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Biology

Caracterização funcional de Na Published: March 30, 2015 doi: 10.3791/52453
* These authors contributed equally

Abstract

Acidificação endossomal é crítica para uma vasta gama de processos, tais como a reciclagem e degradação de proteínas, dessensibilização do receptor e neurotransmissor em vesículas sinápticas carregamento. Esta acidificação é descrito para ser mediada por ATPases de protões, acoplados a transportadores de cloreto clc. Altamente conservada prótons electroneutral transportadores, do Na + / H + trocadores (NHE) 6, 7 e 9 também são expressos nestes compartimentos. As mutações nos seus genes foram ligados com doenças cognitivas e doenças neurodegenerativas humanas. Paradoxalmente, seus papéis são ainda imperceptíveis, como a sua localização intracelular impediu a caracterização funcional detalhado. Este manuscrito apresenta um método para resolver este problema. Esta consiste na selecção de linhas de células mutantes, capazes de sobreviver a acidificação citosólica aguda retendo NHE intracelular na membrana plasmática. Em seguida, ele mostra dois protocolos complementares para medir a seletividade e atividade iondestes permutadores de: (i) uma base em medições de pH intracelular por meio de microscopia de fluorescência de vídeo, e (ii) uma base na cinética de absorção rápida de lítio. Esses protocolos podem ser extrapolados para medir outros transportadores não-electrogénico. Além disso, o processo de selecção aqui apresentada gera células com um fenótipo de retenção intracelular defeituosa. Por conseguinte, estas células expressam também outras proteínas da membrana vesicular na membrana plasmática. A estratégia experimental descrito aqui pode, portanto, constituir um instrumento potencialmente poderoso para estudar outras proteínas intracelulares que será, então, expressa na membrana plasmática vesicular, juntamente com o Na + / H + permutadores utilizados para a selecção.

Introduction

A maioria dos compartimentos intracelulares exibir um pH luminal ácida, o que é um parâmetro essencial para a maturação, o tráfico, a reciclagem de proteínas ou hormônios e neurotransmissores que carregam. Tem sido demonstrado que o gradiente de pH entre o teor de citosol e vesicular é gerado por vacuolar H + ATPase 1, acoplado aos transportadores vesiculares cloreto clc 2. Tanto em camundongos knock-out (KO) e pacientes humanos, a importância desses transportadores tem sido destacada pelos fenótipos pesados ​​causadas por mutações em seus genes 3-6.

Os membros da família SLC9A permutadores de sódio a hidrogénio, também denominado por NHE de Na + / H + permutadores, demonstraram ser importantes efectores no pH intracelular e regulação do volume celular, bem como no transporte vectorial de equivalentes de ácido-base entre epitélios . Além dos NHE da membrana plasmática, três altamente conservada de Na + / H + permutadores de NHE 6, 7e 9 são fixados em rede trans-Golgi e no início endosomes 7. As mutações em seus genes têm sido associados com Angelman-like ou Christianson Síndromes 8-9, autismo base familiar 10 e Attention Deficit Disorder Hiperatividade 11-12. Estes trocadores também foram envolvidos em problemas neurodegenerativas, como Alzheimer susceptibilidade à doença 13 e retardo mental genes contíguos X-ligados síndromes 14. Tomados em conjunto, estes estudos destacam a importância desses NHEs intracelulares no desenvolvimento e / ou a função cerebral.

A localização intracelular destes trocadores impede medições precisas de sua seletividade ion, direcção de transporte, parâmetros cinéticos, e regulamentação. Como é o caso para todos os transportadores expressos em compartimentos intracelulares, que é extremamente difícil de avaliar as suas actividades bioquímicas e, consequentemente, para compreender totalmente os seus papéis fisiológicos e o mechanismos subjacente suas implicações patológicas. Para a concentração de K + cytosolic alta, a hipótese mais comumente aceita era de que eles estavam trabalhando como K + acoplados transportadores de efluxo de prótons. A existência de uma tal fuga de protões tinham sido implicado, como pode contrabalançar bombeamento de protões pelos V-ATPase, a fim de manter um pH vesicular estado estacionário. O objectivo deste artigo visual é (i) para demonstrar um método que permite a selecção genética de linhas celulares que expressam estes transportadores vesiculares na sua membrana plasmática, e (ii) mostram duas abordagens independentes para medir as funções destes transportadores.

Três décadas atrás, Pouysségur e Franchi foram pioneiras na abordagem genética que permitiu a clonagem molecular e caracterização dos membros da família NHE 15. Este baseou-se na toxicidade de protões intracelulares, como um método de rastreio. O primeiro passo foi a obtenção de linhas celulares deficientesem qualquer troca + / H + Na expresso na membrana plasmática, usando a reversibilidade deste transportador. Os fibroblastos (linha celular CCL39) foram pré-carregado com Na + ou Li + e, em seguida, colocado num meio extracelular ácida (pH 6,5) durante 2 h. Isto levou à morte de células que expressam um funcional de Na + / H + e para a troca de selecção de células antiportador-deficiente (linha celular PS120 16). Quando cultivado em meio isento de bicarbonato, estas células são muito sensíveis à acidificação intracelular aguda. Por conseguinte, a expressão de qualquer mecanismo de efluxo de protões funcional na membrana de plasma vai ser seleccionadas positivamente (ver 17), se tais células são submetidas a acidifications intracelulares agudas. Tais técnicas de acidificação pode ser utilizado para isolar as linhas celulares com defeitos tráfico que permitam a expressão forçada de NHE intracelulares WT na membrana plasmática.

Como eucariota Na + / H+ Trocadores são electroneutral, eles não são mensuráveis ​​pelas abordagens eletrofisiológicos que têm sido utilizados com grande sucesso para medir canais. Assim, o presente artigo propõe demonstrar como medir a atividade desta trocador por medições de pH intracelulares e rápida cinética de absorção de lítio. Como os conceitos subjacentes são o mesmo, é interessante notar que muitos dos processos desenvolvidos para a secção de selecção, também são utilizados directamente para medições funcionais.

Curiosamente, observou-se que o defeito tráfico presentes nas linhas de células seleccionadas utilizando a abordagem descrita neste manuscrito conduz a uma maior expressão de outras proteínas vesiculares na membrana do plasma, tais como o canal de potássio vesicular TWIK1 18. Isso aponta para a seleção de um mecanismo geral defeito de retenção de proteínas transmembrana vesiculares. Assim, este processo de selecção e as células que gera Maioconstituem uma ferramenta promissora para a comunidade científica que trabalha em proteínas da membrana de compartimentos intracelulares. Como bem as técnicas de medição apresentados aqui podem ser aplicáveis ​​para o estudo de outros transportadores não-electrogénico.

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Protocol

1. H + Matar Seleção

  1. As linhas celulares
    1. Estavelmente NHE-transfectar células deficientes (por exemplo, a linha celular derivada de CCL39 PS120 16) usando qualquer combinação de vector de expressão de mamífero e transfecção método que produza rendimentos eficientes de transfecção e selecção numa linha de células de fibroblastos.
      NOTA: Para muitos anos de Fosfato de Cálcio precipitação 19 foi utilizado com bons rendimentos de transfecção. Este foi substituída mais recentemente por reagentes comerciais, tais como Lipofectamine2000, as transfecções ser realizadas seguindo as instruções do fabricante.
  2. Soluções
    1. Preparar três soluções estéreis descritos como abaixo. Esteriliza-se estas soluções por meio de filtração (0,22 um).
      1. Prepara-se uma NH4 + Carregando solução (pH 7,4) composto por 50 mM de NH4Cl, 70 mM de cloreto de colina, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glucose e 15 mM de MOPS a pH 7,4.
      2. Prepara-se uma solução de lavagem (pH 7,0) composta por 120 mM de cloreto de colina, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,0.
      3. Prepara-se uma solução de recuperação (pH 7,4) composto por NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4.
  3. Antes de iniciar a selecção, obter uma incubadora de cultura de células que pode ser utilizado a 37 ° C sem adicional de CO 2 a partir do tanque externo (denominado CO 2 - incubadora "livre"), como 5% de CO 2 resultará na memória intermédia que pode prejudicar o acidificação. Amplificar a linha celular que expressa o NHE de interesse até cerca de 2 x 10 8 células (tipicamente cerca de 20 100 placas confluentes mm).
  4. H + matando procedimento:
    1. Incubar as células que expressam o NHE intracelular de interesse durante 1 hora em solução a carregar, em 37 ° C na incubadora de CO 2 -livre.
    2. Aspirar a solução de carga e, em seguida, lave-os duas vezes na solução descrita-rinse acima. Executar esta etapa eficiente para eliminar o residual extracelular NH4Cl que prejudicaria a criação de um gradiente de NH 4 + íngreme que irá gerar a acidificação.
    3. Elimine o meio por aspiração e lavagem incubar as células durante uma hora em solução de recuperação de novo a 37 ° C na incubadora de CO 2 livre.
    4. Substituir o meio de recuperação com meio de cultura normal (tipicamente DMEM com 7,5% de FCS) e as células crescer em condições de cultura padrão (37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 e 95% de ar).
  5. Repetir este ciclo de selecção, duas vezes por semana, até surgir clones estáveis.
    NOTA: Tome especial cuidado relativo à cultura de células e condições de seleção. Meses de trabalho pode ser arruinada por qualquer contaminação que é mais propenso a oCCur após um longo período de cultura de células e manipulações repetidas.
    1. Aqui, escolha se deseja ampliar os clones e caracterizá-los individualmente conforme descrito nas seções 2-3, ou reuni-los em conjunto para gerar uma população celular antes de caracterização.
  6. Aplicar a selecção ocasional (cerca de uma vez a cada duas semanas) para reter as células resistentes à acidificação por contra-selecionar aqueles que podem ter revertido para o sensível ao ácido fenótipo parental (Figura 1B).

2. As medições de pH intracelular

2.1) Imagem de Fluorescência pH

  1. Use a ratiometric sensíveis ao pH de corante fluorescente BCECF / AM, que é sensível ao pH quando excitado a 490 nm e possui uma nm ponto isosbestic 445, seguindo os protocolos do fabricante.
    1. Em alternativa, utilizar outras sondas sensíveis ao pH, seguindo os protocolos do fabricante.
  2. Use um con imagem definidasisting de um microscópio invertido acoplado a uma câmera de vídeo de alta sensibilidade. Equipar este conjunto com 450 nm e 490 nm filtros de interferência de banda estreita emparelhados com quartzo adequado filtros de densidade neutra para a excitação.
    1. Se possível, use o conjunto adequado de filtros e condições de iluminação para configuração valores de fluorescência comparáveis ​​para λ1 e λ2 para que a relação se aproxima de 1. Além disso, evite valores de fluorescência basais que são definidas quer saturar ou muito baixa, tanto para λ1 e / ou λ2. Isso pode produzir artefatos importantes como então a relação pode não foi detectável embora pH intracelular está mudando.
      NOTA: Este sistema deve habilitar perfusão rápida, a excitação de lapso de tempo para os dois comprimentos de onda acima mencionados e aquisição no comprimento de onda de emissão própria (535 nm para BCECF). Equipar o sistema com software que permite a aquisição de dados automática e armazenamento.

2.2) A medição do NHE Atacante Atividade (Extrusão dePrótons do citosol)

  1. Acidifica-se as células por uma incubação de 1 h na solução de NH 4 + Carregando (ver passo 1.4), na ausência de CO 2.
  2. Adicionar BCECF-AM (5 mM concentração final) para a solução para os últimos cinco minutos e, em seguida, lave-o com NH 4 + solução de carga para eliminar a sonda extracelular.
  3. Montar as células no microscópio e tomar várias imagens para gravar uma linha de base estável. Perfundir a solução de lavagem (ver acima). Isto resulta numa queda da fluorescência correspondente à acidificação.
  4. Após a estabilização do pH, perfuse qualquer uma das soluções a seguir para medir as taxas de recuperação de pH mediadas por Li + / H +, Na + / H + ou K + / H + câmbio. Cada solução contém um potencial catião de acoplamento para ser testado para a troca de H +. Se um desses é transportado, isto irá resultar em um aumento de fluorescência a 495 nm que correspgundo a um aumento no pH intracelular:
    LiCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4
    120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4
    KCl 125 mM, MgCl2 1 mM, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4

2.3) A medição do NHE Atividade Reversa

NOTA: O princípio aqui é inverter os gradientes iônicos transmembrana.

  1. Antes da medição, carregar as células com o catião intracelular de interesse (ver abaixo).
  2. Incubar-los por 5 min com BCECF / AM (veja o passo 2.2.2); lavá-los, montá-los no microscópio vídeo.
  3. Perfundir a solução de carga e tomar várias imagens para gravar uma linha de base estável.
  4. Depois da estabilização da linha de base, a imagem das variações de pH quando as células são perfundidos com um meio ácido extracelular contendo 120 mCloreto de colina M, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl 2, CaCl 2 2 mM, 5 mM de glicose e 15 mM de MES a pH 6,5.
  5. Para LiCl carregamento, as células incubar durante 2 horas em uma solução composta de LiCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4. Lítio intracelular medido por espectroscopia de absorção atómica gera um valor de cerca de 60 mM.
  6. Para carregamento de Na +, incubar as células durante duas horas numa solução composta por 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4 na presença de 1 mM de ouabaina para bloquear a bomba de Na / K ATPase. Nestas condições, a concentração intracelular de Na + está na gama de 40 mM.
    NOTA: K + de carga não é necessário, como K + citosólico concentração está na gama de 140 mM e um gradiente dirigido exteriormente-K +, por conseguinte, é fácil de conseguir.

2.4) Tratamento e calibração de dados:

NOTA: Este passo é válido tanto para as medições frente e verso.

  1. No final de cada experiência, perfundir as células com uma solução de KCl 140 mM, HEPES 20 mM e 5 uM nigericina ajustado a valores de pH entre 6,5 e 7,4.
  2. Coletar dados como medições de fluorescência a partir das imagens (níveis de cinza que representam os níveis de intensidade) e exportação nos termos do formato de texto e tratar como explicado abaixo usando um programa de planilha.
  3. Calcular os valores de pH intracelular para cada célula ou região de interesse utilizando a seguinte equação individual:
    pH = pKa + (Log (R-R min) / (R max -R)) x F min (λ2) / F max (λ2)
  4. Utilizar a min F (λ2) / F x ma (λ2) proporção, se houver fuga de branqueamento ou sonda, resultando numa diminuição na fluorescência a 450 nm ao longo das experiências. Esta é no entanto muito raramente observada nas condições utilizadas no desexperimentos crita.
  5. À medida que os dados de calibração estão presentes no final de cada medição de pH, verificar se os valores calculados que correspondem diferentes dos valores de pH utilizados para a calibração. Se for o caso, em seguida, ajustar todos os valores de pH experimentalmente-determinados para a calibração utilizando o seguinte procedimento:
    1. Calcula-se o seguinte quociente (Q, a diferença entre os valores medidos / diferença entre os valores de calibração). Multiplique todo o conjunto de dados por Q. fazer o ajuste final por adição ou subtração de modo que os valores calculados serão iguais aos valores de calibração correspondentes.

3. Medidas de taxas iniciais do NHE7 pelo FAST Li + Captação

  1. Semear as células em placas de múltiplos poços (6 a 24 poços) e acidificam-los usando a técnica de NH 4 + carregamento descrito acima ou, alternativamente, o / albumina de soro bovino (BSA) a acidificação nigericina descrito em 20.
  2. Manter durações de captação de curto e consistentes (tipicamente um minuto ou abaixo) para garantir que o transporte opera em condições de taxas iniciais. Também certifique-se de que todas as soluções utilizadas para a captação são isotônicas.
  3. No final do tempo de absorção, eliminar cuidadosamente a forma absorção e lavar as células quatro vezes com solução salina de fosfato gelada tamponada (PBS). Realizar estas lavagens tão rápido quanto possível (menos de 10 seg para os quatro deles é ideal) para evitar o efluxo de lítio.
  4. Lisar as células em 25% de ácido nítrico. Aplicar 250 ul por poço de 25% de ácido nítrico e deixá-lo assentar durante pelo menos 1 h, em seguida, cada poço de sucata com a extremidade da ponta da pipeta e transferir toda a suspensão bem em um novo mitubo crocentrifuge.
  5. Transferir o lisado em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, centrifugar-los durante 5 minutos a 15.000 x g (temperatura ambiente), para remover os detritos celulares.
  6. Medir a quantidade de lítio do sobrenadante por espectroscopia de absorção atômica 21.
    NOTA: Diferentes empresas fornecem espectrometria de absorção atômica, que têm de ser equipado com uma lâmpada de cátodo oco de lítio. Siga as instruções do fabricante como essas máquinas são muito precisos, mas também bastante delicado.

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Representative Results

Seleção:

A selecção H + matando baseia-se na difusão da amónio base fraca, tal como representado na Figura 1A. O efeito de bases fracas e ácidos difusão no pH intracelular foi iniciada por Walter Boron e colaboradores 22. A idéia elegante para usar este fenômeno para produzir uma acidificação letal para a seleção genética positiva foi então desenvolvido por Jacques Pouysségur 17. De acordo com um protocolo deste tipo, o pH intracelular cai para cerca de 5,5 após o passo de enxaguamento. As células que não expressam um NHE funcional na membrana plasmática não é possível recuperar um valor de pH neutro e mostrar um aspecto típico acidificada com uma forma plana e um citoplasma granular (Figura 1B). Ciclos de seleção Depois de repetidas (cerca de dois H + matando procedimentos / semana), células que totalmente e de forma estável sobrevivem esta acidificação (Figura 1C) emergem, com uma frequência de cerca de 10 -7.Isto irá resultar na formação de clones celulares individuais que podem ser caracterizados quer individualmente ou combinadas para obtenção de populações celulares se desejado. Experiências convencionais, tais como a biotinilação da superfície celular ou silenciamento de RNA pode ser conduzido para controlar que a proteína expressa na membrana plasmática é de facto uma intracelular de NHE, tais como NHE7 (ver, por exemplo Milosavljevic et ai. 18). Assim, RT-PCR e subsequente sequenciação devem ser realizados para verificar a existência de eventuais mutações na sequência dos NHE intracelulares expressas na linha celular seleccionada.

Caracterização funcional:

Fluorescência Videomicroscopia:

A actividade e selectividade de iões intracelulares dos NHE expressas na membrana plasmática podem ser caracterizadas medindo as alterações do pH intracelular induzida por estes NHE em várias condições. Para isso um conjunto videomicroscopia equipado com iluminação umconfigurações de aquisição d a imagem de uma sonda ratiometric como BCECF / AM está esquematizado na Figura 2A. Figura 2B e 2C mostram as variações típicas em valores de fluorescência obtidos directamente para excitações a 490 e 450 nm, na sequência de um NH 4 + carregar acidificação Figura 2D. mostra a curva de pH obtidos a partir destes valores de fluorescência, após o tratamento de dados descritos em 2.4).

Lithium Captação:

Juntamente com hidrogénio e sódio, lítio compreende parte da primeira coluna da tabela periódica e foi demonstrado ser um catião de um acoplamento eficiente para o Na + / H + permutadores. É possível tirar proveito dessas informações para instalação cinética rápida de captação de lítio, a fim de medir em detalhes os parâmetros funcionais de Na + / H + trocadores. Como este cátion está ausente do citoplasma da célula, o seu acúmulo em cima citacidificação osolic irá reflectir quantitativamente a actividade da membrana do plasma de NHE. Além disso, as concentrações de nanomolar a picomolar de lítio pode ser medido com grande precisão utilizando espectrometria de absorção atómica. Assim, esta abordagem é muito potente quando combinado com a selecção da membrana de plasma expressas permutadores vesiculares. A Figura 3 ilustra o protocolo de medição descrito em 3) da secção de protocolos. Células, de preferência, semeados em placas de múltiplos poços (6 a 24) são acidificados como descrito anteriormente. A cinética inicia-se com a incubação das células em meio contendo lítio, e os outros catiões ou inibidores de interesse (Figura 3A).

Para parar a absorção, as células são, em seguida, submetida a quatro lavagens rápidas em PBS gelado. Operando rapidamente remove qualquer lítio extracelular, assegurando que nenhum efluxo lítio significativa ocorre (Figura 3B). Concentração de lítio em cada poço é entãomedido usando espectroscopia de absorção atómica (Figura 3C), e as taxas de absorção iniciais de lítio, as quais produzem directamente a actividade do permutador, no estado estacionário são obtidos como medições de inclinação do curso acumulação de lítio tempo (Figura 3D).

Quanto a cinética da enzima, de dose-resposta das taxas iniciais podem ser usados ​​para derivar valores de Km para substratos (Figura 4A) de valores de Ki para inibidores. Uma característica interessante dos transportadores é que diferentes cátions de acoplamento vai competir para o transporte. Isto origina a possibilidade de medir o Km em relação ao sódio por competição com a absorção de lítio (Figura 4B).

Figura 1
Figura 1: Selecção de células que expressam uma intracelular de Na + / H + </ Forte> permutadores a sua membrana plasmática. (A) Estratégia para as três etapas H + matando a selecção de células que expressam um NHE funcional não mutado e não-marcado intracelular na membrana plasmática. Imagem de microscopia (B) O contraste de fase de PS120 células parentais submetidos a uma carga de ácido. Barra de escala: 25 mm microscopia de imagem (C) de contraste de fase de células PS120 seleccionados para a expressão de um permutador vesicular na membrana plasmática, após uma carga de ácido. Barra de escala: 25 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: medições de pH intracelular (A) Princípio da medição videomicroscopia pH.. (B) Evolução da fluorescência emitida (595 nm) da sonda de pH BCECF seguinte uma excitação a 490 nm. L: carga ácida, Ri; Lavar, Re: recuperação, Cal6.5: calibração em um pH intracelular de 6,5, Cal7.0: Calibração em um pH intracelular de 7,0 (C) Evolução da fluorescência emitida (595 nm) da sonda BCECF pH após uma excitação a 450 nm. L: carga ácida, Ri; Lavar, Re: recuperação, Cal6.5: calibração em um pH intracelular de 6,5, Cal7.0: Calibração em um pH intracelular de 7,0 (D) Evolução do pH intracelular calculado a partir dos índices de 490/450 nm de fluorescência do BCECF pH sonda e a partir dos pontos de calibração. L: carga ácida, Ri; Lavar, Re: recuperação, Cal6.5: calibração em um pH intracelular de 6,5, Cal7.0: Calibração em um pH intracelular de 7,0 por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 3:. Atividade NHE medida pelas taxas iniciais de Li + absorção (A - C) Esquema representando as diferentes etapas críticas da técnica de medição (D) Exemplo de um curso de tempo medido de captação de lítio para a vesicular NHE7 trocador expressa no plasma membrana. Note-se a linearidade da cinética dentro das condições experimentais, garantindo medição taxas iniciais. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Típico curvas dose-resposta para NHE7 (dados originais de 18).As velocidades iniciais de absorção de lítio foram medidos usando a cinética de 1 minuto. (A) Curva de dose-resposta para o lítio extracelular. (B) Concorrência de diferentes concentrações de sódio extracelular em 1 mM de captação de lítio extracelular. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo descreve como para seleccionar células que expressam intracelular de Na + / H + permutadores na membrana plasmática, sem alterar a sua sequência primária por mutagénese dirigida ao local. Estes trocadores de agora pode ser caracterizado.

Este método baseia-se na toxicidade celular de protões intracelulares para seleccionar linhas celulares que expressam vesicular de Na + / H + permutadores na membrana plasmática. Pode ser possível, em princípio, utilizar outros catiões que podem ser suspeitos de serem transportados, tais como Li +, K +, Cs + ou. No entanto, isso adiciona um nível adicional de incerteza. Se a selecção não produz qualquer clone positivo, que em seguida vai ser difícil avaliar se o catião não testado é transportado ou o permutador não é na membrana plasmática. Por estas razões, selecções foram realizadas utilizando Na + como catião de acoplamento como este é o substr extracelularcomeu encontrada em maior abundância em condições fisiológicas. Isto conduziu à selecção de variantes que expressam NHE7 18, bem como NHE6 e NHE9 na membrana plasmática (poeta e Counillon, resultados não publicados).

Esta expressão membrana plasmática permite a medição dos parâmetros funcionais transportadores por métodos que até agora só podiam ser utilizados para os transportadores da membrana plasmática. É claro que não é possível excluir que uma tal mudança no ambiente da membrana podem afectar as características funcionais dos NHE vesiculares. No entanto, esta estratégia pode valer a pena usar, pelo menos, três razões: (i) a expressão intracelular de NHE6, 7 e 9 se opõe a qualquer medida funcional detalhada, (ii) os ambientes de membrana e parceiros de proteínas ou lipídios em sua maioria foram mostrados para afetar sutil regulamentar mecanismos das outras NHEs e não as suas características muito fundamentais destes transportadores (afinidades para cátions de acoplamento, selectividade, direcionalidade, phcaracterísticas armacological). Por isso, é muito provável que aqueles que permanecerá inalterada pela expressão membrana das NHEs vesiculares. (Iii) Conhecer os mecanismos funcionais e perfis farmacológicos de um mecanismo vesicular membrana plasmática-expressa, é então possível fazer medições de pH vesicular para abordar essas possíveis discrepâncias entre membrana plasmática e expressão vesicular.

Outra limitação potencial desta técnica é que a estratégia aqui descrita pode levar à selecção de células que expressam outros, H + do que o mecanismo de extrusão vesicular transfectadas de Na + / H + (tal como uma membrana de plasma de NHE, ou um de H + -ATPase, por exemplo, ). Embora nunca foi observado em laboratório, é, portanto, crucial para usar rotulagem superfície celular clássica acoplado a silenciar para realmente verificar se o NHE de interesse é de fato expresso na membrana plasmática e medeia o Na + ou Li + et al. 18).

Para caracterizar a atividade desses transportadores, dois protocolos, respectivamente com base nas variações de pH intracelulares e fluxos iônicos são descritos. O primeiro método requer a utilização de sondas fluorescentes sensíveis ao pH e de um sistema adequado de microscopia de fluorescência de vídeo. Este método, que é usada por muitos grupos no campo, foi desenvolvida nos anos 1980, primeiro usando fluorimeters para medir sinais formam células em suspensão 23, em seguida, utilizando aquisição digital para medir as células individuais por acoplamento de excitação de fluorescência e de aquisição para Videomicroscopia 24. Esta última técnica tornou-se muito rápido e fácil, devido ao alto desempenho de câmeras, iluminação e sistemas de computador. Curiosamente, as empresas costumam fornecer fichas técnicas muito informativos junto com suas sondas fluorescentes. Estas variações de pH fornecer informações importantespara determinar a natureza dos catiões extracelulares acoplados com protões de efluxo. A este respeito, é importante notar que a duração da pré-incubação de amónio tem de ser cuidadosamente ajustada de acordo com as células utilizadas para as medições. Fibroblastos derivados de CCL39, suporta muito bem a carga de uma hora com 50 mM NH 4 Cl. Isso resulta em uma muito forte acidificação que permite a activação do NHE completo e produz um sinal forte para medições (condições Vmax). No entanto, outras células, como cardiomiócitos ou células renais primárias não apoiaria tal uma importante carga de amónio. Vale a pena realizar vários ensaios preliminares com diferentes tempos de incubação ou NH 4 concentrações Cl. A razão para tais diferenças de sensibilidade ao NH4Cl não são claras. Eles podem ser relacionados com a eventual expressão dos sistemas de transporte de amónio 25,26. Do mesmo modo a solução isenta de sódio, que é utilizado para a lavagem da solução de carregamento não pode ser toleradapor células, tais como por exemplo cardiomiócitos. Embora as velocidades iniciais serão menos precisamente determinada, que é necessário para perfundir directamente com a solução de recuperação após o carregamento de amónio.

Além disso, as medições de pH intracelulares também proporcionam uma forma simples para investigar as propriedades reversíveis destes permutadores como o modo inverso irá produzir uma acidificação que serão facilmente detectados por uma diminuição do nível de fluorescência de BCECF que pode ser expresso como um valor de pH após a calibração . As limitações destas experiências é a falta de uma quantificação precisa das actividades de transporte, como as variações de pH experimentos medida, que operam em uma escala logarítmica e são limitadas pela capacidade de tamponamento intracelular. Este último pode ser medido e variações de pH multiplicado por fluxos de iões de rendimento de capacidade de buffer. No entanto, este processo combina vários erros experimentais (em medições de pH, medições de poder tampão e calibração) e não é, portanto, altamente quantitativa. Assim, para acessar as constantes enzimáticas da membrana plasmática expressa transportador, técnicas de fluxo de iões rápida são muito mais simples e precisa.

Porque conteúdos intracelulares estão na gama mil imolar, detecção de alterações da NHE-mediadas em citosólica de sódio não é possível. Daí em diante, durante anos tais técnicas de captação foram baseados no uso de radioisótopos, tais como Na + 22. Este manuscrito descreve um método não-radioactivos para a qual 22 Na + é substituído por lítio, com base no racional de que este catião que também é utilizado por NHE, está ausente do citosol da célula e pode ser medido com grande precisão utilizando espectrometria de absorção atómica 21. Uma vez que as condições adequadas (tempo e concentração de lítio) para medir absorções lineares (ie., Estando em condições de taxas iniciais) são determinados, afinidades para os outros cátions acoplamento potencial e / ouOs inibidores podem ser medidos com precisão, como mostrado nas Figuras 3 e 4. A última limitação potencial é que o método captação de lítio pode, naturalmente, só funcionam se o permutador de interesse transporta significativamente este cátion. Se não for o caso, o experimentador terá de contar quer nas medições de pH intracelular acima referidas ou terá que usar a absorção de sódio radioactivo.

Um tal conjunto de experiências conduziram recentemente conduziu à observação de que o NHE7 intracelular de Na + / H +, que foi, inicialmente, que se acredita ser um de H + / K + transportador que alcalinizar vesículas era, de facto, um mecanismo de direccionamento endossomal acidificação acoplado a sódio 18. Isto tem implicações profundas para compartimentos intracelulares como até agora este papel foi pensado para ser dedicado aos + ATPases VH. À medida que cada membro da família de NHE parecem exibir uma assinatura cinética o muito específicoasa para seu papel fisiológico, é tentador supor que a caracterização de NHE6 e NHE9 usando os métodos descritos neste artigo irá revelar características novas e inesperadas que irá destacar suas funções fisiológicas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard cell culture equipement Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers
Incubator with CO2 Sanyo MCO15A
Incubator without CO2 Heraeus instrument BB6220
Laminar flow hood PSM1200NF Fisher  52010120
DMEM medium sigma D5796
FBS gold GE Healthcare A15-151
Penicilin/streptomycin PAA P11-010
Trypsin 10x PAA L11-003
Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system Thermo Scientific ICE 3500 GFZ
LiCl sigma L4408
Nitric Acid sigma 438073
Fluorescence videomicroscopy set Leica Composed of many devices with different catalog numbers
Inverted automated microscope Leica DMI6000B
microscope stand leica 11888906
11888911
11505180
11888377
incident fluorescence leica 11888901
11504166
motor bracket leica 11888379
11505234
11521505
11522106
LED transmission light  leica 8097321
8102034
11521580
motorized plate leica 11522068
11531172
11521734
11521719
11888423
11888424
camera output leica 11888373
11507807
11888393
11888259
11888258
11541510
images acquisition/analysis software leica 11888375
optics leica 11506507
11506243
11506203
fluorescence Xenon lamp leica DMI6000
camera hamamatsu 8100601
metafluor/Mmfluor software 11640905
pH sensitive probe, BCECF-AM life technologies B1170
Nigericin Sigma N7143

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References

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Biologia Celular Edição 97 compartimentos intracelulares genética de células somáticas Na
Caracterização funcional de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Trocadores de intracelular compartimentos usando a Seleção Proton-matança de expressá-las na membrana plasmática
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Milosavljevic, N., Poët, M., Monet, M., Birgy-Barelli, E., Léna, I., Counillon, L. Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane. J. Vis. Exp. (97), e52453, doi:10.3791/52453 (2015).

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