Introduction
Technologieën zoals fluorescentie spectroscopie, fluorescentie microscopie en flowcytometrie, allemaal afhankelijk van fluorescentie, een woning op grote schaal uitgebuit in biochemische, biomedische en chemische toepassingen. Fluorescentie, hetzij intrinsiek of door etikettering, is benut voor de analyse van eiwit expressie en profielen lot van de cel, eiwit interacties en biologische functies 1-9, en door fluorescentie / Förster resonantie energieoverbrenging voor de detectie van biomoleculen interacties en conformationele veranderingen 10-13. Aangezien de isolatie van het Aequorea victoria groen fluorescerend eiwit (GFP) 14, de ontdekking van nature voorkomende fluorescerende eiwitten van andere cnidarians, vooral koralen, sterk toegenomen het aantal bestaande fluorescerende eiwitten met onderscheiden excitatie / emissie spectra. Deze, samen met de introductie van mutaties in de genen 15-19, have verder uitgebreid de mogelijkheden, het verkrijgen van een ware palet van fluorescente proteïnen beschikbaar voor wetenschappers die microscopie benutten flowcytometrie andere fluorescentie gebaseerde technologieën voor hun onderzoek.
Daarnaast hoewel onafhankelijk de ontwikkeling van retrovirale technologie drastisch vergemakkelijkt de stabiele expressie van ectopische genetische informatie in zoogdiercellen 20-23. Het is dus niet verwonderlijk dat deze technologie is gebruikt om genen van fluorescerende eiwitten over in een groot aantal celtypen en weefsels 24-28 of voor de productie van transgene dieren 29-31. Na de aard van retrovirussen, wordt de genetische informatie van het ectopische fluorescerend eiwit geïntroduceerd in het genoom van de cel 32 en de cel wordt fluorescente 'voor ever'. Deze woning is toegestaan volgen van lot van de cel, of van een enkele cel binnen een populatie van cellen. De nu fluorescerende cel heeft dus Acquired eigen Biosignatuur en kan worden gedefinieerd als barcode. Zijn unieke Biosignatuur identificeert zich van andere cellen, en belangrijker nog, onderscheidt het zich van cellen genetisch gemanipuleerd om verschillende fluorescerende eiwitten met onderscheiden absorptie / emissie spectra te uiten. Biologische toepassingen zoals het volgen van herprogrammering factoren naar pluripotentie 33, de analyse van subnucleaire factoren voor de opheldering van nucleolaire lokalisatie 34, de constructie van fluorescerende reporter plasmiden voor transcriptionele studies 35 of de genetische kenmerken van neuronen voor de studie van neuronale netwerkarchitectuur 36 , zijn slechts vier voorbeelden van de vele die verschillende fluorescent proteïne genen benut voor dezelfde experimentele opstelling.
Flowcytometrie ruim is toegepast voor de analyse van biologische processen op enkele cel niveau, zoals genexpressie, celcyclus, apoptose en signalering door fosforylatie 37-43 .De stabiele expressie van fluorescent proteïne genen in zoogdiercellen is verder versterkt het nut van flowcytometrie voor celanalyse 38,44 en ligand-receptor interacties 45. Verbeterde mogelijkheden hebben stroom toegestaan cytometrie een veel gebruikt methodologie voor high-throughput en high content 46 geworden. Ondanks het nu uitgebreid aantal fluorometers en robotica technologieën die paar plaatafleesinrichting systemen, beeldvorming en kan flowcytometrie, lijkt er een gebrek in de experimentele ontwerp dat kan benutten en past deze verbeterde technologische mogelijkheden zijn.
Snel, betrouwbaar, eenvoudig en robuust cellen gebaseerde methoden zijn drastisch nodig voor multiplex-toepassingen die verder te verbeteren high-throughput capaciteit. Dit geldt vooral op het gebied van geneesmiddelen waarbij techniek celgebaseerde proeven in een gemultiplexte vorm het vermogen van high-throughput screening 39,47-50 kan verbeteren 51-54. Fluorescerende genetische barcoding maakt niet alleen voor elegante multiplexing, maar ook, zij eenmaal, omzeilt de noodzaak van tijdrovende protocollen, verlaagt de kosten gepaard met antilichamen, kralen en vlekken 39,52,55, en kan het aantal schermen die nodig is voor high verminderen throughput toepassingen. We hebben recent beschreven hoe retrovirale technologie multiplexen via fluorescent genetische barcode verbeteren voor biologische toepassingen, door expressie een assay die eerder HIV-1 protease-activiteit 56,57 monitor met verschillende klinisch voorkomende varianten 58. De methodologie wordt toegelicht in een meer beschrijvende manier te focussen op hoe om te selecteren en te versterken genetisch fluorescerende barcode cellen en hoe panelen van klonale populaties uiten verschillende fluorescerende eiwitten en / of verschillende fluorescentie intensit producerenies. Panelen van celpopulaties onderscheiden op basis van hun fluorescerende eigenschappen verbeteren gemultiplexte vermogens, die verder in combinatie kunnen worden benut met celgebaseerde proeven die verschillende biologische vragen pakken. Het protocol beschrijft ook hoe je een panel van barcode cellen die één van de cel-gebaseerde testen die eerder ontwikkeld in het laboratorium ingenieur, zoals bijvoorbeeld 59. Dit protocol is dus niet bedoeld om de gevestigde retrovirale / lentivirale technologie voor genetische overdracht, de waarde van fluorescerende eiwitten of de toepassing van flowcytometrie 60,48 laten maar om het versterkende kracht van het combineren van de drie voor gemultiplexte aanvragen blijkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van zoogdiercellen, Viral Productie en Transduction voor Genetische barcodes
- Plaat 2,5 x 10 6 hechtende cellen in een 10 cm plaat (of ongeveer 50-60% confluentie) één dag voor transfectie in Dulbecco's gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal kalfsserum (FCS). Voor retrovirale productie gebruik inpakcellijn-lijn van keuze, zoals Phoenix-GP (een soort geschenk van Gary Nolan, Stanford University).
OPMERKING: De inpakcellijn stabiel uitdrukt Gag en Pol eiwitten voor retrovirale vorming deeltje in trans. Controleer cellen gezond en gehecht aan de plaat in een monolaag vóór transfectie. - 24 uur later, de voorbereiding van het DNA transfectie mengsel.
- 125 ul serumvrij DMEM voeg 3 ug Vesiculaire stomatitis envelop glycoproteïne vector (pCI-VSVG) en 3 ug overdracht vector die het fluorescerende proteïne gen van interesse. Mengen en voeg 15 ul van polyethylimine (2 mg / ml).
- Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en voeg aan cellen druppelsgewijs.
OPMERKING: polyethylimine toegevoegd aan het homogene mengsel DNA transfectie reagens voor de vorming van polyplexen. Om virale deeltjes te verkrijgen dragen verschillende fluorescent eiwit markers, voeren elke transfectie zelfstandig met de markering van keuze. Bedenk dat de retrovirale vector overdracht is ongeveer 7 kb in lengte en kan niet worden verpakt als boven 10 kb.
- Incubeer de platen bij 37 ° C. Om virusproductie plaats platen verhogen bij 30 ° C of 32 ° C plaats.
OPMERKING: 24 uur na transfectie media kunnen worden vervangen door 7 ml vers medium, en hoewel dit gezondheid cel kan verbeteren kan viral load in het supernatant af. - 48 uur na transfectie verzamel de bovenstaande vloeistof die virusdeeltjes en filter met een 0,45 pm polytetrafluoretheen filter. Gebruik vers verzameld viraal supernatant voor transductie. Othders houden supernatant in aliquots bij -80 ° C en voorkomen vries-dooi. Bedenk dat virale titer waarschijnlijk tot 50% bij elke invriezen ontdooicyclus zal afnemen.
- Plaat cellijn naar keuze 24 uur voorafgaand aan transductie als aanhanger, of onmiddellijk vóór transductie als niet-klevende. Seed 2.0 x 10 5-3,0 x 10 5 hechtende cellen (hier Huh 7.5.1 en HEK 293T) of 5,0 x 10 5 tot 1 x 10 6 niet-hechtende cellen (hier SupT1) per putje in een 6-wells plaat.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u het kalibreren van het aantal cellen voorafgaand aan transductie te worden gezaaid, vooral zo voor hechtende cellen, zodat de cellen bereiken van een samenvloeiing van ongeveer 60% op het moment van transductie. - Voeg 5 ug / ml polybreen (hexadimethrene bromide) te gezaaide cellen en voeg eerder verzamelde virale supernatant tot ongeveer 20-40% infectie (hier 2 ml) te verkrijgen.
OPMERKING: De MOI of percentage van de infectie is meestal arbitrair, zoals sorteren zal toelaten om elke subpopulat versterkenion cellen. Uiteraard, een hoger percentage van de infectie vergemakkelijkt en versnelt het proces van versterking. - Transduceren cellen door centrifugeren in een hangende bucket rotor bij 1500 xg gedurende 120 min bij 32 ° C. Resuspendeer niet-hechtende cellen met vers medium voorafgaande aan incubatie. Voor hechtende cellen, te vervangen door vers medium 24 uur na transductie.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de platen centrifugeerden met parafilm verzegelen om te voorkomen dat morsen over. Genetisch barcode diversiteit cel te verhogen, transduceren cellen met virale deeltjes dragen verschillende fluorescerende eiwitten (verkregen uit stap 1.4). Bij het kiezen van fluorescente merkers, zorg ervoor dat ze compatibel zijn met de instrumentatie en ze hebben onderscheiden fluorescerende parameters.
2. Selectie en Versterking van genetisch barcode Cellen
- Analyseer getransduceerde zoogdiercellen door flowcytometrie ten minste 72 uur na transductie op het kortingspercentage van transductie te kwantificeren. Gebruik een vergelijkbare niet-getransduceerde cellijn als negatieve controle.
OPMERKING: het sorteren wordt gebruikt om individuele barcode celpopulaties, een hoog percentage van de initiële transductie te zuiveren, terwijl het niet nodig is, moet versnellen het proces van versterking. - Gebruik de cel sorter keuze aan de cellen die het eiwit van interesse tot expressie te verkrijgen.
- Daartoe zorgen de poorten goed zijn ingesteld in de juiste kanalen.
- Om dit te doen gebruiken dezelfde naïeve cellijn als negatieve controle en stel de parameter / kanaal spanning, zodat de negatieve bevolking is lager dan de waarde van 10 3 op elke TL-as. Bepaal venstertijd voor positieve fluorescentie als gebeurtenissen die boven die van de negatieve controle voor elk fluorescerende kanaal verschijnen.
- Wees ervan bewust dat elk instrument kan variëren en de juiste spanning voor het bepalen van gating moet dienovereenkomstig worden aangepast, het maken van positieve en negatieve controles imperatief in elk experimental setup.
- Voor fluorescentie detectie in deze experimentele opstelling te kunnen gebruiken de FITC kanaal (530/30 band pass filter voorafgegaan door een 502 lange pass filter) voor eGFP, de PE-kanaal (585/42 band pass filter voorafgegaan door een 556 lange pass filter) voor td Tomaat , en het APC-kanaal (660/20 band pass filter) voor E2 Crimson.
OPMERKING: De 488 nm laser boeit eGFP en td Tomaat terwijl E2 Crimson wordt opgewekt door de 633 nm laser.
- Voor fluorescentie detectie in deze experimentele opstelling te kunnen gebruiken de FITC kanaal (530/30 band pass filter voorafgegaan door een 502 lange pass filter) voor eGFP, de PE-kanaal (585/42 band pass filter voorafgegaan door een 556 lange pass filter) voor td Tomaat , en het APC-kanaal (660/20 band pass filter) voor E2 Crimson.
- Daartoe zorgen de poorten goed zijn ingesteld in de juiste kanalen.
- Sorteren in 15 ml conische buizen met 1 ml 100% FCS.
Opmerking: Het proces sorteren fluorescente celpopulaties niet verplicht als een direct doorgaan met de soort van individuele klonen (zie hieronder). Sorteren strakke populatie op basis van gekozen fluorescentie zorgt voor een back-up bevolking voor de toekomstige selectie van individuele klonen. Houd in gedachten dat individuele cellen zijn soms moeilijk om te groeien, terwijl een grote populatie van cellen gemakkelijk kunnen worden bevroren, en vervolgens ontdooid en versterkt in een later stadium. - Spin onderaan de gesorteerde populaties hangend bucket rotor centrifuge bij 524 g bij 32 ° C gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren. Resuspendeer in 1 ml vers medium en opnieuw cellaag zodat cel confluentie is dan 60% groei en deling wacht ten minste twee dagen.
- Bijvoorbeeld plaat hechtende cellen op ongeveer 3 x 10 5 cellen in 2 ml medium per putje in een 6-wells plaat en 2 x 10 6 cellen in 2 ml medium in een 6 cm plaat. Gebruik DMEM voor hechtende cellen en RPMI voor niet-hechtende cellen (of enige drager indien nodig). Plaats cellen uitgeplaat in een incubator bij 37 ° C gedurende enkele dagen amplificatie mogelijk.
3. Zorg voor klonale populaties van genetisch barcode cellen op verschillende intensiteiten
- Verkrijgen klonale populaties van cellen oorspronkelijk getransduceerde (stap 1.7) of de gesorteerde populatie (stap 2.3).
LET OP: Dit zal zorgen voor gelijke of gelijkwaardige niveau van fluorescerend eiwit expressie onder al de cels binnen de populatie (een strakke populatie met een kleine CV gemiddelde fluorescentie-intensiteit van 40%).- Daartoe soort enkele cellen in 96-well platen met een geautomatiseerde cel neerslageenheid (ACDU). Stel poorten voor het sorteren volgens de bevolking van belang. Zorgen poorten zijn ingesteld ten minste één log-schaal uit elkaar te onderscheiden populatie te verkrijgen bij het kiezen van cellen op verschillende fluorescentie-intensiteiten. Voor de hier getoonde procedure, maken gebruik van dezelfde flowcytometrie experimentele opgezet als de ene in stap 2.2 beschreven.
- Amplify individuele klonen in een incubator bij 37 ° C gedurende ten minste 2 weken. Door het proces van amplificatie analyseren de cellen onder de microscoop opdat groeiende bevolking ontstaan uit afzonderlijke cellen en niet uit meer dan één.
LET OP: Vergeet niet dat de sorter één cel per putje zal leggen op het gemiddelde, en terwijl sommige putten elke cel niet kan hebben helemaal niet, anderen kunnen er meer zijn.- Om ervoor te zorgen dat een povolking ontstaat uit één cel alleen, uiterst voorzichtig met de plaat en nooit verstoren de putten door pipetteren. Bekijk de plaat, goed door goed, onder de microscoop.
OPMERKING: Terwijl de individuele cellen kan soms moeilijk te identificeren, als ze eenmaal beginnen te delen zullen ze gemakkelijk te herkennen zijn. - Wees ervan bewust dat vaak cellen 'klomp' langs de randen. Gooi die putten waar meerdere klonale populaties kunnen worden waargenomen en die bewaren, dat een strakke bevolking.
OPMERKING: Het is raadzaam om deze over te dragen in grotere platen voor versterking.
- Om ervoor te zorgen dat een povolking ontstaat uit één cel alleen, uiterst voorzichtig met de plaat en nooit verstoren de putten door pipetteren. Bekijk de plaat, goed door goed, onder de microscoop.
- Zeef de vermoedelijke klonale populaties door deze te analyseren door flowcytometrie. Vergelijk ze een negatieve controle die dezelfde flowcytometrie experimentele opstelling.
- Analyseer slechts een percentage van het monster en houden de rest als backup. Kies de meest duidelijk omschreven populaties op basis van gemiddelde intensiteit en de dichtheid van de bevolking. Versterken ze als dat nodig is of voorraden te bevriezen inbevriezing medium met 20% glycerol bij -80 ° C gedurende korte perioden of vloeibare stikstof langer.
LET OP: Vergeet niet dat een 'echte' klonale populatie een zeer strakke fluorescentie patroon zou moeten hebben.
- Analyseer slechts een percentage van het monster en houden de rest als backup. Kies de meest duidelijk omschreven populaties op basis van gemiddelde intensiteit en de dichtheid van de bevolking. Versterken ze als dat nodig is of voorraden te bevriezen inbevriezing medium met 20% glycerol bij -80 ° C gedurende korte perioden of vloeibare stikstof langer.
4. Zorg Multiplexing Mogelijkheden voor high throughput screening (HTS)
- Combineer zoveel afzonderlijke klonale populaties nodig die verder kunnen worden gebruikt in een multiplex formaat. Kies klonen met onderscheidbare absorptie / emissie spectra en / of verschillende intensiteiten. Als een 96-well plaat formaat wordt gebruikt, die geschikt is voor HTS, zaad 50.000 cellen in 200 ul per putje.
OPMERKING: Houd er rekening mee dat het aantal cellen is slechts een schatting en kunnen veranderen op basis van cell-type en of het aanhangend of niet. - Analyseer het monster met behulp van flowcytometrie zodat elk onafhankelijk vastgestelde fluorescerende cellijnen kunnen worden onderscheiden van elkaar. Voorafgaand aan de analyse te maken negatieveen enkele kleur controles om de parameters en compensatie waarden in te stellen.
NB: Het instellen van de parameters om een duidelijk onderscheid van de gemengde populatie zal hen in staat stellen verder te worden gebruikt in een multiplex-formaat.
5. Pas Genetisch Barcoded cellijnen aan de Biologische Toepassing van Keus
- Transduceren vastgesteld genetisch barcode cellijnen met virale deeltjes die de testelementen keuze bevatten, zoals hier beschreven Stolp et al., 2013 59. Bedenk dat de test van keuze een extra en onderscheidbaar fluorescerend kanaal moet innemen en dus moet worden overgebracht naar de juiste barcode cellijn.
OPMERKING: Elke barcode cellijn kan een andere test te dragen. - Sorteer genetisch fluorescerende barcode cellen voor degenen die analyse-elementen bevatten.
OPMERKING: Assay elementen kunnen worden gemanipuleerd gekoppeld aan een label of fluorescerend eiwit (als een fusie of door een interne ribosoom binnenkomstplaats) fof eenvoudig opsporing door western blotting, flowcytometrie of microscopie. Het systeem gebruikt in dit protocol is gebaseerd op HA epitoop oppervlakte-expressie alleen, of met extra FLAG epitoop expressie.- Vlekken de klonale populaties die de assay met HA en APC-fluorescent gekoppelde antilichamen. Vervolgens analyseren de klonale populaties met anti-FLAG en FITC-geconjugeerd antilichaam kleuring.
- Om terug volgen de assay geanalyseerd of "decoderen" van de bevolking in het juiste kanaal waarbij de kenmerkende genetisch barcode cellijnen kunnen worden onderscheiden. Hier, decoderen de aard van het substraat door het analyseren in het PE kanaal TD Tomato detectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multiplexing fluorescerende genetisch barcode cellen ten behoeve van biologische toepassingen kan alleen worden bereikt wanneer individuele klonale populaties zijn gegenereerd. Multiplexing is het meest effectief wanneer barcode populaties duidelijk te onderscheiden fluorescerende eigenschappen met minimale spectrale overlap. De in figuur 1 met klonale populaties van cellen zoogdiercellen SupT1 voorbeeld illustreert dat barcode cellen met mCherry en cyaan fluorescerend eiwit (CFP) gemakkelijk simultaan kunnen worden geanalyseerd zonder dat hun individuele fluorescerende kenmerken. Deze matrix voorbeeld dus een panel van fluorescerende cellen die genetisch barcode is bruikbaar voor multiplexing biologische toepassingen met een uitlezing in weer een extra beschikbaar kanaal. Om een dergelijk paneel te verkrijgen is het belangrijk om de aard van retrovirale technologie, die zal leiden tot variabele gebieden van fluorescentie intensiteiten binnen de populatie als gevolg van insertie ef onthoudenfecten en / of MOI. Figuur 2 toont dat de eerste transductie van zoogdiercellen met virale deeltjes die hetzij td tomaat of E2 Crimson resulteert in cellen die één van de fluorescente proteïnen of beide tot expressie in diverse intensiteiten (linker paneel). Selectie en sortering van afzonderlijke cellen in platen met 96 putjes zoals door de gated vakjes (midden paneel), kan men strakke klonale populaties na expansie (rechter paneel) te verkrijgen. Een strakke populatie moet worden gedefinieerd als een kleine CV die kunnen variëren afhankelijk van celtype, gewoonlijk 30-40% van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit. Figuur 2 illustreert ook dat een verdere verhoging van het aantal genetisch barcode populaties met een matrix van twee fluorescente eiwitten kan men ook benutten fluorescentie-intensiteit. Algemeen een log afwijken van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit tussen populaties geschikt zijn om voldoende afstand tot elkaar volgende sorteren en amplificatie. Td tomaat werd gekozen in het getoonde voorbeeld deze functie wanneer twee populaties van verschillende intensiteiten, midden en hoog, werden verkregen voor het multiplexen met E2 Crimson op een intensiteit illustreren.
Multiplexing is een krachtig hulpmiddel voor de analyse van vele monsters tegelijkertijd en op het vermogen om gemaskeerde populaties decoderen vergemakkelijken. Verbetering multiplexing kan worden bereikt met nog een derde fluorescent eiwit zoals eGFP, zolang spectrale eigenschappen niet met elkaar interfereren. In de experimentele procedure geïllustreerd in figuur 3 de jury van zes populaties verkrijgbaar td Tomaat en E2 Crimson werd benut voor multiplexing toenemen eGFP. Retrovirale technologie werd gebruikt om de overdracht eGFP de populaties weergegeven in een van de matrices. Wanneer waargenomen in de eGFP kanaal, de niet-green naïeve zes populatie matrix (linksboven in figuur 3) is te onderscheiden van het eGFP-getransduceerdebevolking matrix (linksonder in figuur 3). Belangrijker is, kunnen de panelen in de kanalen bezet door de oorspronkelijke genetische barcode worden geanalyseerd (td Tomaat en E2 Crimson). Hoewel onderscheiden in deze kanalen (vergelijk populaties 1-6 bevolkingsgroepen 7-12 midden panelen, figuur 3), de afzonderlijke populaties kunnen worden geanalyseerd in het eGFP kanaal en gedecodeerd of terug gevolgd, zoals in de histogrammen (rechter panelen Figuur 3). Na herhalen van het proces van transductie, selectie, sorteren en amplificatie, profiteren van de onbezette kanalen nutteloos als juiste compensatie wordt toegepast om te corrigeren voor eventuele spectrale overlap. Om deze bij populaties 1, 2, 3 (niet-groene) en 7, 8, 9 (groen) geanalyseerd in de eGFP en td tomaat kanalen populaties 7 en 8 blijken moeilijk te onderscheiden (linker paneel in figuur 4) . Het is dus noodzakelijk om naïeve cellen (bevolking 1) als een negatieve con kiezentrol zodat de parameters van de apparatuur kan worden ingesteld. Bij het analyseren van elke matrix, vooral met fluoroforen die spectraal overlappen, is het noodzakelijk dat een kleur controles worden gebruikt om de juiste correctiewaarden bepalen. In de analyse van figuur 4 populatie 2 of 3, en 7 dienen dit doel, het mogelijk maakt om de bevolking die echt zijn dubbele positieve beter te definiëren (populatie 8 en 9).
Genetisch barcode cellen met fluorescente merkers behouden hun eigen identiteit, zoals gedefinieerd door hun Biosignatuur, wanneer geanalyseerd in het juiste fluorescerende kanaal met het juiste instrument. Echter, de Biosignatuur wordt gewoon een extra individuele eigendom, tenzij benut voor biologische toepassingen. Om de kracht van fluorescerende genetische barcodes blijken voor het multiplexen besloten we één van onze eerder ontwikkelde assays voor drug discovery introduceren in sommige fluorescerende barcode zoogdiercellijnen. Door dit te doen, tlent genetische barcoding werd benut om drie assays te bereiken in één monster. In deze procedure een scaffold eiwit dat één van de drie vermeende viraal substraat voor proteolyse werd overgebracht in de genetisch barcode cellen. In de assay, wordt splitsing onthuld door het verlies van de FLAG epitoop op het celoppervlak (Figuur 5B). Daarentegen FLAG oppervlak kleuring vertegenwoordigt ontbreken van splitsing Figuur 5 illustreert het resultaat van de analyse van drie verschillende substraten.; HIV-1 envelop wild type (Env wt), HIV-1 envelop mutant (Env mut) en Dengue virus (Denv) prM. Elk van hen werd geïntroduceerd in 1 van de 3 barcode cellijnen, naïef, en 2 anderen gebruik te maken van td Tomaat op verschillende intensiteiten (midden en hoog; figuur 5A). Kleuring voor FLAG oppervlakte-expressie laat zien welke van de substraten gesplitst gebaseerd op de respectievelijke barcode. In het voorbeeld houdt alleen HIV Env mut het FLAG tag (positief volgende kleuring), gezien in de groene-FITC kanaal (figuur 5C, rechts onderste paneel). De analyse van de test kan dus worden uitgevoerd onafhankelijk van de oorspronkelijke barcodes, en verder worden benut decoderen en traceren de verschillende populaties. Deze werkwijze van multiplexing berust dus op een extra kanaal gereserveerd voor de biologische uitlezing plaats.
Figuur 1:. Barcoding voor het multiplexen individuele populaties genetisch barcode met verschillende fluorescente proteïnen zoals mCherry, CFP of beide (linker paneel) kan worden gemengd, geanalyseerd en gedecodeerd (rechter paneel) in hun respectievelijke kanalen via flowcytometrie. Aangepast van Smurthwaite, C. et al., 2014 58. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2:. Sorteren en amplificatie van barcode zoogdiercellen cellen werden geanalyseerd 48 uur na transductie met virale deeltjes die hetzij td tomaat of E2-Crimson (linker paneel). Poorten worden dan ingesteld voor het sorteren naar cellen die td Tomaat op verschillende intensiteiten omvatten, met / out E2-Crimson (middelste paneel). Klonen van de soorten werden versterkt en opnieuw geanalyseerd om een matrix van zes onderscheiden populaties (rechter paneel) te genereren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3:. Decoding openbaart gemaskerde populaties De matrixzes populaties verkregen in Figuur 2 (td Tomaat en / of E2-Crimson) verder kan worden gemanipuleerd om een extra fluorescent eiwit tot expressie zoals eGFP. (A) Het oorspronkelijke matrix, bij analyse in de eGFP kanaal (linker paneel) is negatief en de zes populaties te onderscheiden van elkaar. Elk van de zes populaties kunnen afzonderlijk worden geanalyseerd in het eGFP kanaal zoals in de histogrammen (rechter panelen). (B) Hetzelfde matrix, nu ook eGFP expressie werd geanalyseerd als in A, waaruit nu het groen fluorescerend kenmerk. Aangepast van Smurthwaite, C. et al., 2014 58. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Compensatie zorgt voor een juiste scheiding Een deel van de bevolking oorspronkelijk gekozen op basis van td Tomaat en / of eGFP expressie (populatie 7 en 8) kan niet goed worden gescheiden wanneer ze samen geanalyseerd (linker paneel), tenzij een passende compensatie voor deze kanalen wordt aangepast (rechts. paneel). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5:. Selectie van barcodes cellen voor verdere aanpassing aan de gekozen assay (A) Keuze en aanpassing aan assay keuze. Populaties genetisch barcode met td Tomato verschillende intensiteit (linker paneel) werden gebruikt voor biologische toepassingen. Elk van de populaties werd verder ontworpen om een test die klieving controleert bevatten, Maar een ieder van een ander substraat (bovenste rechter paneel). (B) Afbeelding van de assay. Positieve VLAG vlek geeft het ontbreken van splitsing, terwijl negatieve VLAG vlek geeft splitsing. (C) Analyse van de assay volgende FLAG kleuring. Gemengde populaties worden onderscheiden op basis van de TD Tomato streepjescode maar onderscheiden in het FITC kanaal (linker panelen). Wanneer gekleurd met FLAG-FITC antilichaam, maar een bevolking is positief voor de VLAG. Decodering onthult, op basis van genetische barcoding, dat deze populatie draagt de HIV Env mut substraat (rechter paneel). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier twee goed uitgewerkte procedures zijn gecombineerd; genetische manipulatie door middel van retrovirale technologie en detectie van fluorescerende eiwitten met behulp van flowcytometrie. Fluorescerend eiwit gebaseerde genetische barcode voor de productie van unieke cellijnen verschaft een robuuste en eenvoudige manier voor multiplex toepassingen. Genereren van genetisch gemanipuleerde barcode cellen door retrovirale-technologie, is in eerste instantie een langdurig proces, maar maakt het mogelijk om te verkrijgen, eenmaal vastgesteld, een betrouwbare en stabiele bron van celmateriaal. De aard van deze technologie produceert consequent genetisch aangepaste cellijnen met gestage fluorescerende eigenschappen die hun eigen ware onderscheiden Biosignatuur geworden.
Zowel hechtende en niet-hechtende celtypen kunnen worden barcode gebruikmaking fluorescente eiwitten die gemakkelijk te onderscheiden op basis van hun fysische absorptie / emissie spectra. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot eiwitten zoals CFP, mCherry, E2 Crimson en td tomaat. Zodra genetisch barcode met hun onderscheiden fluorescent eiwit, kunnen ze worden gecombineerd om een panel van celpopulaties opleveren. Belangrijk is dat het paneel bevat celpopulaties met de exacte genotypische make-up, maar alleen onderscheiden door hun fluorescentie eigenschap. Als zodanig zijn deze panelen perfect geschikt voor multiplex toepassingen sterk verbeteren high-throughput mogelijkheden.
Door de verschillende insertie voorkeuren van de retrovirale deeltje in het gastheergenoom, gekoppeld aan verschillen in MOI worden variabele fluorescentie-intensiteiten van de uitgevoerde bijzondere fluorescent proteïne gen verwacht. Analyse van een genetisch gemanipuleerde populatie die een unieke fluorescerend gen zal dus detecteert verschillende expressieprofielen die kan worden gedefinieerd op basis van fluorescentie-intensiteit. Deze differentiële expressie profiel kan worden benut om populaties die spectraal zijn te onderscheiden van elkaar te maken. Men kan dus combine keuze van fluorescente markers met fluorescentie-intensiteit van de experimentele opzet past. Hier matrices van 4, 6, en 12 populaties, waarbij twee panelen 6 populatie van E2 Crimson en td Tomaat, met of zonder eGFP omvatten getoond. In theorie kan dit verder worden uitgebreid met verschillende intensiteiten van eGFP alsook populaties van 3 verschillende fluorescerende eiwitten creëren; elk met verschillende intensiteit gekoppeld. Zoals eerder vermeld, moet rekening worden gehouden bij het kiezen van de fluorescerende eiwitten, om ervoor te zorgen dat de scheiding kan inderdaad worden bereikt. Gekozen eiwitten moeten duidelijke absorptie en emissie spectra hebben; Indien echter twee spectraal onderscheiden maar vergelijkbaar fluorescerende eiwitten worden gebruikt, compensatie moet worden toegepast. Belangrijk juiste compensatie, die zorgt voor de fysieke scheiding van emissie / absorptiespectra tussen verschillende fluoroforen en fluorescente eiwitten, wordt bij het gebruik van geschikte enkele kleur controles vooropsporing via flowcytometrie.
Multiplexing met minder fluorescerende eiwitten maar benutten verschillende intensiteiten bevrijdt extra kanalen die dan verder kan worden benut voor biologische toepassingen van belang. Dit kan flexibiliteit van de proefopstelling verhogen en vereenvoudigen de keuze van de combinatie van fluorescente merkers te gebruiken. Bijvoorbeeld, de gemultiplexte assay figuur 5 voert antilichaam kleuring, in dit geval gekoppeld aan FITC. Aangezien alleen de PE bezet is door genetische barcodes kan men gebruik FITC-geconjugeerde antilichamen of omgekeerd, APC-gekoppelde, een beslissing kan worden gemaakt op basis van de juiste instrumentatie en / of beschikbaarheid antilichaam.
Terwijl de technologische prestaties op het gebied van flowcytometrie, microscopie of gecombineerde methoden zijn indrukwekkend, de bottleneck lijkt de beschikbare celtechnologie voor biologische toepassingen en HTS zijn. Retrovirale techlogie in combinatie met de groeiende aantal fluorescerende eiwitten kunnen worden samengevoegd om deze vraag te beantwoorden. Fluorescerende genetische barcoding vergemakkelijkt drastisch multiplexing, die op hun beurt, voldoet de toenemende behoefte aan uitbreiding HTS mogelijkheden van cel-gebaseerde testen. Genetische barcode leidt tot een robuuste, goedkope en eenvoudige manier te koppelen celgebaseerde proeven met high-throughput methodologieën voor biologische toepassingen en drug discovery. De kracht van het uitvoeren van één in plaats van drie schermen met behulp van een 3-populatie panel heeft gunstige kosten en tijd implicaties. Met de groeiende veelzijdigheid in flowcytometrie, high-gehalte beeldvorming en stroom-cytometrie-gekoppelde microscopie, zal fluorescerende genetische barcoding een consistente, betrouwbare hulpmiddel voor de ontwikkeling van testen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij zouden graag Dr Garry Nolan danken aan de Stanford University voor het verstrekken van de Phoenix GP inpakcellijn voor de productie van retrovirale deeltjes. Wij danken Dr Roger Tsien aan de Universiteit van Californië in San Diego voor het verstrekken van td tomaat. We willen ook graag naar de San Diego State University flowcytometrie Core Facility bedanken voor hun service en hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | used for filtering the virus |
| 0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter | Pall Corporation | 4219 | used for filtering the virus |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 45000-304 | cell growth media for HEK 293T cells |
| PEI (Polyethylenimine) | poly sciences | 23966-2 | 2 mg/ml concentration used |
| Hanging bucket centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5805 000.017 | used for spin infection |
| PBS (phosphate buffered saline) | Corning | 21-040-CV | used for washing of cells |
| Polybrene (hexadimethreen bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration. |
| FACSAria | BD Biosciences | instrument used for sorting cell populations | |
| FACSCanto | BD Biosciences | instrument used for cell analysis | |
| Phoenix-GP | Gift from Gary Nolan | cell line used to produced retroviral particles | |
| Fetal calf serum | Mediatech | MT35015CV | used for cell growth and sorting |
| SupT1 cells | ATCC | CRL-1942 | Human T lymphoblasts |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | cell growth media for SupT1 cells |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527 (1997).
- Godwin, A. R., Stadler, H. S., Nakamura, K., Capecchi, M. R. Detection of targeted GFP-Hox gene fusions during mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13042-13047 (1998).
- Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
- Natarajan, L., Jackson, B. M., Szyleyko, E., Eisenmann, D. M. Identification of evolutionarily conserved promoter elements and amino acids required for function of the C. elegans beta-catenin homolog BAR-1. Dev Biol. 272 (2), 536-557 (2004).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin.Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Valencia-Burton, M., et al. Spatiotemporal patterns and transcription kinetics of induced RNA in single bacterial cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16399-16404 (2009).
- Mahmoud, L., et al. Green fluorescent protein reporter system with transcriptional sequence heterogeneity for monitoring the interferon response.J Virol. 85 (18), 9268-9275 (2011).
- Saunders, M. J., et al. Fluorogen activating proteins in flow cytometry for the study of surface molecules and receptors.Methods. 57 (3), 308-317 (2012).
- Wang, Y. L., Taylor, D. L. Probing the dynamic equilibrium of actin polymerization by fluorescence energy transfer. Cell. 27 (3 Pt 2), 429-436 (1981).
- He, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence (Forster) resonance energy transfer from cyan fluorescent protein to yellow fluorescent protein using single-laser excitation at 458 nm. Cytometry A. 53 (1), 39-54 (2003).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Clayton, A. H., et al. Ligand-induced dimer-tetramer transition during the activation of the cell surface epidermal growth factor receptor-A multidimensional microscopy analysis. J Biol Chem. 280 (34), 30392-30399 (2005).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
- Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Ai, H. W., Shaner, N. C., Cheng, Z., Tsien, R. Y., Campbell, R. E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry. 46 (20), 5904-5910 (2007).
- Mishin, A. S., et al. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry. 47 (16), 4666-4673 (2008).
- Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 48 (31), 5612-5626 (2009).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Klages, N., Zufferey, R., Trono, D. A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther. 2 (2), 170-176 (2000).
- Lai, Z., Brady, R. O. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinanat lentivirus vector. J Neurosci Res. 67 (3), 363-371 (2002).
- Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol Biol. 246, 391-411 (2004).
- Grignani, F., et al. High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein. Cancer Res. 58 (1), 14-19 (1998).
- Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Mol Ther. 2 (5), 458-469 (2000).
- Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6 (3), 127-134 (2000).
- Zhang, X. Y., et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol Ther. 5 (5 Pt 1), 555-565 (2002).
- Rossi, G. R., Mautino, M. R., Morgan, R. A. High-efficiency lentiviral vector-mediated gene transfer into murine macrophages and activated splenic B lymphocytes. Hum Gene Ther. 14 (4), 385-391 (2003).
- Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
- Chan, A. W., Chong, K. Y., Martinovich, C., Simerly, C., Schatten, G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science. 291 (5502), 309-3012 (2001).
- Linney, E., Hardison, N. L., Lonze, B. E., Lyons, S., DiNapoli, L. Transgene expression in zebrafish: A comparison of retroviral-vector and DNA-injection approaches. Dev Biol. 213 (1), 207-2016 (1999).
- Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
- Tiemann, U., et al. Optimal reprogramming factor stoichiometry increases colony numbers and affects molecular characteristics of murine induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 79 (6), 426-435 (2011).
- Leung, A. K., Lamond, A. I. In vivo analysis of NHPX reveals a novel nucleolar localization pathway involving a transient accumulation in splicing speckles. J Cell Biol. 157 (4), 615-629 (2002).
- Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
- Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C.J Cell Biol. 161 (5), 899-909 (2003).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
- Edwards, B. S., Ivnitski-Steele, I., Young, S. M., Salas, V. M., Sklar, L. A. High-throughput cytotoxicity screening by propidium iodide staining. Curr Protoc Cytomt. 9 (Unit 9 24), (2007).
- Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 8 (Unit 8 17), (2007).
- Lu, R., Neff, N. F., Quake, S. R., Weissman, I. L. Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding. Nat Biotechnol. 29 (10), 928-933 (2011).
- Grant, G. D., et al. Live-cell monitoring of periodic gene expression in synchronous human cells identifies Forkhead genes involved in cell cycle control. Mol Biol Cell. 23 (16), 3079-3093 (2012).
- Fiering, S. N., et al. Improved FACS-Gal: flow cytometric analysis and sorting of viable eukaryotic cells expressing reporter gene constructs. Cytometry. 12 (4), 291-301 (1991).
- Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (1991).
- Edwards, B. S., Oprea, T., Prossnitz, E. R., Sklar, L. A. Flow cytometry for high-throughput, high-content screening. Curr Opin Chem Biol. 8 (4), 392-398 (2004).
- Durick, K., Negulescu, P. Cellular biosensors for drug discovery. Biosens Bioelectron. 16 (7-8), 587-592 (2001).
- Edwards, B. S., et al. High-throughput flow cytometry for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 2 (5), 685-696 (2007).
- Sklar, L. A., Carter, M. B., Edwards, B. S. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 7 (5), 527-534 (2007).
- Curpan, R. F., et al. High-throughput screen for the chemical inhibitors of antiapoptotic bcl-2 family proteins by multiplex flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 465-474 (2011).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Trejo, A., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding for multiplex flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 6 (Unit 6 31), (2011).
- Surviladze, Z., Young, S. M., Sklar, L. A. High-throughput flow cytometry bead-based multiplex assay for identification of Rho GTPase inhibitors. Methods Mol Biol. 827, 253-270 (2012).
- Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PLoS One. 8 (1), e53015 (2013).
- Vignali, D. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods. 342 (1-2), 243-255 (2000).
- Hilton, B. J., Wolkowicz, R. An assay to monitor HIV-1 protease activity for the identification of novel inhibitors in T-cells. PLoS One. 5 (6), e10940 (2010).
- Rajakuberan, C., Hilton, B. J., Wolkowicz, R. Protocol for a mammalian cell-based assay for monitoring the HIV-1 protease activity. Methods Mol Biol. 903, 393-405 (2012).
- Smurthwaite, C. A., et al. Fluorescent genetic barcoding in mammalian cells for enhanced multiplexing capabilities in flow cytometry. Cytometry A. 85 (1), 105-113 (2014).
- Stolp, Z. D., et al. A Novel Two-Tag System for Monitoring Transport and Cleavage through the Classical Secretory Pathway - Adaptation to HIV Envelope Processing. PLoS One. 8 (6), e68835 (2013).
- Schwartz, A., et al. Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry. 33 (2), 106-114 (1998).
