interesse. Bland og tilsæt 15 ul polyethylimin (2 mg / ml).
- Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 15 minutter og tilsættes til celler drop-wise.
BEMÆRK: polyethylimin tilsættes til den homogene DNA-blandingen som transfektionsreagens for dannelsen af polyplekser. For at opnå viruspartikler bærer forskellige fluorescerende protein markører, udføre hver transfektion uafhængigt med markør for valg. Husk, at den retrovirale vektor overførslen er omkring 7 kb i længde og kan ikke pakkes over 10 kb.
- Pladerne inkuberes ved 37 ° C. For at øge virusproduktion sted plader ved 30 ° C eller 32 ° C i stedet.
BEMÆRK: 24 timer efter transfektion medier kan erstattes med 7 ml frisk medium, og selv om dette kan forbedre celle sundhed det kan nedsætte virusbelastning i supernatanten. - 48 timer efter transfektion indsamle supernatanten indeholdende viruspartikler og filter med 0,45 um polytetrafluorethylen filter. Brug frisk indsamlet viral supernatant for transduktion. Othlers holde supernatanten i portioner ved -80 ° C og undgå frysning-optøning. Husk, at viral titer vil falde sandsynligvis op til 50% med hver frysning-optøning-cyklus.
- Plate cellelinie valg 24 timer før transduktion hvis klæbende, eller umiddelbart før transduktion hvis ikke-klæbende. Seed 2,0 x 10 5 til 3,0 x 10 5 adhærente celler (her Huh 7.5.1 og HEK 293T) eller 5,0 x 10 5 til 1 x 10 6 ikke-adhærente celler (her SupT1) per brønd i en 6-brønds plade.
BEMÆRK: Sørg for at kalibrere det antal celler, der skal podes før transduktion, især så for vedhængende celler, så cellerne opnå en konfluens på ca. 60% på tidspunktet for transduktion. - Tilsæt 5 pg / ml Polybrene (hexadimethrene bromid) til sederede celler og derefter tilføje tidligere indsamlede viral supernatant for at opnå omkring 20-40% infektion (her 2 ml).
BEMÆRK: MOI eller procentdelen af infektion er oftest vilkårligt, da sortering vil gøre det muligt at forstærke enhver subpopulation af celler. Det er klart, en højere infektion letter og fremskynder processen med forstærkning. - Transducere celler ved centrifugering i en hængende spand rotor ved 1.500 xg i 120 minutter ved 32 ° C. Resuspender ikke-adhærente celler med frisk medium før inkubering. For adhærente celler, erstatte med frisk medier 24 timer efter transduktion.
BEMÆRK: Det anbefales at forsegle pladerne inden centrifugering med parafilm at undgå breder sig. For at øge genetisk barcoded celle mangfoldighed transducere celler med virale partikler, der bærer forskellige fluorescerende proteiner (opnået fra trin 1.4). Når du vælger fluorescerende markører, sørg for at de er forenelige med instrumentering og de har skelnes fluorescerende parametre.
2. Valg og Forstærkning af genetisk stregkodede celler
- Analyser transducerede pattedyrceller ved flowcytometri på mindst 72 timer efter transduktion at kvantificere procent transduktion. Brug en sammenlignelig ikke-transduceret cellelinje som negativ kontrol.
BEMÆRK: Som sortering vil blive brugt til at rense individuelle stregkodede cellepopulationer, en høj procent indledende transduktion, mens ikke nødvendigt, bør fremskynde processen med forstærkning. - Anvend cellesorteringsmaskinen valg at opnå celler, som udtrykker proteinet af interesse.
- Med henblik herpå sikrer portene er korrekt sat i de rigtige kanaler.
- For at gøre dette bruger den samme naive cellelinje som negativ kontrol og indstil parameter / kanal spænding, således at den negative befolkning er under værdien af 10 3 på hver fluorescerende akse. Bestem gating positiv fluorescens som begivenheder, der vises over den for den negative kontrol for hver fluorescerende kanal.
- Vær opmærksom på at hvert instrument kan variere, og den korrekte spænding til bestemmelse gating bør justeres i overensstemmelse hermed, hvilket gør positive og negative kontroller tvingende i enhver experimental opsætning.
- For fluorescensdetektion i denne forsøgsopstilling bruge FITC kanal (530/30 båndpasfilter fortsatte med en 502 lang pass filter) for eGFP, PE-kanal (585/42 båndpasfilter fortsatte med en 556 lang pass filter) til TD Tomat og APC kanal (660/20 båndpasfilter) for E2 Crimson.
BEMÆRK: 488 nm laser ophidser eGFP og TD Tomat mens E2 Crimson er begejstret ved 633 nm laser.
- For fluorescensdetektion i denne forsøgsopstilling bruge FITC kanal (530/30 båndpasfilter fortsatte med en 502 lang pass filter) for eGFP, PE-kanal (585/42 båndpasfilter fortsatte med en 556 lang pass filter) til TD Tomat og APC kanal (660/20 båndpasfilter) for E2 Crimson.
- Med henblik herpå sikrer portene er korrekt sat i de rigtige kanaler.
- Sorter i 15 ml koniske rør med 1 ml 100% FCS.
BEMÆRK: Processen med sortering fluorescerende cellepopulationer er ikke obligatorisk, da man direkte kan gå videre med den slags individuelle kloner (se nedenfor). Sortering stramme populationer baseret på valgte fluorescens sikrer en backup population for fremtidige udvælgelse af individuelle kloner. Husk, at de enkelte celler er til tider vanskelig at vokse, mens en stor population af celler kan let fryses og derefter optøet og forstærkes på et senere tidspunkt. - Spi ned de sorterede populationer i en hængende spand rotor centrifugeres ved 524 g ved 32 ° C i 5 minutter for at pelletere cellerne. Resuspender i 1 ml frisk medium, og re-plade celler, således at cellekonfluens er under 60% for at muliggøre vækst og deling i mindst to dage.
- For eksempel plade adhærente celler ved omkring 3 x 10 5 celler i 2 ml medium per brønd i en 6-brønds plade og 2 x 10 6 celler i 2 ml medium i en 6 cm plade. Brug DMEM for vedhængende celler og RPMI til ikke-klæbende celler (eller en bestemt medie, hvis det kræves). Placer udpladede celler i en inkubator ved 37 ° C i flere dage for at tillade amplifikation.
3. Få klonpopulationer af genetisk stregkodede celler ved forskellige intensiteter
- Opnå klonale populationer af celler oprindeligt transducerede (trin 1.7) eller fra den sorterede population (trin 2.3).
BEMÆRK: Dette vil sikre lige eller lignende niveau af fluorescerende protein-ekspression blandt alle cellens i befolkningen (en stram population med en lille CV i gennemsnitlig fluorescensintensitet på op til 40%).- Til dette formål, sortere enkelte celler i 96-brønds plader med en automatiseret celle deposition enhed (ACDU). Sæt porte til sortering efter bestande af interesse. Sørg porte er sat mindst en log-skala fra hinanden for at opnå skelnes populationer, når du vælger celler ved forskellige fluorescerende intensiteter. For proceduren er vist her, skal du bruge samme flowcytometri eksperimentelle oprettet som den der er beskrevet i trin 2.2.
- Forstærke individuelle kloner i en inkubator ved 37 ° C i mindst 2 uger. Gennem processen af amplifikation analysere cellerne under mikroskop for at sikre, at voksende befolkning opstår fra enkelte celler og ikke fra mere end én.
BEMÆRK: Husk at sorteringsanlæg vil placere en celle per brønd i gennemsnit, og mens nogle brønde ikke kan have enhver celle overhovedet, kan andre har mere end én.- For at sikre, at en pokale bestand opstår fra en celle kun være meget blid med pladen og aldrig forstyrre brøndene ved pipettering. Overhold pladen, godt ved godt, under mikroskopet.
BEMÆRK: De enkelte celler kan til tider være vanskeligt at identificere, når de begynder at dividere de vil være let genkendelig. - Vær opmærksom på, at der ofte cellernes klump «langs kanterne. Kassér de brønde, hvor flere klonpopulationer kan observeres og holde dem, der har en stram befolkning.
BEMÆRK: Det er tilrådeligt at overføre dem i større plader til forstærkning.
- For at sikre, at en pokale bestand opstår fra en celle kun være meget blid med pladen og aldrig forstyrre brøndene ved pipettering. Overhold pladen, godt ved godt, under mikroskopet.
- Screen de formodede klonpopulationer ved at analysere dem ved flowcytometri. Sammenligne dem med en negativ kontrol anvendes samme flowcytometri forsøgsopstilling.
- Analysere kun en procentdel af prøven og holde resten som backup. Vælg de mest udpræget adskilte populationer baseret på gennemsnitlig intensitet og tæthed af befolkningen. Forstærk dem efter behov, eller fryse lagre ifrysning medier med 20% glycerol ved -80 ° C i korte tidsrum eller flydende nitrogen i længere tid.
OBS: Husk, at en 'sand' klonal befolkning bør have en meget stram fluorescens mønster.
- Analysere kun en procentdel af prøven og holde resten som backup. Vælg de mest udpræget adskilte populationer baseret på gennemsnitlig intensitet og tæthed af befolkningen. Forstærk dem efter behov, eller fryse lagre ifrysning medier med 20% glycerol ved -80 ° C i korte tidsrum eller flydende nitrogen i længere tid.
4. Sørg Multiplexing evne til high throughput screening (HTS)
- Kombiner så mange forskellige klonpopulationer efter behov, der kan yderligere anvendes i en multiplekset format. Vælg kloner med skelnes absorption / emission spektre og / eller forskellige intensiteter. Hvis der anvendes en 96-brønds plade-format, som er egnet til HTS, frø 50.000 celler i 200 pi per brønd.
BEMÆRK: Husk, at antallet af celler er kun et skøn og kan ændre baseret på celle-type og om det er klæbende eller ej. - Analysere prøverne ved hjælp af flowcytometri for at sikre, at hver af de uafhængige etablerede fluorescerende cellelinjer kan skelnes fra hinanden. Forud for analysen forberede negativeog ensfarvede kontroller til at indstille parametre og korrekturværdier.
BEMÆRK: Parametrisering klart at sondre mellem blandede populationer vil sætte dem i stand til at blive yderligere udnyttet i en multiplex-format.
5. Tilpas Genetisk barkode cellelinier biologiske Application of Choice
- Transducere etableret genetisk stregkodede cellelinier med virale partikler, der indeholder assayelementer af valg, som beskrevet her i Stolp et al. 2013 59. Husk, at assayet valg bør optage en ekstra og skelnes fluorescerende kanal og det er derfor at blive overført til den relevante barcoded cellelinie.
BEMÆRK: Hver barcoded cellelinie kan bære en anden analyse. - Sorter genetisk fluorescerende stregkodede celler til dem, der indeholder assayelementer.
BEMÆRK: assayelementer kan konstrueres koblet til et mærke eller fluorescerende protein (som en fusion eller gennem et internt ribosomindgangssted) feller ligetil detektion gennem western blotting, flowcytometri eller mikroskopi. Den anvendes i denne protokol system er baseret på HA epitop overflade-ekspression alene eller med yderligere FLAG epitop-ekspression.- Plette klonpopulationer indeholdende assay med HA og APC-fluorescens koblede antistoffer. Derefter analysere klonpopulationer med anti-FLAG og FITC-konjugeret antistof farvning.
- For at spore tilbage analysen, analysere eller "afkode" befolkningerne i den rigtige kanal, hvor der kan skelnes mellem forskellige genetisk stregkodede cellelinjer. Her afkode arten af substratet ved at analysere i PE kanal for TD Tomato detektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multiplexing fluorescerende genetisk barkode celler med henblik på biologiske anvendelser kan kun opnås, når de enkelte klonpopulationer er blevet genereret. Multiplexing er mest effektiv, når stregkodede befolkninger har klare tydelige fluorescerende egenskaber med minimal spektral overlapning. Den i figur 1 viste med klonale populationer af mammale SupT1 celler eksempel illustrerer, at stregkodede celler med mCherry og cyan fluorescerende protein (CFP), kan let analyseres samtidigt uden at miste deres individuelle fluorescerende egenskaber. Denne matrix eksemplificerer således et panel af fluorescerende genetisk stregkodede celler, der er anvendelig til multiplexing biologiske anvendelser med en udlæsning i endnu en yderligere tilgængelig kanal. For at opnå et sådant panel er det vigtigt at huske arten af retroviral teknologi, hvilket vil føre til variable intervaller af fluorescerende intensiteter i befolkningen som følge af insertionel efFigur fekter og / eller MOI. 2 viser, at første transduktion af pattedyrceller med viruspartikler, der indeholder enten TD tomatplanter eller E2 Crimson resulterer i celler, der udtrykker enten en af de fluorescerende proteiner eller begge dele på en bred vifte af intensiteter (venstre panel). Udvælgelse og sortering af enkelte celler i 96-brønds plader som vist ved de kanaliserede kasser (midten panel), gør det muligt at opnå stramme klonpopulationer følgende ekspansion (højre panel). En stram population bør defineres som havende en lille CV som kan variere efter celletype, normalt 30-40% i gennemsnitlig fluorescensintensitet. Figur 2 illustrerer også, at yderligere at øge antallet af genetisk stregkodede populationer med en matrix af kun to fluorescerende proteiner, kan man også udnytte fluorescensintensitet. Generelt en log afvigelse i den gennemsnitlige fluorescensintensitet mellem populationer er egnet til at opnå korrekt afstand til hinanden følgende sortering og amplification. Td Tomato blev valgt i det viste eksempel til at illustrere denne funktion, hvor to populationer af forskellige intensiteter, mellem og høj, blev opnået for multiplexing med E2 Crimson på en enkelt intensitet.
Multiplexing er et kraftfuldt værktøj til at lette analysen af mange prøver på samme tid, og for evnen til at afkode maskerede befolkninger. Forbedring multiplexing kan opnås med endnu en tredje fluorescerende protein, såsom eGFP, så længe spektrale egenskaber ikke interfererer med hinanden. I den eksperimentelle procedure er illustreret i figur 3, panel af seks populationer opnået med TD Tomat og E2 Crimson blev udnyttet til at øge multiplexing med eGFP. Retroviral teknologi blev anvendt til at overføre eGFP til befolkningerne repræsenteret i en af matricerne. Når observeret i eGFP kanalen, ikke-grønne naive seks population matrix (øverste venstre panel i figur 3) kan skelnes fra EGFP-transduceredepopulation matrix (nederste venstre panel i figur 3). Vigtigt er det, kan panelerne analyseres i kanalerne besat af den oprindelige genetiske stregkode (TD Tomat og E2 Crimson). Mens skelnes i disse kanaler (sammenlign befolkninger 1-6 med befolkninger 7-12 i midten paneler, figur 3), kan de enkelte befolkninger blive analyseret i eGFP kanalen, og dekodede eller spores tilbage, som vist på histogrammer (højre paneler i figur 3). Efter at gentage processen af transduktion, udvælgelse, sortering og forstærkning, at udnytte de ubesatte kanaler er ubrugelige, hvis rigtige kompensation ikke anvendes til at justere for mulig spektral overlapning. For at bevise dette, når befolkninger 1, 2, 3 (ikke-grøn) og 7, 8, 9 (grøn) analyseres i eGFP og td Tomato kanaler, er vanskelige befolkningsgrupper 7 og 8 til at skelne (venstre panel i figur 4) . Det er derfor nødvendigt at vælge naive celler (population 1) som en negativ control, så kan indstilles parametrene for instrumentering. Ved analyse enhver matrix, især med fluoroforer som spektralt overlapper, er det bydende nødvendigt, at en enkelt farve kontrol anvendes til at bestemme de korrekte korrekturværdier. I analysen af figur 4 populationer 2 eller 3, og 7 tjener dette formål og for bedre at definere befolkningsgrupper, som er virkelig dobbelt positive (populationer 8 og 9).
Genetisk stregkodede celler med fluorescerende markører bevarer deres egen identitet som defineret i deres Biosignatur, når de analyseres i den rigtige fluorescerende kanal med det rette instrument. Imidlertid bliver Biosignatur bare en ekstra individuel ejendom, medmindre der udnyttes til biologiske anvendelser. For at bevise magt fluorescerende genetiske stregkoder for multiplexing besluttede vi at indføre en af vores tidligere udviklede assays for lægemiddelforskning i nogle af de fluorescerende stregkodede pattedyrcellelinjer. Ved at gøre dette, fluorescerent genetiske stregkoder blev udnyttet til at opnå tre analyser i én prøve. I denne procedure et stillads protein indeholdende en af tre formodet viral substrat for proteolyse blev overført til de genetisk stregkodede celler. I assay spaltning afsløret ved tabet af FLAG-epitopen på celleoverfladen (figur 5B). I modsætning hertil FLAG overfladefarvning repræsenterer manglende spaltning Figur 5 illustrerer resultatet af analyse af tre forskellige substrater.; HIV-1 Envelope vildtype (Env wt), HIV-1 Envelope mutant (Env mut) og Dengue virus (Denv) bevægelseshæmmede. Hver af dem blev indført i 1 af 3 stregkodede cellelinjer, naive og 2 andre udnytter td Tomat ved forskellige intensiteter (midten og høje; figur 5A). Farvning for FLAG overfladeekspression afslører hvilke af substraterne blev spaltet baseret på den respektive stregkode. I eksemplet kun HIV env mut bevarer FLAG tag (positiv følgende farvning), som det ses i det grønne-FITC-kanal (figur 5C, nederste højre panel). Analysen af analysen kan således udføres i forbindelse med den oprindelige stregkoder, og udnyttes yderligere til at afkode og spore tilbage forskellige populationer. Denne metode til multiplexing således baseret på en ekstra kanal er reserveret til den biologiske udlæsning af interesse.
Figur 1:. Stregkoder for multiplexing Individuelle populationer genetisk stregkodede hjælp distinkte fluorescerende proteiner såsom mCherry, den fælles fiskeripolitik eller begge (venstre panel) kan blandes, analyseres, og afkodes (højre panel) i deres respektive kanaler via flowcytometri. Tilpasset fra Smurthwaite, C. et al., 2014 58. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2:. Sortering og forstærkning af stregkodede celler Pattedyrceller blev analyseret 48 timer efter transduktion med viruspartikler, der indeholder enten TD Tomat eller E2-Crimson (venstre panel). Gates indstilles derefter til sortering at omfatte celler, der udtrykker td Tomat ved forskellige intensiteter, med / ud E2-Crimson (midterste panel). Kloner fra den slags blev forstærket og re-analyseres for at generere en matrix af seks skelnes befolkninger (højre panel). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3:. Afkodning afslører maskerede populationer Matricenseks populationer er fremstillet i figur 2 (TD Tomat og / eller E2-Crimson) kan yderligere konstrueres til at udtrykke et yderligere fluorescerende protein, såsom eGFP. (A) den oprindelige matrix, når de analyseres i EGFP kanal (venstre panel) er negativ, og de seks populationer ikke kan skelnes fra hinanden. Hver af de seks populationer kan uafhængigt analyseret i EGFP kanalen som vist i histogrammerne (højre paneler). (B) Det samme matrix, nu udtrykker også eGFP, blev analyseret som i A, afslører nu deres grønne fluorescerende egenskab. Tilpasset fra Smurthwaite, C. et al., 2014 58. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4: Kompensation sikrer korrekt adskillelse Nogle af befolkningerne oprindeligt valgte baseret på TD Tomat og / eller eGFP udtryk (populationer 7 og 8) kan ikke ordentligt adskilt, når analyseres sammen (venstre panel), medmindre passende kompensation for disse kanaler justeres (højre. panel). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5:. Udvælgelse af stregkodede celler for yderligere tilpasning til valgte assay (A) Valg og tilpasning til analyse af valg. Populationer genetisk stregkodede med TD Tomat ved forskellige intensiteter (øverste venstre panel) blev anvendt til biologiske anvendelser. Hver af de populationer blev yderligere manipuleret til at indeholde et assay, der overvåger spaltning, Men hver af en forskellig substratspecificitet (øverste højre panel). (B) afbildning af assayet. Positive FLAG plet indikerer manglende spaltning mens negativ FLAG plet indikerer spaltning. (C) Analyse af assayet efter FLAG farvning. Blandede populationer kan skelnes baseret på TD Tomat stregkoden men skelnes i FITC-kanalen (venstre paneler). Når farvet med FLAG-FITC-antistof, kun én population er positiv for FLAG. Afkodning afslører, baseret på genetisk stregkoder, at denne population bærer HIV env mut substrat (højre panel). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her to veletablerede procedurer er blevet kombineret; genteknologi gennem retroviral teknologi og detektering af fluorescerende proteiner anvender flowcytometri. Fluorescerende protein-baseret genetisk stregkoder til fremstilling af unikke cellelinjer tilvejebringer en robust og enkel måde for multipleksede applikationer. Generering gensplejsede stregkodede celler gennem retroviral teknologi, er i første omgang en langvarig proces, men gør det muligt at opnå, når de er etableret, en pålidelig og stabil kilde til cellemateriale. Karakteren af denne teknologi konsekvent producerer gensplejsede cellelinier med stabile fluorescerende egenskaber, der bliver deres egen sande skelnes Biosignatur.
Både adhærente og ikke-adhærente celletyper kan Barcoded udnytte fluorescerende proteiner, der er let at skelne baseret på deres fysiske absorbans / emissionsspektre. Disse omfatter, men er ikke begrænset til proteiner, såsom den fælles fiskeripolitik, mCherryE2 Crimson og TD tomat. Når genetisk Barcoded med deres skelnelige fluorescerende protein, kan de kombineres til at producere et panel af cellepopulationer. Vigtigt er det, indeholder panelet cellepopulationer med den nøjagtige genotypiske make-up, men kun adskiller sig ved deres fluorescens træk. Som sådan er disse paneler perfekt egnet til multipleksede anvendelser i høj grad øge højt gennemløb kapaciteter.
På grund af de forskellige insertionelle præferencer retroviral partikel i værtsgenomet, kombineret med forskelle i MOI, er variable fluorescensintensiteter fra gennemføres især fluorescerende protein-gen forventet. Analyse af en genetisk manipuleret befolkning bærer en unik fluorescerende gen vil således detektere en række udtryk profiler, der kan defineres på grundlag af fluorescensintensitet. Denne differentielle ekspression profil kan udnyttes til at skabe befolkningsgrupper, som er spektralt adskilt fra hinanden. Man kan således combine valg af fluorescerende markører med fluorescensintensitet til at passe den eksperimentelle design. Her matricer af 4, 6 og 12 populationer, som omfatter to 6 befolkningsgrupper paneler af E2 Crimson og TD Tomat, med eller uden eGFP, er vist. I teorien kan dette yderligere udvidet med forskellige intensiteter af eGFP samt at skabe populationer af 3 forskellige fluorescerende proteiner; hver med forskellige intensiteter forbundet med det. Som tidligere nævnt, skal der tages højde valg af de fluorescerende proteiner med henblik på at sikre, at adskillelsen kan faktisk opnås. Udvalgte proteiner bør have særskilte absorbans og emissionsspektre; Men når der anvendes to spektralt skelnelige men lignende fluorescerende proteiner, bør anvendes kompensation. Vigtigere, ordentlig kompensation, som giver mulighed for fysisk adskillelse af emission / absorbansspektre mellem forskellige fluorophorer eller fluorescerende proteiner, der er opnået med anvendelse af passende enkelt farveindstillinger fordetektion via flowcytometri.
Multiplexing med færre fluorescerende proteiner, men at udnytte en række intensiteter frigør yderligere kanaler, der kan derefter yderligere udnyttes til biologisk anvendelse af interesse. Dette kan øge fleksibiliteten af den eksperimentelle opsætning og forenkle valget af kombinationen af fluorescerende markører, der skal anvendes. For eksempel multiplex assay er vist i figur 5 er afhængig af antistof-farvning, i dette tilfælde koblet til FITC. Da kun PE-kanalen er besat af genetisk stregkoder, kan man udnytte FITC-konjugerede antistoffer, eller omvendt, APC-koblet en beslutning, der kan gøres på grundlag af passende instrumentering og / eller antistoffet tilgængelighed.
Mens de teknologiske resultater inden for flowcytometri, mikroskopi eller kombinerede metoder er imponerende, flaskehalsen synes at være den tilgængelige cell teknologi til biologiske anvendelser og HTS. Retroviral technologi kombineret med den voksende antal fluorescerende proteiner kan flettes til at besvare denne forespørgsel. Fluorescent genetiske stregkoder drastisk letter multiplexing, hvilket igen, opfylder det stigende behov for at udvide HTS kapaciteter cellebaserede assays. Genetisk barcoding fører til en robust, omkostningseffektiv og enkel måde at par cellebaserede assays med højt gennemløb metoder til biologiske anvendelser og narkotika. Effekten af at udføre den ene frem for tre skærme ved hjælp af en 3 befolkning panel har gavnlig omkostninger og tid relaterede konsekvenser. Med den stigende alsidighed i flowcytometri, høj indhold billedbehandling og flow-cytometri-koblede mikroskopi vil fluorescerende genetiske stregkoder være et konsekvent pålidelige værktøj til assay udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Garry Nolan fra Stanford University for at give Phoenix GP pakkecellelinien til produktion af retrovirale partikler. Vi takker Dr. Roger Tsien ved University of California i San Diego for at give TD Tomat. Vi vil også gerne takke San Diego State University Flowcytometri Core Facility for deres service og hjælp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | used for filtering the virus |
| 0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter | Pall Corporation | 4219 | used for filtering the virus |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 45000-304 | cell growth media for HEK 293T cells |
| PEI (Polyethylenimine) | poly sciences | 23966-2 | 2 mg/ml concentration used |
| Hanging bucket centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5805 000.017 | used for spin infection |
| PBS (phosphate buffered saline) | Corning | 21-040-CV | used for washing of cells |
| Polybrene (hexadimethreen bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration. |
| FACSAria | BD Biosciences | instrument used for sorting cell populations | |
| FACSCanto | BD Biosciences | instrument used for cell analysis | |
| Phoenix-GP | Gift from Gary Nolan | cell line used to produced retroviral particles | |
| Fetal calf serum | Mediatech | MT35015CV | used for cell growth and sorting |
| SupT1 cells | ATCC | CRL-1942 | Human T lymphoblasts |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | cell growth media for SupT1 cells |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527 (1997).
- Godwin, A. R., Stadler, H. S., Nakamura, K., Capecchi, M. R. Detection of targeted GFP-Hox gene fusions during mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13042-13047 (1998).
- Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
- Natarajan, L., Jackson, B. M., Szyleyko, E., Eisenmann, D. M. Identification of evolutionarily conserved promoter elements and amino acids required for function of the C. elegans beta-catenin homolog BAR-1. Dev Biol. 272 (2), 536-557 (2004).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin.Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Valencia-Burton, M., et al. Spatiotemporal patterns and transcription kinetics of induced RNA in single bacterial cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16399-16404 (2009).
- Mahmoud, L., et al. Green fluorescent protein reporter system with transcriptional sequence heterogeneity for monitoring the interferon response.J Virol. 85 (18), 9268-9275 (2011).
- Saunders, M. J., et al. Fluorogen activating proteins in flow cytometry for the study of surface molecules and receptors.Methods. 57 (3), 308-317 (2012).
- Wang, Y. L., Taylor, D. L. Probing the dynamic equilibrium of actin polymerization by fluorescence energy transfer. Cell. 27 (3 Pt 2), 429-436 (1981).
- He, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence (Forster) resonance energy transfer from cyan fluorescent protein to yellow fluorescent protein using single-laser excitation at 458 nm. Cytometry A. 53 (1), 39-54 (2003).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Clayton, A. H., et al. Ligand-induced dimer-tetramer transition during the activation of the cell surface epidermal growth factor receptor-A multidimensional microscopy analysis. J Biol Chem. 280 (34), 30392-30399 (2005).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
- Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Ai, H. W., Shaner, N. C., Cheng, Z., Tsien, R. Y., Campbell, R. E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry. 46 (20), 5904-5910 (2007).
- Mishin, A. S., et al. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry. 47 (16), 4666-4673 (2008).
- Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 48 (31), 5612-5626 (2009).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Klages, N., Zufferey, R., Trono, D. A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther. 2 (2), 170-176 (2000).
- Lai, Z., Brady, R. O. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinanat lentivirus vector. J Neurosci Res. 67 (3), 363-371 (2002).
- Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol Biol. 246, 391-411 (2004).
- Grignani, F., et al. High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein. Cancer Res. 58 (1), 14-19 (1998).
- Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Mol Ther. 2 (5), 458-469 (2000).
- Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6 (3), 127-134 (2000).
- Zhang, X. Y., et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol Ther. 5 (5 Pt 1), 555-565 (2002).
- Rossi, G. R., Mautino, M. R., Morgan, R. A. High-efficiency lentiviral vector-mediated gene transfer into murine macrophages and activated splenic B lymphocytes. Hum Gene Ther. 14 (4), 385-391 (2003).
- Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
- Chan, A. W., Chong, K. Y., Martinovich, C., Simerly, C., Schatten, G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science. 291 (5502), 309-3012 (2001).
- Linney, E., Hardison, N. L., Lonze, B. E., Lyons, S., DiNapoli, L. Transgene expression in zebrafish: A comparison of retroviral-vector and DNA-injection approaches. Dev Biol. 213 (1), 207-2016 (1999).
- Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
- Tiemann, U., et al. Optimal reprogramming factor stoichiometry increases colony numbers and affects molecular characteristics of murine induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 79 (6), 426-435 (2011).
- Leung, A. K., Lamond, A. I. In vivo analysis of NHPX reveals a novel nucleolar localization pathway involving a transient accumulation in splicing speckles. J Cell Biol. 157 (4), 615-629 (2002).
- Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
- Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C.J Cell Biol. 161 (5), 899-909 (2003).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
- Edwards, B. S., Ivnitski-Steele, I., Young, S. M., Salas, V. M., Sklar, L. A. High-throughput cytotoxicity screening by propidium iodide staining. Curr Protoc Cytomt. 9 (Unit 9 24), (2007).
- Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 8 (Unit 8 17), (2007).
- Lu, R., Neff, N. F., Quake, S. R., Weissman, I. L. Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding. Nat Biotechnol. 29 (10), 928-933 (2011).
- Grant, G. D., et al. Live-cell monitoring of periodic gene expression in synchronous human cells identifies Forkhead genes involved in cell cycle control. Mol Biol Cell. 23 (16), 3079-3093 (2012).
- Fiering, S. N., et al. Improved FACS-Gal: flow cytometric analysis and sorting of viable eukaryotic cells expressing reporter gene constructs. Cytometry. 12 (4), 291-301 (1991).
- Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (1991).
- Edwards, B. S., Oprea, T., Prossnitz, E. R., Sklar, L. A. Flow cytometry for high-throughput, high-content screening. Curr Opin Chem Biol. 8 (4), 392-398 (2004).
- Durick, K., Negulescu, P. Cellular biosensors for drug discovery. Biosens Bioelectron. 16 (7-8), 587-592 (2001).
- Edwards, B. S., et al. High-throughput flow cytometry for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 2 (5), 685-696 (2007).
- Sklar, L. A., Carter, M. B., Edwards, B. S. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 7 (5), 527-534 (2007).
- Curpan, R. F., et al. High-throughput screen for the chemical inhibitors of antiapoptotic bcl-2 family proteins by multiplex flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 465-474 (2011).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Trejo, A., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding for multiplex flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 6 (Unit 6 31), (2011).
- Surviladze, Z., Young, S. M., Sklar, L. A. High-throughput flow cytometry bead-based multiplex assay for identification of Rho GTPase inhibitors. Methods Mol Biol. 827, 253-270 (2012).
- Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PLoS One. 8 (1), e53015 (2013).
- Vignali, D. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods. 342 (1-2), 243-255 (2000).
- Hilton, B. J., Wolkowicz, R. An assay to monitor HIV-1 protease activity for the identification of novel inhibitors in T-cells. PLoS One. 5 (6), e10940 (2010).
- Rajakuberan, C., Hilton, B. J., Wolkowicz, R. Protocol for a mammalian cell-based assay for monitoring the HIV-1 protease activity. Methods Mol Biol. 903, 393-405 (2012).
- Smurthwaite, C. A., et al. Fluorescent genetic barcoding in mammalian cells for enhanced multiplexing capabilities in flow cytometry. Cytometry A. 85 (1), 105-113 (2014).
- Stolp, Z. D., et al. A Novel Two-Tag System for Monitoring Transport and Cleavage through the Classical Secretory Pathway - Adaptation to HIV Envelope Processing. PLoS One. 8 (6), e68835 (2013).
- Schwartz, A., et al. Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry. 33 (2), 106-114 (1998).
