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Biology

ना के कार्यात्मक विशेषता Published: March 30, 2015 doi: 10.3791/52453
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics
* These authors contributed equally

Abstract

Endosomal अम्लीकरण ऐसे synaptic vesicles में प्रोटीन रीसाइक्लिंग और गिरावट, रिसेप्टर desensitization, और neurotransmitter लोड हो रहा है के रूप में प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए महत्वपूर्ण है। इस अम्लीकरण सीएलसी क्लोराइड ट्रांसपोर्टरों के लिए युग्मित प्रोटॉन ATPases, द्वारा मध्यस्थता होना बताया है। Electroneutral प्रोटॉन ट्रांसपोर्टरों की अति-संरक्षित, ना + / एच + एक्सचेंजर्स (Nhe) 6, 7 और 9 भी इन डिब्बों में व्यक्त कर रहे हैं। उनके जीन में उत्परिवर्तन मानव संज्ञानात्मक और neurodegenerative रोगों के साथ जोड़ा गया है। उनके intracellular स्थानीयकरण विस्तृत कार्यात्मक लक्षण वर्णन रोका गया है के रूप में विडंबना यह है कि उनकी भूमिकाओं, मायावी रहते हैं। यह पांडुलिपि इस समस्या को हल करने के लिए एक विधि से पता चलता है। यह प्लाज्मा झिल्ली में इंट्रासेल्युलर NHEs बनाए रखने के द्वारा तीव्र साइटोसोलिक अम्लीकरण जीवित करने में सक्षम उत्परिवर्ती सेल लाइनों, के चयन के होते हैं। यह तो आयन चयनात्मकता और गतिविधि को मापने के लिए दो पूरक प्रोटोकॉल को दर्शाया गया है(मैं) एक प्रतिदीप्ति वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग इंट्रासेल्युलर पीएच माप के आधार पर, और (ii) एक लिथियम तेज की तेजी कैनेटीक्स के आधार पर: इन एक्सचेंजर्स की। इस तरह के प्रोटोकॉल अन्य गैर electrogenic ट्रांसपोर्टरों को मापने के लिए extrapolated किया जा सकता है। इसके अलावा, यहां प्रस्तुत चयन प्रक्रिया एक intracellular प्रतिधारण दोषपूर्ण phenotype के साथ कोशिकाओं को उत्पन्न करता है। इसलिए इन कोशिकाओं को भी प्लाज्मा झिल्ली पर अन्य vesicular झिल्ली प्रोटीन व्यक्त करेंगे। यहाँ दर्शाया प्रयोगात्मक रणनीति इसलिए तो vesicular + / एच + चयन के लिए इस्तेमाल किया एक्सचेंजर्स ना के साथ मिलकर प्लाज्मा झिल्ली में व्यक्त किया जाएगा कि अन्य intracellular प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक संभावित शक्तिशाली उपकरण का गठन हो सकता है।

Introduction

सबसे intracellular डिब्बों परिपक्वता, तस्करी, प्रोटीन या हार्मोन और लदान न्यूरोट्रांसमीटर की रीसाइक्लिंग के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है जो एक अम्लीय luminal पीएच, प्रदर्शित करते हैं। यह साइटोसॉल और vesicular सामग्री के बीच पीएच ढाल vesicular सीएलसी क्लोराइड ट्रांसपोर्टरों दो के लिए युग्मित, vacuolar एच + ATPases एक द्वारा उत्पन्न होता है कि दिखाया गया है। दोनों तोड़े बाहर (को) चूहों और मानव रोगियों में, इन ट्रांसपोर्टरों के महत्व को अपने जीन 3-6 में परिवर्तन की वजह से भारी phenotypes के द्वारा प्रकाश डाला गया है।

सोडियम हाइड्रोजन एक्सचेंजर्स SLC9A परिवार के सदस्यों, भी ना + / एच + एक्सचेंजर्स के लिए NHEs करार दिया, इंट्रासेल्युलर पीएच और सेल मात्रा विनियमन में महत्वपूर्ण प्रभावोत्पादक है, साथ ही में epithelia भर में एसिड आधार समकक्ष के vectorial परिवहन होना दिखाया गया है । प्लाज्मा झिल्ली NHEs इसके अलावा, तीन अत्यधिक + / एच + एक्सचेंजर्स, Nhe 6, 7 ना संरक्षितऔर 9 पार गोल्गी नेटवर्क में और जल्दी endosomes 7 में व्यक्त कर रहे हैं। उनके जीन में उत्परिवर्तन Angelman की तरह या Christianson सिंड्रोम 8-9, परिवार आधारित आत्मकेंद्रित 10 और ध्यान डेफिसिट सक्रियता विकार 11-12 के साथ जोड़ा गया है। ये एक्सचेंजर्स भी ऐसे अल्जाइमर रोग संवेदनशीलता 13 और एक्स-लिंक्ड मानसिक मंदता सन्निहित जीन के रूप में neurodegenerative समस्याओं 14 सिंड्रोम में शामिल किया गया है। साथ में ले ली, इन अध्ययनों के मस्तिष्क के विकास और / या समारोह में इन इंट्रासेल्युलर NHEs के महत्व पर प्रकाश डाला।

इन एक्सचेंजर्स के intracellular स्थानीयकरण सटीक उनके आयन चयनात्मकता की माप, परिवहन दिशा, गतिज पैरामीटर, और विनियमन को रोकता है। Intracellular डिब्बों में व्यक्त सभी ट्रांसपोर्टरों के लिए मामला है, यह उनकी जैव रासायनिक गतिविधियों का आकलन करने के लिए और इसलिए पूरी तरह से उनके शारीरिक भूमिकाओं और mechan को समझने के लिए बहुत मुश्किल हैISMS उनके रोग निहितार्थ अंतर्निहित। उच्च साइटोसोलिक + K एकाग्रता के आधार पर, सबसे सामान्य स्वीकार किए जाते परिकल्पना वे कश्मीर + युग्मित प्रोटॉन तपका ट्रांसपोर्टरों के रूप में काम कर रहे थे। यह एक स्थिर राज्य vesicular पीएच बनाए रखने के क्रम में वि ATPases द्वारा प्रोटॉन पंप counterbalance हो सकता है के रूप में इस तरह के एक प्रोटॉन रिसाव के अस्तित्व, धारणा रही थी। इस दृश्य लेख का उद्देश्य के लिए अपने प्लाज्मा झिल्ली पर इस तरह के vesicular ट्रांसपोर्टरों एक्सप्रेस, और (ii) इन ट्रांसपोर्टरों के कार्यों को मापने के लिए दो स्वतंत्र दृष्टिकोण को दिखाने के लिए कि सेल लाइनों के आनुवंशिक चयन की अनुमति देता है कि एक विधि का प्रदर्शन करने के लिए (मैं) है।

तीन दशक पहले, Pouysségur और Franchi Nhe परिवार 15 सदस्यों की आणविक क्लोनिंग और लक्षण वर्णन सक्षम है कि एक आनुवंशिक दृष्टिकोण का बीड़ा उठाया है। यह एक जांच पद्धति के रूप इंट्रासेल्युलर प्रोटॉन की विषाक्तता के आधार पर किया गया था। पहले कदम के लिए सेल लाइनों की कमी को प्राप्त करने के लिए किया गया थाकिसी भी ना + / एच + विदेशी मुद्रा में इस ट्रांसपोर्टर के उलटने का उपयोग कर, प्लाज्मा झिल्ली में व्यक्त की है। Fibroblasts (CCL39 सेल लाइन) ना + या ली + के साथ preloaded और फिर दो घंटे के लिए एक अम्लीय कोशिकी मध्यम (पीएच 6.5) में रखा गया था। यह एक कार्यात्मक ना + / एच + विनिमय व्यक्त कोशिकाओं की मौत के लिए और antiporter की कमी कोशिकाओं (PS120 सेल लाइन) 16 का चयन करने के लिए नेतृत्व किया। बाइकार्बोनेट मुक्त माध्यम में खेती की जाती है, जब इन कोशिकाओं को तीव्र इंट्रासेल्युलर अम्लीकरण के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं। ऐसी कोशिकाओं तीव्र इंट्रासेल्युलर acidifications को प्रस्तुत कर रहे हैं अगर नतीजतन, प्लाज्मा झिल्ली में किसी भी कार्य प्रोटॉन तपका तंत्र की अभिव्यक्ति सकारात्मक (17 देखें) का चयन किया जाएगा। इस तरह के अम्लीकरण तकनीक प्लाज्मा झिल्ली पर गुम्मट इंट्रासेल्युलर NHEs के लिए मजबूर अभिव्यक्ति सक्रिय करने के दोष तस्करी के साथ सेल लाइनों को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

यूकेरियोटिक ना + / एच के रूप मेंएक्सचेंजर्स electroneutral हैं + वे चैनलों को मापने के लिए बड़ी सफलता के साथ इस्तेमाल किया गया है कि electrophysiological दृष्टिकोण से औसत दर्जे का नहीं हैं। इस पांडुलिपि इसलिए इंट्रासेल्युलर पीएच माप और लिथियम तेज की तेजी कैनेटीक्स द्वारा इस एक्सचेंजर की गतिविधि को मापने के लिए कैसे दर्शाता है। अंतर्निहित अवधारणाओं वही कर रहे हैं, यह चयन अनुभाग के लिए विकसित की प्रक्रियाओं के कई लोग भी कार्यात्मक मापन के लिए सीधे इस्तेमाल किया जाता है कि सूचना के लिए दिलचस्प है।

दिलचस्प बात यह है कि हम इस पांडुलिपि में वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग कर चयनित सेल लाइनों में मौजूद तस्करी दोष ऐसे vesicular पोटेशियम चैनल TWIK1 18 के रूप में प्लाज्मा झिल्ली पर अन्य vesicular प्रोटीन का एक बड़ा अभिव्यक्ति की ओर जाता है कि मनाया है। इस vesicular transmembrane प्रोटीन के लिए एक सामान्य प्रतिधारण दोष तंत्र का चयन बाहर की ओर इशारा करते हैं। इसलिए इस चयन प्रक्रिया है और यह मई उत्पन्न करता है कि कोशिकाओंintracellular डिब्बों की झिल्ली प्रोटीन पर काम कर रहे वैज्ञानिक समुदाय के लिए एक होनहार उपकरण का गठन। के रूप में अच्छी तरह से यहाँ प्रस्तुत माप तकनीक अन्य गैर electrogenic ट्रांसपोर्टरों के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1. एच + हत्या चयन

  1. सेल लाइनों
    1. Stably Nhe की कमी कोशिकाओं transfect (जैसे, CCL39 व्युत्पन्न PS120 सेल लाइन 16) एक तंतुप्रसू सेल लाइन में कुशल अभिकर्मक पैदावार और चयन का उत्पादन होगा कि स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर और अभिकर्मक विधि के किसी भी संयोजन का उपयोग कर।
      नोट: कई सालों के लिए कैल्शियम फास्फेट वर्षा 19 अच्छा अभिकर्मक पैदावार के साथ इस्तेमाल किया गया था। यह एक ऐसी Lipofectamine2000 के रूप में वाणिज्यिक अभिकर्मकों से अधिक हाल ही में बदल दिया गया है, transfections के निर्माता के निर्देशों का पालन किया जा रहा है।
  2. समाधान
    1. नीचे के रूप में वर्णित तीन बाँझ समाधान तैयार करें। निस्पंदन (0.22) के द्वारा इन समाधान जीवाणुरहित।
      1. 50 मिमी एनएच 4 सीएल, 70 मिमी choline क्लोराइड, 5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी 2 CaCl, 5 मिमी जीएल के शामिल एक एनएच 4 + लोड हो रहा है समाधान तैयार (7.4 पीएच)ucose और 7.4 पीएच में 15 मिमी MOPS।
      2. 120 मिमी choline क्लोराइड, 5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी 2 CaCl, 5 मिमी ग्लूकोज और पीएच 7.0 से कम 15 मिमी HEPES के शामिल एक कुल्ला समाधान (पीएच 7.0) तैयार करें।
      3. पीएच 7.4 से कम 120 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी 2 CaCl, 5 मिमी ग्लूकोज और 15 मिमी HEPES के शामिल एक रिकवरी समाधान (7.4 पीएच) तैयार करें।
  3. सीओ 2 क्षीण हो सकता है कि बफरिंग में परिणाम होगा 5% के रूप में, - चयन शुरू करने से पहले, ("मुक्त" इनक्यूबेटर सीओ 2 कहा जाता है) बाहरी टैंक से कोई अतिरिक्त सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर प्राप्त अम्लीकरण। के बारे में 2 एक्स 10 8 कोशिकाओं (आमतौर पर के बारे में 20 मिला हुआ 100 मिमी प्लेट) के लिए ब्याज की Nhe व्यक्त सेल लाइन बढ़ाना।
  4. एच प्रक्रिया की हत्या +:
    1. 3 पर, लोड हो रहा है समाधान में एक घंटे के लिए ब्याज के intracellular Nhe व्यक्त कोशिकाओं को सेतेसीओ 2 मुक्त इनक्यूबेटर में सात डिग्री सेल्सियस।
    2. लोड हो रहा है समाधान Aspirate और फिर ऊपर वर्णित कुल्ला समाधान में उन्हें दो बार कुल्ला। अम्लीकरण उत्पन्न होगा कि एक खड़ी एनएच 4 ढाल के निर्माण के क्षीण होता है कि अवशिष्ट कोशिकी एनएच 4 सीएल खत्म करने के लिए कुशलतापूर्वक इस चरण को पूरा करें।
    3. आकांक्षा से कुल्ला मध्यम हटा दें और सीओ 2 मुक्त इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर फिर से वसूली समाधान में एक घंटे के लिए कोशिकाओं सेते हैं।
    4. नियमित रूप से संस्कृति के माध्यम से (7.5% एफसीएस के साथ आम तौर पर DMEM) के साथ वसूली के माध्यम से बदलें और (5% सीओ 2 और 95% हवा का एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस) मानक संस्कृति की स्थिति में कोशिकाओं को विकसित।
  5. स्थिर क्लोन उभरने जब तक एक सप्ताह में दो बार चयन के इस चक्र को दोहराएँ।
    नोट: सेल संस्कृति और चयन शर्तों के विषय में विशेष ध्यान रखना। काम के महीने ओ की संभावना अधिक होती है कि किसी भी संक्रमण से बर्बाद किया जा सकता हैसंस्कृति और दोहराया सेल जोड़तोड़ की एक लंबी अवधि के बाद ccur।
    1. इधर, क्लोन बढ़ाना और अलग-अलग रूप में आगे वर्गों 2-3 में वर्णित उन्हें चिह्नित करना, या लक्षण वर्णन से पहले एक सेलुलर आबादी उत्पन्न करने के लिए उन्हें एक साथ पूल करने के लिए कि क्या चुनते हैं।
  6. काउंटर का चयन पैतृक एसिड के प्रति संवेदनशील फेनोटाइप (चित्रा 1 बी) को वापस सौंप दिया है हो सकता है कि उन लोगों द्वारा अम्लीकरण प्रतिरोधी कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए कभी-कभार चयन (के बारे में एक बार हर दो सप्ताह) को लागू करें।

2. Intracellular पीएच माप

2.1) प्रतिदीप्ति पीएच इमेजिंग

  1. 490 एनएम पर उत्साहित जब पीएच के प्रति संवेदनशील है और निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद एक 445 एनएम isosbestic बिंदु के पास, जो ratiometric पीएच के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई BCECF / हूँ, का प्रयोग करें।
    1. वैकल्पिक रूप से, निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन अन्य पीएच के प्रति संवेदनशील जांच, का उपयोग करें।
  2. एक इमेजिंग सेट चोर का प्रयोग करेंएक उच्च संवेदनशीलता वीडियो कैमरा करने के लिए मिलकर एक औंधा माइक्रोस्कोप के sisting। 450 एनएम और उत्तेजना के लिए उपयुक्त क्वार्ट्ज तटस्थ घनत्व फिल्टर के साथ रखा 490 एनएम संकीर्ण बैंड हस्तक्षेप फिल्टर के साथ इस सेट से लैस।
    1. यदि संभव हो तो अनुपात भी दोनों λ1 और / या λ2 के लिए, या तो saturating या बहुत कम सेट कर रहे हैं कि बेसल प्रतिदीप्ति मूल्यों से बचने 1. दृष्टिकोण है, ताकि λ1 और λ2 के लिए सेटअप तुलनीय प्रतिदीप्ति मूल्यों के लिए फिल्टर और रोशनी की स्थिति का उचित सेट का उपयोग करें। इस इंट्रासेल्युलर पीएच बदल रहा है, हालांकि अनुपात पता लगाने योग्य नहीं किया गया हो सकता है के रूप में तो महत्वपूर्ण कलाकृतियों उपज हो सकती है।
      नोट: इस प्रणाली के उचित उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य (BCECF के लिए 535 एनएम) में तेजी से छिड़काव, समय चूक दो उपर्युक्त तरंग दैर्ध्य में उत्तेजना और अधिग्रहण के लिए सक्षम होना चाहिए। सॉफ्टवेयर स्वचालित डाटा अधिग्रहण और भंडारण सक्रिय करने के साथ प्रणाली से लैस।

Nhe फॉरवर्ड गतिविधि के 2.2) माप (के बाहर निकालनाCytosol से प्रोटॉनों)

  1. एनएच 4 + लोड हो रहा है समाधान में एक 1 घंटे ऊष्मायन द्वारा कोशिकाओं खट्टा सीओ 2 के अभाव में (1.4 कदम देखें)।
  2. पिछले पांच मिनट के लिए समाधान के लिए BCECF-एएम (5 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) जोड़ें और फिर कोशिकी जांच खत्म करने के लिए राष्ट्रीय राजमार्ग के साथ 4 + लोड हो रहा है समाधान यह कुल्ला।
  3. खुर्दबीन पर कोशिकाओं माउंट और एक स्थिर आधारभूत रिकॉर्ड करने के लिए कई छवियों को ले। कुल्ला समाधान (ऊपर देखें) छिड़कना। इस अम्लीकरण के लिए इसी प्रतिदीप्ति की एक बूंद में यह परिणाम है।
  4. पीएच स्थिरीकरण के बाद, ली + / एच +, ना + / एच + या + K / एच + विनिमय द्वारा मध्यस्थता पीएच वसूली दर को मापने के लिए नीचे दिए गए समाधान के किसी भी छिड़कना। प्रत्येक समाधान के लिए एक संभावित युग्मन कटियन एच + आदान प्रदान के लिए परीक्षण किया जाना शामिल है। उन में से एक ले जाया जाता है, तो इस corresp होगा कि 495 एनएम पर एक प्रतिदीप्ति वृद्धि में परिणाम होगादूसरी इंट्रासेल्युलर पीएच में एक उठाना करने के लिए:
    7.4 पीएच में 120 मिमी LiCl, 5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी 2 CaCl, 5 मिमी ग्लूकोज और 15 मिमी HEPES
    पीएच 7.4 से कम 120 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी 2 CaCl, 5 मिमी ग्लूकोज और 15 मिमी HEPES
    7.4 पीएच में 125 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी 2 CaCl, 5 मिमी ग्लूकोज और 15 मिमी HEPES

Nhe रिवर्स गतिविधि का 2.3) मापन

नोट: यहाँ सिद्धांत ट्रांसमेम्ब्रेन आयनिक ढ़ाल पलटना है।

  1. माप से पहले, ब्याज के intracellular केशन के साथ कोशिकाओं लोड (नीचे देखें)।
  2. BCECF / एएम (देखें कदम 2.2.2) के साथ 5 मिनट के लिए उन्हें सेते हैं; , उन्हें कुल्ला वीडियो माइक्रोस्कोप पर उन्हें माउंट।
  3. लोड हो रहा है समाधान छिड़कना है और एक स्थिर आधारभूत रिकॉर्ड करने के लिए कई छवियों को ले।
  4. आधारभूत स्थिरीकरण, छवि कोशिकाओं को एक कोशिकी अम्लीय मध्यम 120 मीटर युक्त साथ perfused कर रहे हैं जब पीएच विविधताओं के बादएम choline क्लोराइड, 5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी 2 CaCl, 5 मिमी ग्लूकोज और पीएच 6.5 में 15 मिमी एमईएस।
  5. LiCl लोड करने के लिए, 7.4 पीएच में 120 मिमी LiCl, 5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी 2 CaCl, 5 मिमी ग्लूकोज और 15 मिमी HEPES से बना एक समाधान में 2 घंटे के लिए कोशिकाओं सेते हैं। परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा intracellular लिथियम के बारे में 60 मिमी के एक मूल्य पैदावार।
  6. ना + लोड करने के लिए, 1 मिमी ouabain की उपस्थिति में पीएच 7.4 से कम 120 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी 2 CaCl, 5 मिमी ग्लूकोज और 15 मिमी HEPES से बना एक समाधान में दो घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते ना / कश्मीर ATPase ब्लॉक करने के लिए। इन परिस्थितियों में, इंट्रासेल्युलर ना + एकाग्रता 40 मिमी की सीमा में है।
    नोट: साइटोसोलिक + K एकाग्रता 140 मिमी की सीमा में है और एक बाहर का निर्देशन + K ढाल प्राप्त करने के लिए इसलिए आसान है के रूप में कश्मीर + लोड हो रहा है आवश्यक नहीं है।

2.4) डाटा उपचार और कैलिब्रेशन:

नोट: यह कदम आगे और रिवर्स मापन के लिए दोनों पर लागू होता है।

  1. प्रत्येक प्रयोग के अंत में, 6.5 और 7.4 के बीच पीएच मान को समायोजित 140 मिमी KCl, 20 मिमी HEPES और 5 माइक्रोन nigericin का एक समाधान के साथ कोशिकाओं छिड़कना।
  2. पाठ प्रारूप के तहत छवियों से प्रतिदीप्ति माप के रूप में डेटा (ग्रे स्तर तीव्रता के स्तर का प्रतिनिधित्व) और निर्यात लीजिए और के रूप में एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग कर नीचे समझाया समझो।
  3. प्रत्येक व्यक्ति के सेल या निम्न समीकरण का उपयोग हित के क्षेत्र के लिए इंट्रासेल्युलर पीएच मान की गणना:
    पीएच = pKa (+ प्रवेश (आर Rmin) / (आर अधिकतम आर)) एक्स एफ मिनट (λ2) / एफ मैक्स (λ2)
  4. एफ मिनट (λ2) / एफ एम ए एक्स (λ2) प्रयोगों भर में 450 एनएम प्रतिदीप्ति में कमी के परिणामस्वरूप, जांच विरंजन या रिसाव अगर वहाँ अनुपात का प्रयोग करें। हालांकि यह बहुत मुश्किल से ही देस में इस्तेमाल की स्थिति में मनाया जाता हैcribed प्रयोगों।
  5. अंशांकन डेटा प्रत्येक पीएच माप के अंत में मौजूद हैं, के रूप में इसी मूल्यों की गणना अंशांकन के लिए इस्तेमाल किया पीएच मान से अलग है, चाहे की जाँच करें। यह मामला है, तो निम्नलिखित प्रक्रिया का उपयोग कर अंशांकन करने के लिए सभी प्रयोगात्मक निर्धारित पीएच मान को समायोजित:
    1. निम्नलिखित भागफल (क्यू, अंशांकन मूल्यों के बीच मापा मूल्यों / अंतर के बीच अंतर) की गणना। मूल्यों की गणना इसी अंशांकन मूल्यों के बराबर होगा तो यह है कि प्र द्वारा पूरे डाटासेट इसके अलावा या घटाव द्वारा अंतिम समायोजन करने गुणा करें।

फास्ट ली + तेज द्वारा NHE7 की प्रारंभिक दर 3. माप

  1. बहु अच्छी तरह से प्लेटों पर बीज कोशिकाओं (6 अच्छी तरह से करने के लिए 24) और ऊपर या 20 में वर्णित एकांतर nigericin / गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) अम्लीकरण वर्णित एनएच 4 + लोड हो रहा है तकनीक का उपयोग या तो उन्हें खट्टा करना।
  2. कि परिवहन प्रारंभिक दरों की स्थिति में चल रही है सुनिश्चित करने के लिए कम और लगातार तेज durations के (आमतौर पर एक या दो मिनट के नीचे) को बनाए रखें। इसके अलावा तेज के लिए इस्तेमाल सभी समाधान आइसोटोनिक हैं कि सुनिश्चित करें।
  3. तेज समय के अंत में, ध्यान से तेज मध्यम खत्म करने और बर्फ ठंड फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को चार बार धो लें। (उनमें से चार आदर्श है के लिए कम से कम 10 सेकंड) लिथियम तपका को रोकने के लिए जितनी जल्दी हो सके इन washes के प्रदर्शन करना।
  4. Lyse 25% नाइट्रिक एसिड में कोशिकाओं। 25% नाइट्रिक एसिड की अच्छी तरह से प्रति 250 μl लागू करें और यह तो विंदुक टिप के अंत के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से स्क्रैप और एक नया मील में पूरे अच्छी तरह से निलंबन हस्तांतरण, कम से कम 1 घंटे के लिए बैठते हैंcrocentrifuge ट्यूब।
  5. सेलुलर मलबे को हटाने के लिए 15,000 XG (कमरे के तापमान) में 5 मिनट के लिए उन्हें अपकेंद्रित्र, 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में lysate स्थानांतरण।
  6. परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी 21 से supernatants की लिथियम सामग्री को मापने के।
    नोट: विभिन्न कंपनियों को एक लिथियम खोखले कैथोड दीपक के साथ सुसज्जित किया जाना है जो परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोमीटर, प्रदान करते हैं। इन मशीनों बहुत ही सटीक लेकिन यह भी काफी नाजुक हैं के रूप में निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

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Representative Results

चयन:

चित्रा 1 ए में दर्शाया के रूप में एच + हत्या के चयन, अमोनियम कमजोर आधार के प्रसार पर आधारित है। कमजोर कुर्सियां ​​और intracellular पीएच पर एसिड प्रसार के प्रभाव वाल्टर बोरान और सहयोगियों 22 ने बीड़ा उठाया गया है। सुरुचिपूर्ण विचार सकारात्मक आनुवंशिक चयन के लिए एक घातक अम्लीकरण तब जाक Pouysségur 17 द्वारा विकसित किया गया था का उत्पादन करने के लिए इस घटना का उपयोग करने के लिए। इस तरह के एक प्रोटोकॉल के तहत, इंट्रासेल्युलर पीएच के बारे में 5.5 कुल्ला कदम के बाद करने के लिए चला जाता है। प्लाज्मा झिल्ली में एक कार्यात्मक Nhe व्यक्त नहीं करते जो कोशिकाओं को एक तटस्थ पीएच मूल्य की वसूली और एक फ्लैट के आकार और एक बारीक साइटोसॉल (चित्रा 1 बी) के साथ एक ठेठ acidified पहलू दिखाने के लिए नहीं कर सकते हैं। बाद दोहराया चयन चक्र के बारे में 10 -7 की एक आवृत्ति पर, पूरी तरह से और stably इस अम्लीकरण (चित्रा 1C) में उभरने कि जीवित कोशिकाओं (लगभग दो एच + प्रक्रियाओं / सप्ताह हत्या)।यह या तो व्यक्तिगत विशेषता या अगर वांछित सेलुलर आबादी प्राप्त करने के लिए जमा किया जा सकता है कि व्यक्ति सेलुलर क्लोन के गठन में परिणाम होगा। ऐसी कोशिका की सतह biotinylation या आरएनए मुंह बंद करने के रूप में मानक प्रयोगों प्लाज्मा झिल्ली में व्यक्त प्रोटीन वास्तव में NHE7 के रूप में एक intracellular Nhe ऐसी है कि नियंत्रण (उदाहरण Milosavljevic एट अल। 18 के लिए देखें) करने के लिए आयोजित किया जा सकता है। साथ ही, आरटी पीसीआर और बाद अनुक्रमण चयनित सेल लाइन में व्यक्त इंट्रासेल्युलर NHEs के अनुक्रम में अंतिम परिवर्तन के लिए जाँच करने के लिए किया जाना चाहिए।

कार्यात्मक विशेषता:

प्रतिदीप्ति Videomicroscopy:

प्लाज्मा झिल्ली में व्यक्त इंट्रासेल्युलर NHEs की गतिविधि और आयन चयनात्मकता विभिन्न परिस्थितियों में इन NHEs द्वारा प्रेरित इंट्रासेल्युलर पीएच में परिवर्तन को मापने के द्वारा लक्षण वर्णन किया जा सकता है। इस के लिए एक videomicroscopy सेट रोशनी एक साथ सुसज्जितछवि के लिए डी अधिग्रहण सेटिंग्स ऐसे BCECF / एएम के रूप में एक ratiometric जांच 2A चित्रा में schematized है। चित्रा 2B और 2C एक एनएच 4 अम्लीकरण लोड हो रहा है। चित्रा 2 डी निम्नलिखित सीधे 490 और 450 एनएम पर excitations के लिए प्राप्त प्रतिदीप्ति मूल्यों में ठेठ विविधताओं, दिखाने 2.4 में वर्णित डेटा उपचार) निम्नलिखित इन प्रतिदीप्ति मूल्यों से प्राप्त पीएच वक्र से पता चलता है।

लिथियम तेज:

साथ में हाइड्रोजन और सोडियम के साथ, लिथियम आवर्त सारणी के पहले स्तंभ के हिस्से शामिल हैं और ना + / एच + एक्सचेंजर्स के लिए एक कुशल युग्मन कटियन होना दिखाया गया है। यह विवरण में ना + / एच + एक्सचेंजर्स के कार्यात्मक मापदंडों को मापने के क्रम में, लिथियम तेज की स्थापना में तेजी से कैनेटीक्स के लिए इस जानकारी का लाभ लेने के लिए संभव है। इस केशन के रूप में, CYT पर अपनी संचय सेल कोशिका द्रव्य से अनुपस्थित हैosolic अम्लीकरण मात्रात्मक प्लाज्मा झिल्ली Nhe की गतिविधि को प्रतिबिंबित करेगा। इसके अलावा, लिथियम के picomolar सांद्रता के लिए nanomolar परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग काफी सटीकता के साथ मापा जा सकता है। प्लाज्मा झिल्ली व्यक्त vesicular एक्सचेंजर्स के चयन के साथ संयुक्त जब इस प्रकार, इस दृष्टिकोण बहुत शक्तिशाली है। तीन प्रोटोकॉल अनुभाग के 3 में वर्णित माप प्रोटोकॉल) दिखाता है चित्रा। पहले से वर्णित के रूप में अधिमानतः कई अच्छी तरह प्लेटें (6-24) पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं, acidified कर रहे हैं। गतिज मध्यम युक्त लिथियम में कोशिकाओं के ऊष्मायन के साथ शुरू होता है, और अन्य फैटायनों या ब्याज (चित्रा 3 ए) के अवरोधकों।

तेज रोकने के लिए, कोशिकाओं तो ठंडा पीबीएस में चार तेजी से rinses के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं। कोई महत्वपूर्ण लिथियम तपका (3B चित्रा) होता है कि सुनिश्चित करते हुए तेजी से आपरेटिंग किसी भी बाह्य लिथियम हटा। प्रत्येक कुएं में लिथियम एकाग्रता तो हैलिथियम संचय समय कोर्स (चित्रा 3 डी) की ढलान माप के रूप में प्राप्त कर रहे हैं सीधे स्थिर राज्य में एक्सचेंजर की गतिविधि उपज है, जो परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी (चित्रा -3 सी), और लिथियम तेज की प्रारंभिक दरों का उपयोग मापा जाता है।

एंजाइम कैनेटीक्स के लिए के रूप में, प्रारंभिक दरों की खुराक पर प्रतिक्रिया अवरोधकों के लिए की मूल्यों का substrates के (चित्रा -4 ए) के लिए KM मूल्यों प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ट्रांसपोर्टरों का एक दिलचस्प सुविधा अलग युग्मन फैटायनों परिवहन के लिए प्रतिस्पर्धा करेंगे। यह लिथियम तेज (4B चित्रा) के साथ प्रतियोगिता से सोडियम के लिए KM मापने की संभावना पैदावार।

चित्र 1
चित्रा 1: कोशिकाओं का चयन + / एच + <ना एक intracellular व्यक्त/ उनके प्लाज्मा झिल्ली पर मजबूत> एक्सचेंजर। (ए) रणनीति तीन चरणों के लिए एच प्लाज्मा झिल्ली में एक कार्यात्मक उत्परिवर्तित गैर और गैर टैग इंट्रासेल्युलर Nhe व्यक्त कोशिकाओं की हत्या के चयन +। एक एसिड लोड करने के लिए प्रस्तुत PS120 पैतृक कोशिकाओं (बी) चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी छवि। स्केल बार: एक एसिड लोड निम्नलिखित प्लाज्मा झिल्ली पर एक vesicular एक्सचेंजर की अभिव्यक्ति के लिए चयनित PS120 कोशिकाओं, के 25 माइक्रोन (सी) चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी छवि। स्केल बार: 25 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: Intracellular पीएच माप पीएच videomicroscopy माप की (ए) के सिद्धांत।। (बी) ई490 एनएम पर एक उत्तेजना निम्नलिखित BCECF पीएच जांच के उत्सर्जित प्रतिदीप्ति (595 एनएम) की ज़ुल्फ़। एल: एसिड लोड, री; वसूली, Cal6.5:, पुन कुल्ला अंशांकन 6.5 की एक intracellular पीएच पर, Cal7.0: BCECF पीएच जांच के उत्सर्जित प्रतिदीप्ति (595 एनएम) का 7.0 (सी) विकास की एक intracellular पीएच पर अंशांकन में एक उत्तेजना निम्नलिखित 450 एनएम। एल: एसिड लोड, री; वसूली, Cal6.5:, पुन कुल्ला अंशांकन 6.5 की एक intracellular पीएच पर, Cal7.0: BCECF पीएच के 490/450 एनएम प्रतिदीप्ति अनुपात से गणना इंट्रासेल्युलर पीएच 7.0 (डी) की एक intracellular पीएच पर अंशांकन इवोल्यूशन जांच और अंशांकन अंक से। एल: एसिड लोड, री; वसूली, Cal6.5:, पुन कुल्ला अंशांकन 6.5 की एक intracellular पीएच पर, Cal7.0 7.0 की एक intracellular पीएच पर अंशांकन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3:। Nhe गतिविधि ली + तेज की प्रारंभिक दर से मापा जाता है (एक - सी) vesicular NHE7 एक्सचेंजर के लिए लिथियम तेज की एक मापा समय के पाठ्यक्रम की माप तकनीक (डी) उदाहरण के विभिन्न महत्वपूर्ण कदम चित्रण योजना प्लाज्मा में व्यक्त झिल्ली। प्रारंभिक दरों माप सुनिश्चित करने, प्रयोगात्मक शर्तों के भीतर गतिज के linearity ध्यान दें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: NHE7 के लिए विशिष्ट खुराक प्रतिक्रिया घटता (18 से मूल डेटा)।लिथियम तेज की प्रारंभिक दर एक मिनट कैनेटीक्स का उपयोग करके मापा गया था। (ए) कोशिकी लिथियम के लिए खुराक प्रतिक्रिया वक्र। 1mm कोशिकी लिथियम तेज पर कोशिकी सोडियम के विभिन्न सांद्रता (बी) प्रतियोगिता। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल साइट निर्देशित mutagenesis के द्वारा अपनी प्राथमिक अनुक्रम फेरबदल के बिना प्लाज्मा झिल्ली में इंट्रासेल्युलर ना + / एच + एक्सचेंजर्स व्यक्त कोशिकाओं का चयन करने के लिए कैसे करें। ये एक्सचेंजर्स अब लक्षण वर्णन किया जा सकता है।

इस विधि प्लाज्मा झिल्ली में vesicular ना + / एच + एक्सचेंजर्स व्यक्त करेंगे कि सेल लाइनों का चयन करने के intracellular प्रोटॉनों के सेलुलर विषाक्तता पर आधारित है। यह इस तरह ली +, + K, या सीएस + के रूप में ले जाया जाएगा संदेह हो सकता है कि अन्य फैटायनों, उपयोग करने के लिए, सिद्धांत रूप में, संभव हो सकता है। हालांकि, इस अनिश्चितता का एक अतिरिक्त स्तर कहते हैं। चयन किसी भी सकारात्मक क्लोन उपज नहीं है, तो इसे फिर से जांच की कटियन जाया नहीं या एक्सचेंजर प्लाज्मा झिल्ली में नहीं है कि क्या आकलन करना मुश्किल हो जाएगा। इस कोशिकी substr है के रूप में इन कारणों के लिए, चयन एक युग्मन केशन के रूप में ना + का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया हैशारीरिक स्थितियों में उच्चतम बहुतायत में पाया खाया। इस NHE7 18, के रूप में अच्छी तरह से NHE6 और NHE9 के रूप में प्लाज्मा झिल्ली (कवि और Counillon, अप्रकाशित परिणाम) व्यक्त वेरिएंट का चयन करने के लिए नेतृत्व किया।

यह प्लाज्मा झिल्ली अभिव्यक्ति ट्रांसपोर्टरों अब तक केवल प्लाज्मा झिल्ली ट्रांसपोर्टरों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि तरीकों से कार्यात्मक मापदंडों की माप के लिए सक्षम बनाता है। बेशक यह झिल्ली के माहौल में इस तरह के बदलाव vesicular NHEs के कार्यात्मक सुविधाओं को प्रभावित कर सकता है कि बाहर करने के लिए संभव नहीं है। हालांकि, इस रणनीति के कम से कम तीन कारणों के लिए उपयोग करने के लायक हो सकता है: (i) के NHE6 के intracellular अभिव्यक्ति, 7 और 9 किसी भी विस्तृत कार्यात्मक माप precludes, (द्वितीय) झिल्ली वातावरण और प्रोटीन या लिपिड भागीदारों के ज्यादातर नियामक सूक्ष्म प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है युग्मन फैटायनों, चयनात्मकता, दिशात्मकता, पीएच के लिए अन्य NHEs के तंत्र और इन ट्रांसपोर्टरों की नहीं उनके बहुत मौलिक सुविधाओं (समानताएंarmacological सुविधाओं)। तो यह उन vesicular NHEs की झिल्ली अभिव्यक्ति द्वारा यथावत रहेगा कि बहुत संभावना है। (Iii) के कार्यात्मक तंत्र और एक प्लाज्मा झिल्ली व्यक्त vesicular तंत्र के औषधीय प्रोफाइल को जानने के बाद, यह vesicular पीएच माप प्लाज्मा झिल्ली और vesicular अभिव्यक्ति के बीच उन संभव विसंगतियों को संबोधित करने के लिए बनाने के लिए तो संभव है।

इस तकनीक का एक और संभावित सीमा यहाँ वर्णित रणनीति अन्य एच व्यक्त + ट्रांसफ़ेक्ट vesicular से तंत्र extruding कोशिकाओं का चयन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि है ना इस तरह के एक प्लाज्मा झिल्ली Nhe, या उदाहरण के लिए एक एच + ATPase के रूप में / + एच + एक्सचेंजर ( )। यह प्रयोगशाला में कभी नहीं देखा गया था, यह वास्तव में ब्याज की Nhe वास्तव में प्लाज्मा झिल्ली में व्यक्त किया जाता है कि यह पुष्टि करने के लिए मुंह बंद करने के लिए युग्मित शास्त्रीय कोशिका की सतह लेबलिंग का उपयोग करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है और ना + या ली + mediates एट अल। 18 के लिए देखें)।

इन ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि को चिह्नित करने के लिए, दो प्रोटोकॉल, क्रमशः इंट्रासेल्युलर पीएच विविधताओं और आयन अपशिष्टों के आधार पर वर्णित हैं। पहली विधि पीएच के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट जांच और एक पर्याप्त प्रतिदीप्ति वीडियो माइक्रोस्कोपी प्रणाली के उपयोग की आवश्यकता है। क्षेत्र में कई समूहों द्वारा इस्तेमाल किया जाता है जो इस विधि, तो 24 videomicroscopy को प्रतिदीप्ति उत्तेजना और अधिग्रहण युग्मन द्वारा व्यक्ति की कोशिकाओं को मापने के लिए डिजिटल अधिग्रहण का उपयोग करते हुए, पहले निलंबन के 23 में संकेतों फार्म कोशिकाओं को मापने के लिए fluorimeters का उपयोग करते हुए, 1980 के दशक में विकसित किया गया है। उत्तरार्द्ध तकनीक के कारण अब कैमरे, रोशनी और कंप्यूटर प्रणालियों के उच्च प्रदर्शन करने के लिए, बहुत तेजी से और आसान हो गया है। दिलचस्प है, कंपनियों को आम तौर पर उनके फ्लोरोसेंट जांच के साथ बहुत जानकारीपूर्ण तकनीकी चादरें एक साथ प्रदान करते हैं। ये पीएच विविधताओं महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैंप्रोटॉन तपका के साथ युग्मित कोशिकी फैटायनों की प्रकृति का निर्धारण करने के लिए। इस संबंध में, यह अमोनियम preincubation की अवधि को ध्यान से माप के लिए इस्तेमाल कोशिकाओं के आधार पर समायोजित किया जाना है कि सूचना के लिए महत्वपूर्ण है। CCL39 व्युत्पन्न fibroblasts, 50 मिमी एनएच 4 सीएल के साथ बहुत अच्छी तरह से एक घंटे की लोड हो रहा है समर्थन करते हैं। इस Nhe पूर्ण सक्रियण सक्षम बनाता है और माप (Vmax शर्तें) के लिए एक मजबूत संकेत है कि उत्पादन एक बहुत मजबूत अम्लीकरण में यह परिणाम है। हालांकि, cardiomyocytes या प्राथमिक गुर्दे की कोशिकाओं की तरह अन्य कोशिकाओं तरह के एक महत्वपूर्ण अमोनियम लोड हो रहा है का समर्थन नहीं करेंगे। यह अलग ऊष्मायन बार या एनएच 4 सीएल सांद्रता के साथ कई प्रारंभिक परीक्षणों प्रदर्शन करने के लायक है। एनएच 4 सीएल के प्रति संवेदनशीलता में इस तरह के मतभेद के लिए कारण स्पष्ट नहीं हैं। वे अमोनियम परिवहन व्यवस्था 25,26 के संभावित अभिव्यक्ति से संबंधित हो सकता है। इसी प्रकार लोड हो रहा है समाधान धोने के लिए प्रयोग किया जाता है कि सोडियम मुक्त समाधान बर्दाश्त नहीं किया जा सकता हैऐसा ही एक उदाहरण के लिए cardiomyocytes के रूप में कोशिकाओं द्वारा। प्रारंभिक वेग कम ठीक निर्धारित किया जाएगा, यद्यपि यह अमोनियम लदान के बाद वसूली समाधान के साथ सीधे छिड़कना करने के लिए आवश्यक है।

इसके अलावा, इंट्रासेल्युलर पीएच माप भी आसानी से एक पीएच मान निम्नलिखित अंशांकन के रूप में व्यक्त किया जा सकता है कि BCECF प्रतिदीप्ति स्तर में कमी से पता लगाया जाएगा कि एक अम्लीकरण उत्पादन होगा रिवर्स मोड के रूप में इन एक्सचेंजर्स की प्रतिवर्ती संपत्तियों की जांच के लिए एक सरल तरीका प्रदान । इन प्रयोगों की सीमाओं को एक लघुगणकीय पैमाने पर संचालित और intracellular बफरिंग क्षमता द्वारा सीमित हैं कि प्रयोगों उपाय पीएच बदलाव, के रूप में परिवहन गतिविधियों का सही मात्रा का ठहराव की कमी है। उत्तरार्द्ध मापा और पीएच विविधताओं बफरिंग क्षमता उपज आयन अपशिष्टों से गुणा किया जा सकता है। हालांकि, इस प्रक्रिया पीएच माप, बफरिंग क्षमता माप, और calibra पर (कई प्रयोगात्मक त्रुटियों को जोड़ती हैtion के) और इसलिए अत्यधिक मात्रात्मक नहीं है। ट्रांसपोर्टर व्यक्त इसलिए प्लाज्मा झिल्ली के enzymatic स्थिरांक तक पहुँचने के लिए, तेजी से आयन प्रवाह तकनीक और अधिक सरल और सटीक हैं।

इंट्रासेल्युलर सामग्री साइटोसोलिक सोडियम में Nhe की मध्यस्थता परिवर्तन का पता लगाने millimolar रेंज में हैं, क्योंकि संभव नहीं है। अब से आगे, साल के लिए इस तरह के तेज तकनीक ऐसी 22 ना + के रूप में radioisotopes के उपयोग पर आधारित थे। यह पांडुलिपि 22 ना + भी NHEs द्वारा प्रयोग किया जाता है जो इस केशन, सेल cytosol से अनुपस्थित है और परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोमेट्री 21 का उपयोग करते हुए काफी सटीकता के साथ मापा जा सकता है कि इसके पीछे तर्क पर आधारित है, लिथियम द्वारा बदल दिया है, जिसके लिए एक गैर रेडियोधर्मी विधि का वर्णन है। अन्य संभावित युग्मन फैटायनों के लिए उपयुक्त निर्धारित कर रहे हैं शर्तों (समय और लिथियम एकाग्रता) रैखिक uptakes को मापने के लिए (यानी।, प्रारंभिक दरों की स्थिति में किया जा रहा है), समानताएं एक बार और / याआंकड़े 3 और 4 के रूप में दिखाया अवरोधकों सही मापा जा सकता है। एक आखिरी संभावित सीमा लिथियम तेज विधि के पाठ्यक्रम केवल ब्याज की एक्सचेंजर महत्वपूर्ण इस कटियन transports अगर ढंग से काम कर सकते हैं। यह मामला नहीं है, तो प्रयोगकर्ता उपर्युक्त इंट्रासेल्युलर पीएच माप पर या तो भरोसा करना होगा या रेडियोधर्मी सोडियम तेज का उपयोग करना होगा।

प्रयोगों के इस तरह के एक सेट के नेतृत्व में हाल ही में शुरू में माना जाता था जो NHE7 इंट्रासेल्युलर ना + / एच + एक्सचेंजर, एक endosomal अम्लीकरण तंत्र सोडियम के लिए युग्मित पुटिकाओं alkalinize होगा जो एक एच + / + K ट्रांसपोर्टर वास्तव में था होना करने के लिए है कि अवलोकन करने के लिए मार्ग प्रशस्त किया है 18। यह अब तक इस भूमिका VH + ATPases के लिए समर्पित होने लगा था के रूप में intracellular डिब्बों के लिए गहरे निहितार्थ हैं। Nhe परिवार के प्रत्येक सदस्य को एक बहुत ही विशेष गतिज हस्ताक्षर ओ प्रदर्शित करने के लिए प्रकट होता है के रूप मेंअपनी शारीरिक भूमिका के लिए विंग, यह NHE6 और NHE9 के लक्षण वर्णन उनके शारीरिक कार्यों पर प्रकाश डाला जाएगा कि उपन्यास और अप्रत्याशित सुविधाओं खोलेगा इस आलेख में वर्णित तरीकों का उपयोग परिकल्पना है कि आकर्षक है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard cell culture equipement Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers
Incubator with CO2 Sanyo MCO15A
Incubator without CO2 Heraeus instrument BB6220
Laminar flow hood PSM1200NF Fisher  52010120
DMEM medium sigma D5796
FBS gold GE Healthcare A15-151
Penicilin/streptomycin PAA P11-010
Trypsin 10x PAA L11-003
Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system Thermo Scientific ICE 3500 GFZ
LiCl sigma L4408
Nitric Acid sigma 438073
Fluorescence videomicroscopy set Leica Composed of many devices with different catalog numbers
Inverted automated microscope Leica DMI6000B
microscope stand leica 11888906
11888911
11505180
11888377
incident fluorescence leica 11888901
11504166
motor bracket leica 11888379
11505234
11521505
11522106
LED transmission light  leica 8097321
8102034
11521580
motorized plate leica 11522068
11531172
11521734
11521719
11888423
11888424
camera output leica 11888373
11507807
11888393
11888259
11888258
11541510
images acquisition/analysis software leica 11888375
optics leica 11506507
11506243
11506203
fluorescence Xenon lamp leica DMI6000
camera hamamatsu 8100601
metafluor/Mmfluor software 11640905
pH sensitive probe, BCECF-AM life technologies B1170
Nigericin Sigma N7143

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References

  1. Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
  2. Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).
  3. Kornak, U., et al. Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis. Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).
  4. Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease. Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).
  5. Kasper, D., et al. Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration. Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).
  6. Poet, M., et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).
  7. Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).
  8. Gilfillan, G. D., et al. SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).
  9. Mignot, C., et al. Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum. Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).
  10. Morrow, E. M., et al. Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science. 321 (5886), 218-223 (2008).
  11. Lasky-Su, J., et al. Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).
  12. Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. Genome-wide association studies in ADHD. Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).
  13. Meda, S. A., et al. A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort. Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).
  14. Zhang, L., et al. A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred. Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).
  15. Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter. Cell. 56 (2), 271-280 (1989).
  16. Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
  17. Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter. J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).
  18. Milosavljevic, N., et al. The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis. Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).
  19. Wigler, M., et al. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. Cell. 16 (4), 777-785 (1979).
  20. Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens. EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).
  21. Milosavljevic, N., et al. Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling. Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).
  22. Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
  23. Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).
  24. Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells. Nature. 325, 447-450 (1987).
  25. Quentin, F., et al. RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).
  26. Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 97 intracellular डिब्बों दैहिक सेल आनुवंशिकी ना
ना के कार्यात्मक विशेषता<sup&gt; +</sup&gt; / एच<sup&gt; +</sup&gt; चुनाव में प्रोटोन-हत्या का प्रयोग intracellular डिब्बों की एक्सचेंजर्स प्लाज्मा झिल्ली में उन्हें व्यक्त करने के लिए
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Milosavljevic, N., Poët, M., Monet, M., Birgy-Barelli, E., Léna, I., Counillon, L. Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane. J. Vis. Exp. (97), e52453, doi:10.3791/52453 (2015).

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