Abstract
Endozomal asidifikasyonu gibi sinaptik vesiküller protein geri dönüşüm ve bozulma, reseptör duyarsızlaştırma ve nöro-yükleme gibi işlemler, geniş bir aralığı için önemlidir. Bu asitlenme CIC klorür nakliyecilere birleştiğinde proton ATPazların, aracılık tarif edilmektedir. Elektro-proton taşıyıcıları yüksek ölçüde muhafaza edilmiş, Na + / H + değiştiriciler (NHE) 6, 7 ve 9, bu bölmelerin olarak ifade edilmiştir. Genlerindeki mutasyonlar, insan bilişsel ve nörodejeneratif hastalıklar ile bağlantılı olmuştur. Onların hücre içi lokalizasyonu detaylı fonksiyonel karakterizasyonu engelledi gibi Paradoksal, rolleri, zor kalır. Bu yazının bu sorunu çözmek için bir yöntemi gösterir. Bu plazma membranında hücre içi NHEs tutma akut sitosolik asitlenme kalan kapasitesine sahip mutant hücre hatlarının seçimi oluşur. Daha sonra iyon seçiciliği ve aktivitesini ölçmek için iki tamamlayıcı protokol göstermektedir(i) bir floresan görüntü mikroskopi kullanılarak hücre içi pH ölçümleri göre, ve (ii) bir lityum alımının hızlı kinetik göre: Bu değiştirici. Bu tür protokoller olmayan diğer Elektrojenik taşıyıcıları ölçmek için çıkarım olabilir. Ayrıca, burada sunulan seçim prosedürü bir hücre içi tutma arızalı fenotip hücreleri üretir. Bu nedenle, bu hücreler de plazma zarı diğer veziküler membran proteinleri ifade edecektir. Burada tasvir edilen deneysel strateji, bu nedenle daha sonra veziküler + / H + seçimi için kullanılan değiştiriciler, Na ile birlikte, plazma membranında ifade edilecektir diğer hücre içi proteinleri incelemek için potansiyel olarak güçlü bir araç olarak kullanılabilmektedir.
Introduction
Çoğu hücre içi bölmeleri olgunlaşması, insan ticareti, proteinler veya hormonlar ve yükleme nörotransmitterlerin geri dönüşümü için önemli bir parametredir asidik lümen pH görüntüler. Bu sitosol ve vesiküler içeriği arasındaki pH gradyanı veziküler CIC klorür taşıyıcılar 2 bağlanmış, vaküoler H + ATPazların 1 ile elde edildiği gösterilmiştir. Her iki knock-out (KO) farelerde ve insan hastalarda, bu taşıyıcıları önemi onların genlerinde 3-6 mutasyonlar neden ağır fenotip tarafından vurgulanmıştır.
Sodyum-hidrojen değiştirici SLC9A ailesinin üyeleri, aynı zamanda, Na + / H + değiştirici NHEs olarak adlandırılan hücre-içi pH ve hücre hacmi düzenlenmesinde anahtar etkileyiciler yanı sıra epitelden asit-baz eşdeğerleri vektör taşıma olduğu gösterilmiştir . Plazma zarı NHEs yanı sıra, üç yüksek + / H + değiştiriciler, NHE-6, 7, Na korunmuşve 9, trans-Golgi ağı ve erken endozomlarda 7 olarak ifade edilmiştir. Onların genlerinde mutasyonlar Angelman benzeri veya Christianson sendromları 8-9, aile temelli otizm 10 ve Dikkat Eksikliği Hiperaktivite Bozukluğu 11-12 ile bağlantılı olmuştur. Bu dönüştürücüler ayrıca Alzheimer hastalığı yatkınlık 13 ve X-bağlantılı mental retardasyon bitişik genler gibi nörodejeneratif sorunlara 14 sendromları dahil edilmiştir. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar beyin gelişimi ve / veya fonksiyon bu hücre içi NHEs önemini vurgulamak.
Bu eşanjörleri hücre içi lokalizasyonu doğru onların iyon seçicilik ölçümleri, ulaşım yönü, kinetik parametreleri, ve düzenleme önler. Hücre içi bölümlerinde ifade tüm nakliyeciler için olduğu gibi, onların biyokimyasal faaliyetlerini değerlendirmek ve dolayısıyla tam olarak fizyolojik rolleri ve Mechan anlamak son derece zorizm kendi patolojik etkileri altında yatan. Yüksek sitozolik K + konsantrasyonu dayanarak, en çok yaygın kabul gören hipotez onlar K + birleştiğinde proton akış taşıyıcıları olarak görev olmasıydı. Bu değer sabit bir veziküler pH'sını muhafaza etmek için V-ATPazların proton pompalama telafi edilebilir bir proton sızıntı olması, hipotez edilmiştir. Bu görsel maddenin amacı, plazma membranında veziküler taşıyıcıları ifade, ve (ii) bu nakil fonksiyonlarını ölçmek için, bağımsız iki yaklaşım göstermek için hücre çizgilerinin genetik olarak seçilmesi ile sağlayan bir yöntemi göstermek için, (i) 'dir.
Üç yıl önce, Pouysségur ve Franchi NHE ailesinin 15 üyesi moleküler klonlama ve karakterizasyonu etkin bir genetik yaklaşım öncülük etmiştir. Bu tarama yöntemi olarak hücre içi proton toksisite dayanıyordu. İlk adım hücre hatları eksik elde etmek olduHerhangi bir Na + / H + değişimi bu taşıyıcı geri döndürülme oranı kullanılarak, plazma membranında ifade edilmiştir. Fibroblastlar (CCL39 hücre çizgisi), Na + ya da Li + önceden yüklenmiş ve daha sonra 2 saat süre ile bir asidik hücre dışı ortam (pH 6.5) içine yerleştirildi. Bu fonksiyonel, Na + / H + değişimi ifade eden hücrelerin ölümüne ve damar sertliği-yetersizliğine sahip hücrelerin (PS120 hücre çizgisi) 16 seçimine yol açmıştır. Bikarbonat içermeyen bir ortam içinde kültive edilince, bu hücreleri, akut hücre içi asitlenme çok hassastır. Bu tür hücreleri, akut hücre içi acidifications sunulur Sonuç olarak, eğer plazma membranında herhangi bir işlevsel proton akış mekanizması sentezleme pozitif (bakınız 17) seçilir. Bu gibi asitleştirme teknikler plazma membranında WT hücre içi NHEs zorla ifade sağlayan kusurları trafiğe sahip hücre çizgileri izole etmek için kullanılabilir.
Ökaryotik, Na + / H deEşanjörleri elektro +, onlar kanalları ölçmek için büyük bir başarı ile kullanılmaktadır elektrofizyolojik yaklaşımlarla ölçülebilir değildir. Bu yazıda, bu nedenle hücre içi pH ölçümleri ve lityum alımının hızlı kinetik bu değiştirici aktivitesini ölçmek için nasıl gösterir. Temel kavramlar aynı gibi, bu seçim bölümü için geliştirilmiş süreçlerin birçok fonksiyonel ölçümler için doğrudan kullanılan olduğunu fark etmek ilginçtir.
İlginç bir şekilde, bu metinde tarif edilen yaklaşımı kullanılarak seçilmiş hücre çizgileri mevcut trafik kusur veziküler potasyum kanalı TWIK1 18 olarak plazma zarının diğer veziküler proteinlerin daha büyük bir ifadesine neden olduğu gözlenmiştir. Bu veziküler transmembran proteinler için genel bir tutma kusur mekanizmasının seçimi doğru işaret. Dolayısıyla bu seçim prosedürü ve Mayıs üretir hücrelerihücre içi bölmelerin zar proteinleri üzerinde çalışanlar için ümit veren bir araç oluşturmaktadır. Yanı sıra burada sunulan ölçüm teknikleri olmayan diğer Elektrojenik taşıyıcıları çalışmak için geçerli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. H + Killing Seçim
- Hücre çizgileri
- Kararlı olarak NHE-eksikli hücrelerin transfekte (örneğin, CCL39 türetilmiş PS120 hücre çizgisi 16) bir fibroblast hücre çizgisinde etkili transfeksiyon verimi ve seçim üretecek memeli ifade vektörü ve transfeksiyon yöntemi herhangi bir kombinasyonu kullanılmıştır.
NOT: Yıllarca Kalsiyum Fosfat yağış 19 iyi transfeksiyon verimi ile kullanılmıştır. Bu, Lipofectamine2000 gibi ticari reaktifler ile daha yakın değiştirilmiştir, transfeksiyonlar imalatçının talimatlarına uygun olarak yerine getirilmektedir.
- Kararlı olarak NHE-eksikli hücrelerin transfekte (örneğin, CCL39 türetilmiş PS120 hücre çizgisi 16) bir fibroblast hücre çizgisinde etkili transfeksiyon verimi ve seçim üretecek memeli ifade vektörü ve transfeksiyon yöntemi herhangi bir kombinasyonu kullanılmıştır.
- Çözümler
- Aşağıda tarif edilen üç steril çözeltiler hazırlayın. Filtrasyon (0.22 mikron) tarafından bu çözümleri sterilize edin.
- 50 mM NH4CI, 70 mM kolin klorid, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCI2, 5 mM gl içeren bir NH4 + Yükleme çözeltisi hazırlayın (pH 7.4)ucose ve pH 7.4'te 15 mM MOPS.
- 120 mM kolin klorür, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCI2, 5 mM glukoz, pH 7.0, 15 mM HEPES içeren bir durulama çözeltisi (pH 7.0) hazırlayın.
- PH 7.4'te 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCI2, 5 mM glukoz ve 15 mM HEPES içeren bir kurtarma çözeltisi (pH 7.4) içinde hazırlayın.
- Aşağıda tarif edilen üç steril çözeltiler hazırlayın. Filtrasyon (0.22 mikron) tarafından bu çözümleri sterilize edin.
- CO2 bozabilir bu tamponlama neden olur 5% 'si olarak, - seçim başlamadan önce, ("serbest" kuluçka CO2 olarak adlandırılır) dış tanktan ek CO2 ile 37 ° C' de kullanılabilen bir hücre kültürü kuluçka elde asidifikasyon. Ile yaklaşık 2 x 10 8 hücreleri (tipik olarak yaklaşık 20 konfluent 100 mm plakalar) için ilgi NHE sentezleyen hücre soyu yükseltin.
- H prosedürü öldürme +:
- 3 de, yükleme Çözüm, 1 saat için ilgi hücre NHE-ifade eden hücreleri inkübeCO 2 -ücretsiz inkübatör 7 ° C.
- Yükleme çözeltisi aspire ve daha sonra, yukarıda tarif edilen, durulama çözeltisi içinde iki kez yıkayın. Asitlenmesini üretecek bir dik NH 4 + gradyan oluşturulmasını zedeleyecek artık dışı NH 4 Cl ortadan kaldırmak için verimli bu adımı gerçekleştirin.
- Aspirasyon ile durulama ortamı ortadan kaldırmak ve CO2 serbest inkübatör içinde 37 ° C'de tekrar geri kazanım çözeltisi içinde bir saat için kuluçkalayın.
- Normal kültür ortamında (% 7.5 FCS, tipik olarak DMEM) ile kurtarma ortamı yerine ve (% 5 CO2 ve% 95 hava içeren nemli bir atmosferde 37 ° C), standart kültür koşullarında hücreler büyür.
- Stabil klonlar ortaya kadar haftada iki kez seçim bu döngüyü tekrarlayın.
NOT: Hücre kültürü ve seçim koşulları konusunda özel dikkat. Iş Ay o daha eğilimli herhangi bir kontaminasyon tarafından harap olabilirkültür ve tekrarlanan hücre manipülasyonlar uzun bir süre sonra CCur.- Burada, klonlar yükseltmek ve bireysel olarak daha bölümlerde 2-3 açıklanan onları karakterize, ya karakterizasyon önce hücresel nüfus oluşturmak için onları bir araya havuz seçebilirsiniz.
- Sayaç-seçilmesi ebeveyn asit duyarlı fenotip (Şekil 1B) döndürülür olabileceği olanlar tarafından asitlenme dirençli hücreleri korumak için zaman zaman seçim (yaklaşık iki haftada) uygulayın.
2. Hücre içi pH Ölçümleri
2.1) Floresans pH Görüntüleme
- 490 nm'de uyarıldığında, pH'a duyarlı ve üretici protokollerine göre bir 445 mil izosbetik noktası sahip rasyometrik pH'a duyarlı fluoresan boya BCECF / AM kullanın.
- Seçenek olarak ise, üreticinin protokollerine aşağıdaki diğer pH'a duyarlı prob kullanılır.
- Bir görüntüleme set con kullanınyüksek hassasiyet video kamera bağlanmış bir ters mikroskop sisting. 450 nm ve uyarma için uygun kuvars nötr yoğunluk filtreleri ile eşleştirilmiş 490 nm dar bant girişim filtreleri ile bu seti donatın.
- Mümkünse oranı da hem λ1 ve / veya λ2 için, ya doyurarak veya çok düşük ayarlanmış bazal floresan değerlerini önlemek 1. yaklaşır, böylece λ1 ve λ2 kurulum karşılaştırılabilir floresan değerlerine filtreler ve aydınlatma koşulları uygun seti kullanın. Bu hücre içi pH değişiyor olsa oranı tespit edilmiş olmayabilir gibi o önemli eserler verebilir.
NOT: Bu sistem uygun emisyon dalga boyunda (BCECF için 535 nm) hızlı perfüzyon, zaman atlamalı, yukarıda zikredilen iki dalga boylarında uyarım ve satın izin gerekir. Yazılım otomatik veri toplama ve depolama sağlayan sistemi donatın.
- Mümkünse oranı da hem λ1 ve / veya λ2 için, ya doyurarak veya çok düşük ayarlanmış bazal floresan değerlerini önlemek 1. yaklaşır, böylece λ1 ve λ2 kurulum karşılaştırılabilir floresan değerlerine filtreler ve aydınlatma koşulları uygun seti kullanın. Bu hücre içi pH değişiyor olsa oranı tespit edilmiş olmayabilir gibi o önemli eserler verebilir.
NHE İleri Faaliyet 2.2) Ölçüm (eldesiSitosolden protonlar)
- NH4 + Yükleme çözeltisi içinde 1 saat süren kuluçkalamadan hücreleri asitleştirin CO2 yokluğunda (adım 1.4).
- Son beş dakika boyunca solüsyon ile BCECF-AM (5 uM nihai konsantrasyon) ilave edilir ve daha sonra hücre dışı prob ortadan kaldırmak için NH 4 + yükleme çözeltisi durulayın.
- Mikroskop hücreleri monte ve istikrarlı bir temel kaydetmek için birkaç fotoğraf çekmek. Durulama çözeltisi (yukarıya bakın) serpmek. Bu asitleştirme tekabül eden floresans bir düşüşüne yol açar.
- PH stabilize sonra, Li + / H +, Na + / H + veya K + / H + değişimi aracılığı ile pH yükselmesinin oranını ölçmek için aşağıdaki çözümlerden herhangi serpmek. Her bir çözelti bir potansiyel birleştirme katyon H + değişimi için test edilecek olan içerir. Bunlardan biri taşınıyorsa, bu değerden uygun olacak 495 nm'de bir floresan artışı ile sonuçlanırond hücre içi pH zam için:
PH 7.4'de 120 mM LiCİ, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glükoz ve 15 mM HEPES
PH 7.4 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glükoz ve 15 mM HEPES
PH 7.4'de 125 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glükoz ve 15 mM HEPES
NHE Ters Faaliyet 2.3) ölçümü
NOT: Burada ilke transmembran iyonik eğimleri ters etmektir.
- Ölçümden önce, ilgi konusu hücre içi katyon ile yük hücreleri (aşağı bakınız).
- BCECF / AM (bkz: adım 2.2.2) ile 5 dakika boyunca onları inkübe; , yıkayın video mikroskobu onları monte edin.
- Yükleme çözüm serpmek ve istikrarlı bir temel kaydetmek için birkaç fotoğraf çekmek.
- Bazal istikrar, görüntü hücreleri bir hücre dışı asidik ortam 120 m içeren perfüze olan pH değişimleri sonraE kolinklorid, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glükoz ve pH değeri 6.5 olan 15 mM MES,.
- LiCİ yüklemesi için, pH 7.4 ile 120 mM LiCİ, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCI2, 5 mM glukoz ve 15 mM HEPES oluşan bir çözelti içinde, 2 saat boyunca kuluçkalayın. Atom emme spektroskopisi ile ölçülen hücre içi lityum yaklaşık 60 mM arasında bir değer elde edilir.
- Na yüklemesi için, 1mM ouabain varlığında pH 7.4'te 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCI2, 5 mM glukoz ve 15 mM HEPES oluşan bir çözeltiye, iki saat süreyle kuluçkalayın Na / K ATPaz engellemek için. Bu koşullar altında, hücre içi Na konsantrasyonu, 40 mM arasındadır.
Not: sitosolik K + konsantrasyonu 140 mM aralığında ve bir dışarı doğru yönlendirilmiş K + gradyanı elde etmek için, bu nedenle kolay olduğu gibi K + yükleme gerekli değildir.
2.4) Veri Tedavi ve Kalibrasyon:
Not: Bu adım ileri ve geri ölçümler için de geçerlidir.
- Her bir deneyin sonunda, 6.5 ile 7.4 arasında pH değerlerine ayarlanmış 140 mM KCI, 20 mM HEPES ve 5 uM nigerisin eden bir çözelti ile hücreleri serpmek.
- Metin biçiminde altındaki görüntüleri floresan ölçümleri gibi verileri (gri düzeyleri yoğunluk seviyelerini temsil eden) ve ihracat toplayın ve bir elektronik tablo programı kullanarak aşağıda açıklanmıştır davranırım.
- Her bir hücre ya da aşağıdaki denklem kullanılarak ilgili bölge için hücre içi pH değerini hesaplayın:
pH = pKa + (Log (R-Rmin) / (R max R)) x F dk (λ2) / F max (λ2) - F min (λ2) / K ma x (λ2), deneyler boyunca 450 nm floresansta bir azalma ile sonuçlanır sistemi ağartıcı veya kaçak var ise, bu oran kullanın. Ancak bu, çok nadiren des kullanılan koşullarda gözlenenaçıklanan şekilde deneyleri.
- Kalibrasyon verileri her pH ölçümü sonunda mevcut gibi gelen hesaplanan değerler kalibrasyon için kullanılan pH değerleri farklı olup olmadığını kontrol edin. Bu durumda, aşağıdaki yordamı kullanarak kalibrasyon tüm deneysel belirlenen pH değerleri ayarlayın:
- Aşağıdaki katsayısı (Q, kalibrasyon değerleri arasında ölçülen değerler / Fark arasındaki fark) hesaplayın. Hesaplanan değerler karşılık gelen kalibrasyon değerlerini eşit olacak şekilde Q ile bütün veri kümesi ilave veya çıkarma ile son ayarlamayı yapın çarpın.
Hızlı Li + Alımına tarafından NHE7 başlangıç Oranları 3. Ölçümler
- Çok yuvalı plakalar üzerinde Tohum hücreleri (6 yanı sıra 24) üzerinde ya da 20 de tarif edilen alternatif olarak nigericin / sığır serum albümini (BSA) asitlendirme tarif NH4 + yükleme tekniği kullanarak bunları asitleştirmek.
- Bu taşıma başlangıç oranları koşullarda faaliyet sağlamak için kısa ve tutarlı alım süreleri (genellikle bir dakika veya altında) koruyun. Ayrıca alımı için kullanılan tüm çözümler izotonik olduğundan emin olun.
- Alım süresi sonunda, dikkatli bir şekilde alımı ortamı ortadan kaldırmak ve buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile hücreler dört kez yıkayın. (Dördü ideal için az 10 sn) lityum akışını önlemek için mümkün olduğunca hızlı bu yıkar gerçekleştirin.
- Lyse% 25 Nitrik asit hücreler. % 25 nitrik asit, oyuk başına 250 ul uygulanır ve daha sonra pipet ucu ile her bir oyuğa hurda ve yeni mil bütün iyi süspansiyonu transfer, en az 1 saat bekletincrocentrifuge tüp.
- Selüler artığın ayrılması için 15,000 x g'de (oda sıcaklığı), 5 dakika boyunca, onları santrifüj, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine lizat aktarın.
- Atomik absorpsiyon spektroskopisi 21 ile süpernatanların lityum içeriğini ölçün.
NOT: Farklı şirketler Lityum oyuk katot lambası ile donatılmış gereken atomik absorpsiyon spektrometre sağlamak. Bu makineler çok hassas ama aynı zamanda oldukça hassas olarak üreticinin talimatlarını izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seçim:
Şekil 1A'da görüldüğü gibi, lH + öldürme seçimi, amonyum zayıf bir baz difüzyon dayanmaktadır. zayıf bazlar ve hücre içi pH üzerindeki asitler difüzyon etkisi Walter Bor ve işbirlikçileri 22 öncülük edilmiştir. Zarif bir fikir pozitif genetik seçimi için ölümcül bir asitlenme sonra Jacques Pouysségur 17 tarafından geliştirilen üretmek için bu olguyu kullanmak için. Böyle bir protokol kapsamında, hücre içi pH değeri yaklaşık 5.5 durulama aşamasından sonra düşer. Plazma membran fonksiyonel Nhe ifade etmeyen hücreler nötr pH değerine kurtarmak ve düz bir şekil ve bir granüllü sitozol (Şekil 1B) ile tipik bir asitlendirilmiş yönünü göstermiyor olabilir. Sonra tekrar seçim döngüleri 10 -7 bir frekansta, tam olarak ve stabil bir şekilde bu asitlenme (Şekil 1C) ortaya hayatta hücreleri (yaklaşık iki H + prosedürleri / hafta öldürme).Bu tek tek, özelliği ya da istenirse hücre popülasyonlarını elde etmek üzere bir araya toplanmış tek tek hücre klonlarının oluşumu ile sonuçlanacaktır. Hücre yüzey biyotinilasyon ya da RNA susturma gibi standart deneyler plazma membranında ifade edilen protein gerçekten NHE7 olarak hücre içi bir NHE gibi olduğu kontrol (örneğin Milosavljeviç ve ark. 18 bakınız) yapılabilir. Ayrıca, RT-PCR ve sonraki dizi analizi Seçilen hücre hattı içinde ilave edildiği, hücre içi NHEs dizisinde nihai mutasyonlar olmadığını kontrol etmek için uygulanmalıdır.
Fonksiyonel Karakterizasyonu:
Floresan videomikroskopi:
plazma membranında ifade hücre içi NHEs aktivitesi ve iyon seçiciliği çeşitli koşullarda bu NHEs tarafından uyarılan hücre içi pH değişiklikleri ölçülmesiyle ayırt edilebilir. Bunun için bir videomikroskopi seti aydınlatma An ile donatılmışgörüntü d alıcı ayarları, BCECF / AM bir rasyometrik sistemi Şekil 2A'da şematize edilmiştir. Şekil 2B ve 2C, NH4 + asitlenme yükleme. Şekil 2B de doğrudan 490 ve 450 nm 'de uyarımları için elde edilen floresans değerlerinin tipik varyasyonlarını gösteriyor 2.4'te tarif edilen veriler, tedavi) Aşağıda, bu floresans değerlerinden elde edilen pH değeri eğrisini göstermektedir.
Lityum Alımı:
Birlikte hidrojen ve sodyum ile, lityum periyodik tablosunun birinci sütununda bir kısmını ihtiva eder ve Na + / H + değiştiriciler için etkin bir birleştirme katyon olduğu gösterilmiştir. Bu ayrıntılar Na + / H + değiştiricileri fonksiyonel parametreleri ölçmek amacıyla, lityum alımının kurulumu hızlı kinetik Bu bilgi yararlanmak mümkündür. Bu katyon olarak, cyt üzerine kendi birikimi hücre sitoplazmasından yokturosolic asitlenme kantitatif plazma zarı NHE aktivitesini yansıtır. Ayrıca, lityum pikomolar konsantrasyonlarda nanomolar atomik absorpsiyon spektrofotometresi kullanılarak büyük bir hassasiyetle ölçülür. Plazma membranı ifade veziküler değiştirici seçimi ile bir araya getirildiğinde, bu yaklaşım çok güçlüdür. 3 protokolleri bölümünün 3'te tarif edilen ölçüm protokolü) göstermektedir Şekil. Daha önce tarif edildiği gibi tercihen birden çok gözlü levhalar (6-24) ile tohumlanmıştır Hücreler asitleştirilir. Kinetik içeren ortamda lityum hücre kuluçkalama ile başlar ve diğer katyonlar veya ilgi (Şekil 3A) önleyicileri ile ilgilidir.
Alımını durdurmak için, hücreler daha sonra buz soğukluğunda PBS ile dört kez batırıldıktan hızlı sunulur. Anlamlı lityum akış (Şekil 3B) oluşur sağlarken hızla Çalışma herhangi bir hücre dışı lityum kaldırır. Her kuyudaki lityum konsantrasyonu daha sonra,lityum birikimi zamanla (Şekil 3D) eğimi ölçümleri olarak elde edilir doğrudan kararlı durumda değiştirici etkinliğini verim, hangi atomik absorpsiyon spektroskopisi (Şekil 3C), ve Lityum alımı ilk oranları kullanılarak ölçüldü.
Enzim kinetikleri elde etmek üzere, başlangıç hızlarının bir doz-yanıt inhibitörleri için Ki değerleri alt-tabakalar (Şekil 4A) için Km değerleri elde etmek için kullanılabilir. Taşıyıcıların ilginç bir özelliği, farklı bağlama katyonları ulaşım için yarışacak olması. Bu lityum alımı (Şekil 4B) ile yarışma yoluyla sodyum Km ölçme imkanı verir.
Şekil 1: Hücrelerin Seçimi + / H + '<Na bir hücre içi ifade/ Plazma membran strong> değiştirici. (A) Strateji üç aşamada H plazma membran fonksiyonel mutasyona uğramış olmayan ve non-etiketli hücre içi NHE sentezleyen hücrelerin öldürülmesi seçimi +. Bir asit yük sunulan PS120 ana hücrelere (B) faz kontrast mikroskopisi görüntüsü. Ölçek çizgisi: bir asit yük takiben plazma membranında bir veziküler değiştiricinin sentezlenmesi için seçilen PS120 hücreleri, 25 um (C), faz kontrast mikroskopisi görüntüsü. Ölçek çubuğu: 25 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 2: Hücre içi pH ölçümleri, pH ölçümü videomikroskopi (A) İlke.. (B) E490 nm'lik bir uyarma sonrasında BCECF pH sondasının yayılan floresan (595 nm) dönme hareketi. L: asit yükü, Ri; Kurtarma, Cal6.5: Re durulayın kalibrasyon 6.5 hücre içi pH, Cal7.0: BCECF pH probu yayılan floresan (595 nm) 7.0 (C) Evrim bir hücre içi pH Kalibrasyon bir uyarım takip 450 nm. L: asit yükü, Ri; Kurtarma, Cal6.5: Re durulayın kalibrasyon 6.5 bir hücre içi pH değerinde, Cal7.0: BCECF pH 490/450 nm floresan oranları hesaplanan hücre içi pH'ın 7.0 (D) bir hücre içi pH değerinde Kalibrasyon Evrim prob ve kalibrasyon noktaları. L: asit yükü, Ri; Kurtarma, Cal6.5: Re durulayın kalibrasyon 6.5 hücre içi pH, Cal7.0: 7.0 bir hücre içi pH Kalibrasyon bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 3:. NHE-aktivitesi, Li + alımının başlangıç oranları ile ölçülen (A - C) veziküler NHE7 değiştirici lityum alımının ölçülü bir zaman süresi ölçüm tekniği (D), Örnek farklı kritik aşamaları gösteren Şema plazma ifade Membran. İlk oranları ölçümü sağlamak, deneysel koşullar dahilinde kinetik lineerliğini Not. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: NHE7 için tipik doz-tepki eğrileri (18 orijinal veri).Lityum alımının başlangıç değerleri, 1 dakika kinetikleri ölçülmüştür. (A), hücre dışı bir lityum için doz-tepki eğrileri. 1mm dışı lityum alımı üzerine dışı sodyum farklı konsantrasyonlarda (B) Rekabet. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, mevkiye-yönelik mutagenez ile birincil dizisini değiştirmeden, plazma membranında, hücre içi, Na + / H + değiştiriciler ifade eden hücreleri seçin açıklamaktadır. Bu değiştirici hemen karakterize edilebilir.
Bu yöntem, plazma membranında veziküler, Na + / H + değiştiricileri ifade edecek hücre hatları seçmek için hücre içi proton hücresel zehirlilik dayanmaktadır. Bu örneğin, Li +, K +, veya Cs + olarak taşınacak şüphelenilebilir diğer katyonların, kullanımı, prensip olarak, mümkün olabilir. Ancak, bu belirsizlik ek bir düzeyi ekler. Seçim herhangi bir pozitif klon vermezse, o zaman test katyon taşınan değil ya değiştirici plazma membran değildir olmadığını değerlendirmek zor olacaktır. Bu hücre-dışı substr olarak, bu nedenlerden ötürü, seçimleri bir bağlama katyon olarak Na + kullanılarak yapılmıştırFizyolojik koşullarda en yüksek bolca bulunur yedik. Bu NHE7 18, hem de NHE6 ve NHE9 olarak plazma membran (Poet ve Counillon, yayınlanmamış sonuçlar) eksprese eden varyantları seçimine yol açmıştır.
Bu plazma membranı ifade taşıyıcılar şu ana kadar sadece plazma membran ileticileri için kullanılabilecek yöntemlerle fonksiyonel parametrelerin ölçümü sağlar. Tabii ki bu zar ortamı bu tür bir değişiklik veziküler NHEs fonksiyonel özelliklerini etkileyebilir dahil etmek mümkün değildir. Ancak, bu strateji, en az üç nedenden kullanılarak değer olabilir: (i) NHE6 hücre içi ifadesi, 7 ve 9, bir ayrıntılı işlevsel bir ölçüm ortadan kaldırdığı için, (ii) Membran ortamları ve protein veya lipid ortakları çoğunlukla düzenleyici ince etkilediği gösterilmiştir bağlama katyonları, seçicilik, yönlülük, ph için diğer NHEs mekanizmaları ve bu taşıyıcıların değil onların çok temel özellikleri (akrabalıklararmacological özellikler). Yani bu veziküler NHEs membran ifadesi değişmeden kalması muhtemeldir. (Iii) işlevsel mekanizmaları ve plazma zar ifade veziküler mekanizmasının farmakolojik özelliklere bilerek, veziküler pH ölçümleri, plazma zarının ve vesiküler ifadesi arasında bu olası farklılıklar ele yapmak da mümkündür.
Bu tekniğin bir başka potansiyel sınırlama burada tarif edilen strateji, diğer H eksprese + transfekte veziküller daha mekanizması ekstrüzyon hücrelerin seçilmesi yol açabilir ki, Na bir plazma membranı NHE, ya da örneğin, bir H + ATPaz olarak Na + / H + değiştiricisinin ( ). Laboratuvara hiç gözlenmemiş olsa da, aslında ilgi NHE gerçekten plazma zarı ifade olduğunu doğrulamak için susturma birleştirilmiş klasik hücre yüzey etiketleme kullanmak için bu nedenle çok önemlidir ve Na + veya Li + aracılık ve ark. 18 bakınız).
Bu taşıyıcıların aktivitesini karakterize etmek için, iki protokol, sırasıyla hücre içi pH değişimleri ve iyon akıları dayanarak açıklanmıştır. İlk yöntem, pH'a duyarlı floresan sonda ve uygun bir floresan görüntü mikroskopi sisteminin kullanılmasını gerektirir. Alanında birçok gruplar tarafından kullanılan bu yöntem, daha sonra 24 videomikroskopi için floresan uyarma ve satın birleştirilmesi ile tek tek hücrelerin ölçmek için dijital satın kullanarak, ilk süspansiyon 23 sinyaller formu hücrelerini ölçmek için fluorimeters kullanarak, 1980'lerde geliştirilmiştir. İkinci teknik artık nedeniyle kameralar, aydınlatma ve bilgisayar sistemlerinin yüksek performans, çok hızlı ve kolay hale gelmiştir. İlginçtir, şirketler genellikle kendi floresan problar ile çok bilgilendirici teknik sayfaları birbirine sağlamak. Bu pH değişimleri önemli bilgiler sağlarProton efflux ile birleştiğinde dışı katyonların doğasını belirlemek için. Bu hususla ilgili olarak, amonyum ön kuluçka süresi, ölçümleri için kullanılan hücrelerin bağlı olarak ayarlanabilir olması gerektiğini fark etmek önemlidir. CCL39 türetilmiş fibroblastlar, 50 mM NH4CI ile çok iyi bir saat yükleme destekler. Bu NHE tam aktivasyonunu sağlayan ve ölçümler (Vmax koşullar) için güçlü bir sinyal üreten çok güçlü bir asitlenme sonuçlanır. Ancak, kardiyomiyositler veya primer böbrek hücreleri gibi diğer hücrelerin böylesine önemli bir amonyum yükleme destek olmaz. Farklı inkübasyon süreleri veya NH 4 Cl konsantrasyonları ile çeşitli ön denemeler gerçekleştirme değer. NH 4 Cl duyarlılık gibi farklılıkların nedeni açık değildir. Bu amonyum taşıma sistemleri 25,26 olası ifadesi ile ilişkili olabilir. Benzer şekilde yükleme çözeltisi yıkama için kullanılan sodyum içermeyen çözelti tolere edilmeyebilirörneğin kardiyomiyositlerde gibi hücreler tarafından. İlk hızlar daha kesin olarak tespit edilecek olmakla beraber, bu amonyum yükleme sonrası iyileşme çözeltisi ile doğrudan perfüze edilmesi için gereklidir.
Buna ek olarak, hücre içi pH ölçümleri de kolayca pH değerleri aşağıdaki kalibrasyon olarak ifade edilebilir BCECF-fluoresanı seviyesindeki bir azalma ile tespit edilir asidifikasyon üretecek ters modu olarak, bu değiştiriciler döner özelliklerini incelemek için basit bir yol sağlar . Bu deneylerin sınırlamaları logaritmik ölçekte faaliyet ve hücre içi tamponlama kapasitesi ile sınırlıdır deneyler ölçü pH değişimleri, gibi taşımacılık faaliyetlerinin doğru bir miktar eksikliği vardır. İkincisi ölçülür ve pH değişimleri tamponlama kapasitesi verimi iyon akıları ile çarpılır edilebilir. Ancak, bu süreç pH ölçümleri, tamponlama kapasitesi ölçümleri, ve Calibra üzerine (birkaç deneysel hataları birleştirirsiyon) ve bu nedenle yüksek kantitatif değildir. Taşıyıcı ifade dolayısıyla plazma zarı enzimatik sabitler erişmek için, hızlı iyon akı teknikleri çok daha basit ve doğru.
Hücre içi içeriğinin sitosolik sodyumlu NHE aracılığıyla değişikliklerin tespit milimol aralık içinde olduğundan mümkün değildir. Bundan böyle, yıllardır bu alım teknikleri, 22, Na + gibi radyoizotoplar kullanımına dayanmaktadır. Bu yazıda 22, Na +, aynı zamanda NHEs tarafından kullanılan bu katyon, hücre sitoplazmada mevcut ve atomik absorpsiyon spektrofotometresi 21 ile büyük bir hassasiyetle ölçülür edilebilir rasyonele dayanmaktadır, lityum ile ikame edildiği için radyoaktif olmayan bir yöntemi tarif etmektedir. Diğer potansiyel bağlama katyonları için uygun belirlenen koşullar (zaman ve lityum konsantrasyonu) doğrusal uptake'leri ölçmek için (yani., Başlangıç oranları koşullarda varlık), akrabalıklar kez ve / veyaŞekiller 3 ve 4 'de gösterildiği gibi inhibitörleri doğru olarak ölçülebilmektedir. Son bir potansiyel sınırlama lityum alım yöntemi elbette sadece ilgi değiştirici ölçüde bu katyon nakil halinde işlev görebilir olmasıdır. Bu durumda değilse, deneyci yukarıda belirtilen hücre içi pH ölçümleri ya güvenmek zorunda olacak ya da radyoaktif sodyum alımını kullanmak zorunda olacak.
Deneyler bu tür bir dizi yol yakın ilk inanılan NHE7 hücre içi, Na + / H + değiştiricisinin, bir endozomal asidifikasyonu mekanizması sodyum bağlanmış veziküller alkalinize olan bir H + / K + taşıyıcı aslında olduğu için durum ortaya 18. Bu şimdiye kadar bu rolü VH + ATPazların tahsis edilmesi düşünülen gibi hücre içi bölmeleri için derin etkileri vardır. NHE ailesinin her üyesi bir çok özel kinetik imza o görüntülemek göründüğü gibionun fizyolojik rolü kanat, bu NHE6 ve NHE9 karakterizasyonu fizyolojik fonksiyonlarını vurgulayacak roman ve beklenmedik özellikleri ortaya çıkaracak bu makalede açıklanan yöntemleri kullanarak varsayımında cazip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10x | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).
- Kornak, U., et al. Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis. Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).
- Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease. Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).
- Kasper, D., et al. Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration. Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).
- Poet, M., et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).
- Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).
- Gilfillan, G. D., et al. SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).
- Mignot, C., et al. Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum. Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).
- Morrow, E. M., et al. Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science. 321 (5886), 218-223 (2008).
- Lasky-Su, J., et al. Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).
- Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. Genome-wide association studies in ADHD. Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).
- Meda, S. A., et al. A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort. Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).
- Zhang, L., et al. A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred. Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).
- Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter. Cell. 56 (2), 271-280 (1989).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter. J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).
- Milosavljevic, N., et al. The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis. Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).
- Wigler, M., et al. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. Cell. 16 (4), 777-785 (1979).
- Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens. EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).
- Milosavljevic, N., et al. Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling. Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).
- Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells. Nature. 325, 447-450 (1987).
- Quentin, F., et al. RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).
- Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).
