Abstract
تحمض Endosomal أمر بالغ الأهمية لمجموعة واسعة من العمليات، مثل إعادة التدوير البروتين وتدهور، مستقبلات الحساسية، وناقل عصبي تحميل في الحويصلات المشبكية. يتم وصف هذا تحمض أن بوساطة ATPases بروتون، بالإضافة إلى النقل كلوريد CLC. غاية الحفاظ-البروتونات النقل electroneutral، وأعرب نا + / H + المبادلات (NHE) 6 و 7 و 9 أيضا في هذه المقصورات. وقد تم ربط الطفرات في الجينات مع الأمراض المعرفية والعصبية البشرية. ومن المفارقات، تظل أدوارهم بعيد المنال، وتوطين لهم داخل الخلايا منعت توصيف وظيفي مفصل. وتظهر هذه المخطوطة طريقة لحل هذه المشكلة. هذا يتكون من مجموعة من خطوط الخلايا الطافرة، قادرة على قيد الحياة تحمض عصاري خلوي الحاد من خلال الاحتفاظ NHEs داخل الخلايا في الغشاء البلازمي. ثم يصور اثنين من البروتوكولات المكملة لقياس الانتقائية أيون والنشاطهذه المبادلات: (ط) واحدة على أساس قياسات درجة الحموضة داخل الخلايا باستخدام المجهر مضان الفيديو، و (ثانيا) واحدة على أساس حركية سريعة الامتصاص الليثيوم. هذه البروتوكولات يمكن استقراء لقياس غيرها من شركات النقل غير كهربي. وعلاوة على ذلك، فإن الإجراء اختيار المعروضة هنا يولد خلايا مع الاحتفاظ النمط الظاهري خلل داخل الخلايا. لذلك هذه الخلايا سوف التعبير عن الأخرى أيضا بروتينات الغشاء الحويصلي على غشاء البلازما. ولذلك فإن استراتيجية التجريبية يصور هنا تشكل أداة قوية محتملة لدراسة البروتينات داخل الخلايا الأخرى التي سيتم ثم أعرب عنها في غشاء البلازما جنبا إلى جنب مع حويصلي نا + / H + المبادلات المستخدمة في اختيار.
Introduction
عرض معظم مقصورات درجة الحموضة داخل الخلايا اللمعية الحمضية، وهي معلمة رئيسية للنضوج، والاتجار، وإعادة التدوير من البروتينات أو الهرمونات والناقلات العصبية تحميل. وقد تبين أن يتم إنشاء التدرج درجة الحموضة بين العصارة الخلوية والحويصلي المحتوى من قبل فجوي H + ATPases 1، بالإضافة إلى حويصلي النقل كلوريد CLC 2. سواء في طرق المغادرة (KO) الفئران والمرضى من البشر، وقد تم تسليط الضوء على أهمية هذه الناقلين من الظواهر الثقيلة التي تسببها طفرات في جيناتها 3-6.
ووصف أعضاء المبادلات الصوديوم والهيدروجين SLC9A الأسرة، وكذلك NHEs لنا + / H + المبادلات، وقد ثبت أن تكون المؤثرات الرئيسية في درجة الحموضة داخل الخلايا وتنظيم حجم الخلية، وكذلك في نقل اتجاهي من مكافئات الحمضي القاعدي عبر الظهارة . إلى جانب NHEs غشاء البلازما، وثلاثة حفظا للغاية نا + / H + المبادلات، NHE 6 و 7ويتم التعبير عن 9 في شبكة عابرة للجولجي والإندوسومات في وقت مبكر (7). وقد تم ربط الطفرات في الجينات مع Angelman تشبه أو كرستيانسون المتلازمات 8-9 والتوحد القائم على الأسرة 10 ونقص الانتباه فرط النشاط اضطراب 11-12. كما شاركت هذه المبادلات في المشاكل العصبية مثل مرض الزهايمر القابلية 13 و X-ربط التخلف العقلي الجينات متجاورة متلازمات 14. أخذت معا، وتبرز هذه الدراسات على أهمية هذه NHEs داخل الخلايا في نمو الدماغ و / أو وظيفة.
توطين الخلايا من هذه المبادلات يمنع قياسات دقيقة من الانتقائية أيون، والاتجاه النقل والمعلمات الحركية، والتنظيم. كما هو الحال بالنسبة لجميع الناقلين أعرب في المقصورات داخل الخلايا، فإنه من الصعب للغاية لتقييم أنشطتها الحيوية، وبالتالي التوصل إلى فهم كامل أدوارهم الفسيولوجية وميكانالمذهبين الكامنة آثارها المرضية. وبناء على عصاري خلوي تركيز K + عالية، وكانت الفرضية الأكثر شيوعا قبلت أن كانوا يعملون كما K + جانب بروتون النقل هروب رأس المال. وكان وجود مثل تسرب بروتون تم الافتراض، لأنها قد موازنة بروتون ضخ من قبل V-ATPases من أجل الحفاظ على حالة الاستقرار حويصلي درجة الحموضة. والهدف من هذه المادة هو البصرية (ط) ليبرهن على وجود طريقة التي تسمح للاختيار الوراثية من خطوط الخلايا التي تعبر عن هذه الناقلين حويصلي في غشاء البلازما الخاصة بهم، و (ثانيا) لإظهار نهجين مستقلة لقياس وظائف هذه الناقلين.
قبل ثلاثة عقود، Pouysségur وفرانكي كان لها السبق في نهج الجيني التي مكنت الاستنساخ الجزيئي وتوصيف أعضاء الأسرة NHE 15. وقد استند هذا على سمية البروتونات داخل الخلايا كوسيلة من وسائل الفحص. وكانت الخطوة الأولى للحصول على خطوط الخلايا ناقصةفي أي نا + / H + الصرف التي أعرب عنها في غشاء البلازما، وذلك باستخدام عكس هذا الناقل. تم مسبقة الخلايا الليفية (CCL39 خط خلية) مع نا + أو لي + ثم توضع في وسيلة خارج الخلية الحمضية (الرقم الهيدروجيني 6.5) لمدة 2 ساعة. وأدى ذلك إلى موت خلايا تعبر عن وظيفي نا + / H + الصرف واختيار خلايا antiporter ناقص (PS120 خط الخلية) 16. عندما يزرع في خالية من بيكربونات المتوسطة، وهذه الخلايا هي حساسة جدا لتحمض داخل الخلايا الحاد. ونتيجة لذلك، وسيتم اختيار التعبير عن أي آلية بروتون هروب رأس المال وظيفية في غشاء البلازما إيجابيا (انظر 17) إذا قدمت مثل هذه الخلايا إلى داخل الخلايا acidifications الحادة. تقنيات تحمض مثل هذه يمكن استخدامها لعزل خطوط الخلايا مع الاتجار العيوب تمكين التعبير القسري للNHEs داخل الخلايا WT على غشاء البلازما.
كما حقيقية النواة نا + / H+ المبادلات هي electroneutral، فهي ليست قابلة للقياس من قبل النهج الكهربية التي استخدمت مع النجاح الكبير لقياس القنوات. لذا يوضح هذا المخطوط كيفية قياس نشاط هذا مبادل من قياسات درجة الحموضة داخل الخلايا وحركية السريع لامتصاص الليثيوم. كما المفاهيم الأساسية هي نفسها، ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ أن العديد من العمليات التي وضعت لاختيار القسم تستخدم أيضا بشكل مباشر عن القياسات الوظيفية.
ومن المثير للاهتمام، لاحظنا أن العيب الاتجار الحالي في خطوط الخلية المحددة باستخدام النهج الوارد وصفها في هذه المخطوطة يؤدي إلى التعبير أكبر من البروتينات حويصلي أخرى في غشاء البلازما مثل قناة البوتاسيوم حويصلي TWIK1 18. وهذا يشير إلى نحو اختيار آلية عيب الاحتفاظ العامة للبروتينات الغشاء حويصلي. وبالتالي هذا الإجراء الاختيار وخلايا أنه يولد مايوتشكل أداة واعدة بالنسبة للمجتمع العلمي تعمل على بروتينات الغشاء من المقصورات داخل الخلايا. وكذلك تقنيات قياس المقدمة هنا قد تكون قابلة للتطبيق لدراسة أخرى الناقلين غير كهربي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. H + قتل اختيار
- خطوط الخلايا
- ثابت بالنقل خلايا NHE التي تعاني من نقص (على سبيل المثال، PS120 خط الخلية المستمدة CCL39 16) باستخدام أي مزيج من متجه التعبير الثدييات وطريقة ترنسفكأيشن من شأنها أن تنتج عائدات ترنسفكأيشن كفاءة والتحديد في خط الخلية الليفية.
ملاحظة: لسنوات عديدة كانت تستخدم فوسفات الكالسيوم هطول الأمطار 19 مع عائدات ترنسفكأيشن جيدة. تم استبدال هذا أكثر مؤخرا من قبل الكواشف التجارية مثل Lipofectamine2000، وtransfections الذي يقوم باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- ثابت بالنقل خلايا NHE التي تعاني من نقص (على سبيل المثال، PS120 خط الخلية المستمدة CCL39 16) باستخدام أي مزيج من متجه التعبير الثدييات وطريقة ترنسفكأيشن من شأنها أن تنتج عائدات ترنسفكأيشن كفاءة والتحديد في خط الخلية الليفية.
- حلول
- إعداد ثلاثة حلول عقيمة وصفها على النحو التالي. تعقيم هذه الحلول عن طريق الترشيح (0.22 ميكرون).
- إعداد NH 4 + الحل تحميل (7.4 درجة الحموضة) تتألف من 50 ملي NH 4 CL، 70 ملي كلوريد الكولين، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي GLucose و 15 ملي اجتماعات الأطراف في درجة الحموضة 7.4.
- إعداد الحل شطف (درجة الحموضة 7.0) تتألف من 120 ملي كلوريد الكولين، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، الجلوكوز 5 ملي و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.0.
- يعد حل الاسترداد (7.4 درجة الحموضة) تتألف من 120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4.
- إعداد ثلاثة حلول عقيمة وصفها على النحو التالي. تعقيم هذه الحلول عن طريق الترشيح (0.22 ميكرون).
- قبل البدء في الاختيار، والحصول على حاضنة الثقافة الخلية التي يمكن استخدامها عند 37 درجة مئوية مع عدم وجود CO إضافي 2 من خزان الوقود الخارجي (وهو ما يسمى CO 2 - حاضنة "الحرة")، و5٪ CO 2 سيؤدي إلى التخزين المؤقت التي قد تنال من التحميض. تضخيم خط الخلية تعبر عن NHE من الفائدة تصل إلى حوالي 2 × 10 8 خلايا (عادة حوالي 20 متكدسة 100 لوحات ملم).
- H + قتل الإجراء:
- احتضان الخلايا معربا عن NHE داخل الخلايا من الفائدة لمدة 1 ساعة في الحل تحميل، في 37 ° C في الحاضنة خالية من CO 2.
- نضح الحل التحميل وثم شطف لهم مرتين في الحل وصفها-شطف أعلاه. تنفيذ هذه الخطوة بشكل فعال للقضاء على المتبقي خارج الخلية NH 4 الكلورين التي من شأنها أن تنال من إنشاء حاد NH 4 + التدرج من شأنها أن تولد والتحميض.
- القضاء على المديين المتوسط شطف بواسطة الطموح واحتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في حل الانتعاش مرة أخرى عند 37 درجة مئوية في حاضنة المجانية CO 2.
- استبدال المتوسطة الانتعاش مع مستنبت منتظمة (عادة DMEM مع 7.5٪ FCS) وتنمو الخلايا في ظروف الثقافة القياسية (37 درجة مئوية في جو مرطب من CO 2 و 95٪ الجوية 5٪).
- كرر هذه الدورة من اختيار مرتين في الأسبوع حتى تظهر الحيوانات المستنسخة مستقرة.
ملاحظة: خذ رعاية خاصة فيما يتعلق زراعة الخلايا وشروط الاختيار. أشهر من العمل يمكن أن تكون مدمرة من قبل أي تلوث التي هي أكثر عرضة للسccur بعد فترة طويلة من الثقافة والتلاعب خلية المتكررة.- هنا، اختر ما إذا لتضخيم الحيوانات المستنسخة وتميز منهم على حدة كما هو موضح في أقسام 2-3، أو تجمع لهم معا لتوليد سكان الخلوي قبل التوصيف.
- تطبيق الاختيار بين الحين والآخر (حوالي مرة كل أسبوعين) للاحتفاظ خلايا مقاومة للحموضة من قبل تلك التي ربما تكون قد عادت إلى حساسة للحمض النمط الظاهري الوالدين (الشكل 1B)، اختيار المضاد.
2. بين الخلايا درجة الحموضة القياسات
2.1) التصوير الإسفار درجة الحموضة
- استخدام ratiometric الحساسة درجة الحموضة الفلورسنت صبغ BCECF / AM، وهو الرقم الهيدروجيني الحساسة عندما متحمس في 490 نانومتر، وتمتلك 445 نقطة isosbestic نانومتر، بعد بروتوكولات المصنعة.
- بدلا من ذلك، استخدام غيرها من تحقيقات حساسة للدرجة الحموضة، وبعد بروتوكولات الشركة المصنعة.
- استخدام التصوير المنصوص يخدعsisting من مجهر مقلوب بالإضافة إلى كاميرا فيديو عالية الحساسية. تجهيز هذه المجموعة مع 450 نانومتر و 490 نانومتر الضيقة المرشحات تدخل الفرقة يقترن الكوارتز المناسبة مرشحات الكثافة محايدة لالإثارة.
- إذا كان ذلك ممكنا، استخدم مجموعة مناسبة من المرشحات وشروط الإضاءة لإعداد قيم مضان مماثلة لλ1 وλ2 بحيث تقترب نسبة 1. أيضا تجنب القيم مضان القاعدية التي تم تعيينها إما تشبع أو منخفضة جدا، سواء بالنسبة للλ1 و / أو λ2. وهذا قد تسفر عن القطع الأثرية الهامة كما ثم نسبة قد يكن كشفها على الرغم من أن درجة الحموضة داخل الخلايا يتغير.
ملاحظة: هذا النظام يجب تمكين نضح السريع، والإثارة في الوقت الفاصل بين اثنين من موجات المذكورة أعلاه والاستحواذ في الطول الموجي الانبعاثات السليم (535 نانومتر لBCECF). تجهيز نظام مع برنامج تمكين الحصول على البيانات التلقائي والتخزين.
- إذا كان ذلك ممكنا، استخدم مجموعة مناسبة من المرشحات وشروط الإضاءة لإعداد قيم مضان مماثلة لλ1 وλ2 بحيث تقترب نسبة 1. أيضا تجنب القيم مضان القاعدية التي تم تعيينها إما تشبع أو منخفضة جدا، سواء بالنسبة للλ1 و / أو λ2. وهذا قد تسفر عن القطع الأثرية الهامة كما ثم نسبة قد يكن كشفها على الرغم من أن درجة الحموضة داخل الخلايا يتغير.
2.2) قياس NHE إلى الأمام آخر (بثقالبروتونات من العصارة الخلوية)
- تحمض الخلايا عن طريق حضانة 1 ساعة في حل NH 4 + التحميل (راجع الخطوة 1.4) في غياب CO 2.
- إضافة BCECF-AM (5 ميكرومتر تركيز النهائي) إلى حل لآخر خمس دقائق ومن ثم شطفه مع NH 4 + الحل تحميل للقضاء على التحقيق خارج الخلية.
- تركيب الخلايا على المجهر وأخذ عدة صور لتسجيل خط الأساس مستقرة. يروي الحل شطف (انظر أعلاه). وهذا يؤدي إلى انخفاض في مضان المقابلة لالتحميض.
- بعد استقرار درجة الحموضة، ويروي أي من الحلول الواردة أدناه لقياس معدلات الاسترداد درجة الحموضة بوساطة لي + / H +، نا + / H + K + أو / H + الصرف. يحتوي كل حل كاتيون اقتران المحتملين لفحصها لH + الصرف. إذا تم نقل واحد من هؤلاء، وهذا سوف يؤدي إلى زيادة مضان في 495 نانومتر التي سوف الموافقأندو إلى زيادة في درجة الحموضة داخل الخلايا:
120 ملي LiCl، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4
120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4
125 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4
2.3) قياس NHE آخر عكسي
ملاحظة: إن المبدأ هنا هو عكس الغشاء التدرجات الأيونية.
- قبل القياس، تحميل الخلايا مع الموجبة داخل الخلايا من الفائدة (انظر أدناه).
- احتضان لهم لمدة 5 دقائق مع BCECF / AM (راجع الخطوة 2.2.2)؛ شطف لهم، جبل لهم على المجهر الفيديو.
- يروي الحل التحميل وتأخذ عدة صور لتسجيل خط الأساس مستقرة.
- بعد استقرار خط الأساس، صورة الاختلافات درجة الحموضة عند و perfused الخلايا مع وسيلة الحمضية خارج الخلية التي تحتوي على 120 مM كلوريد الكولين، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 الجلوكوز ملي و 15 ملي زارة التربية والعلم في درجة الحموضة 6.5.
- لLiCl التحميل واحتضان خلايا لمدة 2 ساعة في محلول مكون من 120 ملي LiCl، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4. الليثيوم داخل الخلايا يقاس الامتصاص الذري الطيفي غلة قيمتها نحو 60 ملي.
- لنا + التحميل واحتضان خلايا لمدة ساعتين في محلول مكون من 120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4 بحضور 1 ملم ابائين لمنع نا / K أتباز. في هذه الظروف، بين الخلايا تركيز نا + هو في حدود 40 مم.
ملاحظة: K + تحميل ليس من الضروري كما K + عصاري خلوي التركيز هو في حدود 140 مم وموجهة ظاهريا-K + التدرج هو بالتالي من السهل تحقيق.
2.4) العلاج ومعايرة البيانات:
ملاحظة: هذه الخطوة ينطبق على كل من القياسات إلى الأمام وعكس.
- في نهاية كل تجربة، يروي خلايا بمحلول مكون من 140 ملي بوكل، 20 ملي HEPES و 5 ميكرومتر nigericin تعديلها لقيم درجة الحموضة ما بين 6.5 و 7.4.
- جمع البيانات والقياسات مضان من الصور (مستويات الرمادي تمثل مستويات كثافة) والتصدير تحت تنسيق النص وعلاج كما هو موضح أدناه باستخدام برنامج جدول بيانات.
- حساب القيم الرقم الهيدروجيني بين الخلايا لكل خلية فردية أو المنطقة ذات الاهتمام باستخدام المعادلة التالية:
الرقم الهيدروجيني = + الباكاف الحمضية (سجل (R-RMIN) / (ماكس R -R)) × F دقيقة (λ2) / F ماكس (λ2) - استخدام دقيقة F (λ2) / F أماه العاشر (λ2) نسبة إذا كان هناك تحقيق تبييض أو تسرب، مما أدى إلى انخفاض في مضان 450 نانومتر في جميع أنحاء التجارب. هذا هو ولكن نادرا جدا ما لوحظ في الظروف المستخدمة في ديستجارب cribed.
- كما موجودة في نهاية كل قياس درجة الحموضة بيانات المعايرة، والتحقق ما إذا كانت القيم المحسوبة المناظرة تختلف عن قيم الرقم الهيدروجيني المستخدمة في المعايرة. إذا كان هذا هو الحال، ثم ضبط جميع القيم الرقم الهيدروجيني تجريبيا لمعايرة باستخدام الإجراء التالي:
- حساب حاصل التالية (Q، والفرق بين القيم المقاسة / الفرق بين القيم المعايرة). مضاعفة بيانات كله Q. جعل التعديل النهائي من قبل الجمع أو الطرح بحيث القيم المحسوبة سوف تساوي القيم المعايرة المقابلة.
3. قياسات معدلات الأولية للNHE7 التي كتبها سريع لي + امتصاص
- خلايا البذور على لوحات متعددة جيدا (6 إلى 24 عاما أيضا) وتحمض لهم باستخدام إما NH 4 تقنية + تحميل المذكورة أعلاه أو بالتناوب nigericin / البقري ألبومين المصل (BSA) تحمض وصفها في 20.
- الحفاظ على فترات امتصاص قصيرة ومتسقة (عادة دقيقة واحدة أو أقل) لضمان حسن سير هذا النقل في ظروف معدلات الأولية. وتأكد أيضا من أن جميع الحلول المستخدمة لامتصاص هي متساوي التوتر.
- في نهاية الوقت امتصاص، والقضاء على بعناية المتوسطة امتصاص وغسل الخلايا أربع مرات مع المالحة الفوسفات الجليد الباردة مخزنة (PBS). تنفيذ هذه يغسل بأسرع وقت ممكن (أقل من 10 ثانية لأربعة منهم هو المثالي) لمنع هروب رأس المال الليثيوم.
- ليز الخلايا في 25٪ حمض النيتريك. تطبيق 250 ميكرولتر لكل بئر من 25٪ حمض النيتريك والسماح لها الجلوس لمدة 1 ساعة على الأقل، ثم إلغاء كل بئر مع نهاية غيض ماصة ونقل تعليق جيدا كله في ميل جديدأنبوب crocentrifuge.
- نقل المحللة في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge، الطرد المركزي لهم لمدة 5 دقائق على 15،000 x ج (درجة حرارة الغرفة) لإزالة الحطام الخلوي.
- قياس محتوى الليثيوم من supernatants بواسطة الامتصاص الذري الطيفي 21.
ملاحظة: توفر شركات مختلفة الطيف الامتصاص الذري، والتي يجب أن تكون مجهزة ليثيوم مصباح الكاثود جوفاء. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لأن هذه الآلات هي دقيقة جدا ولكن أيضا حساسة جدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الاختيار:
ويستند اختيار H + قتل على نشر قاعدة ضعيفة الأمونيوم، كما هو مبين في الشكل 1A. وقد رائدة تأثير قواعد ضعيفة والأحماض نشر على درجة الحموضة داخل الخلايا والتر البورون والمتعاونين 22. فكرة أنيقة لاستخدام هذه الظاهرة لإنتاج تحمض قاتلة لاختيار الوراثية إيجابية ثم تم تطويرها من قبل جاك Pouysségur 17. وبموجب هذا البروتوكول، وتنخفض درجة الحموضة داخل الخلايا إلى حوالي 5.5 بعد خطوة الشطف. الخلايا التي لا تعبر عن NHE وظيفية في غشاء البلازما لا يمكن استرداد قيمة الرقم الهيدروجيني محايدة وتظهر الجانب المحمض نموذجي مع شكل مسطح والعصارة الخلوية الحبيبية (الشكل 1B). دورات الاختيار بعد تكرار (حوالي اثنين H + قتل الإجراءات / الأسبوع)، الخلايا التي بالكامل ومستقر البقاء على قيد الحياة هذا تحمض (الشكل 1C) الظهور، على تردد عن 10 -7.وسيؤدي هذا في تكوين الحيوانات المستنسخة الخلوية الفردية التي يمكن إما تتميز بشكل فردي أو المجمعة للحصول السكان الخلوي اذا شئت. ويمكن إجراء التجارب القياسية مثل biotinylation سطح الخلية أو RNA إسكات للسيطرة على أن البروتين التي أعرب عنها في غشاء البلازما هو في الواقع داخل الخلايا NHE مثل NHE7 (انظر على سبيل المثال ميلوسافليفيتش وآخرون 18). كذلك، RT-PCR والتسلسل اللاحق يجب أن يتم تنفيذ للتحقق من الطفرات في نهاية المطاف في تسلسل NHEs داخل الخلايا أعرب في خط الخلية المحددة.
توصيف وظيفي:
مضان Videomicroscopy:
ويمكن وصف النشاط وايون الانتقائية للNHEs داخل الخلايا التي أعرب عنها في غشاء البلازما عن طريق قياس التغيرات في درجة الحموضة داخل الخلايا الناجم عن هذه NHEs في مختلف الظروف. لهذا مجموعة videomicroscopy مجهزة الإضاءة لإعدادات د الاستحواذ على الصورة schematized تحقيق ratiometric مثل BCECF / AM في الشكل 2A. الشكل 2B 2C وتبين التغيرات النمطية في القيم مضان الحصول عليها مباشرة عن الإثارات في 490 و 450 نانومتر، وذلك بعد NH 4 + تحميل التحميض. 2D الشكل يظهر منحنى درجة الحموضة تم الحصول عليها من هذه القيم مضان بعد العلاج البيانات وصفها في 2.4).
الليثيوم امتصاص:
جنبا إلى جنب مع الهيدروجين والصوديوم، ويضم الليثيوم جزء من العمود الأول من الجدول الدوري ولقد ثبت أن تكون الموجبة اقتران فعالة لنا + / H + المبادلات. ومن الممكن الاستفادة من هذه المعلومات لإعداد حركية سريعة الامتصاص الليثيوم، من أجل قياس في التفاصيل المعلمات الوظيفية للنا + / H + المبادلات. ولما كان هذا الموجبة هي غائبة عن السيتوبلازم الخلية، وتراكمه على CYTسوف تحمض osolic تعكس كميا النشاط من غشاء البلازما NHE. وعلاوة على ذلك، nanomolar لتركيزات بيكو مولي من الليثيوم يمكن قياسها بدقة كبيرة باستخدام مطياف الامتصاص الذري. وبالتالي، فإن هذا النهج هو قوي جدا عندما يقترن اختيار غشاء البلازما أعرب المبادلات حويصلي الشكل 3 يوضح البروتوكول قياس وصفها في 3) من قسم البروتوكولات. والمحمضة الخلايا، ويفضل أن يكون المصنف على لوحات متعددة جيدا (6 إلى 24) كما هو موضح سابقا. تبدأ الحركية مع حضانة الخلايا في المتوسط يحتوي على مادة الليثيوم، والكاتيونات أو مثبطات الفائدة (الشكل 3A) الأخرى.
لوقف امتصاص، ثم يتم تقديم الخلايا لأربعة يشطف سريعة في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. تعمل بسرعة يزيل أي الليثيوم خارج الخلية مع ضمان عدم هروب رأس المال الليثيوم كبير يحدث (الشكل 3B). تركيز الليثيوم في كل بئر هو ثمتقاس باستخدام مطيافية الامتصاص الذري (الشكل 3C)، ومعدلات الأولية ليثيوم امتصاص، والتي تسفر عن مباشرة النشاط من المبادلات في الحالة المستقرة والتي يتم الحصول عليها القياسات المنحدر من دوام تراكم الليثيوم (الشكل 3D).
أما بالنسبة للحركية الانزيم، الاستجابة للجرعة من المعدلات الأولية يمكن أن تستخدم لاستخلاص القيم كم لركائز (الشكل 4A) من القيم كي لمثبطات. ميزة مثيرة للاهتمام من الناقلين هي أن الكاتيونات اقتران مختلفة سوف تتنافس للنقل. هذه تعطي إمكانية قياس كم لالصوديوم المنافسة مع الليثيوم امتصاص (الشكل 4B).
الشكل 1: اختيار الخلايا إبداء داخل الخلايا نا + / H + </ قوي> المبادلات في غشاء البلازما الخاصة بهم. (A) استراتيجية الخطوات الثلاث H + قتل مجموعة من الخلايا معربا عن وظيفية NHE غير تحور وغير الموسومة الخلايا في الغشاء البلازمي. (ب) المرحلة النقيض من صورة مجهرية من الخلايا الأبوية PS120 المقدمة إلى تحميل الحمضية. شريط مقياس: 25 ميكرون (C) المرحلة تباين الصورة المجهري للخلايا PS120 المختارة للتعبير عن مبادل حويصلي في غشاء البلازما، وبعد الحمل الحمضية. شريط مقياس: 25 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: قياسات درجة الحموضة داخل الخلايا (A) مبدأ قياس درجة الحموضة videomicroscopy. (B) E volution من مضان المنبعثة (595 نانومتر) لجنة التحقيق BCECF درجة الحموضة بعد الإثارة في 490 نانومتر. L: تحميل الحمضية، ري، شطف، رد: الانتعاش، Cal6.5: المعايرة في درجة الحموضة داخل الخلايا من 6.5، Cal7.0: المعايرة في درجة الحموضة داخل الخلايا من 7.0 (C) تطور مضان المنبعثة (595 نانومتر) لجنة التحقيق BCECF درجة الحموضة بعد الإثارة في 450 نانومتر. L: تحميل الحمضية، ري، شطف، رد: الانتعاش، Cal6.5: المعايرة في درجة الحموضة داخل الخلايا من 6.5، Cal7.0: المعايرة في درجة الحموضة داخل الخلايا من 7.0 (D) تطور درجة الحموضة داخل الخلايا المحسوبة من 490/450 نسب نانومتر مضان من BCECF درجة الحموضة التحقيق ومن نقاط المعايرة. L: تحميل الحمضية، ري، شطف، رد: الانتعاش، Cal6.5: المعايرة في درجة الحموضة داخل الخلايا من 6.5، Cal7.0: المعايرة في درجة الحموضة داخل الخلايا من 7.0 الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
her.within صفحة = "دائما"> 
الرقم 3: النشاط NHE تقاس بنسب الأولية لللي + امتصاص (A - C) التي تصور الخطوات الحاسمة مختلفة من تقنية القياس (D) مثال من دورة الوقت يقاس من امتصاص الليثيوم لحويصلي NHE7 مبادل مخطط أعرب في البلازما الغشاء. لاحظ الخطي من الحركية ضمن الشروط التجريبية، وضمان قياس معدلات الأولية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نموذجي منحنيات الجرعة والاستجابة لNHE7 (البيانات الأصلية من 18).معدلات الأولية ليثيوم امتصاص تم قياسها باستخدام حركية-1 دقيقة. (A) منحنى الجرعة والاستجابة ليثيوم خارج الخلية. (B) مسابقة تركيزات مختلفة من الصوديوم خارج الخلية على امتصاص 1MM الليثيوم خارج الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول وكيفية اختيار الخلايا معربا داخل الخلايا نا + / H + المبادلات في غشاء البلازما دون تغيير تسلسل الأساسي من خلال الطفرات موقع الموجه. ويمكن الآن أن تتسم هذه المبادلات.
ويستند هذا الأسلوب على سمية الخلوية من البروتونات داخل الخلايا لتحديد خطوط الخلايا التي من شأنها التعبير عن حويصلي نا + / H + المبادلات في غشاء البلازما. قد يكون من الممكن، من حيث المبدأ، لاستخدام الكاتيونات الأخرى التي قد يشتبه في نقلها، مثل لي +، K +، أو جيم +. ومع ذلك، وهذا يضيف مستوى إضافي من عدم اليقين. إذا لا اختيار تسفر عن أي استنساخ إيجابي، وسوف يكون من الصعب بعد ذلك لتقييم ما إذا كانت الموجبة اختبار لا تنقل أو مبادل ليس في الغشاء البلازمي. لهذه الأسباب، فقد تم إجراء التحديدات باستخدام نا + باعتباره الموجبة اقتران لأن هذا هو SUBSTR خارج الخليةيأكلون وجدت في أعلى وفرة في الظروف الفسيولوجية. وأدى ذلك إلى اختيار المتغيرات معربا عن NHE7 18، وكذلك NHE6 وNHE9 في غشاء البلازما (شاعر وCounillon، ونتائج غير منشورة).
هذا التعبير غشاء البلازما يمكن قياس النقل المعلمات الوظيفية التي كتبها الأساليب التي يمكن حتى الآن أن تستخدم فقط لنقل غشاء البلازما. بالطبع ليس من الممكن استبعاد أن مثل هذا التغيير في البيئة الغشاء قد تؤثر على ميزات وظيفية NHEs حويصلي. ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية قد يكون من المفيد استخدام لمدة ثلاثة أسباب على الأقل: (ط) التعبير داخل الخلايا NHE6 و 7 و 9 يحول دون أي قياس وظيفي مفصل، (ب) ومعظمها ثبت بيئات الغشاء والبروتين أو الدهون الشركاء لتؤثر خفية التنظيمية آليات NHEs البعض وليس على ميزات أساسية جدا من هذه الناقلين (الانتماءات لالكاتيونات اقتران والانتقائية، اتجاهها، ودرجة الحموضةميزات armacological). ولذلك فمن المحتمل جدا أن تلك ستبقى دون تغيير عن طريق التعبير غشاء من NHEs حويصلي. (ج) معرفة آليات الوظيفية وملامح الدوائية آلية حويصلي أعرب غشاء البلازما، فمن الممكن بعد ذلك لإجراء قياسات حويصلي الرقم الهيدروجيني للتصدي لتلك التناقضات المحتملة بين غشاء البلازما والتعبير الحويصلي.
آخر القيد المحتمل لهذه التقنية هو أن استراتيجية الموصوفة هنا قد يؤدي إلى اختيار الخلايا معربا عن الآخرين H + البثق آلية من حويصلي transfected نا + / H + مبادل (مثل NHE غشاء البلازما، أو H + أتباز على سبيل المثال ). على الرغم من أنه لوحظ أبدا في المختبر، ولذلك فمن الأهمية بمكان استخدام الكلاسيكية وضع العلامات سطح الخلية بالإضافة إلى إسكات للتحقق في الواقع أن NHE من الفائدة يتم التعبير عن الواقع في غشاء البلازما وتتوسط نا + أو لي + وآخرون 18).
لوصف نشاط هذه الناقلين، بروتوكولين، استنادا على التوالي على الاختلافات درجة الحموضة داخل الخلايا وتدفقات ايون وصفها. يتطلب الأسلوب الأول استخدام تحقيقات الفلورسنت الحساسة درجة الحموضة ونظام ملائم المجهري مضان الفيديو. هذا الأسلوب، الذي يستخدم من قبل العديد من الجماعات في هذا المجال، وقد وضعت في 1980s، أولا باستخدام fluorimeters لقياس خلايا شكل إشارات في تعليق 23، ثم استخدام اقتناء التكنولوجيا الرقمية لقياس الخلايا الفردية من قبل اقتران الإثارة مضان والاستحواذ على videomicroscopy 24. أصبحت هذه التقنية الأخيرة الآن سريع جدا وسهلة، وذلك بسبب الأداء العالي من الكاميرات، والإضاءة وأنظمة الكمبيوتر. ومن المثير للاهتمام، وشركات ما تقدم ورقة تقنية مفيدة للغاية جنبا إلى جنب مع تحقيقات الفلورسنت الخاصة بهم. وتوفر هذه الاختلافات درجة الحموضة معلومات هامةلتحديد طبيعة الكاتيونات خارج الخلية إلى جانب بروتون هروب رأس المال. وفي هذا الصدد، من المهم أن نلاحظ أن مدة حضن مسبق الأمونيوم لابد من تعديلها بعناية تبعا للخلايا المستخدمة في القياسات. الليفية المشتقة من CCL39، ودعم بشكل جيد جدا على تحميل ساعة واحدة مع 50 ملي NH 4 الكلورين. وهذا يؤدي إلى تحمض قوية جدا تمكن NHE تفعيل كامل وتنتج إشارة قوية للمقاييس (شروط VMAX). ومع ذلك، فإن الخلايا الأخرى مثل العضلية أو خلايا الكلى الأولية لا تدعم مثل هذا تحميل الأمونيوم المهم. ومن الجدير أداء العديد من التجارب الأولية مع أوقات حضانة مختلفة أو NH 4 تركيزات الكلور. سبب هذه الاختلافات في الحساسية للNH 4 الكلورين ليست واضحة. أنها قد تكون ذات صلة إلى التعبير الممكن نظم النقل الأمونيوم 25،26. وبالمثل، فإن الحل خالية من الصوديوم الذي يستخدم لالشطف الحل تحميل قد لا يتم التسامحمن الخلايا، مثل العضلية على سبيل المثال. على الرغم من أن السرعات الأولية وسيتم تحديد أقل دقة، فمن الضروري أن يروي مباشرة مع الحل الانتعاش بعد تحميل الأمونيوم.
وبالإضافة إلى ذلك، وقياسات درجة الحموضة داخل الخلايا أيضا توفير وسيلة مباشرة للتحقيق في خصائص عكسها من هذه المبادلات كوضع العكسي سوف ينتج تحمض التي سيتم الكشف بسهولة عن طريق انخفاض في مستوى مضان BCECF التي يمكن التعبير عنها قيم درجة الحموضة المعايرة التالية . القيود المفروضة على هذه التجارب هي عدم وجود تقدير دقيق لأنشطة النقل، حيث أن الاختلافات درجة الحموضة التجارب التدبير، التي تعمل على مقياس لوغاريتمي ومحدودة بسبب قدرة التخزين المؤقت داخل الخلايا. هذا الأخير يمكن قياس درجة الحموضة والاختلافات مضروبا قدرة التخزين المؤقت تدفقات العائد أيون. ومع ذلك، فإن هذه العملية يجمع بين العديد من الأخطاء التجريبية (على قياسات درجة الحموضة، والقياسات قدرة التخزين المؤقت، وcalibraلذا نشوئها) وليس الكمي للغاية. وبالتالي الوصول إلى الثوابت الأنزيمية للغشاء البلازما أعرب نقل، وتقنيات تدفق أيون السريع هي أكثر وضوحا ودقة.
لأن محتويات الخلايا هي في حدود millimolar، والكشف عن التغيرات NHE بوساطة من الصوديوم عصاري خلوي غير ممكن. من الآن فصاعدا، لسنوات استندت هذه التقنيات امتصاص حول استخدام النظائر المشعة مثل 22 + نا. توضح هذه المخطوطة طريقة غير المشعة التي يتم استبدال 22 + نا من قبل الليثيوم، واستنادا إلى المنطق أن هذا الموجبة والذي يستخدم أيضا من قبل NHEs، غائب من العصارة الخلوية الخلية ويمكن قياسها بدقة كبيرة باستخدام مطياف الامتصاص الذري 21. مرة واحدة في ظروف مناسبة (الوقت وتركيز الليثيوم) لقياس جرعات الخطية (أي.، ويجري في ظروف معدلات الأولية) يتم تحديدها، لالانتماءات الأخرى الكاتيونات اقتران المحتملة و / أومثبطات يمكن قياسها بدقة كما هو موضح في أرقام 3 و 4. وجود قيود محتملة الأخير هو أن طريقة امتصاص الليثيوم يمكن بالطبع تعمل إلا إذا كان مبادل من الفائدة وسائل النقل بشكل كبير هذا الموجبة. إذا لم يكن كذلك، سوف المجرب أن تعتمد إما على قياسات درجة الحموضة داخل الخلايا المذكورة أعلاه أو سوف تضطر إلى استخدام امتصاص الصوديوم المشع.
مثل مجموعة من التجارب أدت أدى مؤخرا إلى ملاحظة أن NHE7 داخل الخلايا نا + / H + المبادلات، الذي كان يعتقد في البداية أن يكون H + / K + نقل التي من شأنها أن قلونة الحويصلات كان في الواقع آلية endosomal تحمض مقترنة إلى الصوديوم 18. وهذا له آثار عميقة للسيارة داخل الخلايا كما كان يعتقد حتى الآن هذا الدور من أجل تكريسها لVH + ATPases. كما يظهر كل فرد من أفراد الأسرة NHE لعرض التوقيع الحركي محددة جدا سالجناح لدورها الفسيولوجي، ومن المغري لنفترض أن توصيف NHE6 وNHE9 باستخدام الطرق الموضحة في هذه المقالة سوف تكشف الرواية وميزات غير متوقعة من شأنها أن تسليط الضوء على وظائفها الفيزيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10x | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).
- Kornak, U., et al. Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis. Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).
- Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease. Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).
- Kasper, D., et al. Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration. Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).
- Poet, M., et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).
- Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).
- Gilfillan, G. D., et al. SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).
- Mignot, C., et al. Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum. Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).
- Morrow, E. M., et al. Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science. 321 (5886), 218-223 (2008).
- Lasky-Su, J., et al. Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).
- Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. Genome-wide association studies in ADHD. Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).
- Meda, S. A., et al. A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort. Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).
- Zhang, L., et al. A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred. Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).
- Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter. Cell. 56 (2), 271-280 (1989).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter. J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).
- Milosavljevic, N., et al. The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis. Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).
- Wigler, M., et al. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. Cell. 16 (4), 777-785 (1979).
- Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens. EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).
- Milosavljevic, N., et al. Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling. Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).
- Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells. Nature. 325, 447-450 (1987).
- Quentin, F., et al. RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).
- Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).
