Introduction
Teknologier som fluorescens spektroskopi, fluorescens mikroskopi og flowcytometri, alle er avhengige av fluorescens, en eiendom allment utnyttet i biokjemiske, biomedisinske, og kjemiske applikasjoner. Fluorescens, enten iboende eller ved merking, har vært utnyttet for analyse av protein uttrykk mønstre og profiler, celle skjebne, protein interaksjoner og biologiske funksjoner 1-9, og gjennom fluorescens / Förster resonans energioverføring for påvisning av biomolekyl interaksjoner og konformasjonsendringer 10-13. Etter isolering av Aequorea Victoria grønt fluorescerende protein (GFP) 14, oppdagelsen av flere naturlig forekommende fluorescerende proteiner fra andre nesledyrene, særlig koraller, har i stor grad økt antall eksisterende fluorescerende proteiner med skjelnes eksitasjon / emisjonsspektra. Disse, sammen med innføring av mutasjoner i genene 15-19, have ytterligere utvidet mulighetene, skaffe en ekte palett av fluorescerende proteiner tilgjengelig for forskere som utnytter mikroskopi, flowcytometri og andre fluorescens-basert teknologi for sin forskning.
I parallell, men uavhengig av hverandre, utviklingen av retrovirale teknologi har muliggjort drastisk stabil ekspresjon av ektopisk genetisk informasjon i pattedyrceller 20-23. Det er derfor ikke overraskende at denne teknologi har blitt brukt for å overføre gener av fluorescerende proteiner inn i en bred rekke celletyper og vev 24-28 eller for produksjon av transgene dyr 29-31. Etter arten av retrovirus, er det genetiske informasjon av ektopisk fluorescerende protein innført i genomet av cellen 32, og cellen blir fluorescerende `for ever'. Denne egenskapen har gjort sporing av celle skjebne, eller av en enkelt celle i en populasjon av celler. Den nå fluorescerende celle har dermed acquirød sin egen BioSignature og kan defineres som strekkode. Sin unike BioSignature identifiserer den fra andre celler, og viktigere, skiller den fra celler genetisk manipulerte til å uttrykke ulike fluorescerende proteiner med identifiserbar absorpsjon / emisjonsspekter. Biologiske applikasjoner som sporing av reprogrammerings faktorer mot pluripotency 33, analyse av faktorene subnuclear for klarlegging av nukleolært lokaliserings 34, konstruksjonen av fluorescerende reporter plasmider for transkripsjonelle studier 35 eller den genetiske merking av nerveceller for studiet av neuronal nettverksarkitektur 36 , er bare fire eksempler på de mange som har utnyttet ulike fluorescerende protein gener for samme eksperimentelle oppsettet.
Strømningscytometri er blitt mye brukt for analyse av biologiske prosesser på enkeltcelle-nivå, for eksempel genekspresjon, cellesyklus, apoptose, og signalisering gjennom fosforylasjon 37-43 sikret stabil uttrykk for fluorescerende protein gener i pattedyrceller har ytterligere forbedret nytten av flowcytometri for celle analyse 38,44 og ligand-reseptor interaksjoner 45. Forbedrede evner har lov flowcytometri for å bli en mye brukt metode for høy gjennomstrømming og høy-innhold screening 46. Til tross for den nå utvidet antall fluorometers og robotikk teknologier som kan par platelesersystemer, bildebehandling og flowcytometri, synes det å være en mangel i eksperimentell design som kan utnytte og tilpasse disse forbedrede teknologiske evner.
Raske, pålitelige, enkle og robuste celle-baserte metoder er drastisk behov for multiplekserte programmer som ytterligere forbedrer høy gjennomstrømming kapasitet. Dette er spesielt tilfelle når det gjelder medisiner hvor konstruksjonscellebaserte assays i en multiplekset format kan øke kraften i high-throughput screening 39,47-50 51-54. Fluorescerende genetisk strekkoding gir ikke bare en elegant multipleksing, men også, når konstruert, omgår behovet for tidkrevende protokoller, reduserer kostnader ledsaget med antistoffer, perler og flekker 39,52,55, og kan redusere antall skjermer som kreves for høy- gjennomstrømning. Vi har nylig beskrevet hvordan retroviral teknologi kan forbedre multiplexing gjennom fluorescerende genetisk barcoding for biologiske applikasjoner, ved å uttrykke en analyse tidligere utviklet for å overvåke HIV-1 protease aktivitet 56,57 med forskjellige klinisk utbredte variantene 58. Metodikken er forklart i en mer beskrivende måte å fokusere på hvordan du velger og forsterke genetisk fluorescerende strekkode celler og hvordan å produsere paneler av klonale populasjoner som uttrykker forskjellige fluorescerende proteiner og / eller annen fluorescens intensitetenkaper. Paneler av cellepopulasjoner kan skjelnes fra hverandre på grunnlag av deres fluorescerende egenskaper forbedre multipleksede kapasiteter, som kan videre utnyttes i kombinasjon med cellebaserte assays som håndterer forskjellige biologiske spørsmål. Protokollen beskriver også hvordan man skal konstruere et panel av strekkode- celler som bærer en av de cellebaserte assays som tidligere er utviklet i laboratoriet, som i eksempel 59. Denne protokollen er således ikke ment å vise den veletablerte retroviral / lentiviral teknologi for genetisk overføring, verdien av fluorescerende proteiner eller anvendelser av flowcytometri 60,48, men i stedet for å vise den styrke kraft for å kombinere de tre for multipleksede anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av pattedyrceller, virusproduksjonen og Transduksjon for Genetic strekkoding
- Plate 2,5 x 10 6 adherente celler i en 10 cm plate (eller rundt 50 til 60% konfluens) en dag før transfeksjon i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) med 10% føtalt kalveserum (FCS). For retroviral bruk produksjon emballasje celle-linje av valg som Phoenix-GP (en slags gave fra Gary Nolan, Stanford University).
MERK: Emballasjen cellelinje stabilt uttrykker Gag og Pol proteiner for retroviral partikkeldannelse i trans. Sørg for at cellene er friske og festet til platen i et enkeltlag, før transfeksjon. - 24 timer senere, forberede DNA transfeksjon blanding.
- Til 125 ul av serumfritt DMEM tilsett 3 ug Vesicular Stomatitis Virus Envelope glykoprotein vektor (PCI-VSVg) og 3 ug overføringsvektor som bærer det fluorescerende protein som genet av interesse. Bland og tilsett 15 ul polyethylimine (2 mg / ml).
- Inkuber blandingen ved romtemperatur i 15 minutter og tilsett til celler dråpevis.
MERK: Polyethylimine blir tilsatt til den homogene blandingen som DNA-transfeksjon reagens for dannelse av polyplexes. For å få viruspartikler bærer ulike fluorescerende protein markører, utføre hver transfeksjon selvstendig med markør av valget. Husk at retroviral overføring vektor er rundt 7 kb i lengde og kan ikke pakkes hvis over 10 kb.
- Inkuber platene ved 37 ° C. For å øke virusproduksjon sted platene ved 30 ° C eller 32 ° C i stedet.
MERK: 24 timer etter transfeksjon medier kan bli erstattet med 7 ml friskt medium, og selv om dette kan forbedre celle helse det kan redusere virusbelastningen i supernatanten. - 48 timer etter transfeksjon samle supernatantprøvene inneholder viruspartikler og filter med 0,45 mikrometer polytetrafluoretylen filter. Bruk fersk samlet viral supernatanten for transduksjon. Otherwise holde supernatanten i alikvoter ved -80 ° C og unngå frysing og tining. Husk at viral titer vil reduseres sannsynligvis opptil 50% med hver frysing-tining syklus.
- Plate cellelinje av valget 24 timer før transduksjon hvis tilhenger, eller umiddelbart før transduksjon hvis ikke-tilhenger. Seed 2.0 x 10 5 til 3,0 x 10 5 adherente celler (her Huh 7.5.1 og HEK 293T) eller 5,0 x 10 5 til 1 x 10 6 ikke-adherente celler (her SupT1) per brønn i en 6-brønns plate.
MERK: Sørg for å kalibrere antall celler å bli seedet før transduksjon, særlig så for heftende celler, slik at cellene oppnå en confluency på rundt 60% på tidspunktet for transduksjon. - Tilsett 5 ug / ml polybrene (hexadimethrene bromid) til seeded celler og deretter legge tidligere oppsamlet viral supernatant for å oppnå rundt 20-40% infeksjon (her 2 ml).
MERK: MOI eller prosentandel av infeksjon er stort sett vilkårlig, som sortering vil tillate å forsterke noen subpopulation av celler. Selvsagt, en høyere rate av infeksjon forenkler og hastigheter opp prosessen med forsterkning. - Transduce cellene ved sentrifugering i en hengende bucket rotor ved 1500 xg i 120 minutter ved 32 ° C. Susp ikke-heftende celler med friske media før inkubasjon. For tilhenger celler, erstatte med fersk media 24 timer etter transduksjon.
MERK: Det anbefales å forsegle platene før sentrifugering med Parafilm for å unngå å smitte over. Å øke genetisk strek celle mangfold, transduce celler med viruspartikler bærer ulike fluorescerende proteiner (hentet fra trinn 1.4). Når du velger fluorescerende markører, sørge for at de er kompatible med instrumentering og de har skjelnes fluorescerende parametere.
2. Utvalg og Amplification of Genetisk strekkode Cells
- Analysere transduserte pattedyrceller ved flowcytometri minst 72 timer etter transduksjon å kvantifisere prosentsats av transduksjon. Bruke et sammenlignbart ikke-transdusert cellelinje som negativ kontroll.
MERK: Som sortering vil bli brukt til å rense individuelle strekkode celle populasjoner, en høy prosentsats av opprinnelig transduksjon, mens ikke nødvendig, bør fremskynde prosessen med forsterkning. - Utnytte cellesorterer av valg for å oppnå celler som uttrykker proteinet av interesse.
- For dette formål, sikre portene er riktig satt i de riktige kanalene.
- For å gjøre dette bruker den samme naive cellelinje som negativ kontroll og sette parameteren / kanal spenningen slik at den negative befolkningen er under verdien av 10 tre på hver fluorescerende aksen. Bestem gating for positiv fluorescens som hendelser som vises over at av den negative kontrollen for hver fluorescerende kanal.
- Vær oppmerksom på at hvert instrument kan variere og riktig spenning for å bestemme gating bør justeres tilsvarende, noe som gjør positive og negative kontroller imperativ i alle experimental oppsett.
- For fluorescensdeteksjon i denne eksperimentelle oppsettet bruke FITC kanal (530/30 band pass filter satte med en 502 lang pass filter) for EGFP, PE-kanal (585/42 band pass filter satte med en 556 lang pass filter) for td Tomato , og APC-kanal (660/20 band pass filter) for E2 Crimson.
MERK: 488 nm laser begeistrer EGFP og td Tomato mens E2 Crimson er opphisset av 633 nm laser.
- For fluorescensdeteksjon i denne eksperimentelle oppsettet bruke FITC kanal (530/30 band pass filter satte med en 502 lang pass filter) for EGFP, PE-kanal (585/42 band pass filter satte med en 556 lang pass filter) for td Tomato , og APC-kanal (660/20 band pass filter) for E2 Crimson.
- For dette formål, sikre portene er riktig satt i de riktige kanalene.
- Sortering i 15 ml koniske rør med 1 ml av 100% FCS.
MERK: Prosessen med å sortere fluorescerende celle populasjoner er ikke obligatorisk som en kan direkte fortsette med den type individuelle kloner (se nedenfor). Sortering tette populasjoner basert på valgt fluorescens sikrer en backup befolkningen for fremtidig valg av individuelle kloner. Husk at individuelle celler er til tider vanskelig å vokse mens en stor populasjon av celler kan lett fryses, og deretter tint og forsterket på et senere stadium. - Spi ned de sorterte populasjonene i et hengende spannrotor sentrifuge ved 524 g ved 32 ° C i 5 minutter for å pelletere cellene. Re-suspen i 1 ml friskt medium, og re-plateceller, slik at celle konfluens er under 60% for å tillate vekst og deling i minst to dager.
- For eksempel plate adherente celler på rundt 3 x 10 5 celler i 2 ml media per brønn i en 6-brønns plate og 2 x 10 6 celler i 2 ml av mediet i en 6 cm plate. Bruk DMEM for adherente celler og RPMI for ikke-adherente celler (eller en hvilken som helst spesifisert medium hvis nødvendig). Plasser belagt cellene i en inkubator ved 37 ° C i flere dager for å tillate amplifisering.
3. Skaff Klonale Bestander av genetisk strekkode celler på forskjellige intensiteter
- Innhente klonale populasjoner fra celler opprinnelig transduserte (trinn 1.7) eller fra den sorterte befolkningen (trinn 2.3).
MERK: Dette vil sikre lik eller tilsvarende nivå av fluorescerende protein uttrykk blant alle cellens i populasjonen (en tett populasjon med en liten CV i gjennomsnittlig fluorescensintensitet på opp til 40%).- For dette formål, sortere enkle celler i 96-brønners plater med en automatisert celleavsetning enhet (ACDU). Sette porter for sortering i henhold til bestander av interesse. Sørg portene er satt minst ett log-skala fra hverandre for å få skjelnes populasjoner når du velger celler på ulike fluorescerende intensiteter. For fremgangsmåten vist her, bruker samme flowcytometri eksperimentelle satt opp som den som er beskrevet i trinn 2.2.
- Amplifisere individuelle kloner i en inkubator ved 37 ° C i minst 2 uker. Gjennom prosessen med forsterkning analysere cellene under mikroskopet for å sikre at en voksende befolkning oppstår fra de enkelte celler, og ikke fra mer enn én.
NB: Husk at sorter vil plassere en celle per brønn i gjennomsnitt, og mens noen brønner ikke kan ha hvilken som helst celle i det hele tatt, mens andre kan ha mer enn én.- For å sikre at en population oppstår fra en celle bare, være svært forsiktig med platen og aldri forstyrre brønnene ved pipettering. Observere plate, godt av godt, under mikroskopet.
MERK: Mens enkeltceller kan til tider være vanskelig å identifisere, når de begynner å dele de vil være lett gjenkjennelig. - Vær oppmerksom på at ofte celler 'klump' langs kantene. Forkaste de brønner der flere klonale populasjoner kan observeres og holde de som har ett tett befolkning.
MERK: Det anbefales å overføre dem til større plater for forsterkning.
- For å sikre at en population oppstår fra en celle bare, være svært forsiktig med platen og aldri forstyrre brønnene ved pipettering. Observere plate, godt av godt, under mikroskopet.
- Sikt de antatte klonale populasjoner ved å analysere dem ved flowcytometri. Sammenligne dem med en negativ kontroll benytte samme flowcytometri eksperimentelle oppsettet.
- Analyser bare en andel av prøven, og holde resten som backup. Velg de mest tydelig atskilte populasjoner basert på gjennomsnittlig intensitet og tetthet av befolkningen. Forsterke dem etter behov eller fryse aksjer ifrysemedier med 20% glycerol ved -80 ° C i korte tidsperioder, eller flytende nitrogen for lengre.
NB: Husk at en "ekte" klonal befolkningen bør ha en meget stram fluorescens mønster.
- Analyser bare en andel av prøven, og holde resten som backup. Velg de mest tydelig atskilte populasjoner basert på gjennomsnittlig intensitet og tetthet av befolkningen. Forsterke dem etter behov eller fryse aksjer ifrysemedier med 20% glycerol ved -80 ° C i korte tidsperioder, eller flytende nitrogen for lengre.
4. Sørg Multiplexing Capabilities for High throughput screening (HTS)
- Kombinere så mange forskjellige klonale populasjoner som trengte det kan bli ytterligere utnyttes i en multiplex format. Velg kloner med identifiserbar absorpsjon / emisjonsspekter og / eller forskjellige intensiteter. Hvis et 96-brønners plateformat blir brukt, noe som er egnet for HTS, frø 50000-celler i 200 ul per brønn.
MERK: Husk at antall celler er bare et estimat og kan endres basert på celle-type og om det er tilhenger eller ikke. - Analyse av prøven ved hjelp av strømningscytometri for å sikre at hver av de uavhengige etablerte fluorescerende cellelinjer kan skilles fra hverandre. Forut for analysen fremstille negativeog enkle fargekontroller for å sette parametre og kompensasjonsverdiene.
MERK: Innstilling av parametere å skille klart de blandede bestander vil gjøre dem i stand til å bli utnyttet videre i en multiplex format.
5. Tilpass Genetisk strekcellelinjer til Biologisk Application of Choice
- Transduce etablerte genetisk strekcellelinjer med viruspartikler som inneholder analyse elementer av valg, som beskrevet her i Stolp et al., 2013 59. Husk at analysen av valget skal oppta en ekstra og skilles fluorescerende kanal og derfor er det å bli overført til den aktuelle strekcellelinje.
MERK: Hver strekcellelinje kan bære en annen analyse. - Sorter genetisk fluorescerende strekkode celler for de som inneholder analyseelementer.
MERK: Analyse elementer kan være konstruert koblet til en tag eller fluorescerende protein (som en fusjon eller gjennom en intern ribosomet oppføring stedet) feller enkel deteksjon gjennom western blotting, flowcytometri eller mikroskopi. Systemet anvendt i denne protokollen er avhengig av HA epitop overflateekspresjon alene, eller sammen med ytterligere FLAG-epitop ekspresjon.- Flekken klonale populasjoner som inneholder analysen med HA og APC-fluorescently koplede antistoffer. Deretter analysere klonale populasjoner med anti-FLAG og FITC-konjugert antistoff farging.
- Å spore tilbake analysen, analysere eller 'dekode' befolkningen i den aktuelle kanalen hvor de forskjellige genetisk strekcellelinjer kan skilles. Her dekode arten av substratet ved å analysere i PE kanalen for td Tomat deteksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multipleksing fluorescerende genetisk strekkode celler for formålet av biologiske anvendelser kan bare oppnås når de enkelte klonale populasjoner er blitt generert. Multipleksing er mest effektiv når strekkode populasjoner har klare distinkte fluorescerende egenskaper med minimal spektral overlapp. Eksempelet vist i figur 1 med klonale populasjoner av pattedyr SupT1 celler illustrerer at strekkode celler med mCherry og cyano fluorescerende protein (CFP) kan enkelt analyseres samtidig uten å miste sine individuelle fluorescerende egenskaper. Denne matrisen eksemplifiserer dermed et panel av fluorescerende genetisk strekkode celler som er brukbare for multipleksing biologiske applikasjoner med en avlesning i enda en ekstra tilgjengelig kanal. For å oppnå et slikt panel er det viktig å huske på arten av retrovirale teknologi, noe som vil føre til variable områder av fluorescerende intensitet i befolkningen som skyldes insertional effects og / eller MOI. Figur 2 viser at den første transduksjon av pattedyrceller med viruspartikler inneholdende enten td tomat eller E2 Crimson resultater i celler som uttrykker enten den ene eller begge av de fluorescerende proteiner ved et bredt spekter av intensiteter (venstre panel). Seleksjon og sortering av enkle celler i 96-brønners plater som vist ved gated boksene (mellompanel), gjør det mulig å oppnå tette populasjoner følgende klonale ekspansjon (høyre panel). En tett populasjon skal defineres som å ha en liten CV som kan variere i henhold til celletype, vanligvis 30 til 40% i gjennomsnittlig fluorescensintensitet. Figur 2 viser også at for ytterligere å øke antall genetisk strekkode populasjoner med en matrise av bare to fluorescerende proteiner, kan man også utnytte fluorescensintensitet. Vanligvis er én logg avvik i gjennomsnittlig fluorescens intensitet mellom populasjoner egnet til å oppnå passende separasjon fra hverandre følgende sortering og amplificasjon. Td tomat ble valgt i det viste eksempel for å illustrere denne funksjonen, hvor to populasjoner av forskjellige intensiteter, middels og høye, ble oppnådd for multipleksing med E2 Crimson på et enkelt intensitet.
Multipleksing er et kraftig verktøy for å lette analyse av mange prøver samtidig, og for evnen til å dekode maskerte populasjoner. Utvidelser multipleksing kan oppnås med ennå en tredje fluorescerende protein som EGFP, så lenge spektrale egenskaper ikke kommer i konflikt med hverandre. I den eksperimentelle prosedyre som er vist i figur 3 panel av seks populasjoner oppnådd med td tomat og E2 Crimson ble utnyttet for å øke multipleksing med EGFP. Retroviral-teknologi ble brukt til å overføre EGFP til de populasjoner som er representert i en av matrisene. Når observert i EGFP-kanalen, ikke kan skilles fra EGFP-transdusert det ikke-grønne naive seks-populasjonen matrise (øvre venstre panel i figur 3)befolkning matrise (nederst til venstre panel i figur 3). Viktigere, kan panelene bli analysert i kanalene okkupert av den opprinnelige genetiske strekkode (td tomat og E2 Crimson). Mens utvisket i disse kanalene (sammenligne populasjoner 1-6 med populasjoner 7-12 i midten paneler, figur 3), kan de enkelte bestander bli analysert i EGFP kanal, og dekodet eller spores tilbake, som vist i histogrammene (høyre panel i figur 3). Etter å gjenta prosessen med transduksjon, utvelgelse, sortering, og forsterkning, utnytter ledig kanaler er ubrukelig hvis riktig erstatning ikke er brukt til å justere for mulig spektral overlapp. For å bevise dette, når populasjoner 1, 2, 3 (ikke-grønn) og 7, 8, 9 (grønn) er analysert i EGFP og td Tomat kanaler, populasjoner 7 og 8 er vanskelig å skille (venstre panel i figur 4) . Det er derfor nødvendig å velge naive celler (populasjons 1) som en negativ conreguleringen slik at parameterne for instrumentering kan innstilles. Når analysere noen matrise, spesielt med fluoroforene som spektralt lapper hverandre, er det viktig at ensfargede kontrollene brukes til å finne riktig kompensasjonsverdiene. I analysen av figur 4 populasjoner 2 eller 3, og 7 tjener dette formålet, slik at for å bedre definere populasjoner som virkelig er dobbelt positive populasjoner (8 og 9).
Genetisk strekkode celler med fluorescerende markører beholde sin egen identitet som definert av deres BioSignature, når analysert i riktig fluorescerende kanal med rett instrument. Men blir det BioSignature bare en ekstra enkelte eiendom med mindre utnyttes for biologiske bruksområder. For å bevise kraften i fluoriserende genetisk barcoding for multipleksing besluttet vi å innføre en av våre tidligere utviklede analyser for stoffet funnet i noen av de fluorescerende strekkode pattedyrcellelinjer. Ved å gjøre det, fluorescerendeent genetisk barcoding ble utnyttet til å oppnå tre analysene i én prøve. I denne prosedyren et stillas proteininneholdende en av de tre antatte viral substrat for proteolyse ble overført til de genetisk strekkode celler. I analysen blir spalting åpenbart av tapet av FLAG-epitop på celleoverflaten (figur 5B). I motsetning til dette representerer FLAG overflatefarging mangel på spaltning Figur 5 viser resultatet av analyse av tre forskjellige substrater.; HIV-1 konvolutt villtype (konvolutt wt), HIV-1 konvolutt mutant (konvolutt mut), og Dengue virus (Denv) PRM. Hver av dem ble innført i en av tre strekkode cellelinjer, naive, og to andre som benytter td Tomato på forskjellige intensiteter (midten og høy, figur 5A). Farging for FLAG overflateekspresjon viser hvilke av de substrater ble spaltet på grunnlag av den respektive strekkoden. I eksemplet bare HIV Env mut beholder FLAG tag (positiv følgende farging), som sett i det grønne-FITC-kanal (figur 5C nede til høyre panel). Analysen av analysen kan således utføres uavhengig av den opprinnelige strekkoding, og videre utnyttes til å dekode og å spore tilbake de distinkte populasjoner. Denne metoden for multipleksing avhengig dermed på en ekstra kanal reservert for den biologiske avlesning av interesse.
Figur 1:. Barcoding for multipleksing Individuelle populasjoner genetisk strekkode ved hjelp av forskjellige fluorescerende proteiner som mCherry, CFP eller begge (venstre panel) kan blandes, analysert, og dekodet (høyre panel) i sine respektive kanaler via flowcytometri. Tilpasset fra Smurthwaite, C. et al., 2014 58. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Sortering og forsterkning av strekkode celler Pattedyrceller ble analysert 48 timer etter transduksjon med viruspartikler som inneholder enten td Tomato eller E2-Crimson (venstre panel). Gates blir deretter satt til sortering å inkludere celler som uttrykker td Tomato på forskjellige intensiteter, med / ut E2-Crimson (midtre panelet). Kloner fra den slags ble forsterket og re-analysert for å generere en matrise av seks skjelnes populasjoner (høyre panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Dekoding avslører maskerte populasjoner Matrisenav seks populasjoner oppnådd i figur 2 (td tomat og / eller E2-Crimson) kan bli ytterligere utviklet til å uttrykke et ytterligere fluorescerende protein som EGFP. (A) Den opprinnelige matrise, er når de analyseres i EGFP kanalen (venstre panel) negativ, og de seks populasjoner er umulig å skille fra hverandre. Hver av de seks populasjoner kan være uavhengig analysert i EGFP kanal som vist på histogrammene (høyre panel). (B) Den samme matrise, nå uttrykker også EGFP, ble analysert som i A, avslører nå sitt grønne fluorescerende karakteristisk. Tilpasset fra Smurthwaite, C. et al., 2014 58. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Kompensasjon sikrer korrekt separasjon Noen av populasjoner opprinnelig valgt basert på td Tomato og / eller EGFP uttrykk (populasjoner 7 og 8) kan ikke være riktig skilt da analyseres sammen (venstre panel) med mindre passende kompensasjon for disse kanalene justeres (høyre. panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5:. Valg av strekkode celler for ytterligere tilpasning til valgt analysen (A) Valg og tilpasning til analyse av valget. Populasjoner genetisk strekkode med td Tomato på forskjellige intensiteter (øverst til venstre panel) ble brukt for biologiske bruksområder. Hver av populasjonene ble ytterligere konstruert for å inneholde en analyse som overvåker spaltning, Men hver og en av en annen substrat (øverst til høyre panel). (B) Avbildning av analysen. Positiv FLAG flekken indikerer mangel på cleavage mens negativ FLAG flekken indikerer cleavage. (C) Analyse av analysen følgende FLAG farging. Blandede bestander er gjenkjennelig basert på td Tomato strekkode men utvisket i FITC kanal (venstre panel). Når farget med FLAG-FITC antistoff, er bare ett befolkningen positive for FLAG. Dekoding avslører, basert på genetisk barcoding, at denne populasjonen bærer HIV konvolutt mut substrat (høyre panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her to veletablerte prosedyrer har blitt kombinert; genteknologi gjennom retroviral teknologi og påvisning av fluorescerende proteiner utnytte flowcytometri. Fluorescerende proteinbasert genetisk strekkoding for fremstilling av unike cellelinjer gir en robust og enkel måte for multipleksede anvendelser. Generering genetisk konstruerte celler strekkode gjennom retrovirale teknologi, er i utgangspunktet en langvarig prosess, men gjør det mulig å få tak i, når etablert, en pålitelig og stabil kilde til cellematerialet. Arten av denne teknologien konsekvent produserer genmodifisert cellelinjer med jevn fluorescerende egenskaper som blir sin egen sanne skjelnes BioSignature.
Både adherente og ikke-adherente celletyper kan strekkode benytte fluorescerende proteiner som er lett gjenkjennelig på grunnlag av deres fysiske absorbans / emisjonsspektra. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til proteiner, slik som CFP, mCherry, E2 Crimson og td Tomato. Når genetisk strekkode med sin skjelnes fluorescerende protein, kan de kombineres for å frembringe et panel av cellepopulasjoner. Viktigere, inneholder panelet celle populasjoner med nøyaktig genotypisk make-up, men differensiert bare av deres fluorescens egenskap. Som sådan, er disse panelene perfekt egnet for multiplekserte applikasjoner, dermed øker high-throughput evner.
På grunn av de forskjellige insertional preferanser av den retrovirale partikkel i vertsgenomet, sammen med forskjellene i MOI, er variable fluorescensintensiteter fra utføres særlig fluorescerende protein genet forventet. Analyse av en genmodifisert befolkning bærer en unik fluorescerende gen vil dermed oppdage en rekke uttrykk profiler som kan defineres på grunnlag av fluorescens intensitet. Denne differensielle ekspresjonen profilen kan utnyttes til å skape populasjoner som er spektralt adskilt fra hverandre. Man kan dermed combine valg av fluorescerende markører med fluorescens intensitet for å passe den eksperimentelle design. Her, matriser av 4, 6 og 12 populasjoner, som inkluderer to seks befolknings paneler av E2 Crimson og td Tomato, med eller uten EGFP, vises. I teorien kan dette utvides ytterligere med forskjellige intensiteter av EGFP samt for å opprette tre forskjellige populasjoner av fluorescerende proteiner; hver med forskjellige intensiteter i forbindelse med den. Som nevnt tidligere, bør det tas hensyn til når du velger den fluorescerende proteiner for å sikre at separasjon kan faktisk oppnås. Valgte proteiner bør ha tydelig absorbans og emisjonsspekter; Når imidlertid to spektralt skjelnes men lignende fluorescerende proteiner blir brukt, erstatning bør anvendes. Viktigere er skikkelig kompensasjon, noe som gjør det mulig for fysisk separasjon av utslipps / absorbans-spektra blant forskjellige fluoroforer eller fluorescerende proteiner, oppnås ved bruk av hensiktsmessige enkeltfargekontroller fordeteksjon via flowcytometri.
Multipleksing med færre fluorescerende proteiner, men å utnytte en rekke forskjellige intensiteter frigjør flere kanaler som kan deretter ytterligere utnyttes for biologisk anvendelse av interesse. Dette kan øke fleksibiliteten av det eksperimentelle oppsettet, og forenkler valg av en kombinasjon av fluorescerende markører som skal brukes. For eksempel, den multipleksfordelte analysen er vist i figur 5, er avhengig av antistoff-farging, i dette tilfellet koplet til FITC. Som bare PE kanalen er opptatt av genetisk barcoding, kan man utnytte FITC-konjugerte antistoffer, eller omvendt, APC-koblet, en beslutning som kan gjøres basert på den aktuelle instrumentering og / eller antistoff tilgjengelighet.
Mens teknologiske fremskrittene innen flowcytometri, mikroskopi eller kombinerte metoder er imponerende, synes flaskehalsen for å være tilgjengelig for celleteknologi for biologiske applikasjoner og HTS. Retroviral techlogi kombinert med å utvide antall fluorescerende proteiner kan bli slått sammen til å svare på dette spørsmålet. Fluorescerende genetisk strekkoding drastisk forenkler multipleksing, som i sin tur, tilfredsstiller det stadig økende behov for å utvide HTS egenskapene til cellebaserte analyser. Genetisk strekkoding fører til en robust, kostnadseffektiv og enkel måte å kople cellebaserte assays med high-throughput metoder for biologiske applikasjoner og medikament-screening. Kraften til å utføre en heller enn tre skjermer ved hjelp av en tre befolkningspanel har gunstig kostnader og tidsmessige konsekvenser. Med den økende allsidighet i flowcytometri, høy-innhold bildebehandling og flow-cytometri-coupled mikroskopi, vil fluorescerende genetisk barcoding være en konsekvent pålitelig verktøy for analyse utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Dr. Garry Nolan fra Stanford University for å gi Phoenix GP emballasje cellelinje for produksjon av retroviruspartikler. Vi takker Dr. Roger Tsien ved University of California i San Diego for å gi td Tomato. Vi vil også gjerne takke San Diego State University flowcytometrisystemer Kjerne Facility for sin service og hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | used for filtering the virus |
| 0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter | Pall Corporation | 4219 | used for filtering the virus |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 45000-304 | cell growth media for HEK 293T cells |
| PEI (Polyethylenimine) | poly sciences | 23966-2 | 2 mg/ml concentration used |
| Hanging bucket centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5805 000.017 | used for spin infection |
| PBS (phosphate buffered saline) | Corning | 21-040-CV | used for washing of cells |
| Polybrene (hexadimethreen bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration. |
| FACSAria | BD Biosciences | instrument used for sorting cell populations | |
| FACSCanto | BD Biosciences | instrument used for cell analysis | |
| Phoenix-GP | Gift from Gary Nolan | cell line used to produced retroviral particles | |
| Fetal calf serum | Mediatech | MT35015CV | used for cell growth and sorting |
| SupT1 cells | ATCC | CRL-1942 | Human T lymphoblasts |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | cell growth media for SupT1 cells |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527 (1997).
- Godwin, A. R., Stadler, H. S., Nakamura, K., Capecchi, M. R. Detection of targeted GFP-Hox gene fusions during mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13042-13047 (1998).
- Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
- Natarajan, L., Jackson, B. M., Szyleyko, E., Eisenmann, D. M. Identification of evolutionarily conserved promoter elements and amino acids required for function of the C. elegans beta-catenin homolog BAR-1. Dev Biol. 272 (2), 536-557 (2004).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin.Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Valencia-Burton, M., et al. Spatiotemporal patterns and transcription kinetics of induced RNA in single bacterial cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16399-16404 (2009).
- Mahmoud, L., et al. Green fluorescent protein reporter system with transcriptional sequence heterogeneity for monitoring the interferon response.J Virol. 85 (18), 9268-9275 (2011).
- Saunders, M. J., et al. Fluorogen activating proteins in flow cytometry for the study of surface molecules and receptors.Methods. 57 (3), 308-317 (2012).
- Wang, Y. L., Taylor, D. L. Probing the dynamic equilibrium of actin polymerization by fluorescence energy transfer. Cell. 27 (3 Pt 2), 429-436 (1981).
- He, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence (Forster) resonance energy transfer from cyan fluorescent protein to yellow fluorescent protein using single-laser excitation at 458 nm. Cytometry A. 53 (1), 39-54 (2003).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Clayton, A. H., et al. Ligand-induced dimer-tetramer transition during the activation of the cell surface epidermal growth factor receptor-A multidimensional microscopy analysis. J Biol Chem. 280 (34), 30392-30399 (2005).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
- Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Ai, H. W., Shaner, N. C., Cheng, Z., Tsien, R. Y., Campbell, R. E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry. 46 (20), 5904-5910 (2007).
- Mishin, A. S., et al. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry. 47 (16), 4666-4673 (2008).
- Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 48 (31), 5612-5626 (2009).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Klages, N., Zufferey, R., Trono, D. A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther. 2 (2), 170-176 (2000).
- Lai, Z., Brady, R. O. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinanat lentivirus vector. J Neurosci Res. 67 (3), 363-371 (2002).
- Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol Biol. 246, 391-411 (2004).
- Grignani, F., et al. High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein. Cancer Res. 58 (1), 14-19 (1998).
- Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Mol Ther. 2 (5), 458-469 (2000).
- Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6 (3), 127-134 (2000).
- Zhang, X. Y., et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol Ther. 5 (5 Pt 1), 555-565 (2002).
- Rossi, G. R., Mautino, M. R., Morgan, R. A. High-efficiency lentiviral vector-mediated gene transfer into murine macrophages and activated splenic B lymphocytes. Hum Gene Ther. 14 (4), 385-391 (2003).
- Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
- Chan, A. W., Chong, K. Y., Martinovich, C., Simerly, C., Schatten, G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science. 291 (5502), 309-3012 (2001).
- Linney, E., Hardison, N. L., Lonze, B. E., Lyons, S., DiNapoli, L. Transgene expression in zebrafish: A comparison of retroviral-vector and DNA-injection approaches. Dev Biol. 213 (1), 207-2016 (1999).
- Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
- Tiemann, U., et al. Optimal reprogramming factor stoichiometry increases colony numbers and affects molecular characteristics of murine induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 79 (6), 426-435 (2011).
- Leung, A. K., Lamond, A. I. In vivo analysis of NHPX reveals a novel nucleolar localization pathway involving a transient accumulation in splicing speckles. J Cell Biol. 157 (4), 615-629 (2002).
- Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
- Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C.J Cell Biol. 161 (5), 899-909 (2003).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
- Edwards, B. S., Ivnitski-Steele, I., Young, S. M., Salas, V. M., Sklar, L. A. High-throughput cytotoxicity screening by propidium iodide staining. Curr Protoc Cytomt. 9 (Unit 9 24), (2007).
- Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 8 (Unit 8 17), (2007).
- Lu, R., Neff, N. F., Quake, S. R., Weissman, I. L. Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding. Nat Biotechnol. 29 (10), 928-933 (2011).
- Grant, G. D., et al. Live-cell monitoring of periodic gene expression in synchronous human cells identifies Forkhead genes involved in cell cycle control. Mol Biol Cell. 23 (16), 3079-3093 (2012).
- Fiering, S. N., et al. Improved FACS-Gal: flow cytometric analysis and sorting of viable eukaryotic cells expressing reporter gene constructs. Cytometry. 12 (4), 291-301 (1991).
- Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (1991).
- Edwards, B. S., Oprea, T., Prossnitz, E. R., Sklar, L. A. Flow cytometry for high-throughput, high-content screening. Curr Opin Chem Biol. 8 (4), 392-398 (2004).
- Durick, K., Negulescu, P. Cellular biosensors for drug discovery. Biosens Bioelectron. 16 (7-8), 587-592 (2001).
- Edwards, B. S., et al. High-throughput flow cytometry for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 2 (5), 685-696 (2007).
- Sklar, L. A., Carter, M. B., Edwards, B. S. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 7 (5), 527-534 (2007).
- Curpan, R. F., et al. High-throughput screen for the chemical inhibitors of antiapoptotic bcl-2 family proteins by multiplex flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 465-474 (2011).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Trejo, A., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding for multiplex flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 6 (Unit 6 31), (2011).
- Surviladze, Z., Young, S. M., Sklar, L. A. High-throughput flow cytometry bead-based multiplex assay for identification of Rho GTPase inhibitors. Methods Mol Biol. 827, 253-270 (2012).
- Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PLoS One. 8 (1), e53015 (2013).
- Vignali, D. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods. 342 (1-2), 243-255 (2000).
- Hilton, B. J., Wolkowicz, R. An assay to monitor HIV-1 protease activity for the identification of novel inhibitors in T-cells. PLoS One. 5 (6), e10940 (2010).
- Rajakuberan, C., Hilton, B. J., Wolkowicz, R. Protocol for a mammalian cell-based assay for monitoring the HIV-1 protease activity. Methods Mol Biol. 903, 393-405 (2012).
- Smurthwaite, C. A., et al. Fluorescent genetic barcoding in mammalian cells for enhanced multiplexing capabilities in flow cytometry. Cytometry A. 85 (1), 105-113 (2014).
- Stolp, Z. D., et al. A Novel Two-Tag System for Monitoring Transport and Cleavage through the Classical Secretory Pathway - Adaptation to HIV Envelope Processing. PLoS One. 8 (6), e68835 (2013).
- Schwartz, A., et al. Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry. 33 (2), 106-114 (1998).
