Abstract
החמצת endosomal היא קריטית עבור מגוון רחב של תהליכים, כגון מחזור חלבון והשפלה, הפחתת רגישות הקולטן, וטעינת מוליך עצבי בשלפוחית סינפטית. החמצה זו מתוארת בתיווכה של ATPases פרוטון, מצמידים את מובילי כלוריד CLC. מאוד-נשמרים מובילי פרוטוני electroneutral, Na + / H + מחליפי (nhe) 6, 7 ו -9 גם באה לידי ביטוי בתאים אלה. מוטציות בגנים שלהם נקשרו עם מחלות ניווניות קוגניטיביים ואנושיות. באופן פרדוקסלי, את תפקידם להישאר חמקמק, כמו הלוקליזציה תאית שלהם מנעה אפיון פונקציונלי מפורט. כתב יד זה מראה שיטה לפתור את הבעיה הזו. זה כולל את הבחירה של שורות תאים שעברו מוטציה, מסוגלת לשרוד החמצת cytosolic חריפה על ידי שמירת NHEs תאית בקרום הפלזמה. לאחר מכן הוא מתאר שני פרוטוקולים משלימים כדי למדוד את הסלקטיביות היון ופעילותשל מחליפי הבאים: (i) המבוסס על מדידות pH תוך תאיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וידאו, וכן (ii) המבוסס על קינטיקה מהירה של ספיגת ליתיום. ניתן להסיק פרוטוקולים אלה על מנת למדוד מובילים שאינם electrogenic אחרים. יתר על כן, הליך הבחירה שהוצג כאן מייצר תאים עם הפנוטיפ פגום שימור תאיים. לכן תאים אלו יהיו גם להביע את חלבוני קרום לפוחי אחרים בקרום הפלזמה. האסטרטגיה הניסיונית המתוארת כאן עשויה לכן מהווה כלי רב עוצמה פוטנציאלית ללמוד חלבונים תאיים אחרים שלאחר מכן באו לידי ביטוי בקרום הפלזמה יחד עם לפוחי Na + / H + מחליפי המשמשים לבחירה.
Introduction
רוב התאים תאיים להציג pH luminal חומציים, שהוא פרמטר מרכזי להתבגרות, סחר, מחזור של חלבונים או הורמונים ונוירוטרנסמיטורים טעינה. הוכח כי שיפוע pH בין תוכן cytosol ולפוחי מופק על ידי H vacuolar + ATPases 1, מצמידים את מובילי כלוריד CLC לפוחי 2. שניהם בנוק-אאוט (KO) עכברים וחולים אנושיים, את החשיבות של מובילים אלה כבר מסומן על ידי פנוטיפים הכבדים הנגרמים על ידי מוטציות בגנים שלהם 3-6.
בני משפחת SLC9A מחליפי נתרן-מימן, המכונים גם NHEs לNa + / H + מחליפי, הוכח להיות effectors מפתח בpH התוך התאי ורגולצית נפח תא, כמו גם בתחבורה וקטורים שווים חומצה-בסיס על פני epithelia . חוץ מזה NHEs קרום פלזמה, שלוש שמורים ביותר Na + / H + מחליפי, 6 nhe, 7ו -9 באים לידי ביטוי ברשת טרנס-Golgi ובendosomes מוקדם 7. מוטציות בגנים שלהם נקשרו עם הפרעה כמו-Angelman או כריסטנסן תסמונות 8-9, אוטיזם מבוסס משפחה 10 וקשב וריכוז והיפראקטיביות 11-12. מחליפי אלה גם היו מעורבים בבעיות ניווניות כגון אלצהיימר רגישות מחלה 13 וגנים רציפים פיגור שהכלי X צמוד תסמונות 14. יחדיו, מחקרים אלה מדגישים את החשיבות של NHEs תאיים אלה בהתפתחות מוח ו / או פונקציה.
הלוקליזציה תאית של מחליפי אלה מונעת מדידות מדויקות של הסלקטיביות יונם, כיוון תחבורה, פרמטרים הקינטית, ורגולציה. כמו במקרה של כל המובילים באו לידי ביטוי בתאים תאיים, שקשה מאוד להעריך פעילות ביוכימית שלהם ומכאן להבין באופן מלא התפקידים הפיסיולוגיים שלהם וmechanהאיזמים בסיס ההשלכות פתולוגיות שלהם. בהתבסס על ריכוז K + הגבוה cytosolic, ההשערה ביותר המקובלת היו שהם עובדים כמובילי פרוטון בזרימת בשילוב K +. קיומה של נזילה כזו פרוטון ששער, כפי שהוא עשוי לאזן שאיבת פרוטון על ידי V-ATPases על מנת לשמור על pH לפוחי מצב יציב. מטרת מאמר זה היא חזותי (i) להפגין שיטה המאפשרת את הבחירה הגנטית של שורות תאים המבטאות את מובילי לפוחי כזה בקרום הפלזמה שלהם, וכן (ii) להציג שתי גישות עצמאיות כדי למדוד את הפונקציות של מובילים אלה.
לפני שלושה עשורים, Pouysségur וFranchi יש חלוץ גישה גנטית שאפשרה שיבוט ואפיון המולקולריים של בני משפחת nhe 15. זו התבססה על הרעילות של פרוטונים תאיים כשיטת הקרנה. הצעד הראשון היה להשיג שורות תאים לקוייםבכל בורסה + / H + Na הביע בקרום הפלזמה, באמצעות ההפיכות של טרנספורטר זה. Fibroblasts (קו תא CCL39) היה מראש עם Na + או Li + ולאחר מכן הניח במדיום תאי חומצי (pH 6.5) עבור שעה 2. זה הוביל למותם של תאים לבטא Na + / H + חילופי פונקציונליים ולבחירה של תאי antiporter לקוי (קו תא PS120) 16. כשטפח במדיום ללא יקרבונט, תאים אלה רגישים מאוד להחמצה תאית אקוטית. כתוצאה מכך, הביטוי של כל מנגנון זרימת פרוטון פונקציונלי בקרום הפלזמה ייבחר באופן חיובי (ראה 17) אם תאים אלה מוגשים לacidifications תאית האקוטי. טכניקות החמצה כזו יכולה לשמש כדי לבודד שורות תאים עם סחר בפגמים המאפשרים ביטוי בכפייה של NHEs תאית WT בקרום הפלזמה.
כאוקריוטים Na + / H+ מחליפי הם electroneutral, הם לא ניתנים למדידה על ידי גישות אלקטרו שנוצלו בהצלחה רבה כדי למדוד ערוצים. כתב-יד זה ולכן מדגים כיצד למדוד את הפעילות של מחליפי זה על ידי מדידות pH תוך תאיות וקינטיקה מהירה של ספיגת ליתיום. כמושגי יסוד הם אותו הדבר, זה מעניין לשים לב שרבים מהתהליכים שפותחו עבור סעיף הבחירה משמשים גם ישירות למדידות פונקציונליות.
מעניין, יש לנו ציינו כי פגם הסחר הנוכחי בשורות התאים שנבחרו בגישה שתוארה בכתב היד הזה מוביל לביטוי גדול יותר של חלבוני לפוחי אחרים בקרום הפלזמה כגון ערוץ אשלגן לפוחי TWIK1 18. זה מצביע על כיוון הבחירה של מנגנון פגם שימור כללי לחלבונים הטרנסממברני לפוחי. מכאן הליך בחירה זו והתאים שמייצרים מאימהווה כלי מבטיח לקהילה המדעית עובדת על חלבוני הקרום של תאים תאיים. כמו גם שיטות המדידה שהוצגו כאן עשויות להיות ישימות ללימוד מובילים שאינם electrogenic אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. H + בחירת הריגה
- שורות תאים
- יציבות transfect תאי nhe הלקויים (למשל, הקו-נגזר CCL39 PS120 תא 16) באמצעות כל שילוב של וקטור ביטוי יונקים ושיטת transfection שיפיק תשואות transfection יעילה ובחירה בשורת תאי פיברובלסטים.
הערה: במשך שנים רבות משקעים סידן זרח 19 היה בשימוש עם תשואות transfection טובות. זה הוחלף לאחרונה על ידי חומרים כימיים מסחריים כגון Lipofectamine2000, transfections מתבצע הבא הוראות היצרן.
- יציבות transfect תאי nhe הלקויים (למשל, הקו-נגזר CCL39 PS120 תא 16) באמצעות כל שילוב של וקטור ביטוי יונקים ושיטת transfection שיפיק תשואות transfection יעילה ובחירה בשורת תאי פיברובלסטים.
- פתרונות
- הכן שלושה פתרונות סטרילי כפי שתוארו להלן. לעקר את הפתרונים הללו על ידי סינון (0.22 מיקרומטר).
- הכן 4 + פתרון Loading NH (pH 7.4) המורכב של 50 מ"מ NH 4 Cl, כלוריד כולין 70 מ"מ, 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl 2, 2 מ"מ CaCl 2, GL 5 מ"מucose ו -15 מ"מ מגבים ב- pH 7.4.
- הכן פתרון שטיפה (pH 7.0) המורכב של 120 מ"מ כלוריד כולין, 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl 2, 2 מ"מ CaCl 2, גלוקוז 5 מ"מ ו -15 מ"מ בHEPES pH 7.0.
- הכן פתרון שחזור (pH 7.4) המורכב של 120 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl 2, 2 מ"מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ"מ ו -15 מ"מ בHEPES pH 7.4.
- הכן שלושה פתרונות סטרילי כפי שתוארו להלן. לעקר את הפתרונים הללו על ידי סינון (0.22 מיקרומטר).
- לפני שתתחיל בבחירה, להשיג תרבית תאי חממה, שניתן להשתמש ב 37 ° C ללא CO 2 נוסף ממכל חיצוני (המכונה CO 2 - חממה "חופשית"), כ5% CO 2 יגרום לחציצה שעלולה לפגוע ב החמצה. להגביר את שורת התאים המבטאת את nhe של ריבית עד לכ 2 x 10 8 תאים (צלחות מ"מ בדרך כלל כ -20 מחוברות 100).
- H + הריגת הליך:
- דגירה התאים המבטאים את nhe תאיים של עניין במשך שעה 1 בפתרון הטעינה, בשעה 37 מעלות צלזיוס בחממת -חינם CO 2.
- לשאוב את פתרון הטעינה ולאחר מכן לשטוף אותם פעמיים בפתרון מתואר השטיפה מעל. לבצע שלב זה ביעילות לחסל Cl השייר תאי NH 4 שיפגע ביצירת מפל + NH 4 תלול שיפיק את החמצה.
- לחסל את מדיום השטיפה על ידי שאיפה ודגירת התאים במשך שעה אחת בפתרון התאוששות שוב על 37 מעלות צלזיוס בחממה החופשית CO 2.
- החלף את ההתאוששות בינונית עם בינוני תרבות קבועה (בדרך כלל DMEM עם 7.5% FCS) ולגדול תאים בתנאי תרבות סטנדרטיים (37 ° C באווירת humidified של 5% CO 2 ו -95% אוויר).
- חזור על מחזור של בחירה זו פעמיים בשבוע עד שיבוטים יציבים לצוץ.
הערה: קח טיפול מיוחד הנוגע לתרבות התא ותנאי בחירה. חודשים של עבודה יכולים להיות הרוסים על ידי כל זיהום שהוא נוטה יותר לoccur לאחר תקופה של תרבות ומניפולציות תא חוזרות ונשנות ארוכה.- כאן, לבחור אם להגביר את השיבוטים ולאפיין אותם בנפרד כפי שתואר בסעיפים 2-3 נוסף, או בריכה אותם יחד כדי ליצור אוכלוסייה סלולרית לפני האפיון.
- החל בחירה מזדמנת (בערך פעם בשבועיים) כדי לשמר את תאי החמצה עמידה על ידי אלה שאולי חזרו לפנוטיפ החומצה רגישה ההורי (איור 1) בחירה לדלפק.
2. מדידות תאיים pH
2.1) הדמיה pH הקרינה
- השתמש בratiometric pH רגיש BCECF הצבע / AM ניאון, שהוא רגיש pH כאשר נרגש ב 490 ננומטר והוא בעל נקודת 445 ננומטר isosbestic, הבא הפרוטוקולים של היצרן.
- לחלופין, להשתמש בבדיקות pH רגיש אחרות, הבאים הפרוטוקולים של היצרן.
- השתמש con הדמיה להגדירsisting של מיקרוסקופ הפוך מצמידים את מצלמת וידאו רגישות גבוהה. לצייד את הסט הזה עם 450 ננומטר ומסנני 490 הפרעות להקת ננומטר צרים יחד עם מסננים ניטראלי צפיפות קוורץ המתאים לעירור.
- במידת האפשר, השתמש בסט המתאים של מסננים ותנאי תאורה לערכי הקרינה דומים התקנה לλ1 וλ2 כך שהיחס מתקרב 1. כמו כן להימנע ערכי הקרינה בסיסיים שנקבעים גם להרוות או נמוך מדי, הן עבור λ1 ו / או λ2. זה עשוי להניב ממצאים חשובים כמו אז היחס לא היה לגילוי למרות pH תוך התאי משתנה.
הערה: מערכת זו צריכה לאפשר זלוף המהיר, עירור הזמן לשגות בשני אורכי הגל הנ"ל ורכישה באורך הגל המתאים הפליטה (535 ננומטר לBCECF). לצייד את המערכת עם תוכנה המאפשרת רכישה אוטומטית של נתונים ואחסון.
- במידת האפשר, השתמש בסט המתאים של מסננים ותנאי תאורה לערכי הקרינה דומים התקנה לλ1 וλ2 כך שהיחס מתקרב 1. כמו כן להימנע ערכי הקרינה בסיסיים שנקבעים גם להרוות או נמוך מדי, הן עבור λ1 ו / או λ2. זה עשוי להניב ממצאים חשובים כמו אז היחס לא היה לגילוי למרות pH תוך התאי משתנה.
2.2) מדידה של nhe קדימה פעילות (שחול שלפרוטונים מCytosol)
- להפוך לחומצת תאים על ידי דגירה שעה 1 בפתרון NH 4 + טעינה (ראה שלב 1.4) בהעדר CO 2.
- להוסיף BCECF-AM (ריכוז סופי 5 מיקרומטר) לפתרון לחמש דקות האחרונות ולאחר מכן לשטוף אותו עם NH 4 + פתרון טעינה לחסל את החללית תאית.
- הר התאים במיקרוסקופ ולקחת כמה תמונות כדי להקליט בסיס יציב. Perfuse פתרון השטיפה (ראה לעיל). התוצאה היא ירידה של הקרינה המתאימה להחמצה.
- לאחר ייצוב pH, ינקב כל הפתרונות מפורטים להלן למדוד שיעורי החלמה pH בתיווכו של Li + / H +, Na + + / H או K + / H + חליפין. כל פתרון מכיל קטיון צימוד פוטנציאל להיבדק לH + חליפין. אם אחד מאותם מועבר, זה יגרום לעלייה של הקרינה ב495 ננומטר שcorrespond להעלאה בpH התוך התאי:
120 מ"מ LiCl, 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl 2, 2 מ"מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ"מ ו -15 מ"מ בHEPES pH 7.4
120 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl 2, 2 מ"מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ"מ ו -15 מ"מ בHEPES pH 7.4
125 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl 2, 2 מ"מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ"מ ו -15 מ"מ בHEPES pH 7.4
2.3) מדידה של פעילות הפוכה nhe
הערה: העיקרון כאן היא להפוך את מפל ריכוזי יונים הטרנסממברני.
- לפני המדידה, לטעון את התאים עם קטיון תאיים של עניין (ראה בהמשך).
- דגירתם ל5 דקות עם BCECF / AM (ראה שלב 2.2.2); לשטוף אותם, לעלות אותם במיקרוסקופ הווידאו.
- Perfuse פתרון הטעינה ולקחת כמה תמונות כדי להקליט בסיס יציב.
- לאחר ייצוב הבסיס, תמונת וריאציות pH כאשר תאי perfused עם מדיום חומציים תאי המכיל 120 מ 'כלוריד M כולין, 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl 2, 2 מ"מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ"מ ו -15 מ"מ MES ב- pH 6.5.
- לטעינת LiCl, דגירה תאים עבור שעה 2 בפתרון המורכב של 120 מ"מ LiCl, 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl 2, 2 מ"מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ"מ ו -15 מ"מ בHEPES pH 7.4. ליתיום תאיים שנמדד על ידי ספקטרום בליעה אטומי מניב ערך של כ -60 מ"מ.
- לNa + טעינה, דגירה תאים במשך שעות בפתרון המורכב של 120 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl 2, 2 מ"מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ"מ ו -15 מ"מ בHEPES pH 7.4 בנוכחות ouabain 1 מ"מ כדי לחסום את Na / K ATPase. בתנאים אלה, ריכוז Na + תאיים הוא בטווח של 40 מ"מ.
הערה: K + טעינה אין צורך כK + ריכוז cytosolic הוא בטווח של 140 מ"מ ושיפוע K + כלפי חוץ מכוון לכן קל להשגה.
2.4) נתונים טיפול וכיול:
הערה: שלב זה חל הן על המדידות קדימה לאחור.
- בסופו של כל ניסוי, perfuse תאים עם פתרון של 140 מ"מ KCl, 20 מ"מ HEPES ו -5 nigericin מיקרומטר המותאם לערכי pH בין 6.5 ו -7.4.
- לאסוף נתונים כמו מדידות הקרינה מהתמונות (רמות אפורות המייצגים רמות עצימות) ויצוא תחת פורמט טקסט ולטפל כפי שיוסבר להלן באמצעות תוכנת גיליונות אלקטרוניים.
- לחשב ערכי pH תוך תאיים לכל תא או אזור של עניין באמצעות המשוואה הבאה בודדים:
pH = pKa דקות + (יומן (R-Rmin) / (R מקסימום -R)) x F (λ2) / F מקסימום (λ2) - השתמש בדקות F (λ2) / x ma F יחס אם יש הלבנת בדיקה או דליפה, וכתוצאה מכך ירידה בקרינת 450 ננומטר ברחבי הניסויים (λ2). זה אולם מאוד לעתים רחוקות נצפה בתנאי שימוש בdesניסויי cribed.
- כנתוני כיול נמצאים בסוף כל מדידת pH, לבדוק אם הערכים מחושבים המקבילים שונים מערכי pH המשמשים לכיול. אם זה המקרה, אז להתאים את כל ערכי ה- pH בניסוי שנקבעו לכיול באמצעות ההליך הבא:
- לחשב את המנה הבאה (Q, את ההבדל בין ערכים / ההבדל נמדד בין ערכי הכיול). הכפל את כל המערך על ידי ש הפוך ההתאמה הסופית על ידי הוספה או גריעה כך שהערכים מחושבים יהיו שווים את ערכי כיול המקביל.
3. מדידות של מחירים ראשוניים של NHE7 ידי מהיר Li + ספיג
- תאי זרע על צלחות גם רב (6 עד 24 גם) ולהפוך לחומצתם או באמצעות NH 4 + טכניקת ההעמסה שתוארה לעיל או לחלופין nigericin אלבומין בסרום שור החמצה / (BSA) תיארה ב -20.
- לשמור על משך ספיגה קצר ועקבי (בדרך כלל דקה אחת או נמוך יותר) כדי להבטיח תחבורה הפועלת בתנאי שיעורים ראשוניים. כמו כן יש לוודא כי כל הפתרונות המשמשים לספיגה הם איזוטוני.
- בסופו של זמן הספיגה, לחסל בזהירות בינוני הספיגה ולשטוף את התאים ארבע פעמים עם פוספט קר כקרח שנאגרו (PBS). לבצע שטיפות אלה מהר ככל האפשר (פחות מ -10 שניות לארבעה מהם הוא אידיאליים) כדי למנוע זרימת ליתיום.
- Lyse התאים ב- 25% חומצה חנקתית. החל 250 μl לכל טוב של 25% חומצה חנקתית ולתת לו לשבת במשך שעה לפחות 1, אז גרוטאות היטב עם כל הסוף של קצה פיפטה ולהעביר את כל ההשעיה גם במיל חדשצינור crocentrifuge.
- העבר את lysate ב 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב15,000 XG (טמפרטורת חדר) כדי להסיר את הפסולת התאית.
- מדוד את תוכן ליתיום של supernatants ידי ספקטרום בליעה אטומית 21.
הערה: חברות שונות מספקות ספקטרומטרים קליטה אטומיים, אשר צריך להיות מצוידים במנורת קתודה חלולה ליתיום. עקוב אחר ההוראות של היצרן מכונה אלה הם מאוד מדויקים, אבל גם די עדינים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בחירה:
הבחירה + הורג H מבוססת על דיפוזיה של הבסיס החלש אמוניום, כמתואר באיור 1 א. ההשפעה של בסיסים חלשים ודיפוזיה חומצות על pH תוך התאי כבר חלוצה ידי וולטר בורון ומשתפי פעולה 22. הרעיון האלגנטי להשתמש בתופעה זו כדי לייצר החמצה קטלנית לבחירה גנטית חיובית אז שפותחה על ידי ז'אק Pouysségur 17. תחת פרוטוקול כזה, pH התוך התאי יורד ל 5.5 לאחר שלב השטיפה. תאים שאינם מבטא nhe פונקציונלי בקרום הפלזמה לא יכולים לשחזר את ערך ה- pH ניטראלי ולהראות היבט acidified טיפוסי עם צורה שטוחה וcytosol פרטנית (איור 1). מחזורי בחירה חוזרות ונשנות אחרי (כשתי + H הרג נהלים / שבוע), תאים שמלאים ביציבות לשרוד החמצה זו (איור 1 ג) עולה, בתדירות של כ -10 -7.זה יגרום להיווצרות של שיבוטים סלולריים בודדים שניתן לאפיין באופן אישי או או יקוו להשיג אוכלוסיות סלולריות אם תרצה בכך. ניתן לבצע ניסויים סטנדרטיים כגון biotinylation פני תא או השתקת RNA לשלוט שהחלבון ביטא בקרום הפלזמה הוא אכן תאית nhe כגון NHE7 (ראו למשל Milosavljevic et al. 18). כמו גם, RT-PCR וסדר הבא צריכים להתבצע כדי לבדוק מוטציות סופו של דבר ברצף של NHEs תאית בא לידי ביטוי בשורת התאים שנבחרה.
אפיון פונקציונלי:
הקרינה Videomicroscopy:
סלקטיביות הפעילות ויון של NHEs תאית ביטא בקרום הפלזמה יכולה להיות מאופיינת על ידי מדידת השינויים ב- pH תאית הנגרמת על ידי NHEs אלה בתנאים שונים. לשם כך ערכת videomicroscopy מצוידת בתאורההגדרות רכישת ד לתמונת בדיקה ratiometric כגון BCECF / AM היא schematized באיור 2 א. איור 2 ו2C להראות וריאציות טיפוסיות בערכי הקרינה ישירות מתקבלים עבור עירורים ב490 ו -450 ננומטר, הבא 4 +. 2D איור טעינת החמצת NH מראה את עקומת ה- pH שהתקבלה מהערכים אלה הקרינה לאחר טיפול המופיעים ב2.4).
ליתיום ספיג:
יחד עם מימן ונתרן, ליתיום כולל חלק מהטור הראשון של הטבלה המחזורית והוכח להיות קטיון צימוד יעיל לNa + / H + מחליפי. אפשר לנצל את המידע הזה לקינטיקה מהירה התקנה של ספיגת ליתיום, על מנת למדוד בפרטי הפרמטרים התפקודיים של Na + / H + מחליפי. כקטיון זה נעדר מהציטופלסמה של תא, הצטברותו על CYTהחמצת osolic כמותית תשקף את הפעילות של קרום הפלזמה nhe. יתר על כן, ננו-מולר לריכוזי picomolar של ליתיום ניתן למדוד בדייקנות רבה באמצעות ספקטרומטריית קליטה אטומית. לפיכך, גישה זו היא חזקה מאוד בשילוב עם מבחר של מחליפי לפוחי הביעו קרום פלזמה. איור 3 ממחיש את פרוטוקול המדידה מתואר ב3) לסעיף הפרוטוקולים. תאים, שנזרעו על צלחות מרובות רצוי היטב (6 עד 24) הם acidified כפי שתוארו לעיל. הקינטית מתחיל בדגירה של התאים במדיום המכיל ליתיום, וקטיונים האחרים או מעכבים של העניין (איור 3 א).
כדי לעצור את הספיגה, תאים ולאחר מכן הוגשו לארבע שטיפות מהירות בPBS קר כקרח. הפועל במהירות מסיר את כל ליתיום תאי, תוך הבטחה כי אין בזרימת ליתיום משמעותית מתרחשת (איור 3). ריכוז ליתיום בכל טוב הוא אזנמדד באמצעות ספקטרוסקופיה האטומית קליטה (איור 3 ג), ושיעורים ראשוניים של ספיגת ליתיום, אשר ישירות להניב הפעילות של מחליף במצב יציב מתקבלים כמדידות שיפוע כמובן זמן הצטברות ליתיום (איור 3D).
באשר לקינטיקה אנזים, מנה-תגובה של שיעורים ראשוניים ניתן להשתמש כדי לגזור ערכי ק"מ למצעים (איור 4 א) של ערכי קי למעכבים. תכונה מעניינת של מובילים היא שקטיונים צימוד שונים יתחרו על הובלה. זה מניב האפשרות של מדידת ק"מ לנתרן בתחרות עם ספיגת ליתיום (איור 4).
איור 1: בחירה של תאים לבטא תאית Na + / H + </ Strong> מחליף בקרום הפלזמה שלהם. () אסטרטגיה לשלושה השלבים H + בחירת הרג של תאים לבטא nhe תאיים-מוטציה שאינה ושאינם מתויג פונקציונלי בקרום הפלזמה. תמונת מיקרוסקופ לעומת (B) שלב של תאים הוריים PS120 הוגשו לעומס חומצה. בר סולם: 25 תמונה מיקרוסקופית מיקרומטר ניגוד (C) שלב של תאי PS120 נבחרו לביטוי של מחליף לפוחי בקרום הפלזמה, הבאים עומס חומצה. בר סולם: 25 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: מדידות pH תאית עיקרון (א) למדידת videomicroscopy pH.. E (B) volution של הקרינה הנפלטת (595 ננומטר) של חללית pH BCECF הבאה עירור ב 490 ננומטר. L: עומס חומצה, הר"י; יש לשטוף, הנדון: התאוששות, Cal6.5: כיול בpH תוך תאי של 6.5, Cal7.0: כיול בpH תוך תאי של 7.0 (C) אבולוציה של הקרינה הנפלטת (595 ננומטר) של חללית pH BCECF הבא עירור ב 450 ננומטר. L: עומס חומצה, הר"י; יש לשטוף, הנדון: התאוששות, Cal6.5: כיול בpH תוך תאי של 6.5, Cal7.0: כיול בpH תוך תאי של 7.0 (D) אבולוציה של pH התוך התאי מחושב מיחסי הקרינה 490/450 nm של pH BCECF בדיקה ומנקודתי הכיול. L: עומס חומצה, הר"י; יש לשטוף, הנדון: התאוששות, Cal6.5: כיול בpH תוך תאי של 6.5, Cal7.0: כיול בpH תוך תאי של 7.0 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
her.within-page = "תמיד"> 
איור 3:. פעילות nhe שנמדדה על ידי שיעורים ראשוניים של Li + ספיגה (- C) תכנית המתארת את השלבים קריטיים השונים של דוגמא טכניקת מדידה (ד ') של מהלך זמן מדוד של ספיגת ליתיום לNHE7 מחליף לפוחי הביעה בפלזמה קרום. שים לב ליניאריות של הקינטית בתנאי הניסוי, על מנת להבטיח מדידת שיעורים ראשוניים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
עקומות אופייני מנה-תגובה לNHE7 (נתונים מקוריים מ -18): איור 4.שיעורים ראשוניים של ספיגת ליתיום נמדדו באמצעות קינטיקה 1 דקות. עקומת מנה-תגובה ליתיום-תאי (). תחרות (B) של ריכוזים שונים של נתרן תאי על ספיגה תאית ליתיום 1 מ"מ. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבחור תאים לבטא תאית Na + / H + מחליפי בקרום הפלזמה מבלי לשנות הרצף הראשוני שלהם על ידי מוטגנזה מכוונת. ניתן לאפיין מחליפי האלה עכשיו.
שיטה זו מבוססת על הרעילות התאית של פרוטונים תאיים כדי לבחור שורות תאים שתבטאנה Na + / H + מחליפי לפוחי בקרום הפלזמה. זה יכול להיות אפשרי, בעיקרון, לשימוש קטיונים אחרים שעשויים להיות חשוד להיות מועברים, כגון Li +, K +, או Cs +. עם זאת, זה מוסיף רמה נוספת של אי-ודאות. אם הבחירה לא תניב שום שיבוט חיובי, אז זה יהיה קשה להעריך אם קטיון נבדק אינו מועבר או מחליף הוא לא בקרום הפלזמה. מסיבות אלה, בחירות בוצעו באמצעות Na + כקטיון צימוד כמו זה substr תאיאכלתי נמצא בשפע הגבוה ביותר בתנאים פיסיולוגיים. זה הוביל לבחירה של גרסאות מביעות 18 NHE7, כמו גם NHE6 וNHE9 בקרום הפלזמה (משורר וCounillon, תוצאות לא פורסמו).
ביטוי זה קרום פלזמה מאפשר המדידה של מובילי פרמטרים תפקודיים בשיטות שיכולים עד כה רק לשמש למובילי קרום פלזמה. כמובן שזה לא ניתן לשלול כי שינוי כזה בסביבת קרום עשוי להשפיע על התכונות פונקציונליות של NHEs לפוחי. עם זאת, אסטרטגיה זו יכולה להיות שווה שימוש לפחות שלוש סיבות: הביטוי תאיים של NHE6 (i), 7 ו -9 מונעים כל מדידה פונקציונלית מפורטת, (ii) סביבות קרום ושותפי חלבון או שומנים בדם ברובם הוכחו להשפיע עדין רגולציה מנגנונים של NHEs האחר ולא תכונות בסיסיות מאוד של מובילים אלה (זיקות לקטיונים צימוד, בררנות, כיווניות, phתכונות armacological). אז זה מאוד סביר להניח כי אלה יישארו ללא שינוי בביטוי של קרום NHEs לפוחי. (Iii) ידיעת המנגנונים התפקודיים ופרופילים תרופתיים של מנגנון לפוחי הביע-קרום פלזמה, אז זה אפשרי לבצע מדידות pH לפוחי להתייחס פערים אפשריים בין אלה קרום פלזמה וביטוי לפוחי.
עוד הגבלת פוטנציאל של שיטה זו היא כי האסטרטגיה שתוארה כאן עלולה להוביל לבחירה של תאים לבטא H אחר + extruding מנגנון מאשר לפוחי transfected Na + / H + מחליף (כגון nhe קרום פלזמה, או ATPase H + לדוגמא ). למרות שזה אף פעם לא נצפה במעבדה, זה חשוב אם כן להשתמש תיוג פני תא קלאסי בשילוב להשתקה כדי לוודא שלמעשה nhe של העניין מתבטא אכן בקרום הפלזמה ומתווך + Na או Li + et al. 18).
כדי לאפיין את הפעילות של מובילים אלה, שני פרוטוקולים, המבוססים על בהתאמה וריאציות pH תוך תאיות ונתיבי יון מתוארים. השיטה הראשונה דורשת השימוש בבדיקות ניאון pH רגיש ומערכת מיקרוסקופ פלואורסצנטי וידאו נאותה. שיטה זו, המשמשת על ידי קבוצות רבות בתחום, פותחה בשנתי ה -1980, באמצעות ראשון fluorimeters למדוד תאי צורת אותות בהשעיה 23, ולאחר מכן באמצעות רכישה דיגיטלית למדידת תאים בודדים על ידי צימוד עירור הקרינה ורכישה לvideomicroscopy 24. הטכניקה האחרונה הפכה כעת מאוד מהירה וקלה, בשל ביצועים הגבוהים של מצלמות, תאורה ומערכות מחשב. מעניין, חברות בדרך כלל מספקות גיליונות טכניים מאוד אינפורמטיבי יחד עם בדיקות הניאון שלהם. וריאציות pH אלו מספקות מידע חשובכדי לקבוע את האופי של קטיונים תאיים בשילוב עם זרימת פרוטון. בהקשר זה, חשוב לשים לב כי משך preincubation אמוניום צריך להיות מותאם בקפידה בהתאם לתאים המשמשים למדידות. fibroblasts הנגזר CCL39, תומך היטב טעינת שעה אחת עם 50 מ"מ NH 4 Cl. התוצאה היא החמצה חזקה מאוד, המאפשרת הפעלה מלאה nhe ומייצרת איתות חזקה למדידות (תנאי Vmax). עם זאת, תאים אחרים כמו שריר לב או תאי כליה עיקריים לא יתמכו טעינת אמוניום חשובה כזה. ראוי ביצוע כמה ניסויים ראשוניים עם זמני דגירה שונים או NH 4 Cl ריכוזים. הסיבה להבדלים כאלה ברגישות לNH 4 Cl אינה ברורה. הם עשויים להיות קשורים לביטוי האפשרי של מערכות תחבורת אמוניום 25,26. בדומה לכך הפתרון ללא נתרן המשמש לשטיפת פתרון הטעינה עשוי שלא להיות נסבלעל ידי תאים, כגון cardiomyocytes למשל. למרות מהירויות ראשוניות ייקבעו פחות בדיוק, יש צורך תנקב ישירות עם פתרון ההתאוששות לאחר טעינת אמוניום.
בנוסף, מדידות pH תוך תאיות גם מספקות דרך פשוטה כדי לחקור את התכונות הפיכה של מחליפי אלה כמצב ההפוך יהיה לייצר החמצה שתזוהה בקלות על ידי ירידה ברמת הקרינה BCECF שיכול לבוא לידי ביטוי בכיול הבא ערכי pH . המגבלות של ניסויים אלה היא חוסר כימות מדויק של פעילויות תחבורה, כמו וריאציות pH מידת ניסויים, הפועלות על סולם לוגריתמים ומוגבלים על ידי יכולת חציצה תאית. ניתן למדוד האחרון ווריאציות pH מוכפלות ובנתיבי יון תשואת קיבולת חציצה. עם זאת, תהליך זה משלב כמה שגיאות ניסיוניות (על מדידות pH, מדידות קיבולת חציצה, וcalibration), ולכן הוא לא כמותי מאוד. לפיכך כדי לגשת לקבועים האנזימטית של קרום הפלזמה הביע טרנספורטר, טכניקות שטף יון מהיר הן הרבה יותר פשוט ומדויק.
בגלל תכולה תאית היא בטווח millimolar, איתור שינויים בתיווך nhe בנתרן cytosolic אינו אפשרי. מעתה והלאה, במשך שנות טכניקות כגון ספיגה התבססו על שימוש ברדיואיזוטופים כגון 22 Na +. כתב יד זה מתאר שיטה שאינה רדיואקטיביים אשר 22 Na + הוא הוחלף על ידי ליתיום, המבוססים על הרציונל שקטיון זה המשמש גם על ידי NHEs, נעדר מcytosol התא וניתן למדוד בדייקנות רבה באמצעות ספקטרומטריית קליטה אטומית 21. ברגע שהתנאים המתאימים (זמן וריכוז ליתיום) כדי למדוד uptakes ליניארי (כלומר., להיות בתנאי שיעורים ראשוניים) נקבעים, זיקות לקטיונים צימוד פוטנציאלי האחרים ו / אומעכבים ניתן מדד במדויק כפי שמוצגים איורים 3 ו -4. הגבלת פוטנציאל האחרונה היא ששיטת ספיגת ליתיום יכולה כמובן רק לתפקד אם מחליף של עניין משלוחי קטיון זה באופן משמעותי. אם זה לא המקרה, הניסוי יצטרך להסתמך גם על מדידות pH התוך התאי הנ"ל או יצטרך להשתמש ספיגת נתרן רדיואקטיביים.
כגון סט של ניסויים הוביל, הביא לאחרונה לתצפית שNHE7 Na + תאיים / H + מחליף, אשר בתחילה היה ככל הנראה H + / K + טרנספורטר שalkalinize שלפוחית הייתה למעשה מנגנון החמצת endosomal מצמידים נתרן 18. יש לכך השלכות עמוקות לתאים תאיים כעד כה תפקיד זה נחשב ליוקדש ל+ ATPases VH. כמו כל חבר במשפחת nhe מופיע להציג o חתימה הקינטית מאוד ספציפיתאגף לתפקיד הפיזיולוגי שלה, זה מפתה לשער שהאפיון של NHE6 וNHE9 באמצעות השיטות המתוארות במאמר זה יחשוף את רומן ותכונות בלתי צפויות שידגיש פונקציות הפיזיולוגיות שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10x | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).
- Kornak, U., et al. Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis. Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).
- Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease. Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).
- Kasper, D., et al. Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration. Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).
- Poet, M., et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).
- Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).
- Gilfillan, G. D., et al. SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).
- Mignot, C., et al. Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum. Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).
- Morrow, E. M., et al. Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science. 321 (5886), 218-223 (2008).
- Lasky-Su, J., et al. Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).
- Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. Genome-wide association studies in ADHD. Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).
- Meda, S. A., et al. A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort. Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).
- Zhang, L., et al. A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred. Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).
- Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter. Cell. 56 (2), 271-280 (1989).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter. J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).
- Milosavljevic, N., et al. The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis. Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).
- Wigler, M., et al. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. Cell. 16 (4), 777-785 (1979).
- Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens. EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).
- Milosavljevic, N., et al. Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling. Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).
- Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells. Nature. 325, 447-450 (1987).
- Quentin, F., et al. RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).
- Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).
