Introduction
이러한 형광 분광법, 형광 현미경 및 유동 세포 계측법 같은 기술은, 모두 형광에 의존 속성은 널리, 생화학 생물 의학, 화학 응용 프로그램에서 악용. 형광 극한 또는 라벨링을 통해 단백질 발현 패턴과 프로필, 세포의 운명, 단백질 결합 및 생물학적 기능 1-9의 분석을 위해 이용하고,되었는지 생체 분자 상호 작용 및 구조 변화의 검출을위한 형광 / 포스터 공명 에너지 전이를 통한 10-13. 빅토리아 (Aequorea victoria) 녹색 형광 단백질 (GFP) (14)의 분리 이후, 다른 자포 동물, 특히 산호로부터 추가 천연 형광 단백질의 발견은, 크게 구별 여기 / 발광 스펙트럼을 가진 기존의 형광 단백질의 수가 증가하고있다. 이 함께 유전자 15-19의 돌연변이의 도입으로, 근래전자는 또한 자신의 연구를위한 세포 계측법 및 기타 형광 기반 기술 흐름, 현미경을 이용 과학자 사용할 수 형광 단백질의 진정한 표를 획득, 가능성을 확장했다.
이와 병행하여, 독립적이지만, 레트로 바이러스 기술의 개발이 크게 포유 동물 세포에서 20-23 이소성 유전 정보의 발현 안정성을 촉진했다. 그것은이 기술은 세포 및 조직 유형의 24-28 넓은 수로 29-31 또는 형질 전환 동물의 생산을위한 형광 단백질 유전자를 전송하기 위해 사용되었는지 따라서 놀라운 일이 아니다. 레트로 바이러스의 성질에 따라, 자궁외 형광 단백질의 유전 정보는 셀 (32)의 게놈 내에 도입되고, 셀에 대한 '형광 ever'된다. 이 속성은 세포 운명의 추적을 허용, 또는 세포 집단 내에서 단일 셀의했다. 지금 형광 세포 따라서 아퀴있다자신의 biosignature 빨간색과 바코드로 정의 할 수 있습니다. 독특한 biosignature 다른 세포를 식별하고, 중요한 것은 유 전적으로 구별 흡수 / 방출 스펙트럼과 다른 형광 단백질을 표현하기 위해 조작 된 세포를 구분합니다. 이러한 다 능성 33 향해 리 프로그래밍 인자 트래킹 생물학적 응용 핵소체 지역화 34 해명 용 subnuclear 요인 분석, 전사 연구 35 또는 신경 네트워크 구조 (36)의 연구 뉴런의 유전 표지 용 형광 리포터 플라스미드의 구성 같은 실험 장치에 대해 서로 다른 형광 단백질 유전자를 악용 한 그 많은 단지 네 가지 예입니다.
계측법 대체로 이러한 유전자 발현, 세포주기, 아폽토시스 같은 단일 세포 수준에서의 생물학적 과정의 분석을 위해 이용하고, 포스 포릴 통해 시그널링 된 흐름포유 동물 세포에 형광 단백질 유전자의 ATION 37-43 국지적 인 안정 표현은 더 셀 분석 38,44과 리간드 - 수용체 상호 작용 45 유동 세포 계측법의 유틸리티를 강화했다. 강화 된 기능은 세포 계측법 높은 처리량과 높은 콘텐츠가 46 스크리닝 널리 활용 방법이 될 흐름을 허용했다. 몇 플레이트 리더 시스템, 영상 및 유동 세포 계측법 수 fluorometers과 로봇 기술의 현재 확장 수에도 불구하고, 악용이 향상된 기술력을 들어갈 수있는 실험 설계의 부족있을 것 같습니다.
빠르고 안정적 간단하고 강력한 세포 기반 방법들이 대폭 더 높은 처리 능력을 향상 다중화 애플리케이션 필요하다. 다중화 형식의 엔지니어링 세포 기반 분석은 높은 처리량 검사 39,47-50의 능력을 향상시킬 수있는 곳은 신약 개발 분야에서 특히 그러하다 (51 ~ 54)을 향상시킨다. 형광 바코드 유전 우아한 다중화를 허용 할뿐만 아니라, 일단 설계 시간을 소비하는 다른 프로토콜의 필요성을 회피, 항체, 구슬 얼룩 39,52,55 수반 비용을 감소시키고, 고 필요한 화면 수를 감소시킬뿐만 아니라 처리 응용 프로그램. 우리는 최근 생물학적 응용 프로그램에 대한, 이전에 다른 임상 적으로 널리 변종 (58) HIV-1 단백질 분해 효소 활동 56,57을 모니터하기 위해 개발 된 분석을 표현함으로써 형광 유전자 바코드를 통해 멀티플렉싱을 어떻게 향상시킬 수 있는지 레트로 바이러스 기술을 설명했다. 방법론은 선택한 유전자 형광 바코드 세포를 증폭하고 뚜렷한 형광 단백질 및 / 또는 상이한 형광 intensit 발현 클론 개체군의 패널을 제조하는 방법을하는 방법에 초점을보다 설명하게 설명한다이거 야. 자신의 형광 특성에 따라 구별 세포 집단의 패널은 또한 다른 생물학적 문제를 해결 세포 기반 분석과 함께 이용 될 수있다 다중화 기능을 향상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 예를 들어 59로, 이전에 실험실에서 개발 된 세포 기반 분석의 한 베어링 바코드 세포의 패널을 설계하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 따라서 유전자 전달을위한 잘 확립 된 레트로 바이러스 / 렌티 기술, 형광 단백질의 값 또는 60,48 유세포의 어플리케이션을 나타 내기위한 것은 아니고, 오히려 다중 애플리케이션을 위해 세 개의 조합의 강화 능력을 보여주는.
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Protocol
포유 동물 세포, 유전자 바코드에 대한 바이러스 생산 및 형질 도입 1. 준비
- 10cm 접시에 플레이트 2.5 × 10 6 부착 세포 (또는 주위 50-60%의 컨 플루) 둘 베코의 수정 독수리 중간 10 % 소 태아 혈청 (DMEM) (FCS)에 Transfection 하루 전날. 이러한 피닉스 GP (게리 놀란, 스탠포드 대학에서 일종의 선물)와 같은 선택의 레트로 바이러스 생산 사용 포장 세포 라인.
주 : 패키징 세포주는 안정적 트랜스 레트로 바이러스 입자 형성 용 개그 단백질 및 폴을 나타낸다. 확인 세포가 이전에 형질에, 건강하고 단층의 판에 부착 해드립니다. - 24 시간 후, DNA 형질 전환 혼합물을 제조한다.
- 무 혈청 DMEM 125 ㎕를 3 μg의 구내염 바이러스 봉투 당 단백질 벡터 (PCI-VSVG)과이자의 형광 단백질 유전자를 운반하는 전이 벡터의 3 μg의를 추가합니다. 2 ㎎ / ㎖ (혼합 및 폴리 에틸 이민의 15 μl를 추가).
- 실온에서 15 분간 인큐베이션하고, 혼합물을 적가 셀에 추가한다.
주 : 폴리 에틸 이민은 폴리 플렉스의 형성을위한 형질 전환 시약으로서 균질 DNA 혼합물에 첨가 하였다. 다른 형광 단백질 마커를 운반하는 바이러스 입자를 얻기 위해, 원하는 마커 각각 독립적 형질 전환을 수행한다. 레트로 바이러스 전달 벡터의 길이가 약 7킬로바이트이고 대략 10 KB 이상 포장 될 수 없다는 것을 기억하라.
- 37 ° C에서 접시를 품어. 대신에 30 ° C, 32 ° C에서 바이러스 생산 도시 판을 증가시키기 위해.
참고 : 24 시간 후 형질 매체는 신선한 미디어 7 ㎖로 대체 될 수 있으며, 이러한 세포의 건강을 향상시킬 수 있지만, 그 상청 바이러스 양을 감소시킬 수있다. - 48 시간 게시물 형질은 0.45 μM 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 필터를 뜨는 포함하는 바이러스 입자 필터를 수집합니다. 전달을 위해 갓 수집 된 바이러스 상층 액을 사용합니다. O 번째erwise C ° -80 분량 씩 뜨는을 유지하고 동결 - 해동을 피하십시오. 바이러스 역가가 각각의 동결 - 융해 사이클 아마 최대 50 % 감소한다는 것을 기억.
- 이전에 선택 24 시간 접시 세포주 전달하기 위해 부착하는 경우, 즉시 전달 비 부착 경우 전. 2.0 × 10 5-3.0 (여기에 허 7.5.1 및 HEK 293T) × 10 (5) 부착 세포 또는 5.0 × 10 (5) 종자 1 × 6 비 부착 세포 (여기 SupT1) 당 잘 6 웰 플레이트.
참고 : 세포가 형질 도입시 약 60 %의 포화 상태를 달성 할 수 있도록 세포의 수는, 특히 부착 세포에 대한 있도록 전달하기 전에 접종하는 교정해야합니다. - 시드 세포에 5 ㎍ / ㎖의 폴리 브렌 (hexadimethrene 브로마이드)를 추가 한 후 약 20~40% 감염 (여기에 2 ㎖) 얻기 위해 이전에 수집 된 바이러스 상층 액을 추가합니다.
참고 : 정렬이 어떤 subpopulat를 증폭 할 수로 MOI이나 감염의 비율이 대부분 임의세포의 이온. 분명히, 감염의 높은 속도는 완화 및 증폭 과정을 가속화. - 32 ° C에서 120 분 1,500 XG에 매달려 버킷 로터에서 원심 분리하여 세포를 형질 도입. 배양 전에 신선한 매체와 비 부착 세포를 재현 탁. 부착 세포의 경우, 신선한 미디어 24 시간 후 전달로 교체.
주 : 흘리 방지하기 위해 파라 필름으로 원심 분리하기 전에 판을 밀봉하는 것이 좋습니다. 유전자 바코드 셀 다이버 시티를 증가시키기 위해, (단계 1.4로부터 구입) 상이한 형광 단백질을 운반하는 바이러스 입자로 세포를 형질 도입. 형광 마커를 선택할 때, 그들은 장비와 호환되어 있는지 확인하고는 구별 형광 매개 변수가 있습니다.
유전자 바코드 세포의 2. 선택과 증폭
- 전달의 비율 속도를 정량화하는 유동 세포 계측법에 의해 적어도 72 시간 게시물 전달을 형질 포유 동물 세포 분석. 음성 대조군으로 비교 비 형질 도입 된 세포주를 사용합니다.
주 : 정렬은, 개별 바코드 세포 집단, 초기 전달의 높은 퍼센트 비율을 정제하는 데 사용될 필요하지 동안 증폭 과정을 빠르게한다. - 관심의 단백질을 발현 세포를 얻기 위해 선택의 셀 소터를 이용한다.
- 이러한 목적을 위해, 게이트들이 적절 우측 채널에 설정되도록.
- 그래서 음성 대조군과 동일한 나이브 세포 라인을 사용하고 음극 형광 인구 각 축에서 10 세 이하의 값이되도록 파라미터 / 채널 전압 설정을 수행한다. 각각의 형광 채널에 대한 음성 대조군의 위에 표시 이벤트로 긍정적 인 형광 게이팅 결정합니다.
- 각 악기는 다를 수 있음을 인식하고 게이팅을 결정하기위한 올바른 전압은 모든 특급에 필수적 양성 및 음성 컨트롤을 만들고 그에 따라 조정되어야한다erimental 설정.
- 이 실험 장치에서 형광 검출 TD를 토마토에 대한 eGFP는 대한 FITC 채널 (502 장거리 패스 필터에 의해 진행 30분의 530 대역 통과 필터), PE 채널 (556 장거리 패스 필터에 의해 진행 42분의 585 대역 통과 필터)를 사용 E2 크림슨, 그리고 APC 채널 (20분의 660 밴드 패스 필터).
참고 : E2 크림슨은 633 nm의 레이저에 의해 흥분되는 동안 488 nm의 레이저 eGFP는 및 TD 토마토 흥분.
- 이 실험 장치에서 형광 검출 TD를 토마토에 대한 eGFP는 대한 FITC 채널 (502 장거리 패스 필터에 의해 진행 30분의 530 대역 통과 필터), PE 채널 (556 장거리 패스 필터에 의해 진행 42분의 585 대역 통과 필터)를 사용 E2 크림슨, 그리고 APC 채널 (20분의 660 밴드 패스 필터).
- 이러한 목적을 위해, 게이트들이 적절 우측 채널에 설정되도록.
- 100 % FCS 1 ㎖와 정렬에 15 ML 원뿔 튜브.
참고 : 하나 직접 개별 클론 (아래 참조)의 종류를 진행할 수있는 형광 세포 집단을 분류하는 과정은 의무적으로하지 않습니다. 선택 형광을 기반으로 꽉 인구를 정렬하면 개별 클론의 미래 선택을위한 백업 인구를 보장합니다. 각각의 세포는 항상 세포의 많은 인구 쉽게 냉동 한 후 해동 이후 단계에서 증폭 될 수있다 성장하기 어려운 있음을 알아 두셔야합니다. - SP5 분 32 ° C에서 524g에 매달려 버킷 로터 원심 분리기에 정렬 된 인구 아래에서 셀을 펠렛. 신선한 미디어 1 ㎖에 재현 탁하고, 그 세포 컨 플루 적어도 이틀 동안 성장과 분열을 허용하도록 60 % 미만 정도로 세포 플레이트 재.
- 예를 들어, 6 웰 플레이트에 웰 당 미디어 2 ㎖에서 약 3 × 10 5 세포와 6cm 판에서 미디어 2 ㎖에 2 × 10 6 세포에서 플레이트 부착 세포. 미부착 세포 부착 및 세포에 대해 RPMI DMEM을 사용하여 (또는 임의의 특정 매체 필요한 경우). 증폭을 할 수 있도록 몇 일 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 도금 세포를 놓습니다.
3. 다른 강렬에서 유전자 바코드 세포의 클론 인구를 얻습니다
- 원래 형질 세포 클론 인구를 확보 (1.7 단계) 또는 정렬 된 인구에서 (단계 2.3).
참고 :이 모든 세포 사이에 형광 단백질의 발현과 같거나 유사한 수준을 보장합니다집단 내의 S (40 %의 평균 형광 강도에서 작은 CV와 타이트한 인구).- 그 목적을 위해, 자동화 된 셀 증착 부 (ACDU) 96 웰 플레이트로 정렬 단셀. 관심의 인구에 따라 정렬 게이트를 설정합니다. 확인 게이트는 서로 다른 형광 강도에 셀을 선택할 때 구별 인구를 얻기 위해 떨어져 적어도 하나의 로그 스케일을 설정합니다. 여기에 표시된 절차, 단계 2.2에 설명 된대로 설정 실험 세포 계측법 같은 흐름을 사용합니다.
- 약 2 주 동안 37 ℃의 배양기에서 개별 클론을 증폭. 증폭 과정을 통해 성장하는 인구가 하나 이상의 개별 셀들에서 발생되지 않도록 현미경으로 세포를 분석한다.
참고 : 정렬은 평균에 잘 당 하나의 셀을 배치합니다, 일부 우물에서 모든 셀이 없을 수 있지만, 다른 사람들이 하나 이상있을 수 있음을 기억하십시오.- 포 있도록하려면pulation는, 플레이트와 매우 부드러운하고 피펫으로 우물을 방해 결코 하나의 셀에서 발생한다. 현미경, 잘 잘하여 판을 준수하십시오.
참고 : 각각의 세포는 항상 그들이 쉽게 알아볼 수있을 것입니다 분할하기 시작하면, 확인하는 것이 어려울 수도있다. - 가장자리를 따라 종종 세포 '덩어리'그주의하십시오. 여러 클론 인구 관찰 할 수있는 그 우물을 버리고 하나 꽉 인구를 가지고 그 사람들을 유지.
참고 :이 증폭에 큰 접시에 사람들을 전송하는 것이 좋습니다.
- 포 있도록하려면pulation는, 플레이트와 매우 부드러운하고 피펫으로 우물을 방해 결코 하나의 셀에서 발생한다. 현미경, 잘 잘하여 판을 준수하십시오.
- 유동 세포 계측법에 의해 이들을 분석하여 클론의 개체군을 추정 화면. 실험 장치 세포 계측법 같은 흐름을 이용하여 음성 대조군에 비교.
- 샘플의 일부만을 분석하고 백업으로 나머지를 유지합니다. 평균 강도 및 인구의 압박감을 기반으로 가장 뚜렷하게 별도의 인구를 선택합니다. 필요에 따라 증폭 또는에서 주식을 동결더 이상 시간 또는 액체 질소의 짧은 기간 동안 -80 ° C에서 20 % 글리세롤과 미디어를 동결.
참고 : '진정한'클론 인구가 아주 꽉 형광 패턴을 가져야한다는 것을 기억하십시오.
- 샘플의 일부만을 분석하고 백업으로 나머지를 유지합니다. 평균 강도 및 인구의 압박감을 기반으로 가장 뚜렷하게 별도의 인구를 선택합니다. 필요에 따라 증폭 또는에서 주식을 동결더 이상 시간 또는 액체 질소의 짧은 기간 동안 -80 ° C에서 20 % 글리세롤과 미디어를 동결.
4. (HTS)을 높은 처리량 검진에 대한 다중화 기능을 확인하십시오
- 상기 다중화 된 포맷으로 이용 될 수있는 필요한만큼 뚜렷한 클론 개체군 수확기. 구별 흡수 / 방출 스펙트럼 및 / 또는 다른 강도와 클론을 선택합니다. 96- 웰 플레이트 형식 HTS 적합되는 사용되는 경우, 200 μL에 50,000 세포를 웰 당 종자.
참고 : 세포의 수는 추정치이며, 세포 유형에 따라 변경 될 수 있으며이 부착인지 여부 있음을 알아 두셔야합니다. - 독립적 인 형광 확립 된 세포주의 각각이 서로 구별 될 수 있도록 유동 세포 계측법을 사용하여 샘플을 분석. 분석에 앞서 음의 준비단일 색상 컨트롤이 매개 변수와 보정 값을 설정합니다.
참고 : 분명히을 가능하게 혼합 된 인구를 구분하는 매개 변수를 설정하면 더 다중화 형식으로 사용합니다.
5. 선택의 생물학적 응용 프로그램에 대한 유전자 바코드 세포주를 적응
- Stolp 외., 2013 (59)에서 여기에 기술 된 바와 같이 원하는 분석 소자를 포함하는 바이러스 입자 유전자 바코드 확립 된 세포주를 형질 도입. 선택의 추가적인 분석은 형광과 구별 채널을 점유한다는 것을 기억하고, 따라서 적절한 바코드 세포주에 전달하여야한다.
주 : 각 바코드 세포주는 다른 분석을 품을 수있다. - 분석 요소를 포함 할 것들에 대한 정렬 유전자 형광 바코드 세포.
참고 : 분석 요소는 F (융합 또는 내부 리보솜 항목 사이트를 통해) 태그 또는 형광 단백질에 결합 설계 할 수있다또는 간단 검출 서부 블로 팅, 세포 계측법 또는 현미경 흐름. 이 프로토콜에 사용 된 시스템은 혼자 HA 항원의 표면 발현에 의존, 또는 추가 FLAG 에피토프 식.- HA 및 APC-형광 결합 된 항체와 분석을 포함하는 클론 인구를 얼룩. 그리고 안티 - 플래그와 FITC - 복합 항체 염색 클론 인구를 분석 할 수 있습니다.
- 분석을 다시 추적하기 위해 분석 또는 '디코드'고유 유전자 바코드 세포주가 구별 될 수있는 적절한 채널 인구. 여기서, TD 토마토 검출 PE 채널에서 분석함으로써, 기판의 특성을 디코딩.
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Representative Results
다중화 형광 유전자 개별 클론 집단이 생성되면 만 달성 될 수 생물학적 응용을 목적으로 세포를 바코드. 바코드 인구가 최소한의 스펙트럼 오버랩 명확 별개의 형광 특성이있을 때 다중 가장 효과적입니다. 포유류 SupT1 세포의 클론 집단으로도 1에 도시 된 예와 mCherry 아노 형광 단백질 (CFP)와 바코드 세포 용이 개별 형광 특성을 잃지 않고 동시에 분석 할 수 있음을 나타낸다. 이 행렬은 따라서 아직 사용 가능한 추가 채널의 판독과 다중 생물학적 응용 프로그램에 사용할 수 형광 유전자 바코드 세포의 패널을 예시한다. 이러한 패널을 얻기 위해서는 그 때문에 삽입 성 EF로 모집단 내의 형광 강도의 가변 범위로 이어질 것이다 레트로 바이러스 기술의 특성을 기억하는 것이 중요fects 및 / 또는 MOI. 2 예시도 그 바이러스 입자가 세기의 다양한 (왼쪽 패널)에서 형광 단백질 중 어느 하나 또는 둘 모두를 발현하는 세포에서 어느 TD 토마토 또는 E2 크림슨 결과로 포함한 포유 동물 세포의 초기 형질. 선택과 (중간 패널) 게이트 상자 같이 96 웰 플레이트에 단일 세포의 정렬은, 하나는 확장 (오른쪽 패널) 다음 꽉 클론 인구를 얻을 수 있습니다. 꽉 인구가 세포 유형에 따라 다양 할 수있다 작은 CV를 갖는 것으로 정의되어야 평균 형광 강도로 정상적으로 30~40%. 또한 도시도 2를 그 또 두 형광의 매트릭스 유전자 바코드 인구의 수가 증가합니다 단백질은, 하나는 형광 강도를 이용할 수있다. 일반적 집단 간의 평균 형광 강도의 하나의 로그 편차 정렬 및 amplifica 서로하기로부터 적절한 분리를 달성하기에 적합기. TD 토마토는 중간 및 높은 다른 강도, 두 집단이 하나의 강도 E2 크림슨와 다중화 얻었다이 기능을 설명하기 위해 도시 예에 선정되었다.
멀티플렉싱과 동시에 마스크 인구를 디코딩 할 수있는 능력에 대해 많은 샘플의 분석을 용이하게하기위한 강력한 도구이다. 강화 다중화 한 분광 특성이 서로 간섭하지 않는 한, 그러한 eGFP는 아직 제 형광 단백질로 달성 될 수있다. (그림 3) 실험 절차에서는 TD 토마토와 E2 크림슨 얻을 여섯 인구의 패널은 eGFP는 멀티플렉싱을 높이기 위해 악용되었다. 레트로 바이러스 기술은 하나의 행렬로 표현 eGFP는 인구에 전송하는 데 사용되었다. eGFP는 채널에서 관찰 할 때, 비 녹색 순진한 여섯 인구 매트릭스 (그림 3의 왼쪽 패널) eGFP는 형질에서 구별인구 매트릭스 (그림 3의 왼쪽 패널). 중요하게는, 패널은 원래의 유전자 바코드에 의해 점유 채널에서 분석 될 수있다 (토마토 및 E2 크림슨 TD). 동안 이러한 채널의 히스토그램과 같이, 각각의 인구가, eGFP는 채널 분석 및 디코딩 또는 다시 추적 할 수 있습니다 (오른쪽 패널 (인구에게 중간 패널의 인구 7-12, 그림 3과 1-6 비교)의 구별 그림 3). 오른쪽 보상 가능한 스펙트럼 오버랩에 대한 조정을 적용하지 않는 경우, 형질 도입, 선택, 정렬 및 증폭 과정을 반복 빈 채널을 활용 후 쓸모. 구별하기 위해 (도 4의 좌측 패널) 집단 1, 2, 3 (비 - 녹색), 7, 8, 9 (녹색)가 eGFP는 분석 토마토 채널 TD 때, 인구 7,8 어려운 이것을 증명해 . 그것은 부정적인 사기꾼 같은 순진한 세포 (인구 1)을 선택하는 것이 필요하다계측 파라미터가 설정 될 수 있도록 트롤. 특히 형광 스펙트럼 중첩 어떠한 행렬을 분석 할 때, 단일 색상 제어가 정확한 보상 값을 결정하는데 사용되는 것이 필수적이다. 도의 분석에 위치한 4 집단 2 또는 3, 및도 7은 더 진정 이중 양성 집단 정의 할 수 있도록,이 목적을 제공 (인구 8, 9).
오른쪽 악기와 오른쪽 형광 채널에서 분석 할 때, 자신의 biosignature에 의해 정의 된 형광 마커 유전자 바코드 세포는 자신의 정체성을 유지합니다. 생물학적 응용 프로그램에 이용하지 않는 그러나, biosignature은 추가로 개인 자산이됩니다. 다중화 형광 유전자 바코드의 힘을 증명하기 위해 우리는 형광 바코드 포유 동물 세포 라인의 일부에 신약 개발에 대한 우리의 이전에 개발 된 시험 법 중 하나를 도입하기로 결정했다. 이렇게함으로써, fluoresc엔트 유전자 바코드는 하나의 샘플에서 세 가지 분석을 달성하기 위해 이용되었다. 이 과정에서 단백질 분해를위한 세 가지 추정되는 바이러스 성 기판의 한쪽을 함유하는 스캐 폴드 단백질은 유전자 바코드 세포로 옮겼다. 분석에서, 분열은 세포 표면 (그림 5B)에 FLAG 에피토프의 손실에 의해 드러났습니다. 대조적으로, FLAG 표면 염색 절단의 부족을 나타내는 5 세 상이한 기판의 분석 결과를 도시한다.; HIV-1 봉투 야생형 (봉투 중량), HIV-1 봉투 돌연변이 (봉투의 MUT) 및 뎅기열 바이러스 (DENV) PRM. (도 5A 및 중간 높음) 이들 각각은 1 내지 3의 나이브 바코드 세포주, 및 상이한 농도에서 TD 토마토를 이용하는 두 사람에 도입 하였다. FLAG 표면 발현을위한 염색 각 바코드에 기초하여 절단 한 기판을 계시한다. 녹색-FI에서 볼 수 있듯이 예에서 만 HIV 봉투의 MUT는, FLAG 태그 (긍정적 인 다음 염색을) 유지TC 채널 (그림 5C, 오른쪽 하단 패널). 분석의 분석 따라서 원래 바코드 독립적으로 수행 될 수 있고, 상기 디코딩과 구별 인구 궤도 시키는데 이용 될 수있다. 이 다중화의 방법은 따라서 목표 세포 판독을 위해 예약 추가 채널에 의존한다.
그림 1 :. 다중화 바코드 유 전적으로 같은 mCherry, CFP 또는 양쪽 (왼쪽 패널)와 같은 고유 한 형광 단백질을 사용하여 바코드 개별 인구, 혼합 분석 및 유동 세포 계측법을 통해 각각의 채널에서 (오른쪽 패널) 디코딩 할 수 있습니다. Smurthwaite, C. 등. 2014 년 58에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 정렬 및 바코드 세포의 증폭 포유 동물 세포는 TD 토마토 또는 E2-크림슨 (왼쪽 패널)를 포함하는 바이러스 입자와 전달 다음 48 시간을 분석 하였다. 게이츠는 다음, 다른 강도에서 TD 토마토를 발현하는 세포를 포함하는 정렬 설정 / 아웃 E2-크림슨 (가운데 패널)와 함께. 종류에서 클론이 증폭 된 여섯 구별 인구 (오른쪽 패널)의 행렬을 생성하기 위해 다시이-분석했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 디코딩이 마스크 인구를 보여 행렬그림 2 (토마토 및 / 또는 E2-크림슨를 TD)에서 얻은 여섯 인구의 추가 등 eGFP는 같은 추가 형광 단백질을 발현하도록 설계 할 수있다. (A) eGFP는 채널 (좌측 패널)에서 분석 할 때 원래의 행렬은 음이며 여섯 개체군들은 서로 구별된다. 히스토그램 (우측 패널)에 나타낸 바와 같이 여섯 인구 각각 독립적 eGFP는 채널에서 분석 될 수있다. 이제 eGFP는 표현 (B) 같은 행렬은, 이제 녹색 형광 특성을 드러내는 같이 분석 하였다. Smurthwaite, C. 등. 2014 년 58에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 보상은 정확한 분리를 보장 인구의 일부는 원래 TD 토마토 및 / 또는 eGFP는 식 (인구 7, 8) 함께 분석 할 때 제대로 분리 될 수 없다 (왼쪽 패널)이 채널에 대한 적절한 보상하지 않는 한 조정 (오른쪽 기준으로 선택. 패널). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
선택의 분석에 선택한 분석에 더 적응을위한 바코드 세포의 선택 (A) 선택과 적응 그림 5.. 유 전적으로 서로 다른 강도의 TD 토마토 (맨 왼쪽 패널)와 바코드 인구는 생물학적 응용 프로그램에 사용되었다. 인구의 각각은 더 분열을 모니터링하는 분석을 포함 할 수 있도록 설계되었다하지만, 다른 기판의 각 (오른쪽 상단 패널). 분석의 (B) 묘사. 부정적인 FLAG 얼룩은 분열을 나타내는 반면 긍정적 인 FLAG 얼룩 분열의 부족을 나타냅니다. FLAG 염색 다음과 같은 분석의 (C) 분석. 혼합 인구는 FITC 채널 (왼쪽 패널)의 TD 토마토 바코드하지만 구별성에 기초하여 구별 할 수있다. FLAG-FITC 항체로 염색 할 때, 하나의 인구는 FLAG에 대한 긍정적이다. 디코딩이 인구가 HIV 봉투 피 시험 메모리 기판 (오른쪽 패널) 곰 것으로, 유전자 바코드를 기반으로 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 두 잘 확립 된 절차가 결합되었습니다; 레트로 바이러스 및 기술을 이용하여 유세포 형광 단백질의 검출을 통해 유전 공학. 고유 세포주의 제조 계 형광 단백질 유전자 바코드 다중화 애플리케이션 견고하고 간단한 방법을 제공한다. 레트로 바이러스 유전자 조작 기술을 통해 세포 바코드를 생성하는 초기 긴 과정이지만, 한 번, 셀 물질의 신뢰성 있고 안정된 소스를 설립 얻게한다. 이 기술의 본질은 지속적으로 자신의 진정한 구별 biosignature가 정상 형광 특성을 가진 유전자 조작 세포 라인을 생산하고 있습니다.
두 점착성 및 비 점착성 세포 유형은 그들의 물리적 흡수 / 방출 스펙트럼에 기초하여 쉽게 구별 형광 단백질을 이용하여 바코드 수있다. 이들은 다음을 포함하지만, 이러한 CFP, mCherry 같은 단백질에 한정되는 것은 아니다, E2 크림슨 및 TD 토마토. 유전자들이 구별 형광 단백질 바코드되면, 그들은 세포 집단의 패널을 생성하기 위해 결합 될 수있다. 중요한 것은, 패널은 형광 특성에 의해서만 차별화 된 정확한 유전자형 메이크업 세포 집단을하지만이 포함되어 있습니다. 이와 같이, 이러한 패널 완벽 크게 높은 처리량 능력을 향상 다중화 애플리케이션에 적합하다.
MOI의 차이로 인해 결합 숙주 게놈 내로의 레트로 바이러스 입자의 다른 삽입 성 기호에, 특정 실시 형광 단백질 유전자에서 가변 형광 농도가 예상된다. 고유 형광성 유전자를 운반하는 유전자 조작 인구 분석 따라서 형광 강도에 기초하여 정의 될 수있다 발현 프로파일의 범위를 검출한다. 이 차등 발현 양상은 스펙트럼 적으로 서로 구별되는 집단을 만들기 위해 이용 될 수있다. 하나는 따라서 콤비 수형광 강도와 형광 마커의 북동 선택은 실험 설계에 맞게. 여기에, E2 크림슨과 또는 eGFP는없이 TD 토마토, 두 6 인구 패널을 포함 4, 6, 12 인구의 행렬은, 표시됩니다. 이론적으로,이 더뿐만 아니라 3 개의 다른 형광 단백질의 인구를 만들려면 eGFP는 서로 다른 강도로 확장 될 수있다; 그와 관련된 다른 강도와 각. 전술 한 바와 같이, 고려 실제로 달성 될 수있는 분리를 보장하기 위해 형광 단백질을 선택할 때주의해야한다. 선정 단백질은 별개의 흡수 및 방출 스펙트럼을 가져야한다; 두 스펙트럼 적으로 구별되지만 유사한 형광 단백질을 사용하는 경우에는, 보정을 적용해야한다. 다른 형광 또는 형광 단백질 중 배출 / 흡수 스펙트럼의 물리적 분리를 허용 중요한 것은, 적절한 보상, 적절한 단일 색상 컨트롤 사용하여 수행됩니다유동 세포 계측법을 통해 감지.
적은 형광 단백질하지만 강도의 다양한 활용과 멀티플렉싱은 더욱 관심의 생물학적 응용 프로그램에 악용 될 수있는 추가 채널을 해제합니다. 이 실험 장치의 유연성을 증가시키고 형광 마커의 조합의 선택은 사용되는 단순화 할 수있다. 예를 들어,도 5에 도시 된 다중화 분석은 FITC 결합이 경우, 항체 염색에 의존한다. 전용 채널은 PE 유전 바코드에 의해 점유 될 때, 적절한 계측 및 / 또는 항체의 가용성에 기초하여 이루어질 수 결정을, 하나는 FITC 공액 된 항체를 활용할 수 있고, 또는 반대로, APC 결합.
흐름 필드에 기술 성과 계측법, 현미경 또는 결합 방법 인상적이지만, 병목 및 생물학적 응용을위한 HTS 가능한 전지 기술이 될 것으로 보인다. 레트로 바이러스 기술형광 단백질의 확장 번호와 결합 술이 쿼리에 응답하기 위해 병합 할 수 있습니다. 형광 바코드 유전 대폭 차례로, 세포 기반 분석법 HTS 기능을 확장하기위한 필요성의 증가를 만족 다중화를 용이하게한다. 유전자 바코드는 생물학적 응용 프로그램 및 약물 검사에 대한 높은 처리량 방법으로 몇 셀 기반 분석에 효과적인 강력한, 비용, 간단한 방법으로 연결됩니다. 3 인구 패널을 사용하여 하나보다는 오히려 세 화면을 행하는 전력 유익한 비용 및 시간 관련 의미를 갖는다. 유동 세포 계측법, 높은 콘텐츠 이미징 및 유동 세포 계측법 결합 현미경의 성장 다양성으로, 형광 유전자 바코드는 분석 개발을위한 지속적으로 신뢰할 수있는 도구가 될 것입니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 레트로 바이러스 입자의 생산을 위해 피닉스 GP 포장 세포주를 제공하기 위해 스탠포드 대학에서 박사 게리 놀란에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 TD 토마토를 제공하기 위해 캘리포니아 샌디에고 대학에서 박사 로저 첸 감사합니다. 우리는 또한 자신의 서비스와 도움을 샌디에고 주립 대학 유동 세포 계측법 핵심 시설에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | used for filtering the virus |
| 0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter | Pall Corporation | 4219 | used for filtering the virus |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 45000-304 | cell growth media for HEK 293T cells |
| PEI (Polyethylenimine) | poly sciences | 23966-2 | 2 mg/ml concentration used |
| Hanging bucket centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5805 000.017 | used for spin infection |
| PBS (phosphate buffered saline) | Corning | 21-040-CV | used for washing of cells |
| Polybrene (hexadimethreen bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration. |
| FACSAria | BD Biosciences | instrument used for sorting cell populations | |
| FACSCanto | BD Biosciences | instrument used for cell analysis | |
| Phoenix-GP | Gift from Gary Nolan | cell line used to produced retroviral particles | |
| Fetal calf serum | Mediatech | MT35015CV | used for cell growth and sorting |
| SupT1 cells | ATCC | CRL-1942 | Human T lymphoblasts |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | cell growth media for SupT1 cells |
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