Introduction
Tecnologie come spettroscopia di fluorescenza, microscopia a fluorescenza e citometria a flusso, tutti si basano su di fluorescenza, una proprietà ampiamente sfruttato in applicazioni biochimiche, biomediche, e chimici. Fluorescenza, sia intrinseca o tramite l'etichettatura, è stata sfruttata per l'analisi dei pattern di espressione di proteine e profili, destino cellulare, interazioni proteina e le funzioni biologiche 1-9, e attraverso di fluorescenza / Förster trasferimento di energia di risonanza per la rivelazione di interazioni biomolecolari e cambiamenti conformazionali 10-13. Dal momento che l'isolamento del victoria proteina fluorescente verde Aequorea (GFP) 14, la scoperta di proteine fluorescenti aggiuntivi presenti in natura provenienti da altri cnidari, in particolare i coralli, ha ampiamente aumentato il numero di proteine fluorescenti esistenti con spettri di eccitazione / emissione distinguibili. Questi, insieme con l'introduzione di mutazioni nei loro geni 15-19, HAVe ulteriormente ampliato le possibilità, ottenendo una vera tavolozza di proteine fluorescenti a disposizione degli scienziati che sfruttano la microscopia, citometria a flusso e altre tecnologie basate sulla fluorescenza per le loro ricerche.
In parallelo, anche se in maniera indipendente, lo sviluppo della tecnologia ha drasticamente retrovirale facilitato l'espressione stabile di informazioni genetiche ectopica in cellule di mammifero 20-23. Non è quindi sorprendente che questa tecnologia è stata utilizzata per trasferire geni di proteine fluorescenti in un ampio numero di tipi di cellule e tessuti 24-28 o per la produzione di animali transgenici 29-31. Seguendo la natura dei retrovirus, l'informazione genetica della proteina fluorescente ectopica viene introdotto all'interno del genoma della cella 32 e la cella diventa fluorescente `per ever'. La struttura, ha permesso il monitoraggio del destino delle cellule, o di una singola cella all'interno di una popolazione di cellule. La cella ora fluorescente così acquicolore rosso proprio BioSignature e può essere definito come codice a barre. La sua unica BioSignature identifica da altre cellule, e, soprattutto, la distingue dalle cellule geneticamente manipolate per esprimere proteine fluorescenti diversi con spettri di assorbimento / emissione distinguibili. Applicazioni biologiche quali il monitoraggio dei fattori di riprogrammazione verso pluripotency 33, l'analisi dei fattori subnucleari per la delucidazione della localizzazione nucleolare 34, la costruzione dei plasmidi reporter fluorescenti per studi trascrizionali 35 o l'etichettatura genetica dei neuroni per lo studio di architettura di rete neuronale 36 , sono solo quattro esempi dei molti che hanno sfruttato diversi geni di proteine fluorescenti per lo stesso apparato sperimentale.
La citometria a flusso è stato ampiamente utilizzato per l'analisi dei processi biologici a livello di singola cellula, come l'espressione genica, ciclo cellulare, apoptosi, e segnalazione attraverso fosforilzione 37-43 .Il espressione stabile di geni di proteine fluorescenti in cellule di mammifero ha ulteriormente migliorato l'utilità di citometria a flusso per l'analisi delle cellule 38,44 e ligando-recettore interazioni 45. Capacità avanzate hanno permesso di citometria a flusso per diventare una metodologia ampiamente utilizzata per high-throughput e alto contenuto di screening 46. Nonostante il numero ampliato di fluorometers e robotica tecnologie che possano sistemi per la lettura paio piastre, imaging e citometria a flusso, sembra che ci sia una mancanza di disegno sperimentale che può sfruttare e montare queste capacità tecnologiche avanzate.
Metodologie basate sulle cellule veloci, affidabili, semplici e robuste sono drasticamente necessari per le applicazioni canalizzate che migliorano ulteriormente la capacità high-throughput. Questo è particolarmente vero nel campo della scoperta di farmaci in cui saggi cellulari di ingegneria in un formato multiplex può migliorare la potenza di high-throughput di screening 39,47-50 51-54. Barcoding genetica fluorescente permette non solo elegante multiplexing, ma anche, una volta costruito, elude la necessità di protocolli in termini di tempo, riduce i costi accompagnate da anticorpi, perline e macchie 39,52,55, e può ridurre il numero di schermi necessari per alto applicazioni di throughput. Abbiamo recentemente descritto come la tecnologia può migliorare retrovirale multiplexing attraverso barcoding genetica fluorescente per applicazioni biologiche, esprimendo un test precedentemente sviluppato per monitorare HIV-1 proteasi 56,57 con diverse varianti clinicamente prevalenti 58. La metodologia è illustrata in modo più descrittivo concentrandosi su come selezionare e amplificare le celle a barre geneticamente fluorescenti e come produrre pannelli di popolazioni clonali che esprimono proteine fluorescenti distinte e / o diversa intensit fluorescenzaIES. Pannelli di popolazioni di cellule distinguibili in base alle loro caratteristiche fluorescenti aumentano funzionalità multiplexing, che possono essere ulteriormente sfruttati in combinazione con saggi cellulari che affrontano diverse questioni biologiche. Il protocollo inoltre descritto come ingegnere di un gruppo di cellule con codice a barre che recano uno dei saggi cellulari precedentemente sviluppate in laboratorio, come ad esempio 59. Questo protocollo non è quindi lo scopo di mostrare la consolidata tecnologia retrovirale / lentivirali per il trasferimento genetico, il valore delle proteine fluorescenti o le applicazioni di citometria a flusso 60,48 ma piuttosto per mostrare la potenza migliorando di combinare tre per le applicazioni canalizzate.
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Protocol
1. Preparazione di cellule di mammifero, produzione virale e trasduzione per codici a barre genetico
- Tavola 2.5 x 10 6 cellule aderenti in un piatto di 10 cm (o intorno 50-60% confluenza) un giorno prima di trasfezione in Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con siero di vitello fetale del 10% (FCS). Per retrovirale uso di produzione imballaggi linea cellulare di scelta, come Phoenix-GP (un gentile dono da Gary Nolan, Stanford University).
NOTA: La linea cellulare di packaging esprime stabilmente Gag e Pol proteine per la formazione di particelle retrovirali in trans. Assicurarsi cellule sono sani e aderito alla piastra in un monostrato, prima trasfezione. - 24 ore più tardi, preparare la miscela di trasfezione DNA.
- Per 125 ml di DMEM senza siero aggiungere 3 g Busta Virus stomatite vescicolare vettore glicoproteina (PCI-VSVG) e 3 mg di trasferimento vettore che trasporta il gene della proteina fluorescente di interesse. Mescolare e aggiungere 15 ml di polyethylimine (2 mg / ml).
- Incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 min e aggiungere alle cellule goccia a goccia.
NOTA: Polyethylimine viene aggiunto alla miscela omogenea DNA come reagente di trasfezione per la formazione di polyplexes. Al fine di ottenere particelle virali che trasportano diversi marcatori proteici fluorescenti, eseguire ogni trasfezione indipendentemente con il marcatore di scelta. Ricordate che il trasferimento vettore retrovirale è di circa 7 Kb di lunghezza e non può essere confezionato se superiori a 10 kb.
- Incubare le piastre a 37 ° C. Per aumentare virali Consiglio produzione piastre a 30 ° C invece o 32 ° C.
NOTA: 24 mezzi trasfezione hr postali possono essere sostituiti con 7 ml di mezzi freschi, e anche se questo può migliorare la salute delle cellule che possono diminuire la carica virale nel surnatante. - 48 ore dopo la trasfezione raccogliere le particelle virali-surnatante contenente e filtrare con un filtro da 0,45 micron politetrafluoroetilene. Utilizzare surnatante virale raccolto di recente per la trasduzione. Othaltri- mantenere surnatante in aliquote a -80 ° C ed evitare di gelo-disgelo. Ricorda che titolo virale diminuirà probabilmente fino al 50% con ogni ciclo di congelamento-scongelamento.
- Linea cellulare Piatto di scelta 24 ore prima della trasduzione se aderenti, o immediatamente prima trasduzione se non aderente. Seed 2.0 x 10 5-3,0 x 10 5 cellule aderenti (qui Huh 7.5.1 e HEK 293T) o 5,0 x 10 5 a 1 x 10 6 cellule non aderenti (qui SupT1) per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti.
NOTA: Assicurarsi di calibrare il numero di cellule per essere seminati prima trasduzione, specialmente per cellule aderenti, cellule così raggiungere una confluenza di circa il 60% al momento della trasduzione. - Aggiungere 5 mg / ml Polybrene (hexadimethrene bromuro) a cellule seminate e poi aggiungere surnatante virale precedentemente raccolti per ottenere intorno al 20-40% di infezione (qui 2 ml).
NOTA: Il MOI o la percentuale di infezione è in gran parte arbitraria, in quanto l'ordinamento consente di amplificare qualsiasi subpopulatione delle cellule. Ovviamente, un più alto tasso di infezione facilita e velocizza il processo di amplificazione. - Trasdurre cellule mediante centrifugazione in un rotore secchio appeso a 1.500 xg per 120 min a 32 ° C. Risospendere le cellule non aderenti con mezzi freschi prima dell'incubazione. Per le cellule aderenti, sostituirlo con fresco supporti 24 ore post-trasduzione.
NOTA: Si raccomanda di sigillare le piastre prima della centrifugazione con parafilm per evitare fuoriuscite sopra. Per aumentare la diversità delle cellule geneticamente con codice a barre, trasdurre cellule con particelle virali che trasportano le proteine fluorescenti diversi (ottenuti dal punto 1.4). Quando si sceglie marcatori fluorescenti, assicurarsi che siano compatibili con la strumentazione e hanno parametri fluorescenti distinguibili.
2. Selezione e Amplificazione delle Cellule geneticamente con codice a barre
- Analizzare le cellule di mammifero trasdotte mediante citometria di flusso di almeno 72 ore dopo la trasduzione per quantificare la percentuale di trasduzione. Utilizzare una linea paragonabile cellule non trasdotte come controllo negativo.
NOTA: Come ordinamento verrà utilizzata per purificare singole popolazioni cellulari a barre, una percentuale elevata di trasduzione iniziale, mentre non necessario, dovrebbe accelerare il processo di amplificazione. - Utilizzare la cellula-sorter di scelta per ottenere le cellule che esprimono la proteina di interesse.
- A tal fine, verificare le porte siano impostati correttamente nei canali giusti.
- Per fare ciò utilizzare la stessa linea cellulare naive come controllo negativo e impostare la tensione parametro / canale in modo che la popolazione negativo è inferiore al valore di 10 3 su ciascun asse fluorescente. Determinare gating per fluorescenza positiva come eventi che appaiono sopra quella del controllo negativo per ciascun canale fluorescente.
- Essere consapevoli del fatto che ogni strumento può variare e la tensione corretta per determinare gating deve essere adeguato di conseguenza, rendendo i controlli positivi e negativi in ogni imperativi expinstallazione erimental.
- Per il rilevamento della fluorescenza in questo setup sperimentale utilizzare il canale FITC (530/30 filtro passa banda proceduto da una lunga filtro passa 502) per eGFP, il canale di PE (585/42 filtro passa banda proceduto da un filtro 556 passaggio lungo) per td Tomato , e il canale di APC (660/20 filtro passa banda) per E2 Crimson.
NOTA: Il laser 488 nm eccita eGFP e td pomodoro mentre E2 Crimson è eccitato dal laser 633 nm.
- Per il rilevamento della fluorescenza in questo setup sperimentale utilizzare il canale FITC (530/30 filtro passa banda proceduto da una lunga filtro passa 502) per eGFP, il canale di PE (585/42 filtro passa banda proceduto da un filtro 556 passaggio lungo) per td Tomato , e il canale di APC (660/20 filtro passa banda) per E2 Crimson.
- A tal fine, verificare le porte siano impostati correttamente nei canali giusti.
- Ordina in 15 ml provette coniche con 1 ml di 100% FCS.
NOTA: Il processo di smistamento popolazioni di cellule fluorescenti non è obbligatoria, come si può procedere direttamente con il tipo di singoli cloni (vedi sotto). Ordinamento popolazioni strette basate sulla fluorescenza scelta garantisce una popolazione di backup per la futura selezione dei singoli cloni. Tenere presente che le cellule individuali sono talvolta difficili a crescere, mentre una grande popolazione di cellule può essere facilmente congelato, e poi scongelato e amplificato in una fase successiva. - Spin giù per le popolazioni ordinati in un rotore di centrifuga appeso secchio a 524 g a 32 ° C per 5 minuti per far sedimentare le cellule. Risospendere in 1 ml di mezzi freschi, e ri-piastra cellule in modo che confluenza cella è inferiore al 60% per consentire la crescita e la divisione per almeno due giorni.
- Ad esempio, piastra cellule aderenti a circa 3 x 10 5 cellule in 2 ml di media per bene in un 6-pozzetti e 2 x 10 6 cellule in 2 ml di media in un 6 centimetri. Utilizzare DMEM per cellule aderenti e RPMI per le cellule non aderenti (o qualsiasi supporto specificato, se necessario). Inserire cellule piastrate in un incubatore a 37 ° C per diversi giorni per consentire l'amplificazione.
3. Ottenere clonali popolazioni di cellule geneticamente con codice a barre a diverse intensità
- Ottenere popolazioni clonali di cellule originariamente trasdotte (punto 1.7) o dalla popolazione ordinata (punto 2.3).
NOTA: Ciò garantirà livello uguale o simile di espressione proteina fluorescente fra tutti la cellas all'interno della popolazione (una popolazione stretto con una piccola CV in media intensità di fluorescenza di fino al 40%).- A tal fine, le cellule singole specie in piastre da 96 pozzetti con una unità di deposizione delle cellule automatizzato (ACDU). Set porte per l'ordinamento in base alle popolazioni di interesse. Assicurarsi che cancelli sono fissati almeno un log scala a parte per ottenere popolazioni distinguibili quando si sceglie cellule a diverse intensità di fluorescenza. Per la procedura qui illustrato, utilizzare la stessa citofluorimetria sperimentale impostato come quello descritto nel passaggio 2.2.
- Amplifica singoli cloni in un incubatore a 37 ° C per almeno 2 settimane. Attraverso il processo di amplificazione analizzare le cellule sotto il microscopio per garantire che le popolazioni crescenti derivano da singole cellule e non da più di uno.
NOTA: Ricordare che la selezionatrice inserirà una cella per pozzetto in media, e mentre alcuni pozzetti non possono avere qualsiasi cella affatto, altri possono avere più di una.- Per garantire che un popopo- deriva da una cellula sola, essere estremamente gentile con la piastra e non disturbare i pozzetti pipettando. Osservare la piastra, così da bene, al microscopio.
NOTA: Mentre le cellule individuali possono a volte essere difficili da identificare, una volta che iniziano dividendo che sarà facilmente riconoscibile. - Essere consapevoli del fatto che spesso cellule 'gruppo' lungo i bordi. Eliminare quei pozzi, dove si possono osservare diverse popolazioni clonali e mantenere quelle che hanno una popolazione stretto.
NOTA: Si consiglia di trasferire in piastre quelli più grandi per l'amplificazione.
- Per garantire che un popopo- deriva da una cellula sola, essere estremamente gentile con la piastra e non disturbare i pozzetti pipettando. Osservare la piastra, così da bene, al microscopio.
- Schermo popolazioni clonali putativi analizzando loro mediante citometria a flusso. Confronta loro di un controllo negativo utilizzando la stessa citometria a flusso setup sperimentale.
- Analizzare solo una percentuale del campione e mantenere il resto come backup. Scegli le popolazioni più nettamente separati in base intensità media e la tenuta della popolazione. Amplificarli come necessario o congelare le scorte incongelamento supporti con 20% glicerolo a -80 ° C per brevi periodi di tempo o azoto liquido per più.
NOTA: Ricordate che un 'vero' popolazione clonale dovrebbe avere un modello di fluorescenza molto stretto.
- Analizzare solo una percentuale del campione e mantenere il resto come backup. Scegli le popolazioni più nettamente separati in base intensità media e la tenuta della popolazione. Amplificarli come necessario o congelare le scorte incongelamento supporti con 20% glicerolo a -80 ° C per brevi periodi di tempo o azoto liquido per più.
4. Garantire capacità multiplexing per High Throughput Screening (HTS)
- Combinare come molte popolazioni clonali distinte come necessario che può essere ulteriormente utilizzato in un formato multiplexati. Scegli cloni con distinguibile assorbimento / spettri di emissione e / o intensità diverse. Se viene utilizzato un formato di piastra a 96 pozzetti, che è adatto per HTS, seme 50.000 cellule in 200 microlitri per pozzetto.
NOTA: tenere presente che il numero di cellule è solo una stima e può variare in base a tipo cellulare e se è aderente o meno. - Analizzare il campione usando citometria a flusso per garantire che ciascuna delle linee cellulari fluorescenti indipendenti stabiliti possono essere distinte tra loro. Prima dell'analisi preparare negativee controlli singoli colori per impostare i parametri ei valori di compensazione.
NOTA: L'impostazione dei parametri per distinguere chiaramente le popolazioni miste li permetterà di essere ulteriormente utilizzato in un formato multiplex.
5. Adattare linee cellulari geneticamente con codice a barre per l'applicazione biologica della scelta
- Trasdurre stabilite linee cellulari geneticamente di codici a barre con particelle virali che contengono gli elementi di analisi di scelta, come descritto qui in Stolp et al., 2013 59. Ricordare che il saggio di scelta dovrebbe occupare un canale fluorescente aggiuntivo e distinguibili e quindi deve essere trasferito alla linea cellulare appropriata codice a barre.
NOTA: Ogni linea cellulare codice a barre può sopportare un test diverso. - Celle a barre Ordina geneticamente fluorescenti per quelli che contengono elementi di analisi.
NOTA: Elementi test può essere progettati accoppiato ad un tag o proteina fluorescente (come una fusione o tramite un sito di entrata ribosoma interna) fo il rilevamento diretto attraverso western blotting, citofluorimetria e microscopia. Il sistema utilizzato in questo protocollo si basa su HA espressione di superficie epitopi da solo, o con l'aggiunta di espressione FLAG epitopi.- Colorare le popolazioni clonali contenenti i test con gli anticorpi accoppiati HA e APC-modo fluorescente. Poi analizzare le popolazioni clonali con anti-FLAG e FITC-coniugato colorazione anticorpi.
- Per rintracciare il test, analizzare o 'decodificare' le popolazioni del canale appropriato caso è possibile distinguere le linee cellulari geneticamente distinte di codici a barre. Qui, decodificare la natura del substrato analizzando nel canale PE per td rilevamento pomodoro.
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Representative Results
Multiplexing fluorescenti geneticamente codice a barre cellule a fini di applicazioni biologiche possono essere realizzati solo dopo che siano stati generati singole popolazioni clonali. Multiplexing è più efficace quando le popolazioni di codici a barre hanno caratteristiche distinte fluorescenti nitide con il minimo sovrapposizione spettrale. L'esempio illustrato nella figura 1 con popolazioni clonali di cellule di mammifero SupT1 illustra che le cellule a barre con mCherry e proteina fluorescente ciano (PCP) possono essere facilmente analizzati simultaneamente senza perdere le loro caratteristiche fluorescenti individuali. Questa matrice esemplifica quindi un gruppo di cellule geneticamente di codici a barre fluorescenti che è utilizzabile per applicazioni biologiche multiplazione con una lettura in ancora un ulteriore canale disponibile. Per ottenere un tale pannello è importante ricordare la natura della tecnologia retrovirale, che porterà a intervalli variabili di intensità di fluorescenza di popolazione a causa ef inserzionaledifetti e / o MOI. La Figura 2 illustra che trasduzione iniziale di cellule di mammifero con particelle virali contenenti sia td pomodoro o E2 Scarlatti risultati in cellule che esprimono uno o entrambi delle proteine fluorescenti ad una vasta gamma di intensità (pannello di sinistra). Selezione e cernita di singole cellule in piastre da 96 pozzetti come indicato dalle scatole chiuse (metà del pannello), permette di ottenere popolazioni clonali stretti seguenti espansione (pannello di destra). Una popolazione tenuta dovrebbe essere definita come avente un piccolo CV che può variare in base al tipo di cellula, normalmente 30-40% di intensità media di fluorescenza. Figura 2 illustra inoltre che per aumentare ulteriormente il numero di popolazioni geneticamente codice a barre con una matrice di solo due fluorescenti proteine, si può anche sfruttare le intensità di fluorescenza. In generale, una deviazione di registro nella fluorescenza media tra le popolazioni è adatto per realizzare la separazione adeguato tra loro successivo smistamento e amplificazione. Td Tomato stato scelto nell'esempio mostrato per illustrare questa caratteristica, dove due popolazioni di diversa intensità, medie ed alte, sono stati ottenuti per multiplexing con E2 Cremisi in un singolo intensità.
Multiplexing è un potente strumento per facilitare l'analisi di molti campioni allo stesso momento e per la capacità di decodificare popolazioni mascherati. Migliorare multiplexing può essere ottenuto con una terza proteina fluorescente come eGFP, purché le proprietà spettrali non interferiscano tra loro. Nella procedura sperimentale illustrata in figura 3 il gruppo di sei popolazioni ottenuti con td pomodoro e E2 Crimson stata sfruttata per aumentare multiplexing con eGFP. La tecnologia retrovirale è stato usato per trasferire eGFP alle popolazioni rappresentate in una delle matrici. Quando osservate nel canale eGFP, l'ingenuo matrice di sei-popolazione non-verde (pannello in alto a sinistra nella figura 3) si confonde con l'eGFP trasdotteMatrice popolazione (pannello inferiore sinistro in figura 3). È importante sottolineare che i pannelli possono essere analizzati nei canali occupati dal codice a barre genetico originale (td Pomodoro e E2 Crimson). Mentre indistinguibile in questi canali (confrontare popolazioni 1-6 con le popolazioni 7-12 in pannelli metà, Figura 3), le singole popolazioni possono essere analizzati nel canale eGFP, e decodificati o monitorati indietro, come mostrato nelle istogrammi (pannelli di destra in Figura 3). Dopo aver ripetuto il processo di trasduzione, selezione, cernita, e l'amplificazione, sfruttando i canali non occupati è inutile se giusto risarcimento non viene applicata per regolare possibile sovrapposizione spettrale. Per dimostrare questo, quando le popolazioni 1, 2, 3 (non verde) e 7, 8, 9 (verde) sono analizzati nel eGFP e TD canali pomodoro, popolazioni 7 e 8 sono difficili da distinguere (pannello di sinistra in figura 4) . E 'quindi necessario scegliere le cellule naïve (popolazione 1) come con negativoTrol modo che i parametri della strumentazione possono essere impostati. Analizzando qualsiasi matrice, soprattutto con fluorofori che spettralmente sovrappongono, è imperativo che i controlli singoli colori vengono utilizzati per determinare i valori di compensazione corretti. Nell'analisi della figura 4 popolazioni 2 o 3, e 7 servire a questo scopo, permettendo di definire meglio popolazioni che sono veramente doppia positivi (popolazioni 8 e 9).
Cellule geneticamente di codici a barre con marcatori fluorescenti mantengono la propria identità come definito da loro BioSignature, se analizzato nel canale fluorescenti destra con lo strumento giusto. Tuttavia, il BioSignature diventa solo una singola proprietà aggiuntiva a meno sfruttata per applicazioni biologiche. Al fine di dimostrare la potenza di barcoding genetica fluorescente per multiplexing abbiamo deciso di introdurre uno dei nostri test precedentemente sviluppato per la scoperta di farmaci in alcune delle linee cellulari di mammiferi codice a barre fluorescenti. In questo modo, flent barcoding genetica è stata sfruttata per raggiungere tre saggi in un campione. In questa procedura una proteina scaffold contenente uno dei tre substrato virale putativa di proteolisi è stato trasferito in cellule geneticamente di codici a barre. Nel saggio, scissione viene rivelata dalla perdita della epitopo FLAG sulla superficie cellulare (Figura 5B). Al contrario, la colorazione superficiale FLAG rappresenta la mancanza di scissione Figura 5 illustra il risultato dell'analisi di tre differenti substrati.; HIV-1 Busta wild type (WT Env), HIV-1 mutante Envelope (Env mut), e Dengue Virus (DENV) PRM. Ognuno di loro è stato introdotto in 1 su 3 linee di codice a barre cellulari, ingenuo, e altri 2 che utilizzano td Pomodoro a diverse intensità (media e alta; Figura 5A). Colorazione per espressione di superficie FLAG rivela che dei substrati è stato scisso basata sul rispettivo codice a barre. Nell'esempio unico HIV Env mut mantiene il tag FLAG (positivo seguente colorazione), come si è visto nel verde-FITC canale (Figura 5C, pannello in basso a destra). L'analisi del dosaggio può quindi essere eseguita indipendentemente dal barcoding originale, ed essere ulteriormente sfruttata per decodificare e rintracciare le popolazioni distinte. Questo metodo di multiplexing basa quindi su un ulteriore canale riservato per la lettura biologica di interesse.
Figura 1:. Barcoding per multiplexing popolazioni individuo geneticamente di codici a barre con proteine fluorescenti distinti quali mCherry, CFP o entrambi (pannello di sinistra) possono essere mescolati, analizzato e decodificato (pannello di destra) nei loro rispettivi canali via citometria a flusso. Adattato da Smurthwaite, C. et al., 2014 58. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Ordinamento e l'amplificazione delle cellule barcode cellule di mammifero sono state analizzate 48 ore dopo trasduzione con particelle virali contenenti sia td pomodoro o E2-Crimson (pannello di sinistra). Gates vengono impostati per l'ordinamento per includere cellule esprimenti td Pomodoro a diverse intensità, con / out E2-Crimson (pannello centrale). Cloni dei tipi sono stati amplificati e ri-analizzati per generare una matrice di sei popolazioni distinguibili (pannello di destra). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Decodifica rivela popolazioni mascherati La matricedi sei popolazioni ottenuti in figura 2 (td di pomodoro e / o E2-Crimson) può essere ulteriormente studiato per esprimere una proteina fluorescente aggiuntivi come eGFP. (A) La matrice originale, se analizzato nel canale eGFP (pannello di sinistra) è negativa e sei popolazioni sono indistinguibili tra loro. Ciascuna delle sei popolazioni può essere analizzata indipendentemente nel canale eGFP come mostrato negli istogrammi (pannelli destra). (B) La stessa matrice, ora esprime anche eGFP, è stato analizzato come in A, rivelando ora loro caratteristica verde fluorescente. Adattato da Smurthwaite, C. et al., 2014 58. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Compensation assicura la separazione corretta Alcune delle popolazioni scelti in base originariamente td Pomodoro e / o espressione eGFP (popolazioni 7 e 8) non può essere adeguatamente separati se analizzato insieme (pannello di sinistra) a meno che una compensazione adeguata per questi canali è regolato (a destra. pannello). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:. Selezione di celle con codici a barre per l'ulteriore adeguamento del dosaggio prescelto (A) Selezione e adattamento al dosaggio di scelta. Le popolazioni geneticamente di codici a barre con td pomodoro a diverse intensità (pannello in alto a sinistra) sono stati utilizzati per le applicazioni biologiche. Ognuna delle popolazioni è stato ulteriormente progettati per contenere un metodo che monitora scissione, Ma ognuno di un substrato diverso (pannello superiore destra). (B) Rappresentazione del test. Macchia FLAG positivo indica la mancanza di scissione mentre macchia FLAG negativo indica scissione. (C) Analisi del test seguente FLAG colorazione. Popolazioni miste sono distinguibili sulla base del codice a barre td Tomato ma indistinguibili nel canale FITC (pannelli a sinistra). Quando colorate con anticorpi FLAG-FITC, solo una popolazione è positiva per FLAG. Decodifica rivela, sulla base di codici a barre genetico, che questa popolazione porta il substrato mut HIV Env (pannello di destra). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui sono stati combinati due procedure consolidate; l'ingegneria genetica attraverso la tecnologia retrovirali e l'individuazione di proteine fluorescenti che utilizzano citometria a flusso. Codici a barre a base di proteine fluorescenti genetica per la produzione di linee cellulari uniche fornisce un modo semplice e affidabile per applicazioni multiplex. Generazione di codici a barre cellule geneticamente modificate attraverso la tecnologia retrovirale, è inizialmente un processo lungo, ma permette di ottenere, una volta costituita, una fonte affidabile e stabile di materiale cellulare. La natura di questa tecnologia produce costantemente linee cellulari geneticamente con caratteristiche costanti che diventano fluorescenti proprio vero BioSignature distinguibili.
Entrambi i tipi di cellule aderenti e non aderenti possono essere di codice a barre utilizzando proteine fluorescenti che sono facilmente distinguibili sulla base della loro spettri di assorbanza / emissione fisica. Questi includono, ma non sono limitati a proteine come PCP, mCherry, E2 Crimson e td pomodoro. Una volta geneticamente con codice a barre con la loro proteina fluorescente distinguibili, possono essere combinati per produrre un pannello di popolazioni cellulari. È importante sottolineare che il pannello contiene popolazioni di cellule con l'esatta genotipica make-up, ma differenziati solo per la loro caratteristica di fluorescenza. In quanto tali, questi pannelli sono perfettamente adatti per le applicazioni canalizzate, migliorando notevolmente le capacità high-throughput.
A causa delle diverse preferenze inserzionali della particella retrovirale nel genoma dell'ospite, insieme con le differenze di MOI, si prevede intensità di fluorescenza variabile dal particolare gene proteina fluorescente effettuata. Analisi di una popolazione geneticamente trasportano un gene fluorescente unica sarà quindi rilevare una gamma di profili di espressione che possono essere definiti sulla base dell'intensità di fluorescenza. Questo profilo di espressione differenziale può essere sfruttata per creare popolazioni che sono spettralmente distinti l'uno dall'altro. Si può quindi combine scelta di marcatori fluorescenti con intensità di fluorescenza per adattarsi al design sperimentale. Qui, matrici di 4, 6, e 12 le popolazioni, che comprendono due 6 pannelli di popolazione di E2 Crimson e td pomodoro, con o senza eGFP, vengono visualizzati. In teoria, questo può essere ulteriormente espansa con diverse intensità di eGFP nonché per creare popolazioni di 3 proteine fluorescenti differenti; ognuno con differenti intensità ad esso associati. Come affermato in precedenza, occorre tener nella scelta proteine fluorescenti per garantire che la separazione può infatti essere raggiunto. Proteine scelti devono avere assorbanza distinto e spettri di emissione; tuttavia, quando si utilizzano due proteine fluorescenti spettralmente distinguibili, ma simili, la compensazione dovrebbe essere applicata. È importante sottolineare che la corretta compensazione, che permette la separazione fisica di emissione / assorbanza spettri tra differenti fluorofori o proteine fluorescenti, si ottiene con l'uso di appropriati controlli singoli colori perrilevamento tramite citometria a flusso.
Multiplexing con meno proteine fluorescenti ma sfruttando una varietà di intensità libera canali aggiuntivi che possono essere poi ulteriormente sfruttati per l'applicazione biologica di interesse. Ciò può aumentare la flessibilità del set-up sperimentale e semplificare la scelta della combinazione di marcatori fluorescenti da utilizzare. Ad esempio, il test multiplato di figura 5 si basa su anticorpi colorazione, in questo caso accoppiato al FITC. Poiché solo il canale PE è occupata da codici a barre genetica, si possono utilizzare anticorpi FITC-coniugati, o viceversa, APC accoppiati, una decisione che può essere effettuata in base alla strumentazione appropriata e / o la disponibilità di anticorpi.
Mentre le conquiste tecnologiche nel campo della citometria a flusso, microscopia o metodologie combinate sono impressionanti, il collo di bottiglia sembra essere la tecnologia delle celle a disposizione per le applicazioni biologiche e HTS. Retrovirale tecnologialogia accoppiato con il numero crescente di proteine fluorescenti possono essere uniti per rispondere a questa domanda. Barcoding genetica fluorescente facilita notevolmente multiplexing, che a sua volta, risponde alla crescente necessità di espandere le capacità di HTS saggi cellulari. Barcoding genetica porta ad un robusto, economico e semplice modo per saggi cellulari coppia con metodologie high-throughput per applicazioni biologiche e droghe. Il potere di eseguire uno piuttosto che a tre schermi con un pannello di 3 popolazione ha costi benefici e sulle implicazioni temporali. Con la crescente versatilità in citometria a flusso, imaging ad alta contenuto e la microscopia citometria a flusso accoppiato, codici a barre genetico fluorescenza sarà uno strumento sempre affidabile per lo sviluppo del test.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dott Garry Nolan dalla Stanford University per la fornitura della linea cellulare di packaging Phoenix GP per la produzione di particelle retrovirali. Ringraziamo il Dr. Roger Tsien presso l'Università della California a San Diego per la fornitura di td Tomato. Vorremmo anche ringraziare il Fondo San Diego State University Citometria a flusso di base per il loro servizio e aiuto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | used for filtering the virus |
| 0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter | Pall Corporation | 4219 | used for filtering the virus |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 45000-304 | cell growth media for HEK 293T cells |
| PEI (Polyethylenimine) | poly sciences | 23966-2 | 2 mg/ml concentration used |
| Hanging bucket centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5805 000.017 | used for spin infection |
| PBS (phosphate buffered saline) | Corning | 21-040-CV | used for washing of cells |
| Polybrene (hexadimethreen bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration. |
| FACSAria | BD Biosciences | instrument used for sorting cell populations | |
| FACSCanto | BD Biosciences | instrument used for cell analysis | |
| Phoenix-GP | Gift from Gary Nolan | cell line used to produced retroviral particles | |
| Fetal calf serum | Mediatech | MT35015CV | used for cell growth and sorting |
| SupT1 cells | ATCC | CRL-1942 | Human T lymphoblasts |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | cell growth media for SupT1 cells |
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