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Biology

Caractérisation fonctionnelle de Na Published: March 30, 2015 doi: 10.3791/52453
* These authors contributed equally

Abstract

L'acidification des endosomes est essentiel pour un large éventail de processus, tels que le recyclage des protéines et de la dégradation, désensibilisation des récepteurs, et neurotransmetteur chargement dans les vésicules synaptiques. Cette acidification est décrite être médiée par ATPases de protons, couplés à des transporteurs de chlorure ClC. Hautement conservé protons électroneutres transporteurs, le Na + / H + (NHE) échangeurs 6, 7 et 9 sont également exprimés dans ces compartiments. Des mutations dans leurs gènes ont été liés à des maladies cognitives et neurodégénératives humaines. Paradoxalement, leurs rôles demeurent insaisissables, que leur localisation intracellulaire a empêché la caractérisation fonctionnelle détaillée. Ce manuscrit montre une méthode pour résoudre ce problème. Il se agit de la sélection de lignées cellulaires mutantes, capables de survivre acidification cytosolique aigu en conservant NHE intracellulaires à la membrane plasmique. Il décrit ensuite deux protocoles complémentaires pour mesurer la sélectivité et l'activité d'ionsde ces échangeurs: (i) une basés sur des mesures de pH intracellulaire par microscopie de fluorescence vidéo, et (ii) une base sur la cinétique de l'absorption rapide de lithium. Ces protocoles peuvent être extrapolés à mesurer d'autres transporteurs non-électrogènes. De plus, la procédure de sélection présentés ici génère des cellules avec un phénotype défectueux rétention intracellulaire. Par conséquent, ces cellules vont aussi exprimer d'autres protéines de la membrane vésiculaire dans la membrane plasmique. La stratégie expérimentale représenté ici peut donc constituer un outil potentiellement puissant pour étudier d'autres protéines intracellulaires qui seront ensuite exprimés à la membrane plasmique avec le vésiculaire Na + / H + échangeurs utilisés pour la sélection.

Introduction

La plupart des compartiments intracellulaires afficher un luminale pH acide, qui est un paramètre clé pour la maturation, le trafic, le recyclage des protéines ou des hormones et des neurotransmetteurs chargement. Il a été montré que le gradient de pH entre le cytosol et vésiculaire contenu est généré par vacuolaire H + ATPases 1, couplé transporteurs vésiculaires de chlorure ClC 2. Tant dans knock-out (KO) chez la souris et des patients humains, l'importance de ces transporteurs a été soulignée par les phénotypes lourds causés par des mutations dans leurs gènes 3-6.

Les membres de la famille de SLC9A échangeurs sodium-hydrogène, aussi appelés NHE pour Na + / H + échangeurs, ont été montré pour être effecteurs clés du pH intracellulaire et la régulation du volume cellulaire, ainsi que dans le transport vectoriel d'équivalents acide-base à travers l'épithélium . Outre les NHE de la membrane plasmique, trois hautement conservée Na + / H + échangeurs NHE 6, 7et 9 sont exprimés dans le réseau trans-Golgi et les endosomes précoces 7. Des mutations dans leurs gènes ont été associés à Angelman-like ou Christianson Syndromes 8-9, l'autisme en milieu familial et 10 Attention Deficit Hyperactivity Disorder 11-12. Ces échangeurs ont également été impliqués dans des problèmes neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer 13 et la susceptibilité des gènes contigus retard mental lié à l'X syndromes 14. Pris ensemble, ces études mettent en évidence l'importance de ces NHE intracellulaires dans le développement et / ou le fonctionnement du cerveau.

La localisation intracellulaire de ces échangeurs empêche des mesures précises de leur sélectivité d'ions, la direction de transport, les paramètres cinétiques et la réglementation. Comme ce est le cas pour tous les transporteurs exprimées dans des compartiments intracellulaires, il est extrêmement difficile d'évaluer leurs activités biochimiques et donc de comprendre pleinement leurs rôles physiologiques et l'Mechanismes qui sous-tend leurs implications pathologiques. Basé sur la concentration élevée K + cytosolique, l'hypothèse la plus communément admise était-qu'ils travaillaient comme K + couplés protons transporteurs d'efflux. L'existence d'une telle fuite de protons a été émis l'hypothèse, car il peut contrebalancer protons pompage par les V-ATPases afin de maintenir un pH vésiculaire état stable. Le but de cet article visuelle est (i) de démontrer une méthode qui permet la sélection génétique de lignées cellulaires qui expriment ces transporteurs vésiculaires à leur membrane plasmique, et (ii) montrent deux approches indépendantes pour mesurer les fonctions de ces transporteurs.

Il ya trois décennies, Pouyssegur et Franchi ont mis au point une approche génétique qui a permis le clonage moléculaire et la caractérisation des membres de la famille NHE 15. Cela était basé sur la toxicité des protons intracellulaires en tant que procédé de criblage. La première étape a consisté à obtenir des lignées cellulaires déficientesdans ne importe quel / H échange de Na + + exprimé à la membrane de plasma, en utilisant la réversibilité de ce transporteur. Les fibroblastes (lignée cellulaire de CCL39) ont été préchargées avec Na + ou Li + et ensuite placées dans un milieu extracellulaire acide (pH 6,5) pendant 2 heures. Cela a conduit à la mort des cellules exprimant un Na + / H + échange fonctionnel et à la sélection des cellules déficientes en antiport (lignée cellulaire de 16 PS120). Lorsque cultivées dans un milieu sans bicarbonate, ces cellules sont très sensibles à l'acidification intracellulaire aiguë. Par conséquent, l'expression de tout mécanisme d'efflux de protons fonctionnelle à la membrane plasmique sera sélectionné positive (voir 17) si ces cellules sont soumises à acidifications intracellulaires aigus. De telles techniques d'acidification peuvent être utilisées pour isoler des lignées de cellules de trafic de défauts permettant l'expression forcée de NHE intracellulaires WT à la membrane plasmique.

Comme eucaryote Na + / H+ Échangeurs sont électroneutre, ils ne sont pas mesurables par les approches électrophysiologiques qui ont été utilisés avec succès pour mesurer canaux. Ce manuscrit montre donc comment mesurer l'activité de cet échangeur par des mesures de pH intracellulaires et une cinétique rapide de l'absorption de lithium. Comme les concepts sous-jacents sont les mêmes, il est intéressant de remarquer que la plupart des procédés mis au point pour la section de sélection sont également utilisés directement pour les mesures fonctionnelles.

Chose intéressante, nous avons observé que le défaut de traite présent dans les lignées cellulaires sélectionnées en utilisant l'approche décrite dans ce manuscrit conduit à une plus grande expression d'autres protéines vésiculaires à la membrane plasmique, comme le canal potassique 18 TWIK1 vésiculaire. Ceci souligne vers la sélection d'un mécanisme général de défauts de conservation des protéines transmembranaires vésiculaires. Ce est pourquoi cette procédure de sélection et les cellules qu'elle génère maiconstituent un outil prometteur pour la communauté scientifique travaillant sur les protéines membranaires de compartiments intracellulaires. Ainsi les techniques de mesure présentées ici pourraient être applicables pour l'étude d'autres transporteurs non-électrogènes.

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Protocol

1. H + Sélection Tuer

  1. Les lignées cellulaires
    1. Transfecter des cellules de manière stable NHE-déficients (par exemple, le PS120 lignée de cellules dérivées 16 CCL39) à l'aide d'une combinaison du vecteur d'expression de mammifère et un procédé de transfection qui produira des rendements de transfection efficace et sélection dans une lignée cellulaire de fibroblastes.
      REMARQUE: Pendant de nombreuses années phosphate de calcium précipitations 19 a été utilisé avec de bons rendements de transfection. Cela a été remplacé par plus récemment réactifs commerciaux tels que Lipofectamine2000, les transfections étant effectuées suivant les instructions du fabricant.
  2. Solutions
    1. Préparer trois solutions stériles décrites ci-dessous. Stériliser ces solutions par filtration (0,22 um).
      1. Préparer une solution de 4 + NH chargement (pH 7,4) composé de 50 mM de NH 4 Cl, 70 mM de chlorure de choline, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, 5 mM glucose et 15 mM MOPS à pH 7,4.
      2. Préparer une solution de rinçage (pH 7,0), composé de 120 mM de chlorure de choline, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, 5 mM de glucose et 15 mM de HEPES à pH 7,0.
      3. Préparer une solution de récupération (pH 7,4) constitué de NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, glucose 5 mM et HEPES 15 mM à pH 7,4.
  3. Avant de commencer la sélection, l'obtention d'un incubateur de culture de cellules qui peut être utilisé à 37 ° C sans CO supplémentaire 2 du réservoir externe (appelé CO 2 - incubateur «libre»), tel que 5% de CO 2 entraînera tampon qui peut nuire à la acidification. Amplifier la lignée cellulaire exprimant le NHE d'intérêt jusqu'à environ 2 x 10 8 cellules (typiquement d'environ 20 100 plaques confluentes mm).
  4. H + tuant procédure:
    1. Incuber les cellules exprimant le NHE intracellulaire d'intérêt pendant 1 heure dans la solution de charge, à 37 ° C dans l'incubateur à CO2 exempt.
    2. Aspirer la solution de chargement, puis les rincer deux fois dans la solution décrite ci-dessus rinçage. Effectuez cette étape efficace pour éliminer le résidu extracellulaire NH 4 Cl qui porterait atteinte à la création d'un NH 4 + forte pente qui va générer l'acidification.
    3. Eliminer le milieu de rinçage par aspiration et on incube les cellules pendant une heure dans une solution de récupération de nouveau à 37 ° C dans l'incubateur CO 2 libre.
    4. Remplacer le moyen de récupération du milieu de culture ordinaire (typiquement du DMEM avec 7,5% de FCS) et faire croître les cellules dans des conditions standard de culture (37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2 et 95% d'air).
  5. Répétez ce cycle de la sélection deux fois par semaine jusqu'à ce que des clones stables émergent.
    NOTE: Faites attention concernant la culture de cellules et les conditions de sélection. Mois de travail peuvent être ruinés par toute contamination qui est plus enclin à oCCur après une longue période de culture et de manipulations répétées de cellules.
    1. Ici, choisir d'amplifier les clones et de caractériser individuellement comme décrit dans la dans les sections 2-3, ou les réunir pour générer une population cellulaire avant caractérisation.
  6. Appliquer la sélection occasionnelle (environ une fois toutes les deux semaines) pour conserver les cellules d'acidification résistant par contre-sélection de ceux qui peuvent être revenu au phénotype sensible à l'acide parentale (figure 1B).

2. Mesures pH intracellulaire

2.1) Fluorescence Imaging pH

  1. Utilisez le ratiométrique sensible au pH colorant fluorescent BCECF / AM, qui est sensible au pH lorsqu'il est excité à 490 nm et possède un point isosbestique nm 445, en suivant les protocoles du fabricant.
    1. Vous pouvez également utiliser d'autres sondes sensibles au pH, en suivant les protocoles du fabricant.
  2. Utilisez une imagerie mis conune superficie d 'un microscope inversé couplé à une caméra vidéo à haute sensibilité. Équipé cet ensemble avec 450 nm et 490 filtres d'interférence à bande étroite nm jumelé avec quartz appropriée des filtres de densité neutre pour l'excitation.
    1. Si possible, utilisez l'ensemble approprié des filtres et des conditions d'éclairage de configuration valeurs de fluorescence comparables pour λ1 et λ2 de sorte que le ratio se rapproche de 1. Evitez également les valeurs de fluorescence de base qui sont définies soit saturer ou trop faible, tant pour λ1 et / ou λ2. Cela peut donner des artefacts importants que le ratio peut pas détectable bien pH intracellulaire est en train de changer.
      NOTE: Ce système doit permettre la perfusion rapide, time-lapse excitation à deux longueurs d'onde mentionnées ci-dessus et l'acquisition à la longueur d'onde d'émission appropriée (535 nm pour BCECF). Équipé du système avec un logiciel permettant l'acquisition automatique des données et le stockage.

2.2) Mesure de l'activité NHE Forward (Extrusion duLes protons du cytosol)

  1. Acidifier cellules par une incubation de 1 h dans la solution NH 4 + chargement (voir l'étape 1.4) en l'absence de CO 2.
  2. Ajouter BCECF-AM (5 uM de concentration finale) à la solution pour les cinq dernières minutes, puis rincer avec de NH 4 + solution de charge pour éliminer la sonde extracellulaire.
  3. Monter les cellules sur le microscope et prendre plusieurs images pour enregistrer une ligne de base stable. Perfuser la solution de rinçage (voir ci-dessus). Il en résulte une chute de la fluorescence correspondant à l'acidification.
  4. Après stabilisation du pH, perfuser l'une des solutions ci-dessous pour mesurer les taux de récupération de pH médiées par Li + / H +, Na + / H + ou K + / H + échange. Chaque solution contient un cation de couplage pourrait être testé pour l'échange de H +. Si l'un de ceux qui est transporté, cela se traduira par une augmentation de la fluorescence à 495 nm qui correspond à une augmentation du pH intracellulaire:
    120 mM de LiCl, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, glucose 5 mM et HEPES 15 mM à pH 7,4
    NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, glucose 5 mM et HEPES 15 mM à pH 7,4
    125 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, CaCl2 2 mM, glucose 5 mM et HEPES 15 mM à pH 7,4

2.3) Mesure de NHE inverse Activité

NOTE: Le principe ici est d'inverser les gradients ioniques transmembranaires.

  1. Avant la mesure, charger les cellules avec le cation intracellulaire d'intérêt (voir ci-dessous).
  2. Incuber pendant 5 min avec BCECF / AM (voir l'étape 2.2.2); rincez-les, montez-les sur le microscope vidéo.
  3. Perfuser la solution de chargement et de prendre plusieurs images pour enregistrer une ligne de base stable.
  4. Après la stabilisation de base, l'image les variations de pH lorsque les cellules sont perfusées avec un milieu acide extracellulaire contenant 120 mM de chlorure de choline, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, CaCl2 2 mM, glucose 5 mM et 15 mM de MES à pH 6,5.
  5. Pour LiCl chargement, incuber les cellules pendant 2 heures dans une solution composée de 120 mM de LiCl, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, glucose 5 mM et HEPES 15 mM à pH 7,4. Lithium intracellulaire mesuré par spectroscopie d'absorption atomique donne une valeur d'environ 60 mM.
  6. Pour le chargement Na +, les cellules incuber pendant deux heures dans une solution composée de 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 5 mM de glucose et 15 mM de HEPES à pH 7,4 en présence de 1 mM d'ouabaïne de bloquer la Na / K ATPase. Dans ces conditions, la concentration intracellulaire de Na + est de l'ordre de 40 mM.
    REMARQUE: K + chargement ne est pas nécessaire que K + cytosolique concentration est dans la gamme de 140 mM et un gradient K + dirigée vers l'extérieur est donc facile à réaliser.

2.4) Le traitement des données et d'étalonnage:

NOTE: Cette étape se applique à la fois pour les mesures avant et arrière.

  1. A la fin de chaque expérience, perfuser les cellules avec une solution de KCl 140 mM, HEPES 20 mM et 5 uM nigéricine ajustée à des valeurs de pH entre 6,5 et 7,4.
  2. Recueillir des données que des mesures de fluorescence à partir des images (niveaux de gris représentant niveaux d'intensité) et l'exportation sous format texte et traiter comme il est expliqué ci-dessous à l'aide d'un tableur.
  3. Calculer les valeurs de pH intracellulaire pour chaque cellule ou d'une région d'intérêt en utilisant l'équation suivante individuelle:
    pH = pKa + (Log (R-Rmin) / (R max -R)) x F min (λ2) / F max (λ2)
  4. Utiliser le F min (de λ2) / F x MA (λ2) se il existe rapport blanchiment de sonde ou de fuite, ce qui entraîne une diminution de la fluorescence de 450 nm tout au long des expériences. Ce ne est cependant très rarement observée dans les conditions utilisées dans le DEScribed expériences.
  5. Comme les données d'étalonnage sont présents à la fin de chaque mesure de pH, de vérifier si les valeurs calculées correspondantes diffèrent des valeurs de pH utilisées pour l'étalonnage. Si ce est le cas, puis réglez toutes les valeurs de pH déterminé de manière expérimentale à l'étalonnage en utilisant la procédure suivante:
    1. Calculer le quotient suivante (Q, la différence entre la valeurs mesurées / Différence entre les valeurs d'étalonnage). Multipliez l'ensemble des données par Q. Faire l'ajustement final par addition ou soustraction de sorte que les valeurs calculées seront égales les valeurs d'étalonnage correspondantes.

3. Mesures de taux initiaux de NHE7 par Fast Li + Absorption

  1. cellules de semences sur des plaques à puits multiples (6 à 24 puits) et acidifier les utiliser soit la technique NH 4 + de chargement décrit ci-dessus ou alternativement le nigéricine / sérum albumine bovine (BSA) acidification décrite dans 20.
  2. Maintenir courtes et cohérentes durées d'absorption (généralement une minute ou ci-dessous) afin de se assurer que le transport fonctionne dans des conditions de taux initiaux. Assurez-vous également que toutes les solutions utilisées pour l'absorption sont isotoniques.
  3. A la fin du temps d'absorption, éliminer soigneusement le milieu d'absorption et laver les cellules à quatre reprises avec une solution saline phosphate glacée tamponnée (PBS). Effectuez ces lavages aussi vite que possible (moins de 10 secondes pour les quatre d'entre eux est idéal) pour empêcher lithium efflux.
  4. Lyse des cellules dans 25% d'acide nitrique. Appliquer 250 pi par puits de 25% d'acide nitrique et laisser reposer pendant au moins 1 h, puis la ferraille chaque puits avec l'extrémité de la pointe de la pipette et transférer la suspension de l'ensemble ainsi dans une nouvelle kmTube crocentrifuge.
  5. Transférer le lysat dans 1,5 ml microtubes, centrifuger les pendant 5 minutes à 15 000 xg (à température ambiante) pour éliminer les débris cellulaires.
  6. Mesurer la teneur en lithium des surnageants par spectroscopie d'absorption atomique 21.
    NOTE: Différentes entreprises offrent spectromètres d'absorption atomique, qui doivent être équipé d'une lampe à cathode creuse au lithium. Suivez les instructions du fabricant, car ces machines sont très précises mais aussi très délicate.

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Representative Results

Sélection:

La sélection + H tuant est basé sur la diffusion de l'ammonium base faible, telle que représentée sur la figure 1A. L'effet des bases faibles et acides diffusion sur le pH intracellulaire a été mis au point par Walter bore et ses collaborateurs 22. L'idée élégante d'utiliser ce phénomène pour produire une acidification mortelle pour la sélection génétique positive a été ensuite développé par Jacques Pouyssegur 17. Dans un tel protocole, le pH intracellulaire chute à environ 5,5 après l'étape de rinçage. Les cellules qui ne expriment pas un NHE fonctionnelle à la membrane plasmique ne peuvent pas récupérer une valeur de pH neutre et montrer un aspect acidifié typique avec une forme plate et un cytosol granulaire (figure 1B). Après des cycles de sélection répétés (environ deux H + tuant procédures / semaine), les cellules qui survivent de manière stable et entièrement cette acidification (figure 1C) sortir, à une fréquence d'environ 10 -7.Cela se traduira par la formation de clones cellulaires individuels qui peuvent être caractérisées individuellement ou regroupés pour obtenir des populations cellulaires si désiré. Expériences standard telles que la biotinylation de la surface cellulaire ou le silençage d'ARN peuvent être effectuées pour contrôler que la protéine exprimée à la membrane plasmique est en effet un NHE intracellulaire tel que NHE7 (voir par exemple Milosavljevic et al. 18). Ainsi, RT-PCR et séquençage ultérieur doivent être effectuées pour vérifier mutations éventuelles dans la séquence des NHE intracellulaires exprimées dans la lignée cellulaire sélectionné.

Caractérisation fonctionnelle:

Fluorescence vidéomicroscopie:

L'activité et la sélectivité des ions intracellulaires NHE exprimés à la membrane plasmique peut être caractérisée par la mesure des changements du pH intracellulaire induite par ces NHE dans diverses conditions. Pour cela, un ensemble de vidéomicroscopie équipé d'un éclairageles paramètres d 'acquisition de l'image d'une sonde ratiométrique comme BCECF / AM est schématisé sur la figure 2A. Figure 2B et 2C montrent les variations typiques de valeurs de fluorescence obtenus directement pour des excitations à 490 et 450 nm, après un NH 4 + chargement acidification. La figure 2D représente la courbe de pH obtenue à partir de ces valeurs de fluorescence après le traitement de données décrit dans 2.4).

Lithium Absorption:

Avec de l'hydrogène et de sodium, de lithium comprend une partie de la première colonne de la classification périodique et a été montré être un cation de couplage efficace pour Na + / H + échangeurs. Il est possible de profiter de ces informations pour configurer une cinétique rapide de l'absorption de lithium, afin de mesurer en détail les paramètres fonctionnels de Na + / H + échangeurs. Comme ce cation est absent du cytoplasme de la cellule, son accumulation sur cytacidification osolic quantitativement refléter l'activité de la membrane plasmique NHE. En outre, à des concentrations nanomolaires picomolaires de lithium peut être mesurée avec une grande précision en utilisant la spectrométrie d'absorption atomique. Ainsi, cette approche est très efficace lorsqu'il est combiné avec le choix de la membrane plasmique vésiculaire échangeurs exprimées. La figure 3 illustre le protocole de mesure décrit dans le 3) de la section des protocoles. Les cellules, de préférence ensemencés sur des plaques multi-puits (6 à 24) sont acidifiées comme décrit précédemment. La cinétique commence par l'incubation des cellules dans un milieu contenant du lithium, et les autres cations ou des inhibiteurs d'intérêt (figure 3A).

Pour arrêter l'absorption, les cellules sont ensuite soumis à quatre rinçages rapides au PBS glacé. Utilisation rapidement supprime toute lithium extracellulaire tout en veillant à ce qu'aucun flux sortant de lithium important se produit (figure 3B). la concentration de lithium dans chaque puits est alorsmesurée par spectroscopie d'absorption atomique (figure 3C), et les taux initiaux de lithium absorption, qui donnent directement l'activité de l'échangeur à l'état d'équilibre sont obtenus comme mesures de l'évolution dans le temps de l'accumulation de lithium (Figure 3D) de pente.

En ce qui concerne la cinétique enzymatique, la dose-réponse de vitesses initiales peut être utilisé pour dériver les valeurs de Km pour les substrats (figure 4A) de valeurs de Ki pour les inhibiteurs. Une caractéristique intéressante de transporteurs est que différents cations de couplage seront en compétition pour le transport. Cela donne la possibilité de mesurer la valeur de Km pour le sodium en compétition avec le lithium absorption (figure 4B).

Figure 1
Figure 1: Sélection de cellules exprimant une intracellulaire de Na + / H + </ Strong échangeur> lors de leur membrane plasmique. (A) Stratégie pour les trois étapes H + tuant sélection de cellules exprimant un NHE intracellulaire fonctionnelle non muté et non-marqué à la membrane plasmique. Image en microscopie (B) à contraste de phase de cellules parentales PS120 soumis à une charge acide. Barre d'échelle: 25 um image de microscopie (C) à contraste de phase de cellules PS120 sélectionnés pour l'expression d'un échangeur vésiculaire à la membrane plasmique, à la suite d'une charge acide. Barre d'échelle: 25 um Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: mesures de pH intracellulaire (A) Principe de mesure pH de vidéomicroscopie.. (B) Evolution de la fluorescence émise (595 nm) de la sonde de pH BCECF la suite d'une excitation à 490 nm. L: la charge acide, Ri; Rincez, Re: récupération, Cal6.5: l'étalonnage à un pH intracellulaire de 6,5, Cal7.0: étalonnage à un pH intracellulaire de 7,0 (C) Evolution de la fluorescence émise (595 nm) de la sonde de pH BCECF suite à une excitation au 450 nm. L: la charge acide, Ri; Rincer, Re: récupération, Cal6.5: étalonnage à un pH de 6,5 intracellulaire, Cal7.0: étalonnage à un pH intracellulaire de 7,0 (D) Evolution du pH intracellulaire calculé à partir des rapports de la BCECF pH de fluorescence 490/450 nm sonde et des points d'étalonnage. L: la charge acide, Ri; Rincez, Re: récupération, Cal6.5: l'étalonnage à un pH intracellulaire de 6,5, Cal7.0: étalonnage à un pH intracellulaire de 7,0 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 3:. Activité NHE mesurée par les taux initiaux de Li + absorption (A - C) Schéma illustrant les différentes étapes critiques de l'Exemple technique de mesure (D) d'un cours de temps mesuré de l'absorption de lithium pour l'échangeur NHE7 vésiculaire exprimé au plasma membrane. Notez la linéarité de la cinétique dans les conditions expérimentales, assurant la mesure des taux initiaux. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Courbes dose-réponse typique pour NHE7 (données originales de 18): Figure 4.Les taux initiaux de lithium absorption ont été mesurés par la cinétique de 1 minute. (A) de la courbe dose-réponse pour le lithium extracellulaire. (B) de la concurrence de différentes concentrations de sodium extracellulaire sur 1 mM absorption de lithium extracellulaire. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Ce protocole décrit la manière de sélectionner les cellules exprimant intracellulaire de Na + / H + échangeurs à la membrane plasmique sans modification de leur séquence primaire par mutagenèse dirigée. Ces échangeurs peuvent maintenant être caractérisés.

Cette méthode est basée sur la toxicité cellulaire des protons intracellulaires pour sélectionner des lignées cellulaires qui expriment vésiculeuse Na + / H + échangeurs à la membrane plasmique. Il pourrait être possible, en principe, d'utiliser d'autres cations qui peuvent être soupçonnés d'être transporté, tels que Li +, K +, ou Cs +. Toutefois, ceci ajoute un niveau supplémentaire d'incertitude. Si la sélection ne donne aucun clone positif, il sera alors difficile d'évaluer si le cation ne est pas testé transporté ou l'échangeur ne est pas à la membrane plasmique. Pour ces raisons, les sélections ont été effectuées en utilisant Na + comme cation de couplage comme ce est le substr extracellulairemangé trouvé dans plus forte abondance dans des conditions physiologiques. Cela a conduit à la sélection de variants qui expriment NHE7 18, ainsi que NHE6 et NHE9 à la membrane plasmique (Poët et Counillon, résultats non publiés).

Cette expression membranaire plasmique permet la mesure des paramètres fonctionnels transporteurs par des méthodes qui pourraient jusqu'ici seulement être utilisés pour les transporteurs de la membrane plasmique. Bien sûr, il ne est pas possible d'exclure qu'un tel changement de milieu de la membrane peut affecter les caractéristiques fonctionnelles des vésiculaires NHE. Toutefois, cette stratégie pourrait être intéressant d'utiliser pour au moins trois raisons: (i) l'expression intracellulaire de NHE6, 7 et 9 se oppose à toute mesure fonctionnelle détaillée, (ii) les environnements membranaires et des protéines ou lipides partenaires ont montré la plupart du temps à affecter subtile réglementaire mécanismes des autres NHE et non leurs caractéristiques très fondamentaux de ces transporteurs (affinités pour les cations de couplage, la sélectivité, la directivité, phcaractéristiques armacological). Il est donc très probable que les personnes resteront inchangées par l'expression membranaire des NHE vésiculaires. (Iii) La connaissance des mécanismes fonctionnels et de profils pharmacologiques d'un mécanisme plasma membrane vésiculaire-exprimés, il est alors possible d'effectuer des mesures de pH vésiculaire pour traiter les écarts éventuels entre la membrane plasmique et d'expression vésiculaire.

Une autre limitation potentiel de cette technique est que la stratégie décrite ici peut conduire à la sélection de cellules exprimant des autres, H + mécanisme d'extrusion de la vésiculaire transfectée Na + / H + échangeur (telle qu'une membrane plasmatique NHE, ou un H + ATPase, par exemple ). Même se il n'a jamais été observée dans le laboratoire, il est donc essentiel d'utiliser l'étiquetage classique de surface cellulaire couplé à taire réellement vérifier que le NHE d'intérêt est en effet exprimé à la membrane plasmique et intervient dans la Na + ou Li + et al. 18).

Pour caractériser l'activité de ces transporteurs, deux protocoles, respectivement basées sur les variations de pH intracellulaires et des flux ioniques sont décrites. La première méthode nécessite l'utilisation de sondes fluorescentes sensibles au pH et d'un système de microscopie à fluorescence vidéo adéquat. Cette méthode, qui est utilisé par de nombreux groupes dans le domaine, a été développé dans les années 1980, d'abord en utilisant fluorimètres pour mesurer cellules signaux de forme en suspension 23, puis en utilisant acquisition numérique pour mesurer cellules individuelles en couplant l'excitation de fluorescence et l'acquisition de vidéomicroscopie 24. Cette dernière technique est devenue très rapide et facile, en raison de la haute performance de caméras, l'éclairage et les systèmes informatiques. Fait intéressant, les entreprises fournissent généralement des fiches techniques très instructifs avec leurs sondes fluorescentes. Ces variations de pH fournissent des informations importantespour déterminer la nature des cations extracellulaires associés à efflux de protons. A cet égard, il est important de noter que la durée de la pré-incubation d'ammonium doit être ajustée avec soin selon les cellules utilisées pour les mesures. fibroblastes CCL39 dérivés, supportent très bien une charge d'une heure avec 50 mM NH 4 Cl. Il en résulte une acidification très forte qui permet NHE activation complète et produit un signal fort pour les mesures (conditions Vmax). Cependant, d'autres cellules comme les cellules rénales ou cardiomyocytes primaires ne seraient pas soutenir une telle charge d'ammonium importante. Il est intéressant d'effectuer plusieurs essais préliminaires avec différents temps d'incubation ou de NH 4 Cl concentrations. La raison de ces différences de sensibilité à NH 4 Cl ne sont pas claires. Ils peuvent être liés à l'expression possible des systèmes de transport d'ammonium 25,26. De même, la solution contient pas de sodium qui est utilisé pour le rinçage de la solution de charge peut ne pas être toléréepar des cellules telles que les cardiomyocytes, par exemple. Bien que les vitesses initiales seront déterminés moins de précision, il est nécessaire de perfuser directement avec la solution de récupération après chargement ammonium.

En outre, des mesures de pH intracellulaires offrent également un moyen simple pour étudier les propriétés réversibles de ces échangeurs que le mode inverse produira une acidification qui sera facilement détectée par une diminution du niveau de fluorescence de la BCECF qui peut être exprimée comme un étalonnage suivant des valeurs de pH . Les limites de ces expériences est le manque d'une quantification précise des activités de transport, que les variations de pH expériences de mesures, qui opèrent sur une échelle logarithmique et sont limitées par la capacité tampon intracellulaire. Celui-ci peut être mesurée et les variations de pH multiplié par la capacité de mise en mémoire tampon des flux d'ions rendement. Toutefois, ce processus combine plusieurs erreurs expérimentales (sur des mesures de pH, les mesures de capacité tampon, et Calibration) et ne est donc pas très quantitative. Par conséquent, pour accéder aux constantes enzymatiques de la membrane plasmique exprimé transporteur, les techniques de flux d'ions rapide sont beaucoup plus simple et précis.

Parce contenu intracellulaire sont dans la plage millimolaire, détecter les changements à médiation par NHE cytosolique en sodium ne est pas possible. Dès lors, pendant des années ces techniques d'absorption ont été basés sur l'utilisation de radio-isotopes tels que 22 Na +. Ce manuscrit décrit un procédé non radioactif pour lequel 22 Na + est remplacé par le lithium, basé sur l'idée que ce cation, qui est également utilisé par NHE, est absent du cytosol de la cellule et peut être mesuré avec une grande précision en utilisant la spectrométrie d'absorption atomique 21. Une fois les conditions appropriées (de temps et de concentration de lithium) pour mesurer les absorptions linéaires (ie., Étant dans des conditions de taux initiaux) sont déterminées, des affinités pour les autres cations de couplage potentiel et / ouLes inhibiteurs peuvent être mesurés avec précision, comme illustré sur les figures 3 et 4. Une dernière limitation est que le potentiel de la méthode d'absorption de lithium peut évidemment fonctionner que si l'échangeur d'intérêt transporte de manière significative ce cation. Si ce ne est pas le cas, l'expérimentateur devra se appuyer soit sur les mesures de pH intracellulaire mentionnés ci-dessus ou devra utiliser l'absorption du sodium radioactif.

Une telle série d'expériences ont conduit récemment conduit à l'observation que le NHE7 intracellulaire Na + / H + échangeur, qui a été initialement considéré comme un H + / K + transporteur qui alcaliniser vésicules était en fait un mécanisme endosomique d'acidification couplé au sodium 18. Ceci a des implications profondes pour les compartiments intracellulaires que jusqu'à présent ce rôle a été pensé pour être consacré aux VH + ATPases. Comme chaque membre de la famille NHE semble afficher une signature cinétique très spécifique oaile pour son rôle physiologique, il est tentant de supposer que la caractérisation de NHE6 et NHE9 utilisant les méthodes décrites dans cet article va révéler caractéristiques nouvelles et inattendues qui mettra en évidence leurs fonctions physiologiques.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard cell culture equipement Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers
Incubator with CO2 Sanyo MCO15A
Incubator without CO2 Heraeus instrument BB6220
Laminar flow hood PSM1200NF Fisher  52010120
DMEM medium sigma D5796
FBS gold GE Healthcare A15-151
Penicilin/streptomycin PAA P11-010
Trypsin 10x PAA L11-003
Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system Thermo Scientific ICE 3500 GFZ
LiCl sigma L4408
Nitric Acid sigma 438073
Fluorescence videomicroscopy set Leica Composed of many devices with different catalog numbers
Inverted automated microscope Leica DMI6000B
microscope stand leica 11888906
11888911
11505180
11888377
incident fluorescence leica 11888901
11504166
motor bracket leica 11888379
11505234
11521505
11522106
LED transmission light  leica 8097321
8102034
11521580
motorized plate leica 11522068
11531172
11521734
11521719
11888423
11888424
camera output leica 11888373
11507807
11888393
11888259
11888258
11541510
images acquisition/analysis software leica 11888375
optics leica 11506507
11506243
11506203
fluorescence Xenon lamp leica DMI6000
camera hamamatsu 8100601
metafluor/Mmfluor software 11640905
pH sensitive probe, BCECF-AM life technologies B1170
Nigericin Sigma N7143

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References

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Biologie cellulaire Numéro 97 compartiments intracellulaires la génétique des cellules somatiques Na
Caractérisation fonctionnelle de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Echangeurs de intracellulaire Compartiments utilisant la sélection Proton-tuant les exprimer à la membrane plasmique
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Milosavljevic, N., Poët, M., Monet, M., Birgy-Barelli, E., Léna, I., Counillon, L. Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane. J. Vis. Exp. (97), e52453, doi:10.3791/52453 (2015).

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