Introduction
Tekniker som fluorescensspektroskopi, fluorescensmikroskopi och flödescytometri, alla förlitar sig på fluorescens, en egenskap utnyttjas i stor utsträckning i biokemiska, biomedicinska och kemiska tillämpningar. Fluorescens, vare inneboende eller genom märkning, har utnyttjats för analys av proteinuttrycksmönster och profiler, cell öde, proteininteraktioner och biologiska funktioner 1-9, och genom fluorescens / Förster resonans energiöverföring för detektion av biomolekyler interaktioner och konformationsförändringar 10-13. Eftersom isoleringen av Aequorea victoria grönt fluorescerande protein (GFP) 14, upptäckten av ytterligare naturligt förekommande fluorescerande proteiner från andra nässeldjur, särskilt koraller, till stor del har ökat antalet befintliga fluorescerande proteiner med urskiljbara excitation / emissionsspektra. Dessa, tillsammans med införandet av mutationer i sina gener 15-19, have utökas ytterligare möjligheter, få en verklig palett av fluorescerande proteiner tillgängliga för forskare som utnyttjar mikroskopi, flödescytometri och andra fluorescensbaserade teknologier för sin forskning.
Parallellt, även oberoende, utvecklingen av retrovirala teknik har drastiskt lättat stabilt uttryck av ektopisk genetisk information i däggdjursceller 20-23. Det är därför inte förvånande att denna teknik har använts för att överföra gener av fluorescerande proteiner i ett brett antal celltyper och vävnader 24-28 eller för produktion av transgena djur 29-31. Efter naturen av retrovirus är den genetiska informationen av den ektopiska fluorescerande proteinet introducerades inom genomet hos cellen 32 och cellen blir fluorescerande 'för ever'. Denna fastighet har tillåtit spårning av cell öde, eller av en enda cell inom en population av celler. Den nu fluorescerande cell har sålunda acquiröd egen Biosignature och kan definieras som barcoded. Dess unika Biosignature identifierar den från andra celler, och viktigare, skiljer den från celler genmanipulerade för att uttrycka olika fluorescerande proteiner med urskiljbara absorption / emissionsspektra. Biologiska applikationer såsom spårning av omprogrammering faktorer mot pluripotens 33, analysen av subnukleära faktorer för att klarlägga nukleolär lokalisering 34, byggandet av fluorescerande reporterplasmider för transkriptions studier 35 eller den genetiska märkning av nervceller för studier av neuronala nätverksarkitektur 36 , är bara fyra exempel på de många som har utnyttjat olika fluorescerande proteingener för samma experimentuppställning.
Flödescytometri har i stort sett utnyttjats för analys av biologiska processer på en enda cell nivå, såsom genuttryck, cellcykeln, apoptos, och signalering genom fosforyl-ation 37-43 .Den stabilt uttryck av fluorescerande protein gener i däggdjursceller har förbättrats ytterligare nyttan av flödescytometri för cellanalys 38,44 och ligand-receptorinteraktioner 45. Förbättrade funktioner har tillåtit flödescytometri för att bli en allmänt utnyttjad metod för hög genomströmning och hög halt screening 46. Trots det nu utökat antalet fluorometrar och robotteknik som par plattläsarsystem, bildbehandling och kan flödescytometri, det verkar finnas en brist i experimentell design som kan utnyttja och montera dessa förbättrade tekniska möjligheter.
Snabba, tillförlitliga, enkla och robusta cellbaserade metoder drastiskt behövs för multiplexerade applikationer som ytterligare förstärker hög genomströmningskapacitet. Detta gäller särskilt inom området läkemedelsutveckling där ingenjörs cellbaserade analyser i en multiplex-format kan öka kraften i high-throughput screening 39,47-50 51-54. Fluorescerande genetisk streckkodning gör inte bara för eleganta multiplexering, men också, en gång konstruerad, kringgår behovet av tidskrävande protokoll, minskar kostnaderna tillsammans med antikroppar, pärlor och fläckar 39,52,55, och kan minska antalet skärmar som krävs för hög- genomströmning applikationer. Vi har nyligen beskrivit hur retroviral teknik kan förbättra multiplexering genom fluorescerande genetisk barcoding för biologiska tillämpningar, genom att uttrycka en analys tidigare utvecklat för att övervaka HIV-1 proteas aktivitet 56,57 med olika kliniskt vanligaste varianterna 58. Metodiken förklaras på ett mer beskrivande sätt med fokus på hur man väljer och förstärker genetiskt fluorescerande streckkod celler och hur man producerar paneler av klonpopulationer som uttrycker olika fluorescerande proteiner och / eller annan fluorescens intensittalet. Paneler av cellpopulationer urskiljbara baserat på deras fluorescerande egenskaper förbättrar multiplexerade kapacitet, som kan utnyttjas ytterligare i kombination med cellbaserade analyser som tar itu olika biologiska frågor. Protokollet beskriver också hur man konstruera en panel av streckkodade celler som bär en av cellbaserade analyser som tidigare utvecklats i laboratoriet, som exempelvis 59. Detta protokoll är således inte avsedd att visa den väletablerade retroviral / lentiviral teknik för genetisk överföring, värdet av fluorescerande proteiner eller tillämpningar av flödescytometri 60,48 utan snarare att visa att öka kraften i att kombinera tre för multiplexerade applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av däggdjursceller, Viral Produktion och transduktion för genetisk Barcoding
- Plate 2,5 x 10 6 vidhäftande celler i en 10 cm platta (eller omkring 50 till 60% konfluens) en dag före transfektion i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 10% fetalt kalvserum (FCS). För retroviral produktionsemballage cellinje val som Phoenix-GP (en slags gåva från Gary Nolan, Stanford University).
OBS: Den packande cellinjen uttrycker stabilt Gag och Pol proteiner för retroviral partikelbildning i träns. Se till celler är friska och vidhäftade till plattan i ett monoskikt, före transfektion. - 24 tim senare, förbereda DNA transfektionsblandningen.
- Till 125 | il av serumfritt DMEM till 3 ug vesikulärt stomatitvirus-höljesglykoproteinet vektor (pCI-VSVG) och 3 | ig överföringsvektor som bär den fluorescerande proteingenen av intresse. Blanda och tillsätt 15 pl polyetylimin (2 mg / ml).
- Inkubera blandningen vid rumstemperatur under 15 minuter och tillsätt till celler droppvis.
OBS: polyetylimin sättes till den homogena DNA-blandningen som transfektionsreagens för bildandet av polyplex. För att erhålla viruspartiklar som bär olika fluorescerande proteinmarkörer, utför varje transfektion självständigt med markör för val. Kom ihåg att det retroviral överföringsvektor är cirka 7 kb i längd och kan inte paketeras om över 10 kb.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C. För att öka virusproduktionen place plattor vid 30 ° C eller 32 ° C i stället.
OBS: 24 h efter transfektion media kan ersättas med 7 ml färskt medium, och även om detta kan förbättra cellernas hälsotillstånd kan det minska virusmängden i supernatanten. - 48 h efter transfektion samla supernatanten-innehållande virala partiklar och filter med en 0,45 pM polytetrafluoreten filter. Använd nytaget viral supernatant för transduktion. Othnars hålla supernatanten i alikvoter vid -80 ° C och undvika frysning-tining. Kom ihåg att viral titer minskar troligen upp till 50% med varje frysning-upptining cykel.
- Plate cellinje val 24 h före transduktion om anhängare, eller omedelbart före transduktion om icke vidhäftande. Seed 2,0 x 10 5-3,0 x 10 5 vidhäftande celler (här Huh 7.5.1 och HEK 293T) eller 5,0 x 10 5 till 1 x 10 6 icke vidhäftande celler (här SupT1) per brunn i en 6-brunnsplatta.
OBS: Se till att kalibrera antalet celler som skall seedas före transduktion, särskilt så för anhängare celler, så cellerna uppnå en sammanflyt på cirka 60% vid tidpunkten för transduktion. - Lägg 5 mikrogram / ml Polybrene (hexadimethrene bromid) till sådda celler och sedan lägga tidigare insamlade viral supernatant att erhålla cirka 20-40% infektion (här 2 ml).
OBS: MOI eller procent av infektion är oftast godtyckligt, eftersom sortering kommer att tillåta att förstärka något subpopulatjon av celler. Självklart, en högre frekvens av infektioner underlättar och snabbar upp processen för förstärkning. - Transducera celler genom centrifugering i en hängande hink rötor vid 1500 xg under 120 min vid 32 ° C. Resuspendera icke vidhäftande celler med färskt medium före inkubering. För anhängare celler, ersätt med färskt medium 24 timmar efter transduktion.
OBS: Det rekommenderas att täta plattorna före centrifugering med parafilm för att undvika att spilla över. För att öka genetiskt streckkodscell mångfald, omvandla celler med virala partiklar som bär olika fluorescerande proteiner (som erhållits från steg 1.4). När du väljer fluorescerande markörer, se till att de är förenliga med instrumentering och de har urskiljbara fluorescerande parametrar.
2. Urval och förstärkning av genetiskt Barcoded celler
- Analysera omvandlade däggdjursceller med flödescytometri minst 72 timmar efter transduktion att kvantifiera procentsats av transduktion. Använd en jämförbar icke-transducerade cellinje som negativ kontroll.
OBS: Eftersom sortering kommer att användas för att rena individuella streckkodade cellpopulationer, en hög procentsats av initial transduktion, medan inte nödvändigt bör påskynda processen av förstärkning. - Utnyttja cellsorterare val för att få de celler som uttrycker proteinet av intresse.
- För detta ändamål, se till grindarna är korrekt inställd i rätt kanaler.
- För att göra detta använder samma naiva cellinje som negativ kontroll och ställ in parameter / kanalspänning så att den negativa befolkningen är under värdet 10 3 på varje fluorescerande axel. Bestäm gating positiv fluorescens som händelser som visas ovanför den för den negativa kontrollen för varje fluorescerande kanal.
- Var medveten om att varje instrument kan variera och rätt spänning för att bestämma gating bör justeras i enlighet därmed, vilket gör positiva och negativa kontroller tvingande i alla experimental installationen.
- För fluorescensdetektion i denna experimentuppställning använda FITC-kanalen (530/30 bandpassfilter fortsatte med en 502 lång passfilter) för eGFP, PE-kanalen (585/42 bandpassfilter fortsatte med en 556 lång passfilter) för td Tomat och APC-kanalen (660/20 bandpassfilter) för E2 Crimson.
OBS: 488 nm laser hetsar eGFP och td Tomat medan E2 Crimson exciteras av 633 nm laser.
- För fluorescensdetektion i denna experimentuppställning använda FITC-kanalen (530/30 bandpassfilter fortsatte med en 502 lång passfilter) för eGFP, PE-kanalen (585/42 bandpassfilter fortsatte med en 556 lång passfilter) för td Tomat och APC-kanalen (660/20 bandpassfilter) för E2 Crimson.
- För detta ändamål, se till grindarna är korrekt inställd i rätt kanaler.
- Sortera i 15 ml koniska rör med 1 ml 100% FCS.
OBS: Processen att sortera fluorescerande cellpopulationer är inte obligatoriskt som man kan direkt fortsätta med den sortens individuella kloner (se nedan). Sortering snäva populationer baserat på vald fluorescens säkerställer en backup population för framtida val av enskilda kloner. Kom ihåg att individuella celler är ibland svåra att växa medan en stor population av celler kan lätt frysas, och tinades sedan och förstärks på ett senare stadium. - Spi ned de sorterade populationer i en hängande hink rotor centrifug vid 524 g vid 32 ° C under 5 min till pellets cellerna. Åter suspendera i 1 ml färskt medium, och återplatt celler så att cell confluency är under 60% för att möjliggöra tillväxt och delning i minst två dagar.
- Exempelvis platt adherenta celler vid cirka 3 x 10 5 celler i 2 ml medium per brunn i en 6-brunnsplatta och 2 x 10 6 celler i 2 ml medium i en 6 cm platta. Använd DMEM för vidhäftande celler och RPMI för icke-vidhäftande celler (eller någon specificerade medium om det behövs). Placera strukna cellerna i en inkubator vid 37 ° C under flera dagar för att möjliggöra amplifiering.
3. Skaffa Klonala Populationer i genetiskt Barcoded celler vid olika intensiteter
- Skaffa klonala populationer från celler som ursprungligen omvandlade (steg 1,7) eller från den sorterade populationen (steg 2,3).
OBS: Detta kommer att säkerställa lika eller liknande nivå av fluorescerande protein uttryck bland alla cellens inom populationen (en tät population med en liten CV i genomsnittlig fluorescensintensitet på upp till 40%).- För detta ändamål, sortera enskilda celler i 96-brunnsplattor med en automatiserad cellavsättningsenhet (ACDU). Ställ portarna för sortering enligt populationer av intresse. Se till grindar sätts minst en log-skala isär för att få urskiljbara populationer vid val celler vid olika fluorescerande intensiteter. För proceduren som visas här, använda samma flödescytometri experimentell inrättas som den som beskrivs i steg 2.2.
- Amplify individuella kloner i en inkubator vid 37 ° C under minst två veckor. Genom arbetet med förstärkningen analysera cellerna under mikroskop för att se till att växande befolkningar uppstår från enskilda celler och inte från mer än en.
OBS: Kom ihåg att sorteraren kommer att placera en cell per brunn i genomsnitt, och medan vissa brunnar inte kan ha någon cell alls, andra kan ha mer än en.- För att säkerställa att en population uppstår från en cell bara, vara extremt försiktig med plattan och aldrig stör brunnarna genom pipettering. Observera plattan, väl av väl, under mikroskop.
OBS: Även om enskilda celler kan ibland vara svårt att identifiera, när de börjar dela de kommer att vara lätt att känna igen. - Var medveten om att ofta cellernas klump "längs kanterna. Kasta de brunnar där kan observeras flera klon befolkningar och hålla dem som har en stram befolkningen.
OBS: Det är lämpligt att överföra dem till större plattor för förstärkning.
- För att säkerställa att en population uppstår från en cell bara, vara extremt försiktig med plattan och aldrig stör brunnarna genom pipettering. Observera plattan, väl av väl, under mikroskop.
- Sikta de förmodade klonala populationer genom att analysera dem genom flödescytometri. Jämför dem till en negativ kontroll utnyttjar samma flödescytometri experimentuppställning.
- Analysera endast en procentandel av provet och hålla resten som backup. Välj de distinkt skilda populationer baserat på medelintensitet och täthet av befolkningen. Amplify dem efter behov eller frysa lager ifrysning media med 20% glycerol vid -80 ° C under korta perioder eller flytande kväve för längre.
OBS: Tänk på att en "riktig" klonal befolkning bör ha en mycket snäv fluorescens mönster.
- Analysera endast en procentandel av provet och hålla resten som backup. Välj de distinkt skilda populationer baserat på medelintensitet och täthet av befolkningen. Amplify dem efter behov eller frysa lager ifrysning media med 20% glycerol vid -80 ° C under korta perioder eller flytande kväve för längre.
4. Se Multiplexing resurser för höghastighetsscreening (HTS)
- Kombinera så många distinkta klon populationer behov som kan utnyttjas ytterligare i en multiplex format. Välj kloner med urskiljbara absorption / emissionsspektra och / eller olika intensitet. Om en 96-brunnars platta format används, som är lämplig för HTS, utsäde 50000 celler i 200 | il per brunn.
OBS: Tänk på att antalet celler är bara en uppskattning och kan ändras beroende på celltyp och om det är vidhäftande eller inte. - Analysera provet med användning av flödescytometri för att säkerställa att var och en av de oberoende etablerade fluorescerande cellinjer kan särskiljas från varandra. Före analysen förbereder negativaoch enstaka färgkontroller för att ställa in parametrar och kompensationsvärden.
OBS: Inställning av parametrar för att tydligt skilja de blandade populationer kommer de att kunna utnyttjas ytterligare i en multiplex format.
5. Anpassa Genetiskt Streckkods cellinjer till biologisk Application of Choice
- Omvandla etablerade genetiskt Barcoded cellinjer med viruspartiklar som innehåller analyselementen av val, som beskrivs här i Stolp et al., 2013 59. Kom ihåg att analysen av val bör inta en ytterligare och urskiljbar fluorescerande kanal och därför ska överföras till lämplig streckkods cellinje.
OBS: Varje streckkods cellinje kan bära en annan analys. - Sortera genetiskt fluorescerande streckkod celler för de som innehåller analyselement.
OBS: analyselementen kan konstrueras kopplad till en tagg eller fluorescerande protein (som en fusion eller genom ett internt ribosominträdesställe) feller okomplicerad upptäckt genom western blotting, flödescytometri eller mikroskopi. Det system som används i detta protokoll förlitar sig på HA-epitop ytexpression ensamt, eller med ytterligare FLAG-epitop-expression.- Fläck de klonala populationer innehållande analysen med HA och APC-fluorescenskopplade antikroppar. Sedan analysera klonala populationer med anti-FLAG och FITC-konjugerad antikropp färgning.
- För att spåra tillbaka analysen, analysera eller "avkoda" befolkningarna i rätt kanal där de distinkta genetiskt Barcoded cellinjer kan urskiljas. Här, avkoda substratets natur genom att analysera i PE-kanalen för td Tomat detektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multiplexing fluorescerande genetiskt barcoded celler i syfte att biologiska tillämpningar kan endast uppnås när enskilda klon populationer har genererats. Multiplexing är mest effektiv när Barcoded populationer har tydliga distinkta fluorescerande egenskaper med minimal spektral överlappning. Exemplet som visas i figur 1 med klonala populationer av däggdjurs SupT1 celler illustrerar att streckkodade celler med mCherry och cyano fluorescerande protein (GFP) kan lätt analyseras samtidigt utan att förlora sina individuella fluorescerande egenskaper. Denna matris exemplifierar således en panel av fluorescerande genetiskt Barcoded celler som är användbar för multiplexering biologiska applikationer med en avläsning i ännu en ytterligare tillgänglig kanal. För att få en sådan panel är det viktigt att komma ihåg vilken typ av retroviral teknik, vilket kommer att leda till variabla intervall av fluorescerande intensiteter inom populationen på grund av insättnings effekter och / eller MOI. Figur 2 illustrerar att initiala transduktion av mammalieceller med virala partiklar som innehåller antingen td Tomat eller E2 Crimson resultat i celler som uttrycker antingen ett eller båda av de fluorescerande proteiner vid ett brett spektrum av intensiteter (vänster panel). Urval och sortering av enskilda celler i 96-brunnars plattor såsom visas av de grindade rutorna (mitten panel), gör det möjligt för en att erhålla snäva klonala populationer följande expansion (höger panel). En stram population bör definieras som att ha en liten CV som kan variera beroende på celltyp, normalt 30-40% av genomsnittlig fluorescensintensitet. Figur 2 visar också att ytterligare öka antalet genetiskt streckkod populationer med en matris av endast två fluorescerande proteiner, kan man också utnyttja fluorescensintensitet. Generellt är lämpliga för att uppnå lämpliga avstånd från varandra följande sortering och amplifica en log avvikelse i medelfluorescensintensitet mellan populationertion. Td Tomat valdes i det visade exemplet för att illustrera denna funktion, där två populationer av olika intensiteter, mid och höga, erhölls för multiplexering med E2 Crimson på en enda intensitet.
Multiplexing är ett kraftfullt verktyg för att underlätta analysen av många prover samtidigt och för förmågan att avkoda maskerade populationer. Förbättra multiplexering kan uppnås med ytterligare en tredje fluorescerande protein såsom EGFP, så länge som spektrala egenskaper inte interfererar med varandra. I det försöksförfarande som illustreras i figur 3 panelen av sex populationer erhållna med td tomat och E2 Crimson utnyttjades för att öka multiplexering med EGFP. Retroviral teknologi användes för att överföra EGFP till de populationer som är representerade i en av matriserna. När observerats i EGFP-kanalen, är omöjlig att skilja från den EGFP-transducerade den icke-grön naiva sex-populationen matris (övre vänstra panelen i figur 3)befolknings matris (nedre vänstra panelen i figur 3). Viktigt kan panelerna analyseras i de kanaler som ockuperas av den ursprungliga genetiska streckkod (td Tomat och E2 Crimson). Medan oskiljbara i dessa kanaler (jämför populationer 1-6 med populationer 7-12 i mitten paneler, figur 3), kan de enskilda populationer analyseras i eGFP kanal och avkodas eller spårade tillbaka, som visas i histogrammen (höger sida i Figur 3). Efter att upprepa processen för transduktion, urval, sortering, och förstärkning, att dra nytta av de lediga kanalerna är värdelös om rätt ersättning inte tillämpas för att justera för eventuell spektral överlappning. För att bevisa detta, när populationer 1, 2, 3 (ej grön) och 7, 8, 9 (grön) analyseras i eGFP och td Tomato kanaler, populationer 7 och 8 är svåra att särskilja (vänster panel i Figur 4) . Det är därför nödvändigt att välja naiva celler (population 1) som en negativ consofort så att parametrarna för instrumente kan ställas in. Vid analys varje matris, särskilt med fluoroforer som spektralt lappar, är det absolut nödvändigt att enstaka färgkontroller används för att bestämma rätt värden ersättning. I analysen av figur 4 populationer 2 eller 3, och 7 tjänar detta syfte, vilket gör att bättre definiera populationer som verkligen dubbla positiva (populationer 8 och 9).
Genetiskt Barcoded celler med fluorescerande markörer behålla sin egen identitet som definieras av deras Biosignature, då analyseras i den högra fluorescerande kanal med rätt instrument. Dock blir Biosignature bara ytterligare en enskild fastighet såvida utnyttjas för biologiska tillämpningar. För att bevisa kraften i fluorescerande genetiska barcoding för multiplexering beslutade vi att presentera en av våra tidigare utvecklade analyser för läkemedelsutveckling i några av de fluorescerande streckkodade mammaliecellinjer. Genom att göra så, fluorescerent genetiska barcoding utnyttjades för att uppnå tre analyser i ett prov. I denna procedur en byggnadsställning protein innehållande en av tre förmodade virala substrat för proteolys fördes till de genetiskt Barcoded cellerna. I analysen, är klyvning avslöjas genom förlust av FLAG-epitopen på cellytan (figur 5B). Däremot representerar FLAG ytfärgning brist på klyvning Figur 5 illustrerar resultatet av analysen av tre olika substrat.; HIV-1 Kuvert vildtyp (Env wt), HIV-1 Envelope mutanten (Env mut), och Dengue-virus (Denv) prM. Var och en av dem infördes i 1 av 3 streckkodade cellinjer, naiva och 2 andra som använder td Tomat vid olika intensiteter (mid och high, figur 5A). Färgning för FLAG ytexpression avslöjar vilka av substraten klövs baserad på respektive streckkod. I exemplet endast HIV Env mut behåller FLAG-märkning (positiv följande färgning), sett i det gröna-FITC-kanal (figur 5C, högra nedre panelen). Analysen av analysen kan sålunda utföras oberoende av den ursprungliga streckkodning, och utnyttjas ytterligare för att avkoda och spåra tillbaka de distinkta populationer. Denna metod för multiplexering förlitar således på en extra kanal reserverad för den biologiska avläsning av intresse.
Figur 1:. Barcoding för multiplexering Individuella populationer genetiskt Barcoded använder distinkta fluorescerande proteiner såsom mCherry, GFP eller båda (vänster panel) kan blandas, analyseras och avkodas (höger panel) i sina respektive kanaler via flödescytometri. Anpassad från Smurthwaite, C. et al., 2014 58. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Sortering och förstärkning av streckkodade celler Mammalieceller analyserades 48 timmar efter transduktion med viruspartiklar som innehåller antingen td Tomat eller E2-Crimson (till vänster). Gates sedan in för sortering inkludera celler som uttrycker td Tomat på olika intensiteter, med / ut E2-Crimson (mitten panel). Kloner från sorterar förstärktes och åter analyseras för att generera en matris av sex urskiljbara populationer (höger panel). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Avkodning avslöjar maskerade populationer Matrisensex populationer erhållits i figur 2 (td Tomat och / eller E2-Crimson) kan manipuleras vidare för att uttrycka en ytterligare fluorescerande protein som eGFP. (A) Den ursprungliga matrisen, när den analyseras i EGFP kanalen (vänster panel) är negativ och de sex populationer är omöjlig att skilja från varandra. Var och en av de sex populationer kan vara oberoende analyseras i EGFP-kanalen, såsom visas i histogrammen (höger fält). (B) Samma matris, nu uttrycker även eGFP, analyserades som i A, avslöjar nu sina grönt fluorescerande karakteristik. Anpassad från Smurthwaite, C. et al., 2014 58. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Ersättning säkerställer korrekt separation Några av befolkningarna valts från början utifrån td Tomat och / eller eGFP uttryck (populationer 7 och 8) kan inte riktigt skiljas när analyseras tillsammans (till vänster), om inte tillräcklig kompensation för dessa kanaler justeras (till höger. panel). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: (A) Urval Urval av streckkodade celler för ytterligare anpassning till vald analys och anpassning till analys av valet.. Populationer genetiskt Barcoded med td Tomat vid olika intensiteter (överst till vänster) användes för biologiska tillämpningar. Var och en av populationerna ytterligare konstruerad för att innehålla en analys som övervakar klyvning, Men var och en av en annan substrat (övre höger panel). (B) Visning av analysen. Positiv FLAG fläck indikerar brist på klyvning medan negativ FLAG fläcken visar klyvning. (C) Analys av analysen efter FLAG färgning. Blandade populationer kan särskiljas utifrån td Tomat streckkod men oskiljbara i FITC-kanalen (vänster paneler). När färgas med FLAG-FITC antikropp, är bara en population positivt för FLAG. Avkodning avslöjar, baserad på genetiska streckkodning, att denna population bär HIV Env mut substrat (högra panelen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här två väletablerade rutiner har kombinerats; genteknik genom retroviral teknik och detektion av fluorescerande proteiner utnyttjar flödescytometri. Fluorescerande proteinbaserad genetisk streckkodning för framställning av unika cellinjer tillhandahåller en robust och enkelt sätt för multiplexerade applikationer. Generera genetiskt manipulerade streckkodade celler genom retroviral teknik, är initialt en lång process, men gör att man kan få, när detta upprättats, en pålitlig och stabil källa till cellmaterial. Karaktären av denna teknik ger konsekvent genetiskt modifierade cellinjer med stadiga fluorescerande egenskaper som blir deras egen sanna urskiljbar Biosignature.
Både vidhäftande och icke-vidhäftande celltyper kan barcoded använda fluorescerande proteiner som är lätt urskiljbara utifrån deras fysiska absorbans / emissionsspektra. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till proteiner, såsom GFP, mCherry, E2 Crimson och td Tomat. När genetiskt barcoded med deras urskiljbar fluorescerande protein, kan de kombineras för att producera en panel av cellpopulationer. Viktigt innehåller panelen cellpopulationer med exakt genotypisk smink men bara differentierade genom sin fluorescens drag. Som sådana är dessa paneler perfekt lämpad för multiplexerade tillämpningar, kraftigt öka hög kapacitet kapacitet.
På grund av de olika inser preferenser den retrovirala partikeln in i värdgenomet, i kombination med skillnaderna i MOI, är variabla fluorescensintensiteter från den burna särskild fluorescerande proteingenen förväntas. Analys av en genetiskt modifierad population bär en unik fluorescerande gen kommer därmed upptäcka en rad uttrycksprofiler som kan definieras utifrån fluorescensintensitet. Denna differentiella uttrycksprofilen kan utnyttjas för att skapa populationer som spektralt skilda från varandra. Man kan alltså combine val av fluorescerande markörer med fluorescensintensiteten för att passa den experimentella designen. Här, matriser av 4, 6, och 12 populationer, som inkluderar två 6 populationspaneler E2 Crimson och td Tomat, med eller utan eGFP, visas. I teorin kan detta utökas ytterligare med olika intensiteter av eGFP samt att skapa populationer av 3 olika fluorescerande proteiner; var och en med olika intensitet i samband med det. Som tidigare nämnts, bör hänsyn tas när man väljer de fluorescerande proteiner för att säkerställa att separationen kan faktiskt uppnås. Valda proteiner bör ha distinkt absorbans och emissionsspektra; Men när två spektralt urskiljbara men liknande fluorescerande proteiner används, ersättning bör tillämpas. Viktigt ordentlig kompensation, vilket möjliggör fysisk separering av emissions / absorbansspektra mellan olika fluoroforer eller fluorescerande proteiner, sker med hjälp av lämpliga enstaka färgkontroller fördetektering via flödescytometri.
Multiplexing med färre fluorescerande proteiner men utnyttja en mängd olika intensiteter frigör ytterligare kanaler som kan sedan ytterligare utnyttjas för biologisk tillämpning av intresse. Detta kan öka flexibiliteten hos den experimentella uppställningen och förenkla valet av kombinationen av fluorescerande markörer som skall användas. Till exempel den multiplex analysen visas i figur 5 bygger på antikroppar färgning, i detta fall kopplat till FITC. Eftersom endast PE-kanalen är upptagen av genetisk streckkodning, kan man använda FITC-konjugerade antikroppar, eller omvänt, APC-kopplade, ett beslut som kan göras baserat på lämplig instrumentering och / eller antikropps tillgänglighet.
Medan de tekniska landvinningar inom flödescytometri, mikroskopi eller kombinerade metoder är imponerande, verkar flaskhalsen vara den tillgängliga cellteknik för biologiska tillämpningar och HTS. Retroviral technik i kombination med det växande antalet fluorescerande proteiner kan slås samman för att svara på denna fråga. Fluorescerande genetisk streckkodning underlättar drastiskt multiplexering, vilket i sin tur uppfyller det ökande behovet av att utöka HTS kapacitet cellbaserade analyser. Genetisk barcoding leder till en robust, kostnadseffektiv och enkelt sätt att koppla cellbaserade analyser med hög genomströmning metoder för biologiska tillämpningar och drogscreening. Kraften i att utföra en i stället för tre skärmar med en 3 befolkningspanel har gynnsam kostnad och tidsrelaterade konsekvenser. Med den växande mångsidighet i flödescytometri, hög halt bildbehandling och flödescytometri kopplade mikroskopi, kommer fluorescerande genetiska barcoding vara ett konsekvent pålitligt verktyg för analys utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr Garry Nolan från Stanford University för att tillhandahålla Phoenix GP förpacknings cellinje för produktion av retroviruspartiklar. Vi tackar Dr Roger Tsien vid University of California i San Diego för att tillhandahålla td Tomato. Vi vill också tacka för San Diego State University flödescytometri Core Facility för deras service och hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | used for filtering the virus |
| 0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter | Pall Corporation | 4219 | used for filtering the virus |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 45000-304 | cell growth media for HEK 293T cells |
| PEI (Polyethylenimine) | poly sciences | 23966-2 | 2 mg/ml concentration used |
| Hanging bucket centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5805 000.017 | used for spin infection |
| PBS (phosphate buffered saline) | Corning | 21-040-CV | used for washing of cells |
| Polybrene (hexadimethreen bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration. |
| FACSAria | BD Biosciences | instrument used for sorting cell populations | |
| FACSCanto | BD Biosciences | instrument used for cell analysis | |
| Phoenix-GP | Gift from Gary Nolan | cell line used to produced retroviral particles | |
| Fetal calf serum | Mediatech | MT35015CV | used for cell growth and sorting |
| SupT1 cells | ATCC | CRL-1942 | Human T lymphoblasts |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | cell growth media for SupT1 cells |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527 (1997).
- Godwin, A. R., Stadler, H. S., Nakamura, K., Capecchi, M. R. Detection of targeted GFP-Hox gene fusions during mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13042-13047 (1998).
- Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
- Natarajan, L., Jackson, B. M., Szyleyko, E., Eisenmann, D. M. Identification of evolutionarily conserved promoter elements and amino acids required for function of the C. elegans beta-catenin homolog BAR-1. Dev Biol. 272 (2), 536-557 (2004).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin.Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Valencia-Burton, M., et al. Spatiotemporal patterns and transcription kinetics of induced RNA in single bacterial cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16399-16404 (2009).
- Mahmoud, L., et al. Green fluorescent protein reporter system with transcriptional sequence heterogeneity for monitoring the interferon response.J Virol. 85 (18), 9268-9275 (2011).
- Saunders, M. J., et al. Fluorogen activating proteins in flow cytometry for the study of surface molecules and receptors.Methods. 57 (3), 308-317 (2012).
- Wang, Y. L., Taylor, D. L. Probing the dynamic equilibrium of actin polymerization by fluorescence energy transfer. Cell. 27 (3 Pt 2), 429-436 (1981).
- He, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence (Forster) resonance energy transfer from cyan fluorescent protein to yellow fluorescent protein using single-laser excitation at 458 nm. Cytometry A. 53 (1), 39-54 (2003).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Clayton, A. H., et al. Ligand-induced dimer-tetramer transition during the activation of the cell surface epidermal growth factor receptor-A multidimensional microscopy analysis. J Biol Chem. 280 (34), 30392-30399 (2005).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
- Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Ai, H. W., Shaner, N. C., Cheng, Z., Tsien, R. Y., Campbell, R. E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry. 46 (20), 5904-5910 (2007).
- Mishin, A. S., et al. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry. 47 (16), 4666-4673 (2008).
- Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 48 (31), 5612-5626 (2009).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Klages, N., Zufferey, R., Trono, D. A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther. 2 (2), 170-176 (2000).
- Lai, Z., Brady, R. O. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinanat lentivirus vector. J Neurosci Res. 67 (3), 363-371 (2002).
- Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol Biol. 246, 391-411 (2004).
- Grignani, F., et al. High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein. Cancer Res. 58 (1), 14-19 (1998).
- Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Mol Ther. 2 (5), 458-469 (2000).
- Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6 (3), 127-134 (2000).
- Zhang, X. Y., et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol Ther. 5 (5 Pt 1), 555-565 (2002).
- Rossi, G. R., Mautino, M. R., Morgan, R. A. High-efficiency lentiviral vector-mediated gene transfer into murine macrophages and activated splenic B lymphocytes. Hum Gene Ther. 14 (4), 385-391 (2003).
- Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
- Chan, A. W., Chong, K. Y., Martinovich, C., Simerly, C., Schatten, G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science. 291 (5502), 309-3012 (2001).
- Linney, E., Hardison, N. L., Lonze, B. E., Lyons, S., DiNapoli, L. Transgene expression in zebrafish: A comparison of retroviral-vector and DNA-injection approaches. Dev Biol. 213 (1), 207-2016 (1999).
- Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
- Tiemann, U., et al. Optimal reprogramming factor stoichiometry increases colony numbers and affects molecular characteristics of murine induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 79 (6), 426-435 (2011).
- Leung, A. K., Lamond, A. I. In vivo analysis of NHPX reveals a novel nucleolar localization pathway involving a transient accumulation in splicing speckles. J Cell Biol. 157 (4), 615-629 (2002).
- Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
- Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C.J Cell Biol. 161 (5), 899-909 (2003).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
- Edwards, B. S., Ivnitski-Steele, I., Young, S. M., Salas, V. M., Sklar, L. A. High-throughput cytotoxicity screening by propidium iodide staining. Curr Protoc Cytomt. 9 (Unit 9 24), (2007).
- Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 8 (Unit 8 17), (2007).
- Lu, R., Neff, N. F., Quake, S. R., Weissman, I. L. Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding. Nat Biotechnol. 29 (10), 928-933 (2011).
- Grant, G. D., et al. Live-cell monitoring of periodic gene expression in synchronous human cells identifies Forkhead genes involved in cell cycle control. Mol Biol Cell. 23 (16), 3079-3093 (2012).
- Fiering, S. N., et al. Improved FACS-Gal: flow cytometric analysis and sorting of viable eukaryotic cells expressing reporter gene constructs. Cytometry. 12 (4), 291-301 (1991).
- Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (1991).
- Edwards, B. S., Oprea, T., Prossnitz, E. R., Sklar, L. A. Flow cytometry for high-throughput, high-content screening. Curr Opin Chem Biol. 8 (4), 392-398 (2004).
- Durick, K., Negulescu, P. Cellular biosensors for drug discovery. Biosens Bioelectron. 16 (7-8), 587-592 (2001).
- Edwards, B. S., et al. High-throughput flow cytometry for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 2 (5), 685-696 (2007).
- Sklar, L. A., Carter, M. B., Edwards, B. S. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 7 (5), 527-534 (2007).
- Curpan, R. F., et al. High-throughput screen for the chemical inhibitors of antiapoptotic bcl-2 family proteins by multiplex flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 465-474 (2011).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Trejo, A., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding for multiplex flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 6 (Unit 6 31), (2011).
- Surviladze, Z., Young, S. M., Sklar, L. A. High-throughput flow cytometry bead-based multiplex assay for identification of Rho GTPase inhibitors. Methods Mol Biol. 827, 253-270 (2012).
- Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PLoS One. 8 (1), e53015 (2013).
- Vignali, D. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods. 342 (1-2), 243-255 (2000).
- Hilton, B. J., Wolkowicz, R. An assay to monitor HIV-1 protease activity for the identification of novel inhibitors in T-cells. PLoS One. 5 (6), e10940 (2010).
- Rajakuberan, C., Hilton, B. J., Wolkowicz, R. Protocol for a mammalian cell-based assay for monitoring the HIV-1 protease activity. Methods Mol Biol. 903, 393-405 (2012).
- Smurthwaite, C. A., et al. Fluorescent genetic barcoding in mammalian cells for enhanced multiplexing capabilities in flow cytometry. Cytometry A. 85 (1), 105-113 (2014).
- Stolp, Z. D., et al. A Novel Two-Tag System for Monitoring Transport and Cleavage through the Classical Secretory Pathway - Adaptation to HIV Envelope Processing. PLoS One. 8 (6), e68835 (2013).
- Schwartz, A., et al. Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry. 33 (2), 106-114 (1998).
