Abstract
Endosomale forsuring er avgjørende for et bredt spekter av prosesser, for eksempel protein resirkulering og degradering, reseptor desensitivisering, og nevrotransmitter lasting i synaptiske vesikler. Denne surgjøring er beskrevet å være mediert av proton ATPaser, koblet til CLC klorid transportører. Svært bevart electro protoner transportører, er Na + / H + lere (NHE) 6, 7 og 9 også til uttrykk i disse rommene. Mutasjoner i sine gener har blitt koblet med menneskets kognitive og nevrodegenerative sykdommer. Paradoksalt nok, deres roller forblir unnvikende, som deres intracellulær lokalisering har hindret detaljert funksjonell karakterisering. Dette manuskriptet viser en metode for å løse dette problemet. Denne består av valget av mutante cellelinjer som er i stand til å overleve akutt cytosoliske surgjøring ved å beholde intracellulære NHEs på plasmamembranen. Den viser da to komplementære protokoller for å måle ion selektivitet og aktivitetav disse vekslere: (i) en basert på intracellulære pH-målinger ved hjelp av fluorescens videomikroskopi, og (ii) en basert på den raske kinetikk av litium-opptak. Slike protokoller kan ekstrapoleres til å måle andre ikke-electrogenic transportører. Videre utvelgelsesprosedyren presenteres her genererer celler med en intracellulær oppbevaring defekt fenotype. Derfor disse cellene vil også uttrykke andre vesicular membran proteiner på plasmamembranen. Den eksperimentelle strategi er vist her, kan således utgjøre en potensielt kraftig verktøy for å studere andre intracellulære proteiner som skal uttrykkes deretter på plasmamembranen sammen med vesikulær Na + / H + vekslere som anvendes for valg.
Introduction
De fleste intracellulære vise et surt luminal pH, som er en viktig parameter for modning, menneskehandel, resirkulering av proteiner eller hormoner og signalstoffer lasting. Det har vist seg at pH-gradient mellom cytosol og vesikulært innhold er generert av vacuolar H + ATPaser 1, koblet til vesikulær CLC klorid transportører 2. Både i knock-out (KO) mus og menneskelige pasienter, har betydningen av disse transport blitt fremhevet av de tunge fenotyper forårsaket av mutasjoner i genene sine 3-6.
Medlemmene av natrium-hydrogen veks SLC9A familien, også kalt NHEs for Na + / H + vekslere, er blitt vist å være viktige effektorer i intracellulær pH og cellevolumregulering, samt i vektor transport av syre-base-ekvivalenter på tvers av epitel . I tillegg til plasmamembranen NHEs, tre sterkt konservert Na + / H + veksleren, NHE 6, 7og 9 er uttrykt i trans-Golgi nettverk og i tidlige endosomer 7. Mutasjoner i sine gener har blitt koblet med Angelman-lignende eller Christianson syndromer 8-9, familiebasert autisme 10 og Attention Deficit Hyperactivity Disorder 11-12. Disse vekslere har også vært involvert i nevrodegenerative problemer som Alzheimers sykdom mottakelighet 13 og X-koblede mental retardasjon sammenhengende gener syndromene 14. Samlet utgjør disse studiene markere betydningen av disse intracellulære NHEs i hjernens utvikling og / eller funksjon.
Den intracellulære lokalisering av disse vekslere hindrer nøyaktige målinger av deres ion-selektivitet, transportretning, kinetiske parametere og regulering. Som tilfellet er for alle transportører uttrykt i intracellulære avdelinger, er det ekstremt vanskelig å vurdere deres biokjemiske aktiviteter og dermed å fullt ut forstå deres fysiologiske roller og mechanismer underliggende deres patologiske implikasjoner. Basert på den høye cytosolisk K + konsentrasjon, den mest allment akseptert hypotese var at de jobbet som K + kombinert proton frigivelshastigheter transportører. Eksistensen av en slik proton lekkasje hadde vært en teori, da det kan oppveie proton pumping av V-ATPaser for å opprettholde en stabil tilstand vesicular pH. Formålet med denne visuelle artikkelen er (i) for å vise en metode som gjør det mulig genetisk utvalg av cellelinjer som uttrykker slike vesikulær transportører ved deres plasmamembranen, og (ii) for å vise to uavhengige fremgangsmåter for å måle funksjonene til disse transportører.
Tre tiår siden, Pouysségur og Franchi har ryddet en genetisk tilnærming som muliggjorde molekylær kloning og karakterisering av medlemmene av NHE familien 15. Dette var basert på giftigheten av intracellulære protoner som en screeningsmetode. Første skritt var å få cellelinjer mangeli en hvilken som helst Na + / H + utveksling uttrykt på plasmamembranen, ved hjelp av reversibilitet av denne transportør. Fibroblaster (cellelinje CCL39) ble forhåndslastet med Na + eller Li + og deretter plassert i et surt ekstracellulært medium (pH 6,5) i 2 timer. Dette førte til døden av celler som uttrykker en funksjonell Na + / H + utveksling og til valg av antiporter-mangel celler (PS120 cellelinje) 16. Når dyrket i bikarbonat-fritt medium, disse cellene er meget følsomme for akutt intracellulære surgjøringen. Følgelig vil uttrykk for noen funksjonell proton efflux mekanisme på plasmamembranen bli positivt valgt (se 17) hvis slike celler er sendt til akutt intracellulære acidifications. Slike forsuring teknikker kan anvendes for å isolere cellelinjer med handel defekter som muliggjør tvungen ekspresjon av WT intracellulære NHEs på plasmamembranen.
Som eukaryote Na + / H+ Lere er electro, de er ikke målbar av de elektrofysiologiske metoder som har blitt brukt med stor suksess å måle kanaler. Dette manuskriptet viser derfor hvordan å måle aktiviteten til dette leren ved intracellulære pH-målinger og raske kinetikk av litium opptak. Som de underliggende begrepene er de samme, er det interessant å legge merke til at mange av de prosessene som er utviklet for utvalget delen er også brukt direkte for funksjonelle målinger.
Interessant, har vi observert at trafficking defekt tilstede i cellelinjer valgte å bruke tilnærmingen beskrevet i dette manuskriptet fører til en større uttrykk for andre vesikulær proteiner på plasmamembranen som vesicular kalium kanal TWIK1 18. Dette peker ut mot valget av en generell oppbevaring defekt mekanisme for vesikulær trans proteiner. Derfor denne utvelgelsesprosedyren og de cellene som den genererer maiutgjøre et lovende verktøy for det vitenskapelige samfunnet arbeider på membran proteiner av intracellulære avdelinger. Samt måleteknikker som presenteres her kan være aktuelt for å studere andre ikke-electrogenic transportører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. H + Killing Selection
- Cellelinjer
- Stabilt transfektere NHE-manglende celler (f.eks den CCL39-avledet PS120 cellelinje 16) ved hjelp av en kombinasjon av pattedyrekspresjonsvektor og transfeksjon metode som vil produsere effektive transfeksjonsteknologier avkastning og valg i en fibroblastcellelinje.
MERK: For mange år kalsiumfosfatutfelling 19 ble brukt med gode transfeksjonsteknologier avkastning. Dette har blitt erstattet mer nylig av kommersielle reagenser som Lipofectamine2000, blir transfeksjonene utføres i henhold til produsentens instruksjoner.
- Stabilt transfektere NHE-manglende celler (f.eks den CCL39-avledet PS120 cellelinje 16) ved hjelp av en kombinasjon av pattedyrekspresjonsvektor og transfeksjon metode som vil produsere effektive transfeksjonsteknologier avkastning og valg i en fibroblastcellelinje.
- Løsninger
- Forbered tre sterile løsninger beskrevet som nedenfor. Sterilisere disse løsningene ved filtrering (0,22 mikrometer).
- Tilbered en NH4 + lastes løsning (pH 7,4) bestående av 50 mM NH4CI, 70 mM kolinklorid, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose og 15 mM MOPS ved pH 7,4.
- Tilbered en skylleløsning (pH 7,0) bestående av 120 mM cholinklorid, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glukose og 15 mM HEPES ved pH 7,0.
- Tilbered en gjenvinningsoppløsning (pH 7,4) bestående av 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glukose og 15 mM HEPES ved pH 7,4.
- Forbered tre sterile løsninger beskrevet som nedenfor. Sterilisere disse løsningene ved filtrering (0,22 mikrometer).
- Før valg, oppnå en cellekulturinkubator som kan brukes ved 37 ° C uten ekstra CO2 fra ekstern tank (betegnet CO 2 - "gratis" inkubator), som 5% CO 2 vil resultere i bufring som kan forringe forsuring. Forsterke cellelinje som uttrykker den NHE av interesse opp til ca 2 x 10 8 celler (vanligvis ca 20 konfluent 100 mm plater).
- H + drepe prosedyre:
- Inkuber cellene som uttrykker den intracellulære NHE av interesse i 1 time i lasteløsning, 37 ° C i CO 2 -fri inkubator.
- Aspirere laste løsning og deretter skylles to ganger i den ovenfor beskrevne-skylleløsning. Dette utføres effektivt for å fjerne gjenværende ekstracellulære NH4Cl som ville forringe dannelsen av en bratt NH4 + gradient som vil generere surgjøring.
- Eliminere skylle medium ved aspirasjon og inkuberes cellene i en time i gjenopprettingsløsning igjen ved 37 ° C i CO 2 fri inkubator.
- Sett på utvinning medium med vanlig kulturmedium (vanligvis DMEM med 7,5% FCS) og dyrke cellene i standard dyrkningsbetingelser (37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2 og 95% luft).
- Gjenta denne syklusen av utvalget to ganger i uken frem til stabile kloner dukke opp.
MERK: Vær spesielt forsiktig når det gjelder cellekultur og utvalgs forhold. Måneders arbeid kan bli ødelagt av eventuell forurensning som er mer utsatt for occur etter en lang periode med kultur og gjentatte celle manipulasjoner.- Her kan du velge om du vil forsterke kloner og karakteriserer dem enkeltvis som nærmere beskrevet i §§ 2-3 eller basseng dem sammen for å skape en mobil befolkning før karakterisering.
- Påfør sporadisk utvalg (ca annenhver uke) for å beholde de forsuring-resistente celler ved kontra velge de som kan ha gått tilbake til den foreldresyrefølsomme fenotype (figur 1B).
2. Intracellulær pH Målinger
2.1) Fluorescens pH Imaging
- Bruk ratiometrisk pH-sensitive fluorescerende fargestoff BCECF / AM, som er pH sensitive når eksitert ved 490 nm og besitter en 445 nm isosbestic punkt, etter produsentens protokoller.
- Alternativt kan du bruke andre pH-følsomme sonder, etter produsentens protokoller.
- Bruk en avbildning satt conbestående av et invertert mikroskop koblet til en høy følsomhet videokamera. Utstyre dette settet med 450 nm og 490 nm smale bandet interferensfiltre paret med passende kvarts nøytral tetthet filtre for eksitasjon.
- Hvis det er mulig, bruke riktig sett med filtre og belysningsforhold til setup sammenlign fluorescens verdier for λ1 og λ2 slik at forholdet nærmer 1. Unngå også basal fluorescens verdier som er satt enten mette eller for lavt, både for λ1 og / eller λ2. Dette kan gi viktige gjenstander som da forholdet kanskje ikke vært påviselig selv intracellulær pH er i endring.
MERK: Dette systemet må muliggjøre rask perfusjon, time-lapse eksitasjon ved de to ovennevnte bølgelengder og oppkjøp på riktig utslipp bølgelengde (535 nm for BCECF). Utstyre systemet med programvare muliggjør automatisk datainnsamling og lagring.
- Hvis det er mulig, bruke riktig sett med filtre og belysningsforhold til setup sammenlign fluorescens verdier for λ1 og λ2 slik at forholdet nærmer 1. Unngå også basal fluorescens verdier som er satt enten mette eller for lavt, både for λ1 og / eller λ2. Dette kan gi viktige gjenstander som da forholdet kanskje ikke vært påviselig selv intracellulær pH er i endring.
2.2) Måling av NHE Forward aktivitet (Ekstrudering avProtoner fra cytosol)
- Surgjøre celler ved en 1 timers inkubasjon i NH4 + lastes løsning (se trinn 1.4) i fravær av CO2.
- Legg BCECF-AM (5 mikrometer endelig konsentrasjon) til løsningen for de siste fem minutter og skyll den med NH 4 + lasting løsning for å eliminere den ekstracellulære sonde.
- Montere cellene på mikroskopet og ta flere bilder for å spille inn en stabil baseline. Perfuse skylleløsning (se ovenfor). Dette resulterer i en reduksjon av fluorescens svarende til surgjøring.
- Etter pH-stabilisering, perfuse hvilken som helst av de oppløsninger som er gitt nedenfor for å måle pH-gjenvinnings mediert av Li + / H +, Na + / H + eller K + / H + utveksling. Hver oppløsning inneholder en potensiell koblings kation som skal testes for H + utveksling. Hvis en av disse transporteres, vil dette resultere i en økning i fluorescens 495 nm som vil CORRESPond til en høyning i intracellulær pH:
120 mM LiCl, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glukose og 15 mM HEPES ved pH 7,4
120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glukose og 15 mM HEPES ved pH 7,4
125 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glukose og 15 mM HEPES ved pH 7,4
2.3) Måling av NHE Reverse aktivitet
MERK: Prinsippet her er å invertere trans ioniske gradienter.
- Før målingen, legger cellene med den intracellulære kation av interesse (se nedenfor).
- Ruge dem i 5 min med BCECF / AM (se trinn 2.2.2); skyll dem, montere dem på video mikroskop.
- Perfuse lasting løsning og ta flere bilder for å spille inn en stabil baseline.
- Etter baseline stabilisering, bilde pH variasjoner når cellene perfusert med et ekstracellulært surt medium inneholdende 120 mM cholinklorid, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glukose og 15 mM MES ved pH 6,5.
- For LiCl lasting, inkubere cellene i 2 timer i en oppløsning sammensatt av 120 mM LiCl, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glukose og 15 mM HEPES ved pH 7,4. Intracellulær litium målt ved hjelp av atom-absorpsjonsspektroskopi gir en verdi på omkring 60 mM.
- For Na + lasting, inkubere cellene i to timer i en oppløsning bestående av 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glukose og 15 mM HEPES ved pH 7,4 i nærvær av 1 mM ouabain for å blokkere Na / K-ATPase. Under disse forholdene, er intracellulær Na + konsentrasjon i området fra 40 mM.
MERK: K + lasting er ikke nødvendig som cytosolisk K + konsentrasjonen er i området fra 140 mM, og en utadrettet K + gradient er derfor lett å oppnå.
2.4) Data Behandling og Kalibrering:
MERK: Dette trinnet gjelder både forover og bakover målinger.
- Ved slutten av hvert forsøk, perfuse celler med en oppløsning av 140 mM KCl, 20 mM HEPES og 5 mM nigericin justert til pH-verdier mellom 6,5 og 7,4.
- Samle data som fluorescensmålinger fra bildene (grå nivåer representerer intensitetsnivåer) og eksport i henhold til tekstformat og behandles som beskrevet nedenfor ved hjelp av et regnearkprogram.
- Beregne de intracellulære pH-verdier for hver enkelt celle eller en region av interesse ved hjelp av den følgende ligning:
pH = pKa + (Log (R-Rmin) / (Rmaks -R)) x F min (λ2) / F max (λ2) - Bruk F min (λ2) / F ma x (λ2) forholdet dersom det er sonden bleking eller lekkasje, hvilket resulterer i en reduksjon i 450 nm fluorescens gjennom eksperimentene. Dette er imidlertid meget sjeldent observert i de betingelser som anvendes i desskribert eksperimenter.
- Som kalibreringsdata er til stede ved slutten av hver pH-måling, sjekke om de tilsvarende beregnede verdier avviker fra de pH-verdier som benyttes for kalibrering. Hvis det er tilfelle, så justere alle eksperimentelt bestemt pH-verdier til kalibrering ved hjelp av følgende fremgangsmåte:
- Beregn følgende kvotient (Q, forskjellen mellom den målte verdier / forskjellen mellom kalibreringsverdiene). Multipliser hele datasettet ved Q. Gjør den endelige justeringen ved addisjon eller subtraksjon slik at de beregnede verdiene vil være lik de tilsvarende kalibreringsverdier.
3. Målinger av Initial Utbredelsen av NHE7 av Fast Li + Opptak
- Seed celler på multibrønnplater (6 til 24-brønn) og acidify dem enten ved hjelp av NH4 + laste teknikk som er beskrevet ovenfor, eller alternativt de nigericin / bovint serumalbumin (BSA) surgjøring er beskrevet i 20.
- Opprettholde korte og konsekvente opptaks varighet (vanligvis ett minutt eller nedenfor) for å sikre at transport opererer i innledende priser forhold. Også sørge for at alle løsninger som brukes for opptak er isotonisk.
- Ved slutten av opptaket tid nøye eliminere opptak mediet og vaskes cellene fire ganger med iskald fosfatbufret saltløsning (PBS). Utfør disse vasker så fort som mulig (mindre enn 10 sekunder for fire av dem er ideelle) for å hindre litium utstrømming.
- Lyse av cellene i 25% salpetersyre. Påfør 250 ul per brønn av 25% salpetersyre og la det stå i minst 1 time, deretter skrap hver brønn med enden av pipettespissen og overføre hele brønnen suspensjon i en ny microcentrifuge tube.
- Overfør lysatet i 1,5 ml mikrosentrifugerør, sentrifuger dem i 5 minutter ved 15 000 x g (romtemperatur) for å fjerne cellerester.
- Måle litiuminnholdet i supernatantene ved atom-absorpsjonsspektroskopi 21.
MERK: Ulike selskaper tilbyr atomabsorbsjon spektrometre, som må være utstyrt med et Lithium hul katode lampe. Følg produsentens anvisninger som disse maskinene er svært presise, men også ganske delikat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utvalg:
H + drepe valget er basert på diffusjon av ammonium svak base, som vist i figur 1A. Effekten av svake baser og syrer diffusjon på intracellulær pH har blitt utviklet av Walter Boron og kollaboratører 22. Den elegante idé å bruke dette fenomenet til å produsere en dødelig forsuring for positiv genetisk seleksjon ble deretter utviklet av Jacques Pouysségur 17. Under en slik protokoll, synker den intracellulære pH-verdien til 5,5 etter skylletrinnet. Celler som ikke uttrykker et funksjonelt NHE på plasmamembranen ikke kan gjenopprette en nøytral pH-verdi, og viser en typisk surgjort aspekt med en flat form og en granulær cytosol (figur 1B). Etter gjentatt seleksjon sykluser (omtrent to H + drepe prosedyrer / uke), celler som fullstendig og stabilt overlever denne surgjøring (figur 1C) dukker opp, ved en frekvens på omkring 10 -7.Dette vil resultere i dannelsen av enkeltcellekloner som kan karakteriseres enten individuelt eller samlet for å oppnå cellepopulasjoner hvis ønskelig. Standard eksperimenter slik som celleoverflate biotinylering eller RNA stanse kan bli utført for å kontrollere at proteinet uttrykt på plasmamembranen er faktisk en intracellulær NHE eksempel NHE7 (se for eksempel Milosavljevic et al. 18). I tillegg bør RT-PCR og sekvensering etterfølgende bli utført for å kontrollere eventuell mutasjoner i sekvensen av de intracellulære NHEs som uttrykkes i den valgte cellelinje.
Funksjonell Karakterisering:
Fluorescens Videomicroscopy:
Aktiviteten og selektiviteten ion av de intracellulære NHEs uttrykt på plasmamembranen kan karakteriseres ved å måle endringer i intracellulær pH indusert av disse NHEs i forskjellige forhold. For dette en videomicroscopy sett utstyrt med belysning end oppkjøpsinnstillingene til bildet en proporsjonal sonde som BCECF / AM er skjematisert i figur 2A. Figur 2B og 2C viser typiske variasjoner i fluorescens verdier direkte innhentet for excitations på 490 og 450 nm, etter en NH 4 + lasting forsuring. Figur 2D viser pH-kurven oppnådd fra disse fluorescens-verdier følgende data behandling som er beskrevet i 2.4).
Lithium opptak:
Sammen med hydrogen og natrium, litium omfatter en del av den første kolonne i det periodiske system, og har vist seg å være en effektiv kopling kation for Na + / H + vekslere. Det er mulig å utnytte denne informasjonen til installasjons raske kinetikk av litium-opptaket, for å måle i detaljer de funksjonelle parametre for Na + / H + vekslere. Ettersom dette kation er fraværende fra celle cytoplasma, at en akkumulering ved cytosolic forsuring vil kvantitativt gjenspeile aktiviteten i plasma membran NHE. Videre kan nanomolar til picomolar konsentrasjoner av litium måles med stor nøyaktighet ved hjelp av atomabsorpsjons-spektrometri. Således er veldig kraftig denne tilnærmingen når kombinert med valget av plasmamembran uttrykt vesikulær vekslere. Figur 3 viser målingen protokoll beskrevet i 3) i protokollene delen. Celler, fortrinnsvis sådd på multippel-brønners plater (6 til 24) er surgjort som beskrevet tidligere. Den kinetiske starter med inkubering av cellene i medium inneholdende litium, og de andre kationer eller hemmere av interesse (figur 3A).
For å stoppe opptaket, blir cellene deretter sendt til fire raske skyllinger i iskald PBS. Operere raskt fjerner ekstracellulære litium og samtidig sikre at ingen signifikant litium utstrømning oppstår (Figur 3B). Litium-konsentrasjon i hver brønn blir derettermålt ved hjelp av atom-absorpsjonsspektroskopi (figur 3C) og innledende forekomst av litium opptak, noe som direkte gir aktiviteten av veksleren ved steady-state oppnås som helningsmålinger av litium akkumulering tidsforløpet (figur 3D).
Som for enzymkinetikk, kan doserespons av innledende priser bli brukt til å utlede Km-verdier for substrater (figur 4A) med Ki-verdier for inhibitorer. Et interessant trekk ved transportører er at ulike koblings kationer vil konkurrere for transport. Dette gir mulighet for å måle Km for natrium ved konkurranse med litium-opptaket (figur 4B).
Figur 1: Seleksjon av celler som uttrykker en intracellulær Na + / H + </ Strong> leren på sine plasmamembran. (A) Strategi for de tre trinnene H + drepe utvalg av celler som uttrykker en funksjonell ikke-mutert og ikke-kodede intracellulær NHE på plasmamembranen. (B) Phase kontrast mikros bilde av PS120 foreldre celler som sendes inn til en syre belastning. Skala: 25 um (C) fasekontrastmikroskopi bilde av PS120-celler som er valgt for ekspresjon av et vesikulært leren på plasmamembranen, som følge av en syre belastning. Skala bar: 25 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Intracellulær pH-målinger (A) Prinsippet om pH videomicroscopy måling.. (B) Evolution av den emitterte fluorescens (595 nm) av BCECF pH-probe etter en eksitering ved 490 nm. L: syre belastning, Ri; Skyll, Re: utvinning, Cal6.5: kalibrering på en intracellulær pH på 6,5, Cal7.0: Kalibrering i intracellulær pH på 7,0 (C) Evolution av utsendt fluorescens (595 nm) av BCECF pH probe etter en eksitasjon ved 450 nm. L: syre belastning, Ri; Skyll, Re: utvinning, Cal6.5: kalibrering på en intracellulær pH på 6,5, Cal7.0: Kalibrering i intracellulær pH på 7,0 (D) Utviklingen av den intracellulære pH beregnes fra 490/450 nm fluorescens prosenter av den BCECF pH probe og fra kalibreringspunkter. L: syre belastning, Ri; Skyll, Re: utvinning, Cal6.5: kalibrering på en intracellulær pH på 6,5, Cal7.0: Kalibrering i intracellulær pH på 7,0 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: NHE-aktivitet målt ved hjelp av innledende forekomst av Li + opptak (A - C) Reaksjonsskjema som viser de forskjellige kritiske trinn i måleteknikken (D) Eksempel på en målt tidsforløpet av litium-opptaket for vesikulær NHE7 leren uttrykt på plasma membran. Legg merke til linearitet av den kinetiske innenfor de eksperimentelle forhold, sikre innledende priser måling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Typisk Dose-responskurver for NHE7 (originaldata fra 18).Innledende priser av Lithium opptak ble målt ved hjelp av en liten kinetikk. (A) Dose-responskurven for ekstracellulær litium. (B) Konkurranse av ulike konsentrasjoner av ekstracellulært natrium på 1mM ekstracellulære litium opptak. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver hvordan du velger celler som uttrykker intracellulær Na + / H + lere på plasmamembranen uten å endre deres primære sekvens ved seterettet mutagenese. Disse vekslere kan nå være preget.
Denne metoden er basert på cellulær toksisitet av intracellulære protoner for å velge cellelinjer som uttrykker vesikulær Na + / H + vekslere på plasmamembranen. Det kan være mulig, i prinsippet, å anvende andre kationer som kan bli mistenkt for å bli transportert, så som Li +, K +, Cs + eller. Men, dette legger et ekstra nivå av usikkerhet. Hvis valget ikke gir noen positiv klon, vil det da være vanskelig å vurdere hvorvidt den testede kation ikke transporteres, eller varmeveksleren er ikke i plasmamembranen. Av disse grunner har valg blitt utført ved hjelp av Na + som et koblings kation som dette er det ekstracellulære substrspiste funnet i høyeste overflod i fysiologiske forhold. Dette førte til valg av varianter som uttrykker NHE7 18, samt NHE6 og NHE9 på plasmamembranen (poet og Counillon, upubliserte resultater).
Dette plasma membran uttrykk muliggjør måling av transportørene funksjonelle parametere ved metoder som kan så langt bare brukes for plasma membran transportører. Selvfølgelig er det ikke mulig å utelukke at en slik endring i membranmiljøet kan påvirke de funksjonelle trekk ved de vesikulær NHEs. Imidlertid kan denne strategien være verdt å bruke minst tre grunner: (i) den intracellulære uttrykk for NHE6, 7 og 9 utelukker noen detaljert funksjonell måling, (ii) membran miljøer og protein eller lipid partnere har stort sett vist seg å påvirke subtile regulatoriske mekanismer av de andre NHEs og ikke deres svært grunnleggende trekk ved disse transportører (slektskap til koblings kationer, selektivitet, retnings, pharmacological funksjoner). Så det er svært sannsynlig at de vil forbli uendret etter membranen uttrykk for vesikulær NHEs. (Iii) Å vite de funksjonelle mekanismer og farmakologiske profiler av en plasmamembran-uttrykt vesikulært mekanisme, er det da mulig å foreta vesikulært pH-målinger for å løse de eventuelle avvik mellom plasmamembranen og vesikulært uttrykk.
En annen potensiell begrensning ved denne teknikk er at den strategi som er beskrevet her, kan føre til valg av celler som uttrykker andre H + ekstrudering mekanisme enn den transfekterte vesikulær Na + / H + veksleren (slik som et plasmamembran NHE, eller et H + ATPase f.eks ). Selv om det aldri ble observert i laboratoriet, er det derfor viktig å bruke klassisk celleoverflaten merking koblet til lyddemping å faktisk bekrefte at NHE av interesse er faktisk uttrykt i plasmamembranen og formidler Na + eller Li + et al. 18).
For å karakterisere aktiviteten av disse transportører, to protokoller, henholdsvis basert på intracellulære pH-variasjoner og ion flukser er beskrevet. Den første metoden krever bruk av pH-følsomme fluorescerende prober og en tilstrekkelig fluorescens videomikros system. Denne metoden, som brukes av mange grupper i feltet, har blitt utviklet på 1980-tallet, først med fluorimeters å måle signalene skjema celler i suspensjon 23, deretter bruke digital oppkjøp for å beregne individuelle celler ved kopling fluorescenseksitasjon og oppkjøp til videomicroscopy 24. Sistnevnte teknikk har nå blitt meget rask og enkel, på grunn av den høye ytelse av kameraer, lys og datasystemer. Interessant, selskaper vanligvis gir svært informative tekniske arkene sammen med sine fluorescerende prober. Disse pH variasjoner gi viktig informasjonfor å bestemme arten av de ekstracellulære kationer sammen med proton effluks. I denne forbindelse er det viktig å legge merke til at varigheten av ammonium preinkubering må justeres nøye avhengig av celler som brukes for målingene. CCL39-avledet fibroblaster, støtter veldig godt en times lasting med 50 mM NH4CI. Dette resulterer i en meget sterk surgjøring som muliggjør NHE full aktivering og frembringer et sterkt signal for målinger (Vmax betingelser). Imidlertid vil andre celler som kardiomyocytter eller primære nyreceller ikke støtte en så viktig ammonium lasting. Det er verdt å utføre flere preliminære forsøk med forskjellige inkubasjonstider eller NH4CI konsentrasjoner. Grunnen til slike forskjeller i følsomhet for NH4Cl er ikke klare. De kan bli relatert til den mulige ekspresjon av ammonium transportsystemer 25,26. Tilsvar natrium-fri løsning som benyttes for å skylle laste løsning kan ikke bli tolerertved celler, så som kardiomyocytter f.eks. Selv om det opprinnelige hastighetene vil bli mindre nøyaktig bestemt, er det nødvendig å perfuse direkte med gjenvinningsoppløsningen etter ammonium lasting.
I tillegg intracellulære pH-målinger gir også en grei måte for å undersøke de reversible egenskaper av disse vekslere som revers modus vil produsere en surgjøring som vil bli lett påvises ved en nedgang i fluorescens BCECF nivå som kan uttrykkes som en pH-verdier etter kalibrering . Begrensningene i disse eksperimentene er mangel på en nøyaktig kvantifisering av transportvirksomhet, som forsøkene måle pH-variasjoner, som opererer på en logaritmisk skala, og er begrenset av intracellulær bufferkapasitet. Sistnevnte kan måles og pH-variasjoner multiplisert med bufferkapasitet avkastning ion flukser. Men kombinerer denne prosessen flere eksperimentelle feil (på pH-målinger, målinger bufferkapasitet, og calibrasjon), og er derfor ikke meget kvantitativ. Derfor for å få tilgang til de enzymatiske konstanter av plasmamembranen uttrykt transportør, hurtig ionefluks teknikker er mye enklere og mer nøyaktig.
Fordi de intracellulære innhold er i millimolar område, å detektere NHE-medierte endringer i cytosol-natrium er ikke mulig. Fra nå av, i årevis slike opptaksteknikker var basert på bruk av radioisotoper så som 22 Na +. Dette manuskriptet beskriver en ikke-radioaktiv metode hvor 22 Na + er erstattet med litium, basert på begrunnelsen at dette kation som også brukes av NHEs, er fraværende fra celle cytosol og kan måles med stor nøyaktighet ved hjelp av atomabsorpsjons-spektrometri 21. Når de aktuelle forholdene (tid og litium konsentrasjon) for å måle lineære uptakes (ie., Å være i innledende priser betingelser) er bestemt, slektskap til de andre potensielle koblings kationer og / ellerinhibitorer kan måles nøyaktig som vist på figurene 3 og 4. En siste potensiell begrensning er at litium opptak metoden kan selvfølgelig bare fungere hvis leren av interesse betydelig transporterer dette varselet. Hvis det ikke er tilfelle, vil experimenter må stole enten på de ovenfor nevnte intracellulære pH-målinger, eller vil måtte bruke radioaktivt natrium-opptak.
Et slikt sett av eksperimenter har ført nylig ført til den observasjon at NHE7 intracellulær Na + / H + veksleren, som i utgangspunktet ble antatt å være en H + / K + transportør som ville alkalinize vesikler var faktisk en endosomale surgjøring mekanisme koplet til natrium 18. Dette har dype konsekvenser for intracellulære som så langt denne rollen ble antatt å være viet til VH + ATPaser. Som hvert medlem av NHE familien ser ut til å vise en meget bestemt kinetisk signatur ovinge til sin fysiologiske rolle, er det fristende å hypotese at karakterisering av NHE6 og NHE9 bruke metodene som er beskrevet i denne artikkelen vil avdekke nye og uventede egenskaper som vil markere sine fysiologiske funksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10x | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).
- Kornak, U., et al. Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis. Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).
- Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease. Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).
- Kasper, D., et al. Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration. Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).
- Poet, M., et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).
- Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).
- Gilfillan, G. D., et al. SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).
- Mignot, C., et al. Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum. Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).
- Morrow, E. M., et al. Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science. 321 (5886), 218-223 (2008).
- Lasky-Su, J., et al. Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).
- Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. Genome-wide association studies in ADHD. Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).
- Meda, S. A., et al. A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort. Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).
- Zhang, L., et al. A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred. Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).
- Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter. Cell. 56 (2), 271-280 (1989).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter. J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).
- Milosavljevic, N., et al. The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis. Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).
- Wigler, M., et al. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. Cell. 16 (4), 777-785 (1979).
- Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens. EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).
- Milosavljevic, N., et al. Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling. Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).
- Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells. Nature. 325, 447-450 (1987).
- Quentin, F., et al. RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).
- Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).
