Introduction
Такие технологии, как флуоресцентной спектроскопии, флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии, все полагаются на флуоресценции, недвижимость широко используется в биохимических, медико-биологических и химических применений. Флуоресценции, будь внутренняя или с помощью маркировки, эксплуатируется для анализа белковых паттернов экспрессии и профилей, клеточной судьбы, белковых взаимодействий и биологических функций 1-9, а через флуоресценции / Ферстер резонансный перенос энергии для обнаружения биомолекул взаимодействий и конформационных изменений 10-13. Так изоляции Aequorea Виктория зеленого флуоресцентного белка (GFP) 14, открытие дополнительных природных флуоресцентных белков из других кишечнополостных, в частности, кораллы, в значительной степени увеличилось число существующих флуоресцентных белков с различимым спектров возбуждения / эмиссии. Эти, а также с введением мутаций в генах 15-19, ВГАе расширена возможности, получение истинного палитру флуоресцентных белков в распоряжение ученых, которые используют микроскопии, проточной цитометрии и другие флуоресценции на основе технологии для их исследования.
Параллельно, хотя независимо, развитие ретровирусной технологии резко способствовали стабильной экспрессии эктопического генетической информации в клетках млекопитающих 20-23. Таким образом, не удивительно, что эта технология используется для передачи гены флуоресцирующих белков в широком ряде типов клеток и тканей 24-28 или для производства трансгенных животных 29-31. После природе ретровирусов, генетическую информацию о внематочной флуоресцентного белка вводят в геном клетки 32 и клетка становится люминесцентные `для ever'. Это свойство позволило отслеживать судьбу клеток, или из одной клетки в популяции клеток. Теперь люминесцентные ячейка имеет, таким образом, Акуикрасный свою biosignature и может быть определена как Barcoded. Его уникальная biosignature идентифицирует его от других клеток, и, что важно, отличает его от клеток генетически измененных выразить различные белки люминесцентные различимы спектров поглощения / излучения. Биологические приложения, такие как отслеживание факторов перепрограммирования к плюрипотентности 33, анализ субъядерных факторов для выяснения ядрышек локализации 34, строительство люминесцентных репортер плазмид для транскрипции исследований 35 или генетического маркирования нейронов для изучения нейронной сети архитектуры 36 , всего четыре примеры многих, которые эксплуатируются различные гены флуоресцентного белка для той же экспериментальной установке.
Проточной цитометрии был широко используются для анализа биологических процессов на уровне одной клетки, такие как экспрессии генов, клеточного цикла, апоптоза и передачи сигналов через фосфорильнойция 37-43 .The стабильная экспрессия люминесцентных генов белков в клетках млекопитающих еще больше повышает полезность проточной цитометрии для анализа клеток 38,44 и лиганд-рецепторных взаимодействий 45. Расширенные возможности позволили проточной цитометрии, чтобы стать широко используются методология высокой пропускной и высокого содержания скрининга 46. Несмотря на в настоящее время расширенного ряда флуорометры и робототехника технологий, которые могут систем читатель пара плита, изображения и проточной цитометрии, там, кажется, отсутствие в опытно-конструкторских, которые могут использовать и подходят эти расширенные технологические возможности.
Быстрый, надежный, простой и надежной методологии на основе клеток являются резко необходимы для мультиплексированных приложений, которые дальнейшего повышения высокой пропускной способности. Это особенно верно в области открытия лекарств, где анализы инженерные основе клеток в мультиплексной формате может повысить мощность высокопроизводительного скрининга 39,47-50 51-54. Флуоресцентный генетического штриховое кодирование позволяет не только элегантной мультиплексирования, но после того, как инженерии, избежать необходимости протоколов времени, снижает затраты в сопровождении с антителами, шариков и пятен 39,52,55, и может уменьшить количество экранов, необходимые для высокого высокой пропускной способности. Недавно мы описали, как ретровирусный технологии могут повысить мультиплексирование через флуоресцентного генетического штрих-кодирования для биологических применений, путем экспрессии продукта по результатам анализа ранее разработанный, чтобы контролировать ВИЧ-1 протеазы с различными 56,57 клинически распространенных вариантах 58. Методология поясняется в более описательный характер внимание на том, как выбрать и усилить генетически флуоресцентные штрих-кодом клетки и как производить панели клоновых популяциях, выражающие различные флуоресцентные белки и / или другой флуоресценции intensitх гг. Панели клеточных популяций различимых на основе их флуоресцентных характеристик повышения мультиплексированных возможности, которые могут быть дополнительно эксплуатируемых в комбинации с анализов на основе клеток, направленных на решение различных биологических вопросы. Протокол также описывает, как спроектировать панель со штрих клеток, несущих один из анализов на основе клеток ранее разработанных в лаборатории, в качестве примера 59. Этот протокол, таким образом, не предназначены, чтобы показать устоявшуюся ретровирусную / Lentiviral технологии для передачи генетического, значение флуоресцентных белков или приложения проточной цитометрии 60,48, а чтобы показать повышая мощность объединения трех для мультиплексированных применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка клетках млекопитающих, вирусный производства и трансдукции генной штриховое кодирование
- Пластинчатые 2,5 × 10 6 адгезивные клетки в 10 см пластины (или около 50-60% слияния) за один день до трансфекции в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Для ретровирусов использование для производства упаковки клеточной линии выбора, таких как Феникс-GP (своего рода подарок от Гарри Нолан, Стэнфордский университет).
ПРИМЕЧАНИЕ: упаковка клеточная линия стабильно выражает Gag и Pol протеинов для формирования ретровирусов частиц в транс. Убедитесь, что клетки здоровы и присоединились к пластине в виде монослоя, до трансфекции. - 24 ч спустя, подготовить трансфекции ДНК смесь.
- 125 мкл бессывороточной DMEM добавить 3 мкг Вирус везикулярного стоматита гликопротеина оболочки вектор (PCI-VSVg) и 3 мкг передачи вектора, несущего ген флуоресцентного белка. Смешайте и добавьте 15 мкл polyethylimine (2 мг / мл).
- Инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 15 мин и добавляют к клеткам каплям.
Примечание: Polyethylimine добавляется к однородной смеси ДНК в качестве реагента для трансфекции для формирования polyplexes. Для того чтобы получить вирусные частицы, несущие различные флюоресцентные маркеры белка, выполнять каждый независимо друг от друга трансфекции с маркером по выбору. Следует помнить, что ретровирусный вектор переноса составляет около 7 кб в длину и не могут быть упакованы, если выше 10 кб.
- Планшеты инкубируют при 37 ° С. Для того чтобы увеличить производство вирусных место пластины при температуре 30 ° С или 32 ° C вместо.
Примечание: 24 ч после трансфекции носители могут быть заменены 7 мл свежей среды, и, хотя это может улучшить здоровье клеток, что может снизить вирусную нагрузку в надосадочной жидкости. - 48 часов после трансфекции собрать супернатант, содержащий вирусные частицы и фильтр с размером пор 0,45 мкм политетрафторэтилена фильтра. Используйте только что собранной вирусной супернатант для трансдукции. Othслучае производимые держать супернатант в аликвотах при -80 ° C и избежать замораживания-оттаивания. Помните, что титр вируса будет уменьшаться, вероятно, до 50% с каждого цикла замораживания-оттаивания.
- Линия Plate ячейка выбор 24 ч до трансдукции, если единомышленником, или непосредственно перед трансдукции, если не соблюдают. Семенной 2,0 х 10 5 до 3,0 × 10 5 прилипшие клетки (в данном случае Ха 7.5.1 и НЕК 293Т) или 5,0 х 10 5 на 1 × 10 6, не прилипшие клетки (здесь SupT1) на лунку в 6-луночный планшет.
Примечание: Убедитесь, что для калибровки количество клеток, чтобы быть заполнена до трансдукции, особенно для адгезивных клеток, так клетки достичь слияния составляет около 60% в момент трансдукции. - Добавить 5 мкг / мл Полибрен (hexadimethrene бромид), чтобы посеянных клеток, а затем добавить ранее собранной вирусной супернатант, чтобы получить 20-40% инфекции (здесь 2 мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: МВД или процент заражения в основном произвольным, поскольку сортировка позволит усилить и любое subpopulatионов из клетки. Очевидно, что более высокий уровень заражения облегчает и ускоряет процесс усиления. - Трансдукции клеток центрифугированием в роторе ковша висит в 1500 мкг в течение 120 мин при 32 ° С. Ресуспендируют неадгезированных клеток свежей средой перед инкубацией. Для адгезивных клеток, заменить свежей средой 24 ч после трансдукции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы запечатать пластины перед центрифугированием с парафином, чтобы избежать выплескивания. Для увеличения генетически штрих-кодом разнообразие клеток, преобразовывать клетки с вирусными частицами, осуществляющих различные флуоресцентные белки (полученный на стадии 1.4). При выборе флуоресцентных маркеров, убедитесь, что они совместимы с приборами, и они имеют различимые флуоресцентные параметры.
2. Выбор и усиления генетически Barcoded клеток
- Анализ трансдуцированных клеток млекопитающих с помощью проточной цитометрии по меньшей мере, 72 часов после трансдукции для количественного определения процентной ставки трансдукции, Используйте сравнимую линии, не трансдуцировали клеток в качестве отрицательного контроля.
ПРИМЕЧАНИЕ: как сортировка будет использоваться для очистки отдельных популяций штрих-кодом клеток, высокой процентной ставкой первоначального трансдукции, в то время как не надо, следует ускорить процесс усиления. - Использование сотового сортировщик выбора, чтобы получить клетки, которые экспрессируют белок, представляющий интерес.
- Для этого, убедитесь, что ворота правильно установить в нужных каналов.
- Для этого используйте один и тот же наивный клеточной линии в качестве отрицательного контроля и установить напряжение параметр / канал, так что отрицательный население ниже значения 10 3 на каждой люминесцентной оси. Определить стробирования для положительного флуоресценции как события, которые появляются выше, чем отрицательного контроля для каждого флуоресцентного канала.
- Помните, что каждый инструмент может изменяться и правильное напряжение для определения стробирования должны быть соответствующим образом скорректированы, делая положительные и отрицательные контроли императив в каждом ехрerimental настройки.
- Для обнаружения флуоресценции в этой экспериментальной установки использовать канал FITC (530/30 полосовой фильтр сопровождаемое 502 длинный пас фильтра) для EGFP, РЕ канал (585/42 полосовой фильтр сопровождаемое 556 длинный пас фильтра) для тд Помидор и канал АРС (660/20 полосовой фильтр) для Е2 Темно-красного.
ПРИМЕЧАНИЕ: 488 нм лазер возбуждает EGFP и т.д Помидор, а E2 Багровый возбуждается 633 нм лазера.
- Для обнаружения флуоресценции в этой экспериментальной установки использовать канал FITC (530/30 полосовой фильтр сопровождаемое 502 длинный пас фильтра) для EGFP, РЕ канал (585/42 полосовой фильтр сопровождаемое 556 длинный пас фильтра) для тд Помидор и канал АРС (660/20 полосовой фильтр) для Е2 Темно-красного.
- Для этого, убедитесь, что ворота правильно установить в нужных каналов.
- Сортировка в 15 мл конические пробирки с 1 мл 100% FCS.
ПРИМЕЧАНИЕ: процесс сортировки флуоресцентные клеточных популяций не является обязательным, как можно непосредственно приступить к своего рода индивидуальных клонов (см ниже). Сортировка жесткие населения зависят от выбранной флуоресценции обеспечивает население резервного копирования для будущего выбора отдельных клонов. Имейте в виду, что отдельные клетки порой трудно расти, а большая популяция клеток может быть легко заморожены, а затем разморожены и усиливается на более позднем этапе. - Spв вниз отсортированных населения в подвесной ведро ротора центрифуги на 524 г при 32 ° С в течение 5 мин для осаждения клеток. Повторное приостановить в 1 мл свежей средой и повторно пластины клеток таким образом, что клетки конфлюентности ниже 60%, чтобы обеспечить рост и деление, по крайней мере, двух дней.
- Например, пластины прилипшие клетки в около 3 х 10 5 клеток в 2 мл среды на лунку в 6-луночный планшет и 2 × 10 6 клеток в 2 мл среды в 6 см пластины. Использование DMEM для адгезивных клеток и RPMI для не-адгезивные клетки (или любой указанной среде при необходимости). Поместите плакированные клетки в инкубаторе при 37 ° С в течение нескольких дней, чтобы позволить амплификации.
3. Получить клоновых популяциях генетически Barcoded клеток с различной интенсивностью
- Получение клональных популяций клеток из первоначально трансдуцированных (шаг 1,7) или из отсортированного населения (этап 2.3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечит равномерное или аналогичный уровень экспрессии флуоресцентного белка среди всех клеткес в популяции (плотно население с небольшим резюме в средней интенсивности флуоресценции на 40%).- С этой целью, вроде отдельные клетки в 96-луночных планшетах с блоком автоматизированной осаждения клеток (АСДУ). Установите ворота для сортировки по населению, представляющих интерес. Обеспечить ворота устанавливаются по крайней мере, один журнал масштаба на части, чтобы получить различимые населения при выборе клеток при различных флуоресцентных интенсивности. Для процедуры, показанной здесь, используют один и тот же проточной цитометрии экспериментальной установки, как описана на стадии 2.2.
- Amplify отдельных клонов в термостате при 37 ° С в течение по меньшей мере 2 недель. Через процесс амплификации анализа клеток под микроскопом, чтобы гарантировать, что рост численности населения возникают из отдельных клеток, а не из более чем одного.
ПРИМЕЧАНИЕ: Помните, что сортировщик будет разместить одну ячейку на лунку в среднем, и, хотя некоторые скважины не могут иметь любую ячейку на всех, другие могут иметь более чем один.- Чтобы убедиться, что ПОмахинация развивается из одной клетки только чрезвычайно нежны с плиты и никогда не беспокоить скважин с помощью пипетки. Обратите внимание на пластину, а хорошо, под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя отдельные клетки могут порой трудно определить, когда они начинают делиться, они будут легко узнаваемы. - Помните, что часто клетки "комок" по краям. Отменить эти скважины, где можно наблюдать несколько клоновых населения и сохранить те, что есть один жесткий населения.
Примечание: Желательно, чтобы передать те, в более крупные пластины для усиления.
- Чтобы убедиться, что ПОмахинация развивается из одной клетки только чрезвычайно нежны с плиты и никогда не беспокоить скважин с помощью пипетки. Обратите внимание на пластину, а хорошо, под микроскопом.
- Экран предполагаемые клоновых населения путем анализа их с помощью проточной цитометрии. Сравнение их отрицательного контроля с использованием того же проточной цитометрии экспериментальной установки.
- Анализ только процент от образца и держать остальных в качестве резервного. Выберите наиболее отчетливо отдельные популяции, основанные на средней интенсивности и плотности населения. Усильте их по мере необходимости или заморозить акции взамораживания средств массовой информации с 20% глицерина при -80 ° С в течение коротких периодов времени или жидким азотом для дольше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Помните, что "истинный" клональный население должно иметь очень плотный узор флуоресценции.
- Анализ только процент от образца и держать остальных в качестве резервного. Выберите наиболее отчетливо отдельные популяции, основанные на средней интенсивности и плотности населения. Усильте их по мере необходимости или заморозить акции взамораживания средств массовой информации с 20% глицерина при -80 ° С в течение коротких периодов времени или жидким азотом для дольше.
4. Убедитесь, мультиплексирования возможности для высокопроизводительного скрининга (HTS)
- Зерноуборочный как много различных клоновых популяций, которые при необходимости могут быть дополнительно использованы в мультиплексном формате. Выберите клонов с различимым поглощения / спектрах испускания и / или разной интенсивности. Если формат 96-луночный планшет используется, который подходит для HTS, семян 50000 клеток в 200 мкл на лунку.
Примечание: имейте в виду, что количество клеток только ориентировочным и может быть изменяются в зависимости от типа клеток и является ли это приверженец или нет. - Анализ образца с помощью проточной цитометрии, чтобы гарантировать, что каждый из независимых установленных клеточных линий флуоресцентных можно отличить друг от друга. Перед анализом готовят отрицательноеи одиночные управления цветом для настройки параметров и значений компенсации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка параметров четко различать смешанные популяции позволит им в дальнейшем использоваться в мультиплексной формате.
5. Адаптация генетически Barcoded клеточных линий на биологической применения выбор
- Трансдукции, установленные генетически Barcoded клеточных линий с вирусными частицами, которые содержат анализа элементов выбора, как описано здесь, в Stolp и др., 2013 59. Следует помнить, что этот анализ выбора должен занимать дополнительные и различимый флуоресцентный канал и, таким образом, он должен быть переведен в соответствующее Barcoded клеточной линии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый штрих-кодом клеточная линия может нести различное анализа. - Сортировать генетически флуоресцентные Barcoded клетки для тех, которые содержат опробования элементов.
Примечание: Аналитические элементы могут быть сконструированы в сочетании с меткой или флуоресцентного белка (в виде гибрида или через внутренний сайт входа рибосомы) Fили просто обнаружение через вестерн-блоттинга, проточной цитометрии или микроскопии. Система используется в данном протоколе зависит от эпитопа HA поверхностной экспрессии в одиночку, или с дополнительной экспрессии эпитопа FLAG.- Пятно клоновых населения, содержащие анализ с HA и APC-флуоресцентной связанных антител. Тогда проанализировать клоновых населения с анти-FLAG и окрашивания FITC-конъюгированных антител.
- Для отслеживания обратно анализ, анализ или «декодировать» население в соответствующем канале, где различные генетически Barcoded клеточные линии могут быть выделены. Здесь декодировать природы подложки на основе анализа в канале PE для обнаружения тд томатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мультиплексирование флуоресцентный генетически Barcoded клеток с целью биологических применений может быть достигнуто только когда отдельные клоновых популяции были получены. Multiplexing является наиболее эффективным, когда штрих-кодом группы населения имеют четкие различных флуоресцентных характеристик с минимальными спектрального перекрытия. В примере, показанном на фиг.1, с клональных популяций млекопитающих SupT1 клетки показывает, что Barcoded клетки с mCherry и циано флуоресцентного белка (CFP) может быть легко проанализирована одновременно без потери их отдельные флуоресцентные свойства. Таким образом, эта матрица является примером панель флуоресцентных генетически Barcoded клеток, что может использоваться для мультиплексирования биологических применений с отсчетом в еще одном дополнительном доступного канала. Для того, чтобы получить такую группу важно помнить, характер ретровирусов технологии, которые приведут к переменной диапазонов флуоресцентных интенсивности в популяции из-за инсерционного EFдефекты и / или МВД. Рисунок 2 иллюстрирует, что начальное трансдукции клеток млекопитающих с вирусные частицы, содержащие либо тд томатном или Е2 Crimson результаты в клетках, которые экспрессируют один или оба из флуоресцирующих белков в широком диапазоне интенсивностей (слева). Выбор и сортировка одиночных клеток в 96-луночных планшетах, как показано в закрытых коробках (середина панели), позволяет получить плотные клоновых популяций следующие расширения (справа). Жесткой населения должны быть определены как имеющие небольшую CV, которые могут варьироваться в зависимости от типа клеток, как правило, 30-40%, в средней интенсивности флуоресценции. Рисунок 2 иллюстрирует также, что для дальнейшего увеличения числа генетически со штрих популяций с матрицей только два флуоресцентные белки, можно также использовать интенсивность флуоресценции. Как правило, один отклонение журнала интенсивности флуоресценции средней между популяциями подходит для достижения надлежащего разделения друг от друга с сортировки и amplificaния. Td Томатный был выбран в показанном примере, чтобы проиллюстрировать эту функцию, где две популяции, отличающихся интенсивностью, средних и высоких, были получены для мультиплексирования с Е2 Crimson, на одном интенсивности.
Multiplexing является мощным инструментом для облегчения анализа многих образцов в то же время и по способности декодировать масках населения. Повышение мультиплексирования может быть достигнуто с еще третьего флуоресцентного белка, такие как EGFP, до тех пор, спектральные свойства не мешают друг другу. В экспериментальной методике, показанной на фиг.3 панель из шести популяций, полученных с тд помидоров и E2 Темно-красного была использована для увеличения мультиплексирование с EGFP. Технология ретровирусных был использован для передачи EGFP для населения, представленных в одной из матриц. При наблюдении в канале EGFP, незеленых наивно матрица шести населения (верхняя левая панель на рисунке 3) ничем не отличается от EGFP-ТрансдуцированныеМатрица населения (в левом нижнем панель на рисунке 3). Важно отметить, что панели могут быть проанализированы в каналах, занимаемых исходного генетического штрих-кода (TD помидоров и Е2 малиновый). В то время как неразличимы в этих каналах (ср популяций 1-6 с населением 7-12 в середине панели, рис 3), индивидуальный популяции могут быть проанализированы в канале EGFP и декодируются и гусеничных назад, как показано на гистограммах (справа панели в Рисунок 3). После повторения процесса трансдукции, отбора, сортировки и усиления, воспользовавшись незанятых каналов бесполезно, если право компенсации не применяется для корректировки возможной спектральной перекрытия. Чтобы доказать это, когда их популяции 1, 2, 3 (не зеленые) и 7, 8, 9 (зеленый) анализируются в EGFP и т.д Томатный каналов, население 7 и 8 трудно отличить (левая панель на рисунке 4) , Таким образом, необходимо выбрать наивных клеток (население 1) в качестве отрицательного ConТроль так, что параметры приборов могут быть установлены. При анализе любую матрицу, особенно с флуорофорами, что спектрально перекрываются, необходимо, что отдельные управления цветом используются для определения правильных значений компенсации. При анализе рис 4 популяции 2 или 3, и 7 служат этой цели, что позволяет более точно определить популяции, которые действительно дважды положительные (популяции 8 и 9).
Генетически Barcoded клетки с флуоресцентными маркерами сохранить свою самобытность, как это определено их biosignature, при анализе в правильном флуоресцентного канала с правой инструмента. Тем не менее, biosignature становится просто дополнительный индивидуальной собственности, если не использовались для биологических применений. Для того, чтобы доказать силу флуоресцентного генетического штрих-кодирования для мультиплексирования мы решили представить одного из наших ранее разработанных тестов для обнаружения наркотиков в некоторых флуоресцентных со штрих клеточных линий млекопитающих. Поступая таким образом, fluorescЛОР генетический штриховое кодирование было использовано для достижения трех анализов в одном образце. В этой процедуре каркасный белок, содержащий один из трех предполагаемого вирусного субстрата для протеолиза переносили в генетически Barcoded клеток. В анализе, отщепление раскрывается потери FLAG эпитопом на клеточной поверхности (фиг.5В). В отличие от этого, окрашивание FLAG поверхность представляет отсутствие расщепления фиг.5 показан результат анализа трех различных субстратов.; ВИЧ-1 конверт дикого типа (Env вес), ВИЧ-1 конверт мутант (ENV Мут), и денге Вирус (DenV) PRM. Каждый из них был введен в 1 из 3 со штрих клеточных линий, наивный, и 2 других, использующих TD Помидор с разной интенсивностью (средние и высокие, рисунок 5А). Окрашивание для экспрессии ФЛАГ поверхности показывает, какой из субстратов расщепляется на основе соответствующего штрих-кода. В примере только ВИЧ Env Mut сохраняет флаг метки (положительное) с последующим окрашиванием, как показано на зеленый-FITC канала (5С, прямо нижняя панель). Анализ анализа, таким образом, осуществляется независимо от исходного штрих-кодирования, и в дальнейшем использована для декодирования и отслеживать назад различные группы населения. Этот способ мультиплексирования, таким образом, зависит от дополнительного канала, зарезервированного для биологической считывания интерес.
Рисунок 1:. Штриховое кодирование для мультиплексирования отдельных популяций, генетически штрих-кодом, используя различные флуоресцентные белки, такие как mCherry, CFP или оба (левая панель) могут быть смешаны, проанализированы и декодируется (правая панель) в своих каналов через проточной цитометрии. Взято из Smurthwaite, С. и др., 2014 58. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2:. Сортировка и усиление со штрих клеток млекопитающих клетки анализировали 48 ч следующую трансдукции вирусных частиц, содержащих либо TD Помидор или E2-Crimson, (левая панель). Ворота затем установите для сортировки включить клетки, экспрессирующие TD Помидор с разной интенсивностью, с / без Е2 Crimson, (средняя панель). Клоны сортов были усилены и повторно проанализированы, чтобы создать матрицу из шести различимых групп населения (правая панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3:. Расшифровка показывает масках населения матрицыиз шести населения, полученных на рисунке 2 (TD Помидор и / или E2-Crimson) могут быть дополнительно разработаны, чтобы выразить дополнительную флуоресцентный белок, такой как EGFP. (А) исходная матрица, при анализе в канале EGFP (слева) является отрицательным и шесть популяции неотличимы друг от друга. Каждый из шести групп может быть независимо анализировали в канале EGFP, как показано на гистограммах (справа) панелей. (B) та же матрица, в настоящее время выражая также EGFP, была проанализирована как в A, открывая теперь их зеленый флуоресцентный характеристику. Взято из Smurthwaite, С. и др., 2014 58. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Компенсация обеспечивает правильное разделение Некоторые из населения, первоначально отобранных на основе тд помидоров и / или EGFP выражения (населения 7 и 8) не может быть должным образом разделены при анализе вместе (левая панель), если соответствующей компенсации для этих каналов не регулируется (в порядке. панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5:. Выбор со штрих клеток для дальнейшей адаптации к выбранной анализа () Выбор и адаптация к анализе выбора. Популяции генетически штрих-кодом с тд Помидор при различной интенсивности (верхняя левая панель) были использованы для биологических применений. Каждый из популяций далее разработаны для содержат анализ, который контролирует расщепление, Но каждый из другого субстрата (верхняя правая панель). (В) изображен анализа. Положительный FLAG пятно указывает отсутствие расщепления в то время как отрицательный FLAG пятно указывает расщепление. (C) Анализ анализа с последующим окрашиванием флаг. Смешанные популяции различимы на основе тд Томатный штрих-код, но неотличимым в канале FITC (слева панели). При окраске с FLAG-FITC антитела, единственная популяция является положительным для флага. Расшифровка показывает, на основе генетического штрих-кодирования, что это население несет ВИЧ Env матовая подложка (правая панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Вот два хорошо установленных процедур были объединены; генная инженерия через ретровирусов технологии и обнаружения флуоресцентных белков с использованием проточной цитометрии. Флуоресцентного белка на основе генетического штрих кода для производства уникальных клеточных линий обеспечивает надежную и простой способ для мультиплексированных применений. Создание генетически модифицированных штрих-кодом клетки через ретровирусов технологии, изначально длительный процесс, но позволяет получить после того, как установлено, надежный и стабильный источник клеточного материала. Характер этой технологии постоянно производит генно-инженерных клеточных линий с устойчивой люминесцентных характеристик, которые становятся их собственное истинное различимы biosignature.
Как адгезивные и не адгезивные типы клеток могут быть Barcoded использованием флуоресцентные белки, которые легко различимы на основе их физических спектров поглощения / излучения. Они включают, но не ограничиваются белков, таких как CFP, mCherry, E2 Багровый и т.д помидор. После того, как генетически Barcoded с их различимого флуоресцентного белка, они могут быть объединены для получения панели из клеточных популяций. Важно отметить, что панель содержит клеточных популяций с точным генотипической макияж, но дифференцированной только по их флуоресценции признака. Таким образом, эти панели идеально подходят для мультиплексированных приложений, что значительно усиливает возможности с высокой пропускной способностью.
Из-за различных инсерционных предпочтений ретровирусной частицы в геном хозяина, в сочетании с различиями в МВД, переменной интенсивности флуоресценции от проводимой конкретной гена флуоресцентного белка, как ожидается. Анализ генной инженерии населения, несущего уникальный флуоресцентный ген, таким образом, обнаружить диапазон профилей экспрессии, которые могут быть определены на основе интенсивности флуоресценции. Этот профиль дифференциальное выражение может быть использовано для создания групп населения, которые являются спектрально отличаются друг от друга. Таким образом, можно комбиNE выбор флуоресцентных маркеров с интенсивностью флуоресценции для подгонки экспериментальных дизайн. Здесь матрицы 4, 6 и 12 популяций, которые включают в себя два 6 населения панели Е2 Crimson, и т.д помидор, с или без EGFP, показаны. В теории, это может быть расширена с различной интенсивностью EGFP, а для создания популяции 3 различных флуоресцентных белков; каждый с разной интенсивностью, связанных с ним. Как указывалось ранее, следует соблюдать осторожность при выборе флуоресцентные белки, чтобы гарантировать, что разделение действительно может быть достигнута. Выбранные белки должны иметь четкую оптическую плотность и спектры излучения; Однако, когда два спектрально различимые, но подобные флуоресцентные белки используются, компенсация должна быть применена. Важно отметить, что надлежащая компенсация, которая позволяет физического разделения выбросов / абсорбции спектров между различными флуорофоров или флуоресцентных белков, осуществляется с использованием соответствующих одиночных управления цветом дляОбнаружение с помощью проточной цитометрии.
Мультиплексирование с меньшим количеством флуоресцирующих белков, но используя различные интенсивности освобождает дополнительные каналы, которые могут быть затем дополнительно эксплуатируемых для биологического применения интерес. Это может увеличить гибкость экспериментальной установки и упростить выбор комбинации флуоресцентных маркеров, которые будут использоваться. Например, мультиплексированный анализе, показанном на фиг.5 зависит от окрашивания антител, в этом случае в сочетании с FITC. Как только канал PE занимают генетического штрих-кодирования, можно использовать FITC-сопряженных антител или, наоборот, APC связью, решение, которое может быть сделано на основании соответствующего инструментария и / или доступности антител.
В то время как технологические достижения в области проточной цитометрии, микроскопия или комбинированные методики впечатляют, узким местом, как представляется, имеется клеточной технологии для биологических применений и ВТСП. Ретровирусная Технологиялогии в сочетании с расширением числа флуоресцентных белков могут быть объединены, чтобы ответить на этот вопрос. Люминесцентная генетический штриховое кодирование резко облегчает мультиплексирование, который, в свою очередь, удовлетворяет растущую потребность в расширении ВТС возможности клеточных анализов. Генетическая штриховое кодирование приводит к надежной, экономически эффективной и простой способ пару анализов на основе клеток с высокой пропускной методологий для биологических применений и скрининга лекарственных средств. Мощность выполнения, а одного тремя экранами с использованием панели 3 населения оказывает благотворное стоимости и времени, связанных с последствиями. С ростом универсальность в проточной цитометрии, высокой содержание изображений и потока цитометрии в сочетании микроскопии, флуоресцентный генетический штриховое кодирование будет последовательно надежный инструмент для развития анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Гарри Нолан из Стэнфордского университета для обеспечения упаковки клеточной линии Phoenix GP для производства ретровирусных частиц. Мы благодарим доктора Роджера Цяня из Калифорнийского университета в Сан-Диего для обеспечения TD помидор. Мы хотели бы также поблагодарить Сан-Диего государственный университет проточной цитометрии основной комплекс для их обслуживания и помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | used for filtering the virus |
| 0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter | Pall Corporation | 4219 | used for filtering the virus |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 45000-304 | cell growth media for HEK 293T cells |
| PEI (Polyethylenimine) | poly sciences | 23966-2 | 2 mg/ml concentration used |
| Hanging bucket centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5805 000.017 | used for spin infection |
| PBS (phosphate buffered saline) | Corning | 21-040-CV | used for washing of cells |
| Polybrene (hexadimethreen bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration. |
| FACSAria | BD Biosciences | instrument used for sorting cell populations | |
| FACSCanto | BD Biosciences | instrument used for cell analysis | |
| Phoenix-GP | Gift from Gary Nolan | cell line used to produced retroviral particles | |
| Fetal calf serum | Mediatech | MT35015CV | used for cell growth and sorting |
| SupT1 cells | ATCC | CRL-1942 | Human T lymphoblasts |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | cell growth media for SupT1 cells |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527 (1997).
- Godwin, A. R., Stadler, H. S., Nakamura, K., Capecchi, M. R. Detection of targeted GFP-Hox gene fusions during mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13042-13047 (1998).
- Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
- Natarajan, L., Jackson, B. M., Szyleyko, E., Eisenmann, D. M. Identification of evolutionarily conserved promoter elements and amino acids required for function of the C. elegans beta-catenin homolog BAR-1. Dev Biol. 272 (2), 536-557 (2004).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin.Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Valencia-Burton, M., et al. Spatiotemporal patterns and transcription kinetics of induced RNA in single bacterial cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16399-16404 (2009).
- Mahmoud, L., et al. Green fluorescent protein reporter system with transcriptional sequence heterogeneity for monitoring the interferon response.J Virol. 85 (18), 9268-9275 (2011).
- Saunders, M. J., et al. Fluorogen activating proteins in flow cytometry for the study of surface molecules and receptors.Methods. 57 (3), 308-317 (2012).
- Wang, Y. L., Taylor, D. L. Probing the dynamic equilibrium of actin polymerization by fluorescence energy transfer. Cell. 27 (3 Pt 2), 429-436 (1981).
- He, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence (Forster) resonance energy transfer from cyan fluorescent protein to yellow fluorescent protein using single-laser excitation at 458 nm. Cytometry A. 53 (1), 39-54 (2003).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Clayton, A. H., et al. Ligand-induced dimer-tetramer transition during the activation of the cell surface epidermal growth factor receptor-A multidimensional microscopy analysis. J Biol Chem. 280 (34), 30392-30399 (2005).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
- Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Ai, H. W., Shaner, N. C., Cheng, Z., Tsien, R. Y., Campbell, R. E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry. 46 (20), 5904-5910 (2007).
- Mishin, A. S., et al. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry. 47 (16), 4666-4673 (2008).
- Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 48 (31), 5612-5626 (2009).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Klages, N., Zufferey, R., Trono, D. A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther. 2 (2), 170-176 (2000).
- Lai, Z., Brady, R. O. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinanat lentivirus vector. J Neurosci Res. 67 (3), 363-371 (2002).
- Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol Biol. 246, 391-411 (2004).
- Grignani, F., et al. High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein. Cancer Res. 58 (1), 14-19 (1998).
- Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Mol Ther. 2 (5), 458-469 (2000).
- Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6 (3), 127-134 (2000).
- Zhang, X. Y., et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol Ther. 5 (5 Pt 1), 555-565 (2002).
- Rossi, G. R., Mautino, M. R., Morgan, R. A. High-efficiency lentiviral vector-mediated gene transfer into murine macrophages and activated splenic B lymphocytes. Hum Gene Ther. 14 (4), 385-391 (2003).
- Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
- Chan, A. W., Chong, K. Y., Martinovich, C., Simerly, C., Schatten, G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science. 291 (5502), 309-3012 (2001).
- Linney, E., Hardison, N. L., Lonze, B. E., Lyons, S., DiNapoli, L. Transgene expression in zebrafish: A comparison of retroviral-vector and DNA-injection approaches. Dev Biol. 213 (1), 207-2016 (1999).
- Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
- Tiemann, U., et al. Optimal reprogramming factor stoichiometry increases colony numbers and affects molecular characteristics of murine induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 79 (6), 426-435 (2011).
- Leung, A. K., Lamond, A. I. In vivo analysis of NHPX reveals a novel nucleolar localization pathway involving a transient accumulation in splicing speckles. J Cell Biol. 157 (4), 615-629 (2002).
- Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
- Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C.J Cell Biol. 161 (5), 899-909 (2003).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
- Edwards, B. S., Ivnitski-Steele, I., Young, S. M., Salas, V. M., Sklar, L. A. High-throughput cytotoxicity screening by propidium iodide staining. Curr Protoc Cytomt. 9 (Unit 9 24), (2007).
- Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 8 (Unit 8 17), (2007).
- Lu, R., Neff, N. F., Quake, S. R., Weissman, I. L. Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding. Nat Biotechnol. 29 (10), 928-933 (2011).
- Grant, G. D., et al. Live-cell monitoring of periodic gene expression in synchronous human cells identifies Forkhead genes involved in cell cycle control. Mol Biol Cell. 23 (16), 3079-3093 (2012).
- Fiering, S. N., et al. Improved FACS-Gal: flow cytometric analysis and sorting of viable eukaryotic cells expressing reporter gene constructs. Cytometry. 12 (4), 291-301 (1991).
- Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (1991).
- Edwards, B. S., Oprea, T., Prossnitz, E. R., Sklar, L. A. Flow cytometry for high-throughput, high-content screening. Curr Opin Chem Biol. 8 (4), 392-398 (2004).
- Durick, K., Negulescu, P. Cellular biosensors for drug discovery. Biosens Bioelectron. 16 (7-8), 587-592 (2001).
- Edwards, B. S., et al. High-throughput flow cytometry for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 2 (5), 685-696 (2007).
- Sklar, L. A., Carter, M. B., Edwards, B. S. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 7 (5), 527-534 (2007).
- Curpan, R. F., et al. High-throughput screen for the chemical inhibitors of antiapoptotic bcl-2 family proteins by multiplex flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 465-474 (2011).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Trejo, A., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding for multiplex flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 6 (Unit 6 31), (2011).
- Surviladze, Z., Young, S. M., Sklar, L. A. High-throughput flow cytometry bead-based multiplex assay for identification of Rho GTPase inhibitors. Methods Mol Biol. 827, 253-270 (2012).
- Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PLoS One. 8 (1), e53015 (2013).
- Vignali, D. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods. 342 (1-2), 243-255 (2000).
- Hilton, B. J., Wolkowicz, R. An assay to monitor HIV-1 protease activity for the identification of novel inhibitors in T-cells. PLoS One. 5 (6), e10940 (2010).
- Rajakuberan, C., Hilton, B. J., Wolkowicz, R. Protocol for a mammalian cell-based assay for monitoring the HIV-1 protease activity. Methods Mol Biol. 903, 393-405 (2012).
- Smurthwaite, C. A., et al. Fluorescent genetic barcoding in mammalian cells for enhanced multiplexing capabilities in flow cytometry. Cytometry A. 85 (1), 105-113 (2014).
- Stolp, Z. D., et al. A Novel Two-Tag System for Monitoring Transport and Cleavage through the Classical Secretory Pathway - Adaptation to HIV Envelope Processing. PLoS One. 8 (6), e68835 (2013).
- Schwartz, A., et al. Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry. 33 (2), 106-114 (1998).
